LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ Aplikace pokročilých metod pro zpracování dat v FTIR spektrometrii (metoda: infračervená spektrometrie s Fourierovou transformací) Garant úlohy: prof. Dr. Ing. Jan Poustka
OBSAH 1. Náplň úlohy... 3 3. Automatická interpretace spekter... 4 4. Využití funkce dekonvoluce... 6 5. Demonstrace vlivu volby absorpčních pásů na vytvoření charakteristických skupin vzorků využitím statistického softwaru TQ Analyst... 8 2
1. Náplň úlohy a) Opakování základního zpracování naměřených infračervených spekter technikou ATR pro různé typy vzorků. b) Interpretace spekter jednotlivých vzorků identifikace charakteristických funkčních skupin. Aplikace automatické interpretace a dekonvoluce. c) Vytvoření kalibračního modelu pomocí statistického softwaru TQ Analyst, volba spektrálních pásů s ohledem na odlišování vzorků do skupin. 2. Interpretace spekter a jejich další zpracování Úkolem je pro vybrané vzorky určit (odhadnout) jaké obsahují funkční skupiny. Cílem je rozpoznat základní skelet a příslušné funkční skupiny Při interpretaci se aplikují charakteristické vlnočty vibrací funkčních skupin a modelová spektra základních komponent potravin. Začínáme s nejvýraznějšími absorpčními pásy. Je třeba upozornit, že se nesnažíme za každou cenu přiřadit všechny pásy ve spektru. Především v oblasti fingerprintu (cca pod 1300 cm 1 ) nalezneme pásy, které nelze přiřadit dílčím funkčním skupinám, ale jsou charakteristické pro molekulu jako celek. Významnou pomocí jsou v softwaru zabudované funkce automatická interpretace a dekonvoluce. Další podstatnou roli hraje statistické zpracování naměřených spekter, pomocí kterého můžeme rozlišovat vzorky do skupin. Pro tuto aplikaci můžeme využívat spektra v celém rozsahu nebo volit vybrané segmenty a zvýšit tak možnost odlišení vzorků podle charakteristického složení. 3
3. Automatická interpretace spekter V softwaru OMNIC si otevřeme spektrum, u kterého by měly být identifikované jednotlivé absorpční pásy, přes záložku File a příkaz Open, kde si v dané složce najdeme požadované spektrum. Dále v záložce Analyze zvolíme IR Spectral Interpretation, tedy funkci automatické identifikace absorpčních pásů. 4
Výsledkem použití funkce automatické interpretace je infračervené spektrum, které zobrazuje závislost transmitance na vlnočtu. Software automaticky identifikoval jednotlivé absorpční pásy a přiřadil jim návrh funkčních skupin, kterými v případě arganového oleje jsou uhlovodíkové řetězce a alkeny a dále estery octanů. 5
4. Využití funkce dekonvoluce Tato funkce slouží k identifikaci jednotlivých absorpčních pásů v oblasti překrývajících se absorpčních pásů a je vhodná pro lepší rozčlenění vzorků při použití statistického softwaru TQ Analyst. Před využitím této funkce je nutné si otevřít spektrum, na které ji chceme aplikovat, opět přes záložku File a příkaz Open. Funkci lze opět nalézt v softwaru OMNIC v záložce Process, příkaz Fourier Self-Deconvolution. 6
Výsledkem je tedy okno, na kterém je vidět jak původní spektrum, tak i spektrum s využitím funkce dekonvoluce označené jako FSD Trace. Po kliknutí na pravé horní tlačítko Add se denkonvoluované spektrum přidá do okna s původním spektrem a můžeme s ním zacházet jako s běžným spektrem, resp. ho uložit, smazat a atd. Dekonvoluované spektrum uložíme přes záložku File, příkaz Save as do nově vytvořené složky a uložíme pod původním názvem s rozdílem přidání podtržítka a FSD, např. arganový olej1_fsd. Danou funkci použijeme na všechna spektra, se kterými budeme dále pracovat. 7
5. Demonstrace vlivu volby absorpčních pásů na vytvoření charakteristických skupin vzorků využitím statistického softwaru TQ Analyst Software TQ Analyst je rozdělen do několika panelových nástrojů a vývojových listů. Použití tlačítka Calibrate bývá posledním úkonem první etapy vývoje kalibrační metody. Po kalibraci se červená kontrolka Uncalibrated na konci lišty panelu nástrojů změní na zelenou Calibrated. Po jakékoliv změně vyvinuté kalibrační metody je metodu nutné opět kalibrovat. 8
Začneme vývojem statistického modelu. Ve vývojovém listu Description musíme zvolit typ analýzy. Pro naše účely vybereme z kvalitativních metod Diskriminační analýzu Discriminant analysis. Ve vývojovém listu Pathlenght zaškrtneme možnost Constant, čímž říkáme softwaru, že vrstva oleje byla při měření vždy stejná, tedy konstantní. 9
V dalším vývojovém listu Classes si ve sloupci Class Name nadefinujeme jednotlivé třídy a do sloupce Abbrev. jejich zkratky. Dále ve vývojovém listu Standards budeme vkládat spektra, která nám poslouží ke kalibraci metody, pomocí tlačítka Open Standard. Po vložení standardů musíme ve sloupci Usage zvolit, že všechny budou využity pro kalibraci, poslední volný řádek budeme ignorovat, proto mu ve sloupci Usage dáme Ignore. Ve sloupci Class musíme jednotlivým standardům přiřadit názvy dřív, do které patří, resp. všem spektrům dýňového oleje přiřadíme třídu dýňový olej. 10
A dále musíme všechna spektra označit kliknutím na tlačítko Select v levém sloupci tabulky, abychom při následujícím kroku viděli všechna spektra najednou. Vývojový list Spectra nabízí několik možností úpravy spekter: odečítání spekter, vyhlazování spekter, změnu formátu spektra a korekci základní linie. Korekce lze provádět jak na spektrech kalibrační řady, tak na spektrech neznámého vzorku. Tlačítko View Standards pak umožňuje sledovat změny spekter po zadané úpravě. Ve většině běžných kalibrací není použití tohoto vývojového listu nutné a k úpravě spekter postačuje následující list Regions. Po kliknutí na list Regions vyskočí upozornění Suggest Regions, které stačí zavřít tlačítkem Cancel. Funkce Suggest automaticky vybírá oblasti spektra, kde je tato korelace největší a danou oblast, popř. oblasti označí a následně použije k vývoji dané kalibrační metody. Funkce Edit Regions pak umožňuje úpravu těchto automaticky vybraných oblastí spekter. Aktivací této funkce se otevře nové okno k manipulaci s naměřenými spektry a specifikaci jejich použití pro danou metodu Region Selection Task Window. Často se může stát, že automaticky vybrané oblasti spektra nejsou charakteristické pro měřenou látku, pak je nutné oblasti změnit posouváním jejich hranic v okně výběru regionu. 11
Právě tyto hranice určují, které části spektra budou, či nebudou zahrnuty do statistického modelu. Po výběru celého spektra klikneme na tlačítko Save a okno zavřeme vpravo nahoře šedým křížkem. Další vývojové listy nebudeme využívat a vytvořenou metodu si uložíme přes File, Save method as. 12
Po uložení klikneme na tlačítko Calibrate v horní liště a ukáže se nám 2D model, ve kterém vidíme rodělení vzorků do jednotlivých klastrů. Tento 2D model můžeme převést na 3D model přes záložku Diagnostic a příkaz Principal Component Scores 3D Display. V tomto modelu si lze v prostorovém uspořádání prohlédnout rozdělení vzorků. 13
Dalším krokem je opět vytvoření kalibračního modelu, ale pouze s určitými částmi spekter. Vytvoříme podle výše uvedeného postupu kalibrační model, rozdíl bude pouze v tom, že až se dostaneme na záložku Regions, tak vybereme pouze určitou oblast vlnočtů ve spektrech. Nejprve zvolíme oblast odpovídající rozsahu vlnočtů 3100 2700 cm -1, tedy oblast odpovídající charakteristickým vibracím nenasycených uhlovodíkových řetězců. A opět vytvoříme 3D model. V tomto případě došlo k lepšímu oddělení arganového, dýňového a mandlového oleje než v případě, že do statistiky bylo zahrnuté celé spektrum. 14
Dále budeme do kalibračního modelu zadávat pouze oblast odpovídající rozsahu vlnočtů 1850 400 cm -1, kdy právě v této oblasti jsou na první pohled patrné největší rozdíly mezi vzorky. Kdy je opět vidět, že vzorky nejsou oddělené jako v předchozích dvou případech. 15
Tyto kalibrační modely dále vytvoříme i pro spektra, na kterých byla použita funkce dekonvoluce, opět se zhodnotí vliv výběru části spektra na výsledek. 16