HYDRAGEL IEP PLUS. Ref /01

Transkript

1 HYDRAGEL IEP PLUS Ref /01

2 PŘEDPOKLÁDANÉ VYUŽITÍ Sada HYDRAGEL IEP PLUS je určena k detekci precipitačních protilátek na parazitické nebo plísňové antigeny (z rodů Candida a Aspergillus) nebo v důsledku vystavení ptačím antigenům v lidském séru pomocí imunoelektroforézy na agarózových gelech upravených alkalickým tlumivým roztokem (ph 8,7). Antigenní bílkoviny, které byly rozděleny elektroforézou, jsou imunofixovány protilátkami obsaženými v pacientově séru k analýze. Vysrážené bílkoviny jsou pak obarveny kyselou violetí a přebytečné barvivo je odstraněno kyselým roztokem. Poté je gel připraven k interpretaci a analýza je pouze kvalitativní. Sada HYDRAGEL IEP PLUS je určena pouze k laboratornímu použití. Každý agarózový gel v sadě HYDRAGEL IEP PLUS je určen k analýze šesti vzorků. Pro diagnostické použití In Vitro. PRINCIP TESTU Postup imunoelektroforézy podle Grabara a Williamse je založen na vizualizaci specifických bílkovin pomocí precipitačních proužků vzniklých reakcí antigenu s protilátkou, po oddělení těchto bílkovin pomocí elektroforézy. Když rozpustné antigeny přijdou do styku s protilátkami ve vhodném difúzním médiu, jako je agarózový gel, difundují k sobě, aby vytvořily viditelné precipitační proužky podél zóny rozhraní optimálních relativních koncentrací. Imunoelektroforéza se provádí ve čtyřech krocích : 1. Separace antigenních bílkovin elektroforézou na agarózovém gelu. 2. Imunoprecipitace bílkovin, které byly rozděleny elektroforézou : pacientova séra jsou aplikována do příslušných stop. Oddělené bílkoviny a protilátky (z pacientova séra) difundují do gelu. Protilátky se váží na odpovídající antigen a vytváří precipitační proužky. 3. Nespecifické nevysrážené, rozpustné bílkoviny jsou z gelu odstraněny odsáváním a vymýváním. Precipitovaný komplex antigen-protilátka zůstává zachycen v matrici gelu. 4. Vysrážené bílkoviny jsou vizualizovány barvením a jsou analyzovány pacientovy precipitační proužky. Tato imunoprecipitace vede k precipitačním proužkům, které jsou pro antigen specifické a umožní charakterizovat infekci. Tvar, pozice a délka proužku jsou pro každou antigenní bílkovinu charakteristické. Tento rychlý a citlivý postup umožňuje detekovat protilátky u pacienta, jehož sérum je specifický marker nemoci. REAGENTY A MATERIÁLY DODÁVANÉ V SADĚ HYDRAGEL IEP PLUS VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽKY KAT. č Agarózové gely (připravené k použití) 10 gelů Tris-barbitalový tlumivý roztok (zásobní roztok) 3 lahvičky, 75 ml každá Promývací roztok (zásobní roztok) 6 lahviček, 100 ml každá Barvivo kyselá violeť (zásobní roztok) 1 lahvička, 75 ml Odbarvovací roztok (zásobní roztok) 1 lahvička, 100 ml 7 jamkové proužky 1 balení po 10 kusech Proužky filtračních papírů 1 balení po 10 kusech 6 žlábkových masek 1 balení po 10 kusech Filtrační papíry - tenké 6 balení po 10 kusech v každém Filtrační papíry - silné 7 balení po 10 kusech v každém PRO OPTIMÁLNÍ VÝSLEDKY : Všechna činidla ze stejné sady musí být vždy používána společně a podle pokynů uvedených v příbalovém letáku. PROSÍME, ČTĚTE PEČLIVĚ PŘÍBALOVÝ LETÁK. VAROVÁNÍ : Nepoužívejte běžně prodávanou deionizovanou vodu, jako např. na žehlení. Používejte výhradně ultračistou vodu, jako je např. voda čistoty pro nástřik. 1. AGARÓZOVÉ GELY Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumivý roztok ph 8,7 ± 0,5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Nosné médium pro elektroforézu a imunoprecipitaci bílkovin. Gely skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech při pokojové teplotě (15 až 30 C) nebo v chladničce (2 až 8 C). Stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na balení gelu. (šipky na přední straně krabice musí směřovat nahoru). Neskladovat v blízkosti okna nebo tepelného zdroje. Zamezte prudkým změnám teploty při skladování. NEMRAZIT SEBIA NÁVOD - Czech

3 Nepoužívejte : (i) když se vytvoří krystaly nebo sraženiny na povrchu gelu nebo jeho struktura změkne (oboje v důsledku zmrazení gelu), (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) nadměrné množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení tlumivého roztoku z gelu v důsledku nesprávného skladování). 2. TRIS-BARBITALOVÝ TLUMIVÝ ROZTOK Každá lahvička zásobního tlumivého roztoku se může zředit destilovanou nebo deionizovanou vodou až na 1 litr. Pracovní roztok po naředění obsahuje : tlumivý roztok ph 9,2 ± 0,5. Tlumivý roztok pro elektroforézu. HYDRAGEL IEP PLUS /01 Zásobní tlumivý roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Zásobní roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky tlumivého roztoku. Zředěný tlumivý roztok je stabilní jeden rok při skladování při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Zředěný tlumivý roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. 3. PROMÝVACÍ ROZTOK Každá lahvička zásobního promývacího roztoku se může zředit destilovanou nebo deionizovanou vodou až na 500 ml. Pracovní roztok po naředění obsahuje : tlumivý roztok s ph 9,0 ± 0,5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. POZNÁMKA : Promývací roztok může krystalizovat, aniž by to mělo nepříznivý vliv na jeho vlastnosti. Rekonstituce promývacího roztoku : - Vylijte lahvičku promývacího roztoku do nádoby pro rekonstituci. - Do lahvičky promývacího roztoku přidejte destilovanou nebo deionizovanou vodu a pečlivě ji zavřete. - Lahvičku pořádně promíchejte opakovaným převracení, aby se krystaly rozpustily. - Tento roztok nalijte do nádoby pro rekonstituci. - Objem doplňte destilovanou nebo deionizovanou vodou na 500 ml. - Uzavřete nádobu a promíchávejte roztok, dokud se v něm krystaly zcela nerozpustí. Promývací roztok je pak připraven k použití. K promývání gelů po imunoprecipitaci. Zásobní i pracovní promývací roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní promývací roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky promývací roztoku. Naředěný promývací roztok je stabilní 3 měsíce. Zředěný promývací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. 4. KYSELÁ VIOLEŤ Lahvička zásobní kyselé violeti může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 300 ml. Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok ph 2 ; kyselou violeť ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Barvení gelů s rozdělenými bílkovinami po elektroforéze. DŮLEŽITÉ : Barvicí roztok je určen k obarvení pouze 10 gelů. Roztok vyměňte po 10 použití k barvení. Zásobní i pracovní barvicí roztok skladujte v temnu při pokojové teplotě nebo v chladničce v těsně uzavřených nádobách tak, aby nedošlo k odpařování. Zásobní barvicí roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky barvicího roztoku. Pracovní barvicí roztok je stabilní 6 měsíců. 5. ODBARVOVACÍ ROZTOK Lahvička zásobního odbarvovacího roztoku může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 100 litrů. Praktické je připravit roztok zředěný 1 : 1000 z malého alikvotního množství zásobního roztoku, například zředěním 1 ml zásobního roztoku na 1 litr. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok ph 2. Roztok je určen k odstranění přebytečného barviva a odbarvení pozadí gelů. Zásobní odbarvovací roztok skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Zásobní roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky odbarvovacího roztoku. Zředěný odbarvovací roztok je stabilní jeden týden při skladování v uzavřené láhvi při pokojové teplotě. Zředěný odbarvovací roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se stane zakaleným v důsledku bakteriální kontaminace. Nepřidávat azid sodný. Pro zabránění mikrobiálního růstu ve zředěném odbarvovacím roztoku skladovaném déle než 1 týden lze přidat 5 µl/dl roztoku ProClin 300. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem ProClinu je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky

4 6. 7 JAMKOVÉ PROUŽKY Nařezané šablony k jednorázovému použití pro nanášení antigenu na gel. 7. PROUŽKY FILTRAčNÍCH PAPÍRŮ Absorpční proužky k jednorázovému použití pro odsátí přebytečného antigenu z jamek šablony po nanesení. Skladování Proužky filtračních papírů skladujte při pokojové teplotě na suchém místě ŽLÁBKOVÝCH MASEK Nařezané masky k jednorázovému použití pro nanášení vzorků séra na gel pro analýzu imunoprecipitací. 9. FILTRAčNÍ PAPÍRY - TENKÉ Absorpční vložky k jednorázovému použití pro odsátí přebytečné tekutiny z povrchu gelů před a po elektroforéze a nevysrážených bílkovin po imunoprecipitaci. Skladování Tenké filtrační papíry skladujte při pokojové teplotě na suchém místě. 10. FILTRAčNÍ PAPÍRY - SILNÉ Absorpční papírové vložky k jednorázovému použití pro imunoprecipitaci (k umístění do inkubačního boxu) a pro odsátí nevysrážené bílkoviny z gelu po imunoprecipitaci. Skladování Silné filtrační papíry skladujte při pokojové teplotě na suchém místě. POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ 1. FYZIOLOGICKÝ ROZTOK Připravte roztok 0,15 M (0,9 g/dl) NaCl, v destilované nebo deionizované vodě. K promývání gelů po imunoprecipitaci. Skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Zneškodněte po třech měsících, nebo pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. 2. ANTIGENY (PŘÍKLADY) Výsledky pro testy protilátek srážející sérum z pacientů s parazitálními a plísňovými infekcemi nebo vystaveným ptačím antigenům, které jsou uvedeny v části ÚDAJE O VÝKONU, byly získány s následujícími antigeny : - Ptačí alergeny, Microgen Bioproducts, ref. FSK 4. - Aspergillus, Microgen Bioproducts, ref. FSK 1. - Aspergillus fumigatus, antigeny : metabolické + somatické antigeny, Bio-Rad, ref Aspergillus, antigeny : A. flavus, A. nidulans, A. niger, A. terreus : metabolické antigeny, Bio-Rad, ref Candida albicans, antigeny : metabolický antigen + somatický antigen, Bio-Rad, ref Postup HYDRAGEL IEP PLUS lze také provádět se jinými antigeny, například : - Ascaris, antigeny z pohlavních orgánů, SR2B, ref. ASCGENIT. - Ascaris, antigeny z tělních tekutin, SR2B, ref. ASCOELO. - Antigen na distomatózu (antigen na motolici jaterní), Bio-Rad, ref Antigen na distomatózu, SR2B, ref Micropolyspora faeni, Microgen Bioproducts, ref. FSK 3. Každé laboratoři se doporučuje, aby si stanovila experimentální podmínky přizpůsobené pro každý analyzovaný antigen, zvláště co se týká koncentrace, podle specifikací poskytnutých výrobcem., použití a skladování Viz leták přiložený ke každému antigenu

5 3. KONTROLNÍ SÉRA (PŘÍKLADY) - Candida albicans, pozitivní kontrolní sérum, Bio-Rad, ref Aspergillus fumigatus, pozitivní kontrolní sérum, Bio-Rad, ref Aspergillus, pozitivní kontrolní séra : A. flavus, A. nidulans, A. niger, A. terreus, pozitivní kontrolní séra, Bio-Rad, ref , použití a skladování Viz leták přiložený ke každému kontrolnímu séru. HYDRAGEL IEP PLUS /01 POZNÁMKY : - Doporučuje se používat kontrolní séra pro specifikaci koncentrace antigenu pro použití při analýze. - Při manipulaci s biologickými vzorky humánního nebo zvířecího původu se doporučuje nosit ochranný pracovní oděv, rukavice a brýle. VOLITELNÝ REAGENT (NEOBSAŽENÉ V BALENÍ) VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. PEROXID VODÍKU : H 2 O 2, 10 objemů Těsně před použitím si připravte pracovní vyvolávací roztok : Nařeďte peroxid vodíků (10 objemů) 3krát destilovanou nebo deionizovanou vodou. Pro vizualizaci katalázové enzymatické aktivity na gelu. Bublinky okolo specifických precipitačních oblouků označují katalázové aktivity na gelech HYDRAGEL IEP PLUS používaných pro diagnózy aspergilóz ze séra např. pomocí imunoprecipitační reakce. Skladování Peroxid vodíku musí být uchováván v tmavé lahvi a v chladničce (2 až 8 C). Při dávkování vždy používejte čistou pipetu, abyste zabránili kontaminaci obsahu lahve. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda použitá pro rekonstituci roztoků musí být bez přítomnosti bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,22 µm) a musí mít odpor vyšší než 10 megaohmů na cm. VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ NEOBSAŽENÉ V BALENÍ 1. Zdroj napájení : MG 300 SEBIA, kat. č nebo MG 500 SEBIA, kat. č Elektroforetická komora : K20 SEBIA, PN 1400 (nebo elektroforetická komora BECKMAN). 3. Pipety : 5 µl a 200 µl. 4. Inkubátor - sušička pro sušení gelových desek IS 80 SEBIA, kat. č Sada příslušenství HYDRAGEL IEP PLUS SEBIA, PN nebo 6. Sada příslušenství HYDRAGEL K20 SEBIA, PN 1420 a inkubační boxy SEBIA, PN VZORKY PRO ANALÝZU Odběr a skladování vzorků Pro analýzu se doporučuje používat čerstvé vzorky séra. Odběr séra musí být v souladu se zavedenými postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. V případě potřeby je možné skladovat séra v chladničce (2 až 8 C) až po dobu jednoho týdne. Pro skladování na delší dobu vzorky zmrazte. Zmražené vzorky jsou stabilní nejméně jeden měsíc. vzorků Mohou být analyzovány čisté nebo koncentrované vzorky séra. V případě, že je elektroforézou zjištěna vysoká koncentrace protilátky, se doporučuje zředit vzorek fyziologickým roztokem, aby se zabránilo překrytí zón. POSTUP I. MIGRACE 1. Vybalte gel a položte jej na plochý povrch. 2. Tenkým filtračním papírem šetrně a rychle odsajte přebytečnou tekutinu z povrchu gelu. 3. Na povrch gelu umístěte proužek pro nanesení antigenu. Vyrovnejte dva vnější otvory proužku s místy v pozici č. 1 vytištěné na podkladu gelu. Vyvarujte se, aby se pod proužkem zachytily vzduchové bublinky. POZNÁMKA : Pro aplikace antigenů s migrací blíže katodě se doporučuje umístit proužek do pozice č. 2 vytištěné na podkladu gelu. 4. Do každého otvoru v proužku naneste 3 až 4 µl antigenu. 5. Nechte antigeny difundovat do gelu 15 minut. 6. Přebytečný antigen případně odsajte filtračním papírem a vyjměte proužek s antigenem. 7. Vložte gel do příslušné komory. Při používání komory SEBIA K20 (nebo komory BECKMAN) vkládejte HYDRAGEL na můstek tak, aby čelní strana gelu směrovala vzhůru. Tento můstek musí být mimo komoru, aby nedocházelo ke vnikání tlumivého roztoku na místa s antigenem. Potom opatrně vložte můstek do komory, antigeny by měly být na katodické straně. Gel je na každé straně ponořen přibližně 1 cm do tlumivého roztoku

6 Další informace jsou uvedeny v příbalovém letáku komory K20 (nebo komory BECKMAN). 8. Připojte komoru ke zdroji proudu. Podmínky migrace* SEBIA K20 Reakční komora BECKMAN Objem tlumivého roztoku v každé části 150 ml 45 ml Celkový objem tlumivého roztoku 300 ml 90 ml Doba migrace 28 minut 24 minut Konstantní napětí 100 V 100 V Počáteční proud (jeden gel) 12 ± 2 ma 14 ± 3 ma * pro antigeny na Aspergillus a Candidu. II. 9. Po migraci odpojte komoru a vyjměte gelovou desku. IMUNOPRECIPITACE 1. Položte gel na rovný povrch. 2. Odsajte přebytečnou kapalinu tak, že na povrch gelu rychle a rovnoměrně narolujete filtrační papír. 3. Naneste aplikační šablonu pro vzorky séra pro analýzu na gelu zarovnáním jejích místy na pozici č. 1 vytištěné na podkladu gelu a na krajích gelu. Vyvarujte se, aby se pod šablonou zachytily vzduchové bublinky a ověřte, že je povrch gelu zcela utěsněn. 4. Do každé stopy naneste 120 µl pacientova séra k analýze. 5. Inkubujte při pokojové teplotě 30 minut. 6. Tenkým filtračním papírem případně rychle odsajte přebytečné sérum. 7. Vyjměte šablonu a gel umístěte do inkubačního boxu na silný filtrační papír namočený v destilované nebo deionizované vodě. 8. Uzavřete inkubační box a inkubujte při pokojové teplotě 18 až 72 hodin. III. ODSTRANĚNÍ NEVYSRÁŽENÝCH BÍLKOVIN 1. Vyjměte gel z inkubačního boxu a umístěte jej do držáku gelu. 2. Omývejte gel ve svislé poloze v promývacím roztoku alespoň 1 hodinu. 3. Položte gel na rovný povrch. 4. Položte na gel jeden tenký filtrační papír. Přidejte další dvě vrstvy silného filtračního papíru a zatižte je závažím o hmotnosti 1 až 1,5 kg na dobu 20 minut. Ujistěte se, že je hmotnost závaží rovnoměrně rozdělena. Když se zpracovává několik gelů současně, mohou být pokládány na sebe. Umisťujte mezi ně filtrační papíry stejně, jako bylo popsáno výše. 5. Vyjměte filtrační papíry. Omývejte gel ve svislé poloze ve fyziologickém roztoku alespoň po dobu 20 minut. 6. Položte na gel jeden tenký filtrační papír. Přidejte další dvě vrstvy silného filtračního papíru a zatižte je závažím o hmotnosti 1 až 1,5 kg na dobu 20 minut. 7. Zopakujte předchozí kroky 5 a 6 (promývání gelu a odsávání). 8. Vyjměte filtrační papíry. Gel úplně dosušte v inkubátoru - sušičce při 50 C po dobu 5 minut pro kroky barvení a odbarvování (nebo při 37 C přibližně 20 minut pro vizualizaci katalázové aktivity, viz odstavec V VIZUALIZACE KATALÁZOVÉ AKTIVITY). POZNÁMKA : Dříve popsané kroky 4 až 7, barvení a promývání fyziologickým roztokem, lze zkrátit až na 10 minut. V takovém případě bude gel po barvení přítomen v lehce obarveném pozadí, ale nenaruší interpretaci výsledku. Pro odstranění nevysrážené bílkoviny, aby se získalo čiré pozadí gelu, se doporučuje dodržovat následující postup. IV. BARVENÍ A ODBARVOVÁNÍ 1. Po usušení ponořte usušený gel na 5 minut svisle do fyziologického roztoku. 2. Odbarvení proveďte ve třech po sobě následujících lázních s odbarvovacím roztokem, dokud není pozadí zcela bezbarvé a průhledné. 3. Promývejte gel 1 minutu destilovanou nebo deionizovanou vodou. 4. Odsajte přebytečnou tekutinu z povrchu gelu a sušte gel při 50 C proudem teplého vzduchu. Je-li třeba, očistěte zadní (podpůrnou část) vlhkým měkkým papírem. V. VIZUALIZACE KATALÁZOVÉ AKTIVITY (VOLITELNÁ) 1. Odstraňte nevysrážené bílkoviny, jak je popsáno v předchozím odstavci III (kroky 1 až 7). 2. Vyjměte filtrační papíry a gel dosušte v inkubátoru - sušičce při 37 C po dobu přibližně 20 minut. 3. Umístěte gel do inkubačního boxu. 4. Namočte gel do vizualizačního roztoku peroxidu vodíku při pokojové teplotě. Pozitivní reakce se projeví bublinkami okolo specifických precipitačních oblouků. 5. Gel usušte horkým vzduchem. POZNÁMKA : Po vizualizaci katalázové aktivity může být vysušený gel obarven podle protokolu barvení a odbarvování, který je popsán výše v odstavci IV. KONTROLA KVALITY Doporučuje se provádět na multivalentních pozitivních kontrolních antisérech obsahujících vhodné titry příslušných protilátek pro různé zkoušené antigeny. Ujistěte se, že jsou precipitační proužky vidět mezi pozitivní kontrolou a zkoušenými antigenovými přípravky

7 VÝSLEDKY VÝKLAD Sérodiagnostika parazitických nebo plísňových chorob nebo vystavení ptačím antigenům imunoprecipitací je založena na detekci specifických protilátek testovaným antigenům v pacientově séru. Precipitační protilátky na odpovídající antigeny umožní detekovat choroby. Jejich přítomnost indikuje vystavení a imunologickou odpověď na zkoušené antigeny. Interpretace se provádí vizuálním pozorováním nebo na světelné tabuli z počtu, tvaru, velikosti a poloze precipitačních proužků. Analýza je pouze kvalitativní. Když rozpustné antigeny přijdou do styku s protilátkami ve vhodném difúzním médiu, jako je agarózový gel při postupu HYDRAGEL IEP PLUS, difundují k sobě, aby vytvořily viditelné precipitační proužky podél zóny rozhraní optimálních relativních koncentrací. Přítomnost precipitačních proužků mezi pacientovým vzorkem a antigenem je indikátorem pozitivního výsledku, nepřítomnost proužku indikuje negativní výsledek. Mnoho precipitačních proužků indikuje přítomnost různých specifických protilátek v analyzovaném pacientově séru. K diagnostice infekce může být dostačující pouhý jediný precipitační proužek. Když sérum obsahuje velké množství protilátky, je precipitační proužek blíže k antigenu. Když je protilátky málo, je precipitační proužek blíže k pacientovu séru. Precipitační protilátky detekované postupem HYDRAGEL IEP PLUS vznikají jako součást imunitní odpovědi na vystavení testovaným antigenům, tyto protilátky jsou především třídy Ig G, ačkoliv také jiné třídy mohou mít precipitační funkci. V některých případech se objevují později během infekce a detekují se pouze po druhé analýze provedené po době, která závisí na antigenu. Počet pozorovaných precipitačních proužků je úměrný závažnosti klinického stavu a zvyšuje se s postupem onemocnění. Precipitační protilátky mohou vymizet po 2 až 3 letech, pokud se vystavení antigenům zastaví a reverzibilita klinických symptomů závisí na závažnosti a rozšíření onemocnění. Reakce antigen-protilátka, charakterizována imunoprecipitací, není pro diagnostikování onemocnění dostatečná a je nezbytné zvážit další klinická kritéria. Diagnóza může být stanovena pouze po klinických, radiologických a biologických výsledcích (např. mikrobiologie, histologie a sérologie). Konkrétní případ : V některých případech mohou mít precipitační proužky enzymatickou aktivitu, která se projeví specifickými reakcemi. Vizualizace katalázové aktivity na některých precipitačních proužcích poskytuje další důkaz specificity proužků v důsledku aspergilózy. Interference a omezení Vzhledem k omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy je možné, že některé protilátky na parazity nebudou touto metodou detekovány. Čas imunodifuze doporučovaný pro postup HYDRAGEL IEP PLUS je v rozmezí 18 až 72 hodin při pokojové teplotě. Prodloužení inkubační doby může vést k difúzi a zkreslení precipitačních proužků. Zkrácení inkubace neumožní optimální imunoprecipitaci. Detekce precipitačních proužků je přímo závislý na imunitním stavu pacientů a přítomnost nízkých úrovní precipitačních protilátek může prostě ukazovat minulé nebo současné vystavení antigenům bez jakéhokoli výskytu onemocnění. Detekce samotných precipitačních protilátek nepředstavuje diagnostikování aktivního onemocnění způsobeného zkoušenými antigeny. Je rovněž nutné analyzovat klinická data pacienta. Nepřítomnost precipitační protilátky nevylučuje existenci onemocnění způsobeného zkoušenými antigeny. Řešení problémů Pokud při dodržení veškerých pokynů pro přípravu a skladování materiálů a provedení testu uvedených v příbalovém letáku testy nevycházejí, kontaktujte technickou podporu svého dodavatele. Bezpečnostní datové listy sady reagentů a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA a obaly pro přepravu biologických vzorků jsou k dispozici na DVD s "NÁVODY A BEZPEČNOSTNÍMI DATOVÝMI LISTY. ÚDAJE O VÝKONU Pro údaje o výkonu postupu HYDRAGEL IEP PLUS se použily standardní materiály, příprava vzorku a postupy. Všechny elektroforegramy byly vyhodnoceny vizuálně. Výsledky získané kvalitativní analýzou elektroforetických typů a imunoprecipitace prokázala velmi dobrou shodu s gelem a mezi reprodukovatelností gelů (přesnost) postupu HYDRAGEL IEP PLUS pro všechny zkoušky, s metabolickými a somatickými antigeny z Candida albicans a Aspergillus fumigatus a ptačími antigeny připravenými z vzorků sér a holubích, kuřecích a andulčích výmětů. Po vizuální kontrole elektroforeogramů nebyly viditelné žádné rozdíly mezi opakováními. Reprodukovatelnost v rámci gelu Reprodukovatelnost v rámci gelu pro detekci protilátek byla předvedena na 3 různých vzorcích kontrolního séra (včetně 1 pozitivního séra na Candida albicans, 1 pozitivního séra na Aspergillus fumigatus a 1 pozitivního séra na ptačí antigeny) postupem HYDRAGEL IEP PLUS na gelech z téže šarže. Každý vzorek kontrolního séra byl analyzován podle své imunologické specificity včetně 6 nebo 12 analýz na gel na metabolické a somatické antigeny z Candida albicans a Aspergillus fumigatus a ptačí antigeny připravené ze vzorků sér a holubích, kuřecích a andulčích výmětů. Všechna opakovaná stanovení vedla ke shodným výsledkům v rámci stejného gelu a precipitační proužky odpovídaly typu každého testovaného vzorku. Specifické protilátky byly správně detekovány postupem HYDRAGEL IEP PLUS imunoprecipitací každého ze 3 analyzovaných vzorků a na každý gel. Mezi opakováními nebyly pozorovány žádné rozdíly. Reprodukovatelnost mezi gely Reprodukovatelnost mezi gely na detekci protilátek byla předvedena na 2 různých vzorcích kontrolního séra, včetně 1 pozitivního séra na ptačí antigeny a 1 pozitivního séra na Aspergillus fumigatus. Analýza byla provedena 9krát, respektive 2krát na gel. Tyto vzorky kontrolního séra byly analyzovány postupně 5x po sobě podle své imunologické specificity na gelech ze stejné šarže postupem HYDRAGEL IEP PLUS na ptačí antigeny připravené ze vzorků sér a holubích, kuřecích a andulčích výmětů a metabolických a somatických antigenů z Aspergillus fumigatus. Všechna opakovaná stanovení vedla ke shodným výsledkům mezi gely a precipitační proužky odpovídaly typu každého testovaného vzorku. Specifické protilátky byly správně detekovány postupem HYDRAGEL IEP PLUS imunoprecipitací každého ze 2 analyzovaných vzorků a na všech gelech. Mezi opakováními nebyly pozorovány žádné rozdíly

8 Přesnost Studie vnitřní shody POZNÁMKA : Vzorky séra analyzované v následující studii vnitřní shody poskytla biomedicínská laboratoř specializovaná na plísňovou a parazitologickou sérologii se sídlem ve Francii. Studie shody byla provedena na 34 různých vzorcích séra, včetně 3 normálních vzorků séra a 31 patologických vzorků séra, mezi postupem HYDRAGEL IEP PLUS a jiným komerčním referenčním imunoelektroforetickým postupem na agarózovém gelu určeném pro detekci precipitačních sérových protilátek u pacientů s parazitickými nebo plísňovými onemocněními nebo vystaveným ptačím antigenům. Zkoušená antigeny byly komerční antigeny. Tato studie předvedla perfektní korelaci mezi 2 analýzami pro detekci precipitačních sérových protilátek na parazitické, plísňové nebo ptačí antigeny se 100 % sensibilitou a 100 % specificitou postupu HYDRAGEL IEP PLUS ve srovnání s referenčním imunoelektroforetickým postupem na agarózovém gelu, vypočítanou pomocí doporučení techniky (Wendling, 1986). Výsledky jsou popsány v následující tabulce : Candida albicans 9 pozitivních vzorků úplná shoda Aspergillus fumigatus 12 pozitivních vzorků úplná shoda 2 negativní vzorky úplná shoda Ptačí antigeny 10 pozitivních vzorků úplná shoda 1 negativní vzorek úplná shoda Přesnost Studie vnější shody POZNÁMKA : Následující studie vnější shody provedena nemocniční laboratoří specializovanou na plísňová a parazitická onemocnění, která se nachází ve Francii. Studie shody byla provedena na 44 různých vzorcích séra, včetně 16 normálních vzorků séra a 28 patologických vzorků séra, analyzovaných na komerční antigeny na Candida albicans a Aspergillus fumigatus, mezi postupem HYDRAGEL IEP PLUS a jiným komerčním referenčním imunoelektroforetickým postupem na agarózovém gelu určeném pro detekci precipitačních sérových protilátek u pacientů s parazitickými nebo plísňovými onemocněními. Tato studie předvedla perfektní korelaci mezi 2 analýzami pro detekci precipitačních sérových protilátek na parazitické nebo plísňové antigeny se 100 % sensibilitou a 100 % specificitou postupu HYDRAGEL IEP PLUS ve srovnání s referenčním imunoelektroforetickým postupem na agarózovém gelu, vypočítanou pomocí doporučení techniky (Wendling, 1986). Výsledky jsou popsány v následující tabulce : 28 pozitivních vzorků úplná shoda Candida albicans 16 negativních vzorků úplná shoda Aspergillus fumigatus 44 negativních vzorků úplná shoda

9 BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. Aide-Mémoire de Parasitologie et de Pathologie Tropicale, P. Bourré, 3 ème édition, Médecine-sciences, Flammarion. 2. Andriamanantena D, Rey P, Perret JL, Klotz F. Distomatoses, EMC (Elsevier SAS Paris), Maladies infectieuses, A - 10, Axelsen NH, Bock E. Identification and quantitation of antigens and antibodies by means of quantitative immunoelectrophoresis. A survey of methods. J. Immunol. Methods Jan ; 1 (2) : Barboriak JJ, Sosman AJ, Reed CE. Serological studies in pigeon breeder s disease. J Lab Clin Med Apr ; 65 : Becq-Giraudon B, Roblot F, Le Moal G, Landron C. Fascioloses. Encycl. Med. Chir., Maladies infectieuses, B 514 A -10, 2003, 10 p. 6. Biguet J, Tran Vanky P, Fruit J, Andrieu S. Identification d une activité chymotrypsique au niveau de fractions remarquables de l extrait antigénique d Aspergillus fumigatus. Répercussion sur le diagnostic immunologique de l Aspergillose. Rev. Immunol., 1967, 31, Bronstein JA, Klotz F. Cestodoses larvaires. Encycl. Med. Chir., Maladies infectieuses, A - 12, 2005, 18 p. 8. Danuser B. Respiratory health risks in working with chickens, Pneumonologie, 2000 ; 54 : Debeaupuis JP, Sarfati J, Kobayashi H, Boucias D, Gumowski P, Beauvais A, Paris S, Monod M, Latgé JP, (1995) Antigens of Aspergillus fumigatus expressed during infection. Can. J. Bot. 73 : Debeaupuis JP, Sarfati J, Chazalet V, Latgé JP, (1997) Genetic diversity among clinical and environmental isolates of Aspergillus fumigatus. Infect. Immun. 65 : Drouhet E, Dupont B. Infections mycosiques et parasitaires au cours des traitements immunosuppresseurs. Pathol. Biol. (1976), 24, Drouhet E. Antigènes des Candida. Application à l étude de l immunité humorale et du diagnostic immunologique. Rev. Franc. Allergol. (1976) 16, No. 5, Drouhet E. Systemic candidosis and its immunology. Mykosen (1978), Suppl 1, Fink JN. Hypersensitivity pneumonitis. J Allergy Clin Immunol 1973 ; 52 : Frisk A. Serological aspects of candidosis. Current Therap. Research. (1977), 22, No. 1, Glickman LT, The epidemiology of human toxocariasis. In Toxocara and toxocariasis. J.W. Lewis et R.M. Maizels ed ; British Society for Parasitology, Londres, 1993, p Iranitalab M, Jarolim E, Rumpold H, Steiner R, Ebner H, Feldner H, Scheiner O, Kraft D. Characterization of Micropolyspora faeni antigens by human antibodies and immunoblot analysis. Allergy, Volume 44, Issue 5, Pages Munksgaard Jensen HE, Latgé JP, (1995) An analysis of antibodies against Aspergillus fumigatus in bovine serum by immunoblotting and enzyme-linked immunosorbent assays. APMIS 103 : Kobayashi M, Stahmann MA, Rankin J, Dickie HA. Antigens in moldy hay as the cause of farmer's lung. Proc Soc Exp Biol Med Jun ; 113 : Latgé JP (1999) Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clin. Microbiol. Rev. 12 : Latgé JP (2001) The pathobiology of Aspergillus fumigatus. Trends Microbiol. 9 (8) : Latgé JP (2003). Aspergillus fumigatus, a saprophytic pathogenic fungus. Mycologist 17, Longbottom JL. Immunological aspects of infection and allergy due to Aspergillus Species. Mukosen (1978), suppl 1, Makni F, Hachicha L, Maeddi F et al. Apport de la technique Western Blot dans le diagnostic d'hydatidose. Bull. Soc. Path. Exot., 2007, 100, Parasitologie-Mycologie, ANOFEL, 7 ème édition, Format Utile. 26. Peltre G. Électrophorèse, les trois principes de base. Technique et Biologie, 1990, 1, p. 16 à Pilly E, Maladies Infectieuses et Tropicales, APPIT, 18 ème édition, 2M2 éd. 28. Roberts RC. Fractionation and chemical characterization studies on Micropolyspora faeni antigens. Ann N Y Acad Sci ; 221 : Tekaia F, Latgé JP (2005) Aspergillus fumigatus: saprophyte or pathogen? Curr Opin Microbiol. 8 : Tomee JFC, Van der Wer TS, Latgé JP, Koeter, GH, Dubois AEJ, Kauffman HF (1995) Serologic monitoring of disease and treatment in a patient with pulmonary aspergilloma. Amer. J. Respir. Crit. Care. Med. 151 : Van Wijk RG, van Toorenbergen AW, Dieges PH. Nasal allergy to avian antigens. Clin Allergy 1987 ; 17 : Walbaum S, Vaucelle T, Biguet J. Analyse de l'extrait de Micropolyspora faeni par immunoélectrophorèse en double dimension. Localisation des activités chymotrypsiques. Pathol Biol (Paris) Apr ; 21 (4) : Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact-Internat, 1986 ; Sept :