SÉRODIAGNOSTIKA ASPERGILÓZY IMUNOPRECIPITAČNÍ REAKCÍ

ASPERGILLUS ANTIGENS Aspergillus antigens Aspergillus fumigatus antigens Aspergillus fumigatus positive control serum Aspergillus positive control sera 52942 52962 61681 61682 SÉRODIAGNOSTIKA ASPERGILÓZY IMUNOPRECIPITAČNÍ REAKCÍ

1- KLINICKÝ VÝZNAM Společnost Bio-Rad vyrábí různé aspergilové antigeny pro sérodiagnostiku aspergilózy imunoprecipitační reakcí. Diagnostika aspergilózy průkazem specifických protilátek v séru pacientů je často jednodušší než diagnóza přímou identifikací této plísně. 2- PRINCIP Antigeny společnosti Bio-Rad lze použít v různých imunoprecipitačních reakcích. Doporučovány jsou zejména tyto dvě techniky: IMUNOLELEKTROFORÉZA (IEP) PROTISMĚRNÁ ELEKTROFORÉZA (ES) Imunoprecipitační metody dále zvyšují přesnost diagnostického stanovení aspergilózy prostřednictvím identifikace specifických protilátek proti dvěma enzymům, chymotrypsinu a kataláze, které jsou přítomny v antigenních extraktech. Jejich enzymatická aktivita se projeví v precipitačních liniích. 3- BALENÍ Aspergillus fumigatus antigens, kód 52962 2 lahvičky s lyofilizovanými antigeny, které se rozpouštějí v 1 ml sterilní destilované vody (přibližně 10 reakcí). - Aspergillus fumigatus metabolický antigen - Aspergillus fumigatus somatický antigen Aspergillus antigens, kód 52942 4 lahvičky s lyofilizovanými antigeny, které se rozpouštějí v 1 ml sterilní destilované vody (přibližně 10 reakcí). - Aspergillus flavus metabolický antigen - Aspergillus nidulans metabolický antigen - Aspergillus niger metabolický antigen - Aspergillus terreus metabolický antigen Aspergillus fumigatus positive control, kód 61681 1 lahvička s lyofilizovaným králičím antisérem proti Aspergillus fumigatus, které se rozpouštějí v 1 ml sterilní destilované vody. Aspergillus positive control sera, kód 61682 4 lahvičky s lyofilizovaným králičím antisérem proti Aspergillu, které se rozpouštějí v 1 ml sterilní destilované vody. - Aspergillus flavus pozitivní kontrolní sérum - Aspergillus nidulans pozitivní kontrolní sérum

- Aspergillus niger pozitivní kontrolní sérum - Aspergillus terreus pozitivní kontrolní sérum 4- SLOŽENÍ Antigeny (dva typy): Metabolický antigen, získaný filtrací kultur po 10 dnech inkubace při 30 C. Somatický nebo celulární antigen získaný z mladých myceliových kultur (3 dny, beze spor), které se drtí a promíchávají při 30 C. 5- UCHOVÁVÁNÍ Reagencie v lyofilizované formě skladované na suchém místě při teplotě 2-8 C jsou stabilní až do data exspirace, uvedeného na soupravě. Po rozpuštění: reagencie mohou být skladovány několik měsíců při -20 C v rozdělených alikvotech. Vyhněte se opakovanému zamrazování a rozmrazování reagencií. 6- VZORKY 1. Testy se mohou provádět pouze se vzorky séra ze suchých zkumavek. 2. Dodržujte následující doporučení pro přípravu, uchovávání a zacházení se vzorky séra: - Při odběru vzorků séra dodržujte všechna běžná bezpečnostní opatření. - Před centrifugací nechte vzorky krve úplně srazit. - Udržujte zkumavky neustále uzavřené. - Po centrifugaci oddělte sérum a uchovávejte jej v důkladně uzavřené zkumavce. - Pokud budou vzorky vyšetřeny do 24 hodin, mohou být uchovávány při teplotě 2-8 C. Jestliže nebude vyšetření provedeno do 24 hodin nebo pro účely přepravy uchovávejte vzorky zamražené při teplotě minimálně -20 C. - Přednostně rozmrazujte vzorky pouze jednou. Zamražené vzorky je nutné po rozmražení před testováním důkladně promíchat. 3. Interference s vysokými hladinami albuminu, bilirubinu a hemoglobinu nebyla testována. 4. Vzorky nezahřívejte.

7- PRACOVNÍ POSTUP A) POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY Barbital sodný Kyselina chlorovodíková Destilovaná voda Barbital Glycin 0,05 M Tris pufr ph 7,0 Agaróza 30 % H2O2 N-acetyl-DL fenylalanin naftylester Dimethylformamid Diazoblue B B) IMUNOELEKTROFORÉZA (fotografie 1) Imunoelektroforéza (Grabar) může být prováděna na mikroskopických podložních sklíčkách. Připravte gel purifikovaného 1% agaru nebo agarózy s barbitalovým pufrem o ph 8,2 (přidejte merthiolát v ředění 1:10 000). Do gelu vyřízněte žlábek o délce 60 mm a šířce 2 mm a dva otvory o průměru 2 mm po každé straně žlábku ve vzdálenosti 4 mm (viz diagram). Naneste 20 µl neředěného antigenu do dvou postranních otvorů. Po dobu 90 minut aplikujte na konce sklíčka potenciál 5 V/cm. Do středního žlábku naneste sérum a nechte jej difundovat pro dobu 48 hodin ve vlhké atmosféře při teplotě okolí (18-30 C). Třetí den ponořte sklíčka na 24 hodin do promývacího roztoku. Vyhodnocení proveďte čtvrtý den. K vyhodnocení zvláště jemných linií precipitační reakce může být zapotřebí barvivo Coomassie Blue. C) PROTISMĚRNÁ ELEKTROFORÉZA (obr. 1) Protisměrná elektroforéza (Bussard) může být prováděna na agarózovém gelu nebo na acetátu celulózy. Jedná se o jednoduchou metodu, která je velmi citlivá a rychlá a je vhodná k vyšetření velkého počtu sér. Při použití agarózového gelu a mikroskopických podložních sklíček se vyříznou otvory podle uvedeného schématu: antigeny se nanášejí na straně katody (-), séra na straně anody (). Otvory o průměru 2 mm se oddělují mezerou o šířce 6 mm.

Naplňte otvory pro antigen čistým roztokem ředěným v poměru 1:2 a 1:4. Do otvorů pro sérum naneste 20 µl séra. Aplikujte potenciál 5 V/cm na dobu 90 minut. Reakce se zpravidla odečítá bezprostředně po migraci. Jestliže je nutno použít Coomassie blue, je nutné provést nejdříve dva po sobě jdoucí cykly promývání: ve fyziologickém séru (přes noc) a poté v destilované vodě (24 hodin), následovně sušení. Doporučuje se paralelně testovat pozitivní kontrolu pomocí stejného postupu jako pro testování antigenů. D) IDENTIFIKACE ENZYMATICKÉ AKTIVITY U NĚKTERÝCH PRECIPITAČNÍCH LINIÍ Linie nejčastěji pozorované po imunoelektroforéze se označují C a J (viz schéma) a indikují enzymatickou aktivitu (C: chymotrypsin a J: kataláza). Další důkazy o přítomnosti těchto enzymů poskytují specifické reakce (BIGUET et al.) (viz příloha). E) PŘÍPRAVA REAGENCIÍ 1) PUFRY - VERONALOVÝ PUFR ph 8,2 Barbital sodný 15,85 g HCl 1N 23 ml H2O ad 1 000 ml - BARBITAL SODNÝ BARBITAL TRIS GLYCINE (BBNa TG) ph 8,8 A. Barbital sodný 65 g Barbital 10,35 g H2O q.s.p. 5 000 ml B. Glycin 281 g Tris 226 g H2O ad 5 000 ml Po smísení stejných objemů roztoků A a B získáme pufr o ph 8,8 a osmolaritě 0,08. 2) 1% AGARÓZA (HMOTNOST/OBJEM) Agaróza H2O Přiveďte k varu a po ochlazení (přibližně na 60 C) Přidejte: Barbitalový pufr ph 8,2 nebo Pufr BBNa TG ph 8,8 (naředěný na 50 % destilovanou vodou) 10 g 500 ml 500 ml 500 ml

3) KATALÁZA 30% H2O2 ředěný v 0,05 M TRIS pufru ph 7,0 (0,3 ml H2O2 50 ml pufru) na imunoelektroforetické agaróze. Pozitivní reakce: bublinky kolem dané linie. 4) CHYMOTRYPSIN - ROZTOK A N-acetyl-DL fenylalanin naftylester 5 mg Dimethylformamid 2 ml - ROZTOK B Diazoblue B 10 mg Tris pufr 0,05 M, ph 7,4 18 ml Před použitím smíchejte roztok A* a B*, inkubujte elektrosynersní membránu v této směsi po dobu 30 minut při 37 C. Vylijte směs, inkubujte přes noc při 37 C v 18 ml roztoku B. Promyjte membrány vodou. Pozitivní reakce: temně červené linie korespondují s chymotrypsinovou aktivitou.

F) SOUHRNNÁ TABULKA P.J. SVENDSEN MANUEL OF QUANTITATIVE IMMUNOELECTROPHORESIS, FURLAGET UNIVERSITY, OSLO. VYDAVATEL: EXELSEN KROLL-WEEXE. Analýza aspergilových antigenů (tabulka). Imunoelektroforéza Elektrosyneréza Fotografie 1 Pufry Napětí Trvání Barviva veronalový pufr ph 8,2 BBNa-TG pufr, ph = 8,8 veronalový pufr ph 8,2 5 V/cm 90 min 25 V/cm 60 min 5 V/cm 90 min Coomassie Blue 1 a 2: Antigeny S: Sérum pacienta Obr. 1 Sr: kontrolní sérum Kataláza Chymotrypsin Fotografie 2 Fotografie 3 BBNa-TG pufr, ph = 8,8 veronalový pufr ph 8,2 BBNa-TG pufr, ph = 8,8 veronalový pufr ph 8,2 BBNa-TG pufr, ph = 8,8 10 V/cm 60 min 5 V/cm 90 min 25 V/cm 60 min 5 V/cm 90 min 25 V/cm 60 min Coomassie Blue Ředěný H2O2*, Pozitivní reakce: bublinky kolem linie J Reagencie A* a B* Pozitivní reakce: temně červené zbarvení linie C * Viz kapitola 6 Pracovní postup (E- Příprava reagencií) 8- INTERPRETACE Přítomnost specifických precipitačních linií při použití imunoprecipitační metody pro stanovení aspergilového antigenu indikuje infekční aspergilózu. Vzhledem k větší rychlosti se protisměrná elektroforéza upřednostňuje před imunoelektroforézou jako screeningová metoda. Séra vyhodnocená jako pozitivní pomocí této techniky však musí být konfirmována pomocí imunoelektroforézy. Chymotrypsinová a katalázová enzymatická aktivita v daných precipitačních liniích poskytuje další důkaz o jejich specificitě. V případě bronchopulmonární nebo difúzní aspergilózy jsou testy pozitivní v 80-90 % případů, a obecně jsou pozorovatelné specifické precipitační linie. V případě aspergilomu jsou reakce vysoce pozitivní: zpravidla lze pozorovat 5 až 10 linií a C linii.

U alergické bronchitidy vyvolané aspergilem je reakce pozitivní v 50 % případů. Precipitující protilátky se objevují v pozdní fázi infekce: v určitých případech jsou detekovány během druhého vyšetření, tj. jeden měsíc po prvním vyšetření. 9- ÚČINNOST/KONTROLA KVALITY A) PRŮKAZ PRECIPITAČNÍCH LINIÍ Účinnost aspergilových antigenů je kontrolována pomocí pozitivních kontrolních sér obsahujících protilátky proti aspergilu (anti-aspergillus králičí sérum, získané imunizací králíků standardizovanými antigeny A. fumigatus a standardizovanými metabolickými antigeny A. flavus, A. niger, A. nidulans a A. terreus). Průkaz precipitačních linií imunoelektroforézou (ph = 8,2) A. fumigatus somatický Ag A. fumigatus metabolický Ag Pozitivní kontrolní sérum Anti- A. fumigatus Anti- A. flavus Anti- A. nidulans Anti- A. niger Anti- A. terreus 4-8 linií 3-5 linií A. flavus metabolický Ag - - - - - - - - - 3-5 linií A. nidulans metabolický Ag - - - - - 3-5 linií A. niger metabolický Ag - - - - - 3-5 linií A. terreus metabolický Ag - - - - - 3-5 linií

B) PRŮKAZ ENZYMATICKÉ AKTIVITY PRECIPITAČNÍCH LINIÍ Imunoelektroforéza (ph = 8,2) Protisměrná elektroforéza (ph = 8,2) Průkaz katalázové enzymatické aktivity po přidání H2O2: bublinky v okolí J linie dokazují katalázovou aktivitu Průkaz chymotrypsinové enzymatické aktivity po inkubaci s reagenciemi A a B: temně červené zbarvené C linie dokazují chymotrypsinovou aktivitu 10- KONTROLA KVALITY PROVÁDĚNÁ VÝROBCEM Všechny vyráběné reagencie jsou připravovány podle našeho systému jakosti, počínaje převzetím surovin až po finální komercionalizaci výrobku. Každá šarže je podrobena kontrole kvality a je propouštěna na trh pouze tehdy, pokud odpovídá stanoveným kritériím. Dokumentace týkající se výroby a kontroly každé jednotlivé šarže je uchovávána u firmy Bio-Rad. 11- OMEZENÍ TESTU Při diagnostice aspergilózy je nutné posoudit všechny klinické, radiologické a biologické (mikrobiologické, histologické a sérologické) aspekty, každý z těchto prvků hodnocený samostatně je nutno interpretovat s opatrností.

12- RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. BIGUET J.; TRAN VANKY P.; FRUIT J. ; ANDRIEU S. : Identification d une activité chymotrypsique au niveau de fractions remarquables de l extrait antigénique d Aspergillus fumigatus. Répercussion sur le diagnostic immunologique de l Aspergillose. REV. IMMUNOL. (1967) 31, pp. 317-328. 2. DROUHET E.; CAMEY L. ; SEGRETAIN G. : Valeur de l immunoprécipitation et de l immunofluorescence indirecte dans les Aspergilloses bronchopulmonaires. ANN. INST. PASTEUR (1972) 123, pp. 379-395. 3. DROUHET E. ; DUPONT B. : Infections mycosiques et parasitaires au cours des traitements immunosuppresseurs. PATHOL. BIOL. (1976) 24, pp. 99-116. 4. LONGBOTTOM J.L. : Immunological aspects of infection and allergy due to Aspergillus Species. MUKOSEN (1978), supp. 1 pp. 207-217. 5. SEGRETAIN G.; DROUHET ; MARIAT F.; Diagnostic de laboratoire en mycologie médicale (1979, 4e édition), MALOINE Edt. PARIS 150 pages. 20

- CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) - EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) - CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) IVD - For in vitro diagnostic use - Catalogue number - Pour diagnostic in vitro REF - Référence catalogue - Para diagnóstico in vitro - Número de catálogo - In vitro-diagnostikum - Bestellnummer - Per uso diagnostico in vitro - Numero di catalogo - Para uso em diagnóstico in vitro - Número de catálogo - In vitro diagnostik - Katalognummer - In vitro diagnose - Katalognummer - Manufacturer EC REP - Authorised Representative - Fabricant - Représentant agréé - Fabricante - Representante autorizado - Hersteller - Bevollmächtigter - Produttore - Distributore autorizzato - Fabricante - Representante Autorizado - Tillverkad av - Auktoriserad representant - Fremstillet af - Autoriseret repræsentant LOT - Batch code - Expiry date YYYY/MM/DD - Code du lot - Date de peremption AAAA/MM/JJ - Código de lote - Estable hasta AAAA/MM/DD - Chargen-Bezeichnung - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT - Codice del lotto - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG - Código do lote - Data de expiração AAAA/MM/DD - Batch nr. - Utgångsdatum År/Månad/Dag - Batchkoden - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD - Storage temperature limitation - Consult Instruction for use - Limites de températures de stockage - Consulter le mode d'emploi - Temperatura limite - Consulte la instrucción para el uso - Lagerungstemperatur - Siehe Gebrauchsanweisung - Limiti di temperatura di conservazione - Consultare le istruzioni per uso - Limites de temperatura de armazenamento - Consulte o folheto informativo - Temperaturbegränsning - Se instruktionsanvisning vid användning - Temperaturbegrænsning - Se instruktion før brug 82

The other languages which are required in conformity to the European Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent. Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponibles auprès de votre représentant Bio-Rad local. Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la Directiva Europea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad. Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVD Direktive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-Rad Niederlassung. Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europee possono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad. As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a Directiva Europeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próxima de si. Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från din lokala Bio-Rad-representant. De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås ved henvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : 33 (0) 1 47 95 60 00 11/2003 Fax.: 33 (0) 1 47 41 91 33 code: 880011 83