Z čeho můžeme usuzovat na mykotickou infekci laboratorní diagnostika

Transkript

1 Naďa Mallátová Pracoviště parazitologie a mykologie, Nemocnice Č. Budějovice, a.s. Z čeho můžeme usuzovat na mykotickou infekci laboratorní diagnostika

2 EORTC KRITÉRIA pro diagnostiku invazivních fungálních infekcí De Pauw et al. 2008, revize 2015 Dg. jistá Histologie Mikroskopie Kultivace Z primárně sterilních lokalit!!!! Dg. pravděpodobná Predispozice Klinická kritéria Mykologická kritéria Hemokultura, tkáň, sterilní tělní tekutiny (mok, výpotky...) BAL není považován za materiál z primárně sterilních lokalit!!!

3 Invazivní kandidóza - diagnostika

4 Metoda Výhody Nevýhody Mannan/ Biologické markery antimannan Časný (sérum) Dobrá senzitivita i specificita Nezařazeno mezi mykol. kritéria EORTC Nízká senzitivita pro C. parapsilosis a C. guilliermondii i C. glabrata Falešná pozitivita Nestabilita ag v séru BDG Beta-D-glukan (sérum) Časný panfungální marker Vysoká negativní prediktivní hodnota Monitoring rizikových pacientů Houbově nespecifický marker Nezachytí infekce mukormycetami a kryptokoky Nížší pozitivní prediktivní hodnota (falešná pozitivita) Molekulární metody CAGTA - C.albicans germ tube antibody test Rychlá metoda Senzitivita i specificita je závislá na validitě vzorku (nízká v krvi, vyšší v tkáni) Vysoká negativní prediktivní hodnota Odhalí předešlou expozici u rizikových pacientů (možná profylaxe) Chybí standardizace Nezařazeno mezi mykol. kritéria EORTC Riziko kontaminace Obtížná interpretace (infekce - kolonizace kontaminace) CAGTA C.albicans germ tube antibody detekce specifických antimyceliárních protilátek proti Candida spp. Linares 2001, Morageus. 2004: senzitivita 84,4-96 %, specificita 94,7-100 % Penam 2011: hematol. malignity - senzitivita % a specificita 94,7-95% Protilátky mají i kolonizovaní Imunosuprimovaní netvoří protilátky

5 CS - candida skore Parenterální nutrice (1) Chirurgický zákrok (1) Multifok. kolonizace (1) Sepse (2 body) CI kolonizační index lokality kolonizované kandidou / odebrané lokality Odebírané lokality: orofaryng, trach. aspirát, tekutina z duodena, žaludku, stěr z perinea, stolice, moč, abdominální drén, okolí katétru

6 retrospektivní kontrolovaná studie, JIP 50 lůžek, , univ. nemocnice 43 pacientů s kandidémií (CA 40 %, CP 23%, CT 19 %, CG 17 %) 67 pacientů kontrolní skupina sledována byla kolonizace kandidami, BDG a mannan/antimannan v séru 8 týdnů před a po 1. pozitivní hemokultivaci median do vzniku kandidémie byl 19 dní po přijetí na ICU BDG časný marker, pozitivita BDG - medián 19 dní před pozitivní HMK, max. pokles BDG do 3 týdnů, vyjímečně déle nižší specificita Mannan pozdější marker, nižší senzitivita Závěr: BDG i mannan/antimannan v kombinaci s kolonizačním indexem jsou přínosné markery v diagnostice IC na JIP nejsou vhodné pro monitoring terapie, ale mohou predikovat relaps

7 BETA-D-GLUKAN polysacharid buněčné stěny mikromycet nespecifický houbový marker panfungální antigen přítomný u rodu Candida, Trichosporon, Aspergillus, Fusarium, Acremonium, Pneumocystis a dalších chybí u Mucorales, rodu Cryptococcus 1. glukan reaguje s lyzátem krabích amébocytů 2. aktivacie serinové proteázy 3. srážecí reakce, rychlost je úměrná koncentraci glukanu 4. vzniklý produkt se měří kalorimetricky nebo turbidimetricky Miceli 2015

8 BDG - metaanalýzy White et al. Am J Clin Pathol 2018.

9 BDG diagnostické možnosti Obayashi et al. CID 2008.

10 Detekce BDG toxinometr WAKO detekce ze séra, plasmy příprava vzorku 5 minut vzorky lze vkládat jednotlivě i v průběhu reakce doba detekce max. 90 minut výsledek většinou do hodiny průběh reakce lze sledovat na monitoru cut off 11 ng/ml sledovat pozorněji pacienty s hodnotou BDG nad 7 ng/ml

11 srovnání výsledků WAKO a Fungitell Assay (FGA) 120 sér od pacientů s kultivačně potvrzenou kandidémii 63 sér od pacientů s prokázanou PCP 120 sér negativní kontrola Kandidémie: medián BDG FGA 351 pg/ml, WAKO 8,4 pg/ml signifikantně vyšší než kontrolní skupina FGA senzitivita 87 %, specificita 85 %, PPV 6 %, NPV 99 % WAKO senzitivita 42,%, specificita 98 %, PPV 19 %, NPV 99 % PCP: medián BDG FGA 963 pg/ml, WAKO 57,7 pg/ml FGA senzitivita 100 %, Wako senzitivita 88,9 % Korelace: Vynikající pro kandidémii (r=0,956, P<0,001), dobrá pro PCP (r=0,391, P=0,002)

12 37 relevantních studií

13 pokles incidence u HIV nemocných (antiretrivirová léčba, profylaxe) vzestup incidence u hematol. i orgánových malignit, orgánové translantace (ledviny), u pacientů na imunomodulační terapii (anti-tnf), pacienti s chronickým onemocněním plic, pacienti na kortikoterapii nespecifická klinika teplota, suchý kašel, bolest na hrudi, dušnost, hypoxie RTG zpočátku negativní nález, později bilaterální intersticiální pneumonie, doporučeno CT elevace LDH! u HIV+ 100% senzitivita (v korelaci s poškozením plic) PCT a CRP nejednoznačné Pneumocystová pneumonie

14 Diagnostika pneumocystózy mikroskopie PCR detekce BDG

15 fluorescence B A R V Í C Í PAS Grocott T E CH N I K Y HEO Gram-Weigart T. modř

16 Přínos BDG pro diagnostiku PCP Přínos PCR pro diagnostiku PCP

17 Pneumocystóza jako nosokomiální infekce literatura , vybráno 29 studií z toho 83 % byli pacienti po orgánové transplantaci (dominantně ledvin) v 47 % studií byla provedena genotypizace Pneumocystis prokázána nosokomiální infekce a interhumánní přenos, pouze ve 2 případech se našel zdroj v prostředí (filtr, ventilace) prokázán přenos mezi pacienty při přesunu nemocného pacienta do jiného zařízení prokázán přenos z personálu na imunosuprimovaného pacienta autoři nepotvrzují teorii, že jsme jako děti kolonizováni pneumocystou a vzniklé onemocnění je vzplanutí latentní infekce studie post mortem neprokázaly přítomnost pneumocyst v plicích u zdravé populace z okolí nemocných pacientů byly izolovány stejné genotypy (80 % do 1 m, max.8 m) Závěr: profylaxe rizikových pacientů neumísťovat pacienty s PCP společně s ostatními imunosuprimovanými (CDC)

18 PCR Candida není standardizovaná metoda není zařazeno mezi kritéria EORTC obtížná interpretace v závislosti na validitě vzorku! (infekce vs. kolonizace) přínosné u bioptátů a vzorků z primárně sterilních lokalit (tkáň, mok ) LightCycler septifast Test (CA, CP, CT, CK, CG, AFU) prověřeno 248 citací, do metaanalýzy vybráno 34 studií pacientů septických epizod bakteriální inf.: senzitivita 80 %, specificita 95 % mykotické inf.: senzitivita 61 %, specificita 91 %

19 T2MR využívá magnetickou resonanci k detekci specifických molekul v cílovém vzorku (kombinace molekulární detekce a MR) lýza erytrocytů, koncentrace patogenu, lýza patogenu, amplifikace DNA, detekce amplifikovaného produktu pomocí amplifikací indukované aglomerace supermagnetických částic měřené T2MR detekuje hematogenní infekce vyvolané C. albicans, C. tropicalis C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei detekce ze séra doba do detekce hodiny (3-5)!!! v ČR již k dispozici, cena za 1 vyšetření asi 5 tisíc Kč

20 Nespecifické zánětlivé markery v diagnostice invazivní kandidózy , 40 nemocnic, 4858 pacientů, pozitivní HMK: 815 G- bakterie, 948 G+ bakterie, 65 Candida sp. PCT koncentrace byla nejvyšší u G- bakterémií 26 ng/ml (7,7-63,1), G+ bakterémie 7,1 ng/ml (2,0-23,3), kandidémie 4,7 ng/ml (1,9-13,7) nebyl rozdíl v hodnotách CRP a leukocytů nejvyšší koncentrace PCT měli pacienti s urogenitální a abdominální infekcí

21 retrospektivní analýza 01/ /2016 přínos PCT pro rozlišení bakteriální a kandidové hematogenní infekce 3 JIP universitní nemocnice ve Florencii celkem 64 případů kandidémie (CA 61 %, CP 23 %, CG 12 %, CT 3%, CK 2%) a 128 případů bakteriální sepse (G- 55 %, G+41 %, 7 % polymikr.) průměr PCT byl výrazně nižší u kandidémií (3,37+10,10 ng/ml vs. 18,14+38,23 ng/ml) negativní prediktivní hodnota PCT > 2,5 ng/ml byla 98 % kandidémie hlavně u pacientů těžce nemocných, nízký BMI, malnutrice, prolongovaná hospitalizace, atb, kortikoidy imunoalterace nízké PCT? Závěr: pacienti v septickém stavu s PCT <2,5 ng/ml jsou v riziku kandidové infekce Doporučení : PCT kombinovat s biologickými markery (beta-d- glukan, mannan) zásadní pro zvládnutí kandidové sepse je včasné nasazení adekvátní terapie

22 kombinace stanovení beta-d-glukanu (BDG) a prokalcitoninu (PCT) k rozlišení původu sepse BDG je specifický marker pro detekci invazivní fungální infekce, může však být falešně pozitivní právě u pacientů s bakteriální infekcí krevního řečiště PCT je zvýšený u bakteriálních infekcí, u kandidémií však zůstávají jeho hodnoty nízké, nebo se zvyšují pomaleji 166 pacientů na JIP (73 prokázaná kandidémie a 93 prokázaná bakteriémie) autoři sledovali hodnoty BDG a PCT samostatně a v kombinaci za výchozí byly považovány hodnoty při kandidemii: BDG>80 pg/ml a PCT<2 ng/ml Závěr: při kombinaci obou markerů byla pozitivní prediktivní hodnota vyšetření výrazně vyšší (96 %) ve srovnání s BDG (79 %) nebo PCT (66 %) hodnocenými samostatně.

23 October 31, 2018 Presepsin (P-SEP) u fungálních infekcí 0/ /2017, 11 pacientů s fungémií měřen PCT, CRP, P-SEP, BDG od 1. pozitivního záchytu kandid v hemokultuře sledována korelace markerů s klinickým stavem P-SEP nejlépe odpovídal klinice, rychlý nástup, stoupá se závažností stavu, pokles při dobré odpovědi na léčbu CRP pozvolný nástup, PCT nízké hodnoty doporučení kombinovat nespecifické markery s BDG

24 Přínos imunologického vyšetření (CD64) při imunitní reakci proti mykotickým elementům má buněčná imunita výsadní postavení specifické protilátky nehrají zásadní roli, částečně brání adhezi houby a tvorbě hyf v počátečních fázích makrofágy reagují prostřednictvím lektinů s cukernými složkami povrchu hub, fagocytují a rozkládají mikromycety rozložené elementy předkládají T-lymfocytům a rozvíjí se buňkami zprostředkovaná imunita polymorfonukleáry (PMN) adherují na hyfy, které pro svoji velikost nemohly být fagocytovány a uvolňují cytotoxiny, které houby za přispění komplementu ničí CD64 je specifický receptor pro Fc fragment imunoglobulinů, exprimuje se na povrchu PMN po jejich aktivaci (díky zvýšenému působení zánětlivých cytokinů), zvyšuje schopnost PMN fagocytovat

25 CD64 diagnostika CD64 (na neutrofilech!) pomocí průtokové cytometrie v rámci vyšetření buněčné imunity hodnotí se procento aktivovaných neutrofilů (CD64/CD16) při daném index MFI (mean fluorescence index) nerozliší jednoznačně bakteriální a mykotickou infekci hodnotit společně s ostatními parametry buněčné imunity metaanalýza do 05/2014 senzitivita 76 %, specificita 85 % vysoce přínosné, hodnotit v kombinaci s ostatními výsledky metaanalýza do 06/2015 senzitivita 80 %, specificita 83 % vysoce přínosné, hodnotit v kombinaci s ostatními výsledky vysoká NPV!

26 Aspergilóza

27 ICU univ. nemocnice Hamburg, leden červenec 2014, 8952 pacientů, vyhledáváni pacienti v riziku IPA dle kritérií EORTC a dle klinických kritérií (Vandewoude, Blot) BAL byl vyšetřen kultivačně, na přítomnost GM, PCR, bylo provedeno CT a stanoven GM v séru do studie bylo zařazeno 85 pacientů, 43 mělo kultivační nález Aspergillus (PAC group), 42 jen pozitivní GM v BAL (OPG group) PCR bylo pozitivní pouze u 15 pacientů z PAC a 4 pacientů z OPG jen 16 pacientů mělo pozitivní GM v séru v kultivačně pozitivní skupině byl GM v BAL statisticky významně vyšší (průměr IP 5,9 x 1,7) léčeno bylo 63 pacientů (85 % z PAC, 60 % z OPG) celková mortalita v 28 dnu byla vyšší v OPG (32 % vs. 45 %) Při aplikaci EORTC kritérií byla prokázaná IA u 2 pacientů, pravděpodobná jen u 16, při aplikaci klinických kritérií 2 prokázaná, 67 domnělá. Autoři doporučují začlenit detekci GM v BAL do kritérií k identifikaci pacientů s IPA na ICU. Cut off IP >1 zvyšuje specificitu testu!

28

29 Mikroskopie, kultivace z DC (BAL, aspirát) Galaktomanan z BAL nízká senzitivita,vysoká specificita nutná interpretace v souvislosti s mikroskopickým nálezem (leukocyty, bakteriální flora ), klinikou a predispozicí (kolonizace, kontaminace) výhoda: izolace a identifikace původce, možnost stanovit MIC! vysoká senzitivita i specificita na JIP vyšší přínos než GM ze séra interpretace v souvislosti s klinikou a predispozicí hodnotí se dle indexu pozitivity (IP), sérum cut off > 0,5 cut off v BAL není jednoznačně stanoven Bassetti: cut off > 0,8; ECIL: cut > 1,0 PCR z BAL vysoká senzitivita, vysoká specificita nutná interpretace v souvislosti s klinikou a predispozicí (kolonizace, kontaminace) identifikace původce, možnost stanovit rezistenci

30 PCR Aspergillus White et al. CID 2015: metaanalýza studií GM od 2002, BDG od 2008, PCR PCR v BAL má srovnatelnou senzitivitu i specificitu s detekcí GM v BAL detekce PCR v séru má vyšší senzitivitu než detekce BDG i GM a nižší specificitu než detekce GM Závěr: PCR zařadit do EORTC kritérií! Dannaoui E. JCM 2017: real-time PCR kit pro detekci A. fumigatus a jeho rezistence k ATM soubor 157 vzorků (88 BAL, 69 sérum) vysoká senzitivita i specificita kitu v BAL (92,9 % a 90,1 %) i v séru (100 % a 84,6 %) detekuje zároveň rezistenci k ATM (mutace na cyp51 genu, TR 34 L98) senzitivita 100 % a specificita 84,6 %

31 Beta-D-Glukan ze séra patří mezi metody doporučené EORTC dobrá senzitivita i specificita vysoká negativní prediktivní hodnota nutná interpretace v souvislosti s klinikou, predispozicí a ostatními nálezy Beta-D-Glukan z BAL není standardizovaná metoda nízká senzitivita i specificita pro IA není zařazeno mezi EORTC kritéria Lateral flow vysoká specificita, dobrá senzitivita rychlá, jednoduchá, levná metoda ideální pro skíningové vyšetření není zařazeno mezi EORTC kritéria

32 Miceli 2015 Lateral Flow Assay imunochromatografický test test využívá k detekci monoklonální myší protilátku, která váže epitopy extracelulárního glykoproteinu uvolňujícího se z buněčné stěny aspergilů během jejich růstu vzniklý komplex je detekován na nitrocelulózové membráně jako proužek různé intenzity (slabý, střední, silný) do 10 až 15 minut zkřížená reakce byla pozorována pouze u rodu Penicillium metaanalýza Eigl et al. 2015: senzitivita 87 %, specificita 81 %, PPV 36 %, NPV 98 % v ČR již k dispozici

33 pacient ARO Č. Budějovice po těžkém úrazu způsobeném při kácení stromu BAL barveno Gramovým barvením, GM IP 8,7 kultivačně prokázán y BAL A. fumigatus

34 CRP a PCT u aspergilózy a mukormykózy 563 pacientů s AML a lymfoblastickou leukémií 77 pravděpodobná/prokázaná invazivní plicní aspergilóza 17 pravděpodobná/prokázaná plicní mukormykóza prokalcitonin, CRP a fibrinogen sledovány D-12 až D+12 od diagnózy fungální infekce hodnotu PCT > 1,5 ng/ml mělo alespoň 1x pouze 6,5 %, CRP >100 mg/l 80 %, fibrinogen >6 75 % CRP Fib PCT

35 pacienti po transplantaci plic jsou ve vysokém riziku invazivní aspergilózy (IA), pozitivní kultivační nález i průkaz GM v BAL pentraxin 3 (PTX3) je marker akutní fáze podobný CRP však může být pouze projevem kolonizace dýchacích cest syntéza PTX3 je vyvolána prozánětlivými cytokiny TNF-α autoři sledovali stanovení PTX3 v BAL jako marker k rozlišení nebo IL-1β a mikrobiálními složkami stěn kolonizace či infekce plic způsobené Aspergillus spp. PTX3 se podílí na obraně organizmu před mikroorganizmy analyzovali 322 vzorků BAL u 151 pacientů po transplantaci plic chrání organismus před rozvojem autoimunitních reakcí ( ), kdy jako invazivní plicní aspergilóza bylo uzavřeno odstraňováním vlastních apoptotických buněk 15 případů, u 17 pacientů byl prokázán galaktomanan v BAL bez fyziologický průběh obranných reakcí vyžaduje koordinovanou kultivační pozitivity Aspergillus spp., 38 případů bylo uzavřeno aktivitu PTX3 a TNFα, při poruše rovnováhy je organismus více jako kolonizace náchylný k fungálním infekcím nebo naopak k autoimunní reakci PTX3 v BAL byl signifikantně vyšší u pacientů s IA (medián plazmatické koncentrace PTX3 jsou zvýšené i u pulmonální 439,2 pg/ml) ve srovnání s kolonizovanými (medián 68,93 pg/ml) infekce a akutního poranění plic (Kuneš P. Čas Lék Čes 2005.) a pacienty s non-aspergillus diagnózou (medián 13,67 pg/ml)

36 Mukormykóza (zygomykóza) třída: Zygomycetes řád: Mucorales, Entomophthorales klinicky významné rody v ČR: Lichtheimia, Rhizopus, Mucor ubiquitární saprofyté, izolováni z půdy, vzduchu, z prostředí, potravin... některé druhy parazitují na rostlinách, hmyzu, savcích, člověku způsobují u člověka oportunní, často nosokomiální nákazy Brána vstupu: dýchací cesty - inhalace spor - ovzduší, příroda, vzduchotechnika.. perkutánní - traumata, popáleniny, injekce, katetry, bodnutí hmyzem zažívací trakt sporami kontaminované potraviny, léčiva, pomůcky... Klinické formy: rhinoorbitocerebrální (sinusitida, rhinoorbitální) kožní a podkožní (lokální, invaze) plicní (lokalizovaná, invaze) gastrointestinální diseminovaná Infect Dis Clin N Am 30 (2016)

37 Mukormykóza - rizikové skupiny déle trvající neutropenie hematologické malignity transplantace orgánové i kostní dřeně diabetes mellitus - ketoacidóza, hyperglykemie léčba steroidy, imunosupresivy léčba deferoxaminem malignity intravenózní uživatelé drog poškození kožní bariéry - popáleniny, traumata u dětí - nízká porodní váha, malnutrice

38 Literární review případů postraumatické mukormykózy 99 prokázaná, 23 pravděpodobná převládající původce v Evropě: Lichtheimia, Mucor, Rhizopus nejčastěji šlo o dopravní nehodu nebo úraz při domácích pracích (poškození tkáně + příroda) diseminace v 10 případech (2 imunosuprimovaní) diagnostika: 111 kultivační průkaz z rány léčba: 92 % chirurgické ošetření + ATM

39 Mukormykóza - diagnostika jen přímý průkaz mikroskopie, kultivace, PCR z infikované lokality! PCR z krve: Millon et al. CMI 2016: 194 vzorků séra od 44 pacientů (4,4/1 pac.) s pravděpodobnou a prokázanou mukormykózou 81% mělo alespoň 1 vzorek pozitivní

40 Mikroskopie, kultivace Foto MUDr.Fanta DEO ČB MUCOR RHIZOPUS LICHTHEIMIA

41 Děkuji za pozornost.