NMR biomakromolekul RCSB PDB. Progr. NMR

Transkript

1 NMR biomakromolekul Typy biomakromolekul a možnosti studia pomocí NMR proteiny a peptidy rozmanité složení, omezení jen velikostí molekul nukleové kyseliny (RNA, DNA) a oligonukleotidy omezení malou rozmanitostí chemického složení polysacharidy a oligosacharidy omezení malou rozmanitostí chemického složení kombinace výše uvedených RCSB PDB RCSB PDB Progr. NMR

2 NMR Proteinů Polymery α-aminokyselin, mnoho funkcí v organismu Katalytická - enzymy Strukturní a pohybové Signální Zásobní a transportní Obranné Pomocí NMR spektroskopie studujeme: Prostorové uspořádání Interakce s jinou molekulou Dynamika proteinu

3 Stavba a struktura proteinů Ala Asp Asn Arg Cys Glu Gln Gly is Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val Vznik peptidové vazby: + + Ala1 Ala2 Ala1 Ala2 2 O

4 Struktura proteinů U proteinů rozlišujeme čtyři pojmy: primární, sekundární, terciární a kvartérní struktura. Primární struktura udává pořadí aminokyselin v řetězci (sekvence). Píšeme vždy ve směru od N k C konci. Sekundární struktura udává konformaci hlavního řetězce v určitém úseku. Nejčastějšími prvky pravidelné sekundární struktury jsou helikální a extendovaná struktura, které jsou stabilizovány sítí vodíkových vazeb. helikální struktura (α-helix) extendovaná struktura (β-sheet) náhodné klubko (random coil) Terciární struktura je prostorové uspořádání všech atomů proteinu. Kvartérní struktura popisuje strukturu nadmolekulového uspořádání více proteinů.

5 Zdroje Proteinů Původní organismus + přirozená forma včetně všech modifikací - malé množství, drahé, nemožnost izotopového značení, etické problémy, složitá izolace,. Syntéza proteinu v mikroorganismech (E. coli, P. pastoris) + levné, velký výtěžek proteinu, snadné uniformní izotopové značení - možné problémy s modifikacemi postranních řetězců Chemická syntéza + velké možnosti izotopového značení, rychlé, vhodné pro toxické proteiny - drahé, menší výtěžky, omezení maximální velikosti, problémy se správným sbalením proteinu In-vitro translace + vhodné pro toxické proteiny, možnost selektivního izotopového značení - drahé, posttranslační modifikace

6 Využívaná jádra v biomakromolekulách 1 + vysoké přirozené zastoupení + vysoká citlivost (1,00) malá disperse chemických posunů (cca. 15 ppm) 13 C + velká disperse chemických posunů (cca. 210 ppm) nízké přirozené zastoupení (1,11 %) nízká citlivost (1, ); po 100% isotopovém obohacení 1, N střední disperse chemických posunů (cca. 30 ppm) nízké přirozené zastoupení (0,37 %) nízká citlivost (3, ); po 100% isotopovém obohacení 1, speciální účely

7 Specifika řešení struktury proteinů pomocí NMR měření ve fyziologickém prostředí, možnost úpravy fyzikálně-chemických vlastností prostředí sledování průběhu biochemických dějů vysoce selektivní odezva na úrovni atomů Čím jsme omezeni: velikost molekuly (ovlivnění T 2 ) do 10 kda ( 10 kg mol 1 ) [< 70 AA] lze řešit přímo kombinací COSY, TOCSY a NOESY experimentů do 20 kda [< 180 AA] nutné 100% isotopové obohacení 13 C a 15 N do ~100 kda 100% isotopové obohacení 13 C, 15 N a částečné nebo úplné obohacení 2 (odstranění 1 jako hlavního zdroje rychlé relaxace 13 C) větší proteiny přístupný pouze hrubý náhled na celkovou strukturu, sekundární struktura koncentrace vzorku alespoň 0,2 mm dlouhodobá stabilita vzorku několik týdnů

8 Vzorek proteinu pro NMR měření nutno dosáhnout koncentrace proteinu alespoň 0,2 0,5 mmol l 1 (obecně více = lépe) používá se filtrace přes membrány s mikropóry (protein zadržen) nebo lyofilizace a opětovné rozpuštění úprava p pufrem (p typicky 4 8) vyšší p by způsobilo rychlou výměnu amidických vodíků s molekulami vody a ztrátu signálů přidání redukčních činidel (R S) zabránění oxidace cysteinů a následného vysrážení vzorku přidání 5 10 % D 2 O referenční jádro pro spektrometr (lock) roztok vzorku µl

9 Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR příprava vzorku naměření NMR spekter přiřazení signálů atomům v molekule obecné informace o molekule (primární struktura, S S vazby,...) výpočet souboru počátečních struktur přiřazení NMR parametrů pro výpočet struktury vyhodnocení kvality struktur oprava přiřazení výpočet souboru struktur validace struktur

10 1. publikované NMR spektrum proteinu spektrum proteinu RNasy A, měřeno 40 Mz spektrometrem, Mz CW spektrometr Saunders M., Wishnia A. and Kirkwood J.G. (1957) J. Am. Chem. Soc. 79, 3289.

11 První 1Gz NMR spektrometr instalován firmou Bruker v Centre de RMN à Très auts Champs, Lyon, France 1 NMR spektrum proteinu měřené tímto spektrometrem

12 Nutný krok potlačení signálu vody jako rozpouštědlo se používá 2 O, ne D 2 O z těchto důvodů: jde o fysiologické prostředí při použití D 2 O by došlo k výměně amidických vodíků za deuterium tím pádem je nutné potlačit dominantní signál 2 O, protože její signál je krát intensivnější než signály měřené látky spektrum proteinu bez potlačení 2 O:

13 Potlačení signálu 2 O metoda presaturace selektivní CW-ozařování 2 O během relaxační periody Δ π/2 1 NMR spektrum proteinu po presaturaci vody zbytkový signál 2 O

14 Potlačení signálu 2 O metoda WATERGATE spinové echo s pulsními gradienty magnetického pole (π/2) π y 1 x Δ (π/2) -y (π/2) -y sel. sel. Δ G z zbytkový signál 2 O 1 NMR spektrum proteinu po WATERGATE excitační profil selektivního π/2 pulsu

15 Jednodimensionální 1 NMR spektrum proteinu charakteristické oblasti výskytu jednotlivých typů 1 signálů aminokyselin kuřecí lysozym (129 AA, M = 14,6 kda) C 3 N peptidické aromatické N postranní α alifatické N C R 1 AA1 O C R 2 N C C O AA2 N C R 3 AA3 O C 1 spinové systémy ( 3 J) jednotlivých aminokyselin jsou odděleny C=O skupinami 1D 1 spektrum tedy obsahuje superposice spekter jednotlivých aminokyselin v daném proteinu a k sekvenčnímu propojení a přiřazení signálů se používají všechna jádra: 1, 13 C a 15 N

16 Vícedimensionální NMR experimenty rozlišení informací obsažených v 1D spektrech korelace chemických posunů 1 13 C 15 N propojení spinových systémů jednotlivých aminokyselin pro dostatečnou citlivost experimentů je nutné použít isotopové obohacení

17 1-15 N SQC otisk palce proteinu ověření dobré terciární struktury proteinu, sledování lokálních strukturních změn, interakcí s jinými molekulami, sbalený protein rozložený protein 15N (ppm) 15N (ppm) 1 (ppm) 1 (ppm)

18 1-15 N SQC otisk palce proteinu Sledování skládání proteinu intrinsically disordered proteins Samotný peptid Peptid po 2 dnech po přídavku interakčního partnera 15N (ppm) 1 (ppm) 1 (ppm)

19 Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR příprava vzorku naměření NMR spekter přiřazení signálů atomům v molekule obecné informace o molekule (primární struktura, S S vazby,...) výpočet souboru počátečních struktur přiřazení NMR parametrů pro výpočet struktury vyhodnocení kvality struktur oprava přiřazení výpočet souboru struktur validace struktur

20 Interpretace NMR spekter přiřazení resonancí přiřazení NMR signálů jednotlivým atomům v molekule postup: 1.přiřazení hlavního řetězce ( N, N, α, C α, C O ) 2.přiřazení postranních řetězců (především 1 a 13 C) N N O C O β C α C β α označení jednotlivých atomů v aminokyselině Páteř proteinu postranní řetězce je nutné znát sekvenci aminokyselin daného proteinu

21 Přiřazení resonancí atomy hlavního řetězce pro přiřazení 1, 13 C a 15 N se používá soubor komplementárních třídimensionálních korelačních experimentů přenos magnetizace pomocí skalárních inerakcí ( 1 J, 2 J) základní experimenty (je mnoho dalších kombinací): C C N C C O C O C N NCA C C N C C O C O C N N(CO)CA C C N C C O C O C N CBCAN C C N C C O C O C N CBCA(CO)N modrá: jádra excitovaná i detekovaná zelená: jádra detekovaná vývojem magnetizace (chemického posunu) červená: jádra použitá pro přenos magnetizace, bez vývoje magnetizace

22 Přiřazení resonancí experimenty NCA a N(CO)CA 1 O 13 C β 15 N i C α 13 C' 1 13 C β 13 C γ N C γ C α 11 < 1 i C' N(CO)CA po excitaci i N je magnetizace je přenesena na N i ( 1 J N,N ), dále na C i 1 ( 1 J N,C ) a na C i 1 α ( 1 J C,Cα ) vývoj chemických posunů nastává pro N, N a C α každá N skupina dává jeden signál o frekvenci {ω( in ), ω(n i ), ω(c α i 1 )} O NCA po excitaci i N je magnetizace přenesena na N i ( 1 J N,N ) a dále současně na C i α ( 1 J N,Cα ) a C α i 1 ( 2 J N,Cα ) vývoj chemických posunů nastává pro N, N a C α každá N skupina dává dva signály o frekvencích {ω( i N ), ω(n i ), ω(c i α )} a {ω( i N ), ω(n i ), ω(c α i 1 )} 1 O 13 C β 15 N i C α 13 C' 1 13 C β 13 C γ N 1 13 C γ C α < 1 i C' O interakční konstanty J v z

23 Sekvenční propojení hlavního řetězce NCA a N(CO)CA 2D řezy spektry NCA a N(CO)CA v rovině C na frekvencích jednotlivých amidických N N(CO)CA NCA N(CO)CA NCA N(CO)CA NCA N(CO)CA NCA C N někdy chybí pík

24 Přiřazení signálů postranních řetězců různé implementace experimentů TOCSY a COSY C(CCO)N-TOCSY (C)C-COSY C γ O C β N C' C α C α N C' C β O C γ

25 Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR příprava vzorku naměření NMR spekter přiřazení signálů atomům v molekule obecné informace o molekule (primární struktura, S S vazby,...) výpočet souboru počátečních struktur přiřazení NMR parametrů pro výpočet struktury vyhodnocení kvality struktur oprava přiřazení výpočet souboru struktur validace struktur

26 Interpretace NMR spekter přiřazení strukturních parametrů NOE skalární interakční konstanta chemický posun residuální dipolární interakce vodíkové vazby meziatomová vzdálenost dihedrální úhel chemické okolí vzájemná orientace vazeb detailní lokální struktura

27 Nukleární Overhauserův efekt (NOE) přímá dipól-dipólová interakce mezi atomy I a S vlivem křížové relaxace rychlostní konstanta křížové relaxace mezi dvěma jádry 1, σ IS : γ... gyromagnetická konstanta 1 τ c... korelační čas molekuly ω... Larmorova frekvence r IS... vzdálenost interagujících jader dosah interakce do 5 6 Å NOE je hlavní zdroj informace o struktuře proteinu. Cílem je nalézt co největší počet NOE interakcí a jednoznačně je přiřadit dvojicím konkrétních vodíkových atomů v molekule. Pravidelné prvky sekundární struktury tvoří charakteristické sítě NOE kontaktů. Z NOE se nepočítají přesné vzdálenosti vodíků, ale rozdělí se do pásem podle intenzity. Např. (1,8 2,5) Å; (1,8 3,5) Å; (1,8 5) Å.

28 X-editované NOESY experimenty excitace pouze 1 atomů vázaných na atomy 15 N nebo 13 C, přenos magnetizace vlivem NOE na blízké atomy 1, detekce 1 řez 3D spektrem v rovině 1 N 1 na pozici 122 ppm v 15 N doméně = signál Tyr66 1 N

29

30 Skalární interakce zjištění dihedrálních úhlů peptidová vazba tvoří rovinu definovanou atomy O C α N N vzájemná orientace dvou sousedních peptidových vazeb, a tedy i konformace páteře proteinu je určena dihedrálními úhly φ a ψ φ (C N C α C ) a ψ (N C α C N) Karplusova rovnice závislost velikosti interakce 3 J na dihedrálním úhlu (θ) konstanty A a B zjištěny pro různé kombinace interagujících jader problém: jedné hodnotě 3 J mohou odpovídat až čtyři hodnoty dihedrálního úhlu 3 J 10 8 N C α N C α CO N C α C β N C ' 6 4 C 2 N C ' 0 [z] CO N C α θ [deg]

31 Chemický posun chemický posun některých jader je charakteristicky závislý na sekundární struktuře přiřazení resonancí hlavního řetězce ( α, C α a C') klesá α-helix chemický posun δ( α ) náhodné klubko roste β-sheet výpočet indexů chemického posunu (CSI) odhad sekundární struktury podle lokální hustoty CSI N istogram indexu chemického posunu jader α, C α a C' sekvence proteinu C helix I helix II helix III helix IV

32 Residuální dipolární interakce (RDC) přímá dipól dipólová interakce dvou jader v isotropním roztoku nedetekovatelná pozorovatelná v neisotropním prostředí u molekul částečně orientovaných vůči magnetickému poli tvorba neisotropního prostředí kapalné krystaly [fosfolipidy, PEG, proteiny (virové částice, bakteriorhodopsin)], zmáčknutý polyakrylamidový gel samotné vnější magnetické pole příspěvek ke skalární interakci snadná měřitelnost velikost interakce D IS závisí na orientaci vazby vůči směru B 0 fosfolipidové bicely orientované v magnetickém poli Θ I r IS S Θ...úhel mezi vektorem I S a B 0

33 Vodíkové vazby identifikace: výměnné experimenty D teplotní závislosti chemických posunů charakterizace: měření skalární interakce (J) přes -vazbu stabilizace pravidelných sekundárních struktur vodíkovými vazbami

34 Obecný postup řešení struktury proteinu pomocí NMR příprava vzorku naměření NMR spekter přiřazení signálů atomům v molekule obecné informace o molekule (primární struktura, S S vazby,...) výpočet souboru počátečních struktur přiřazení NMR parametrů pro výpočet struktury vyhodnocení kvality struktur oprava přiřazení výpočet souboru struktur validace struktur

35 Přiřazení resonancí a) páteř b) postranní řetězce Identifikace prvků sekundární struktury Strukturní omezení z NMR parametrů vzdálenosti z NOE kontaktů (intra- a interresiduální) dihedrální úhly ze skalárních interakčních konstant relativní orientace vazeb z dipolárních kaplingů případně další omezení Výpočet trojrozměrné struktury molekulová mechanika + simulované žíhání

36 Výpočet struktury proteinu Přímý výpočet energie všech možných konformací proteinu je příliš výpočetně náročný molekulová mechanika v prostoru kartézských souřadnic (Newtonovy pohybové rovnice) nebo torsních úhlů (Lagrangeovy rovnice) energetická plocha v závislosti na dvou dihedrálních úhlech v disacharidu V případě proteinu se jedná o plochu závislou na n proměnných (n je počet optimalizovaných souřadnic/úhlů).

37 použití všech dostupných experimentálních omezení, minimalizace celkové energie systému simulované žíhání: molekula se ohřeje na vysokou teplotu (10 3 K) a nechá se postupně chladnout. Po každém ochlazení se vypočítá nová energie systému. Cílem je překonat lokální energetická minima a najít (nejlépe) to globální. přidáme nové energetické členy pro experimentální omezení: čím bližší bude shoda vypočítané struktury s experimentálními údaji, tím nižší bude celková energie Molekulová dynamika

38 Vypočítané struktury obdržíme soubor velice podobných struktur s minimálními energiemi Nejedná se o jedinou strukturu jako v případě rentgenové krystalografie, ale o soubor struktur. NOE omezení se totiž nezadává jako fixní vzdálenost, ale jako interval vzdálenosti. Souboru NOE tedy bude vyhovovat více struktur, které by se ovšem měly lišit jen nepatrně. Větší rozptyl struktur v určité oblasti může být způsoben nedostatkem experimentálních dat nebo zvýšenou pohyblivostí dané části proteinu. struktura matrixového proteinu Masonova-Pfizerova opičího viru soubor struktur RMSD = 1,3 Å (jen helikální oblasti) vybraná reprezentativní struktura

39 Interakce proteinu s ligandem Protein-protein, protein-nk, protein-malá molekula, oligomerace Interaguje specificky? Kde interaguje? Síla interakce (vhodné i pro slabší interakci) Farmaceutický průmysl Proteomické studie Metody pro měření interakce pomocí NMR Sledování změn chemických posunů Intermolekulární NOE Transferred NOESY Mapování -D chemické výměny N skupin Mapování pomocí paramagnetické látky Sledování změny dynamiky proteinu

40 Změny chemických posunů Titrace proteinu ligandem Sledování změn chemických posunů skupin (nejčastěji N ) Interakční povrch Disociační konstanta

41 STD Saturation transfer difference Interakce protein-malá molekula Ozáření proteinu a přenos magnetizace na ligand během interakce Přebytek ligandu Zjistíme, která část ligandu interaguje Odhad K D

42 STD-NMR princip protein ligand k off k on ligand 1 NMR (off-resonance) Lukáš Vrzal

43 Excitace on-resonance ligand k off k on ligand protein

44 Přenos magnetizace ligand k off k on ligand protein

45 Přenos magnetizace ligand k off k on ligand protein

46 Relaxace signálů proteinu protein k off k on ligand 1 NMR (off-resonance) on-resonance

47 on-resonance off-resonance STD-NMR (diferenční spektrum)

48 93% 100% 91% 73% 1 NMR STD-NMR (difference spectrum)

49 STD Saturation transfer difference

50 Intermolekulární NOE NOE efekt mezi dvěma molekulami U složitějších systémů vhodné odfiltrovat intermolekulární NOE Rozdílné izotopové značení 13 C filtrované 13 C editované NOESY

51 Studium dynamického chování molekul molekuly nejsou statické, pohybují se v různých časových škálách různě rychlé pohyby se vzájemně doplňují funkce mnoha biomolekul závisí na jejich flexibilitě regulace dějů, interakce molekul, oligomerizace vypočítaná struktura je někdy průměrem více konformerů možnost charakterizace časové škály pohybů různé relaxační mechanismy postihují různé časové škály molekulárních pohybů lokální pohyby globální pohyby příklady jevů pohyb N rotace C 3 pohyb smyček pohyb domén transport, katalýza, další biologické děje... ps ns μs ms s > s relaxace R 1, R 2, het. NOE relaxace R 1ρ, CPMG metody studia analýza tvaru signálu saturation transfer, NOESY výměna /D

52 Analýza směsí, kvantitativní NMR spektroskopie a využití NMR spektroskopie ve forenzní analýze

53 Analýza směsí a kvantitativní NMR NMR spektrum čisté látky je lineární kombinací spekter jejích jednotlivých atomových skupin navíc pozorujeme vzájemné interakce atomů/skupin NMR spektrum směsi látek je lineární kombinací spekter jednotlivých látek integrální intenzity NMR signálů ve spektru jsou přímo úměrné zastoupení jednotlivých měřených entit u čisté látky integrály odpovídají počtu ekvivalentních jader ve skupině u směsi integrály odpovídají molárnímu zastoupení složek Absolutní plocha píku v NMR spektroskopii je závislá na mnoha faktorech, není tedy možné měřit koncentraci absolutně

54 Požadavky na měření spekter pro kvantitativní NMR (qnmr) integrální intenzita NMR signálu, S k c B 90 T konstanta přístroje koncentrace vzorku (měřených jader) délka π/2-pulsu teplota d 1 90 y akvizice úplná relaxace všech spinů před začátkem měření (čekací perioda d 1 = 5 10x T 1 ) 90 y stejnoměrná excitace celého spektra (dostatečně tvrdé pulsy, dobrá kalibrace π/2-pulsů) 13 C d 1 akvizice zamezení změn intenzit signálů vlivem interakcí (DD-interakce NOE, J-interakce); dekapling může být použit jen po dobu akvizice, jinak vypnutý 1 ozařování dekapling dostatečný počet naměřených bodů (u starších přístrojů) počet bodů dostatečný poměr signál/šum konstantní objem vzorku (nejlépe využití celé délky excitační a měřící cívky)

55 Zpracování a vyhodnocení spekter pečlivé zpracování spekter (korekce fáze), výběr integrovaných signálů a integračních mezí hlavní slabina kvantitativní NMR (lidský faktor), lze zlepšit praxí pokud možno, volit dostatečně široké integrační meze překryv signálů dekonvoluce integrace celé skupiny signálů

56 Zpracování a vyhodnocení spekter při porovnávání integrálních intenzit je nutné uvažovat počty jader přispívajících k signálu koncentrační standardy bez přidaného standardu o poměr intenzit signálů dvou látek měřených ve směsi odpovídá poměru jejich koncentrací o zjištění relativního zastoupení složek vnější standard o zatavená kapilára s referenční látkou vnitřní standard o referenční látka je rozpuštěna spolu se vzorkem lze dosáhnout přesnosti stanovení přibližně 1 % (v oblasti 5 20 mm)

57 Analýza směsí na základě rozdílné pohyblivosti složek Velké překryvy spekter měřených látek, přímé měření difuzního koeficientu molekuly v roztoku vykonávají rotační a translační pohyb translační pohyb (volná difuse) charakterizován difusním koeficientem, D Stokesova-Einsteinova rovnice k Boltzmannova konstanta T termodynamická teplota η visozita rozpouštědla R hydrodynamický poloměr molekuly platí pro kulové částice (molekuly), lze ale využít pro odhad velikosti částic obecně nepřímá úměra mezi velikostí (hmotností) molekuly a jejím difusním koeficientem vliv velikosti difusního koeficientu (= velikosti) molekuly na intenzitu jejího NMR signálu lze sledovat po aplikaci gradientů magnetického pole metoda spinového echa s pulsními gradienty magnetického pole (PGSE, pulse gradient spin echo) aplikace rozlišení molekul ve směsi oligomerizace molekul (proteiny) výpočet translačního difusního koeficientu

58 Spinové echo s pulsními gradienty excitace 90 y magnetického pole, PGSE kódování molekul podle pozice v ose z τ vývoj, volná difuse 180 y dekódování τ akvizice 1 g δ Δ δ z intenzita signálů: D 3 z D 2 D měření série spekter za různých intenzit g z koherentní magnetizace všech spinů B = B 0 + g z z ztráta koherence vlivem gradientu magnetického pole v ose z úbytek (kódované) magnetizace v jednotlivých z- vrstvách vlivem difuse 1D 3 > D 1 > D 2 obnovení koherence aplikací stejného gradientu po spinovém echu

59 Analýza naměřených spekter metoda DOSY Diffusion Ordered SpectroscopY, DOSY série PGSE spekter změřených s měnící se intenzitou gradientu g z pro každý bod spektra se vypočítá difusní koeficient a bod se zobrazí v pseudo-2d spektru na příslušné pozici D g z (ppm) (ppm) 7. 9 D (cm 2 s 1 ) Inverzní laplaceova transformace Carlos Cobas,

60 DOSY náhradní sladidlo Canderel Překryv signálů vede k jejich špatnému rozlišení podle difusního koeficientu. K rozlišení je nutné pokročilejší zpracování. M-A.Delsuc (2008) 23 rd NMR Valtice

61 LC-NMR propojení kapalinové chromatografie (PLC, GPC) a NMR spektroskopie Vzorek směsi je nanesen na LC, kde je rozdělen na vhodné stacionární fázi. Jednotlivé frakce jsou pak kapilárou vedeny z výstupu LC přímo do měřící sondy NMR spektrometru. speciální průtočná měřící sonda s malým aktivním objemem (60 μl), detekce μg množství látek Je nutné potlačit signál rozpouštědla. Případně se po optimalizaci pro daný vzorek dá použít deuterované rozpouštědlo. dvě možnosti měření spekter: během průtoku, nebo vždy po zastavení průtoku měří se 1 spektra (především), která se zaznamenají v pseudo-2d formě čas [min] 1 [ppm]

62 LC-NMR analýza oleje ze semínek černého rybízu kolona C8+C18; zapojení v serii; 0,5 ml/min C3CN CDCl3 90:10 (v/v); 1 28 min AQ = 1s; NS = 4; D1 = 0s k. stearová k. palmitová k. olejová Jan Sýkora, ÚCP, AV ČR, v.v.i. k. linolová k. γ-linolenová k. α-linolenová

63 Průmyslové aplikace obsah vody/oleje NMR relaxometrie Využívá výrazně odlišné doby relaxace/rychlosti difuze dvou látek ve směsi Není potřeba vysoké rozlišení stačí levný spektrometr s trvalým magnetem Použitelné na veškeré potraviny s vlhkostí pod 15% Odečítá se z kalibrační křivky (uložená v paměti přístroje, pro různé systémy různá) emulze olej ve vodě Relaxační čas T 2 volného oleje je mnohem kratší než T 2 volné vody. Metoda mnohonásobného spinového echa (CPMG), Po odečtení převažující dlouhorelaxující komponenty ( 2 O) se získá obsah oleje extrapolací křivky (b) do t = 0. Pro získání hmotnostního zlomku je ještě nutný kalibrační faktor. Relaxometr fi. Bruker

64 Průmyslové aplikace kvalita džusu současné sledování mnoha ukazatelů ověření země původu identifikace a kvantifikace viz SNIF-NMR cukrů (glukosa, fruktosa, sacharosa ) kyselin (citronová, jablečná ) indikátorů rozkladu (ethanol, k. fumarová, mléčná) způsobu zpracování phlorin (3,5-dihydroxyfenyl-β-Dglukopyranosid) obsažen v kůře, indikátor lisování celých pomerančů z x y

65 NMR spektroskopie jako nástroj forenzní analýzy Použití NMR spektroskopie ve forenzní analýze je limitováno nízkou citlivostí metody a finanční náročností nákupu a provozu NMR spektrometru (národní referenční laboratoře) lavní využití: Průkaz zakázané látky Návykové látky Často je nutné prokázat, že se jedná přesně o zakázanou látku (MS/IČ nestačí) Problém legálních drog (látky účinné, ale dosud nezakázané) Průkaz falšování potravin Ověření původu Přítomnost zakázané/jiné než deklarované látky

66 Průkaz zakázaných látek Použití NMR spektroskopie ve forenzní analýze je limitováno nízkou citlivostí metody a finanční náročností nákupu a provozu NMR spektrometru (národní referenční laboratoře) Prokázání přítomnosti látky Určení čistoty/nečistot, optické čistoty, zda se jedná o sůl Použití při vyšetřování původu látky Klasické experimenty 1, 13 C, vícerozměrné experimenty, posunová činidla Knihovny spekter známých látek

67 Fencyklidin

68 Specific site Natural Isotope Fractionation SNIF-NMR sledování rozdílného izotopického zastoupení na jednotlivých místech molekuly Izotopické rozdělení závisí na původu příslušné molekuly. Např. D/ vody v Nantes (Francie) je 150 ppm, v Antarktidě 89 ppm. Je rozdíl např. v odpařování 2 O a DO. V.SMOW = Vienna Standard Mean Ocean Water SNIF-NMR: určení poměru D/ odchylka isotopů (isotope deviation), δ alternativní metoda: hmotnostní spektrometrie (v praxi se tak měří zastoupení 13 C/ 12 C) použití: ověření pravosti a původu potravin Materiály a obrázky laskavě poskytli J. Mazáč a P. avelec z Celní laboratoře MF ČR.

69 Distribuce isotopů 13 C a 2 v přírodě

70 Specific site Natural Isotope Fractionation SNIF-NMR Metoda schválena pro (/D): Ovocné šťávy Obvykle před měřením jsou cukry fermentačně převedeny na ethanol Jediná metoda pro průkaz cukru z C3 nebo C4 rostlin Víno Vanilin Kyselina octová V kombinaci s 13 C/ 12 C je možné odlišit i cukry z C4 od CAM rostlin (falšování tequilly) Měření 2 D spektra a integrace jednotlivých píků vůči standardu Při zjišťování zastoupení 13 C/ 12 C integrace satelitů okolo signálů v 1 spektru Alternativa MS spektroskopie (hlavně 13 C/ 12 C), výhodnou NMR je zjištění poměrů v jednotlivých skupinách atomů - přesnější

71 Specific site Natural Isotope Fractionation SNIF-NMR Příklad 2 D spektra ethanolu Při zjišťování zastoupení 13 C/ 12 C integrace satelitů okolo signálů v 1 spektru