ELISA-VIDITEST anti-borrelia recombinant IgG + VlsE (CSF) OD-282/ 5ST Návod k použití soupravy VÝROBCE: VIDIA spol. s r.o., Nad Safinou II č. 365, Vestec, 252 42 Jesenice, tel.: +420 261 090 565, www.vidia.cz 1. NÁZEV SOUPRAVY: ELISA-VIDITEST anti-borrelia recombinant IgG + VlsE (CSF) enzymoimunoanalytická souprava III. generace s vysokou diagnostickou citlivostí a specifitou. 2. POUŽITÍ: Souprava je určena pro semikvantitativní a kvantitativní detekci specifických IgG protilátek proti antigenům hlavních patogenních kmenů borelie (B.afzelii, B.garinii a B.burgdorferi sensu stricto) v lidském séru nebo plazmě, mozkomíšním moku a synoviální tekutině, a pro stanovení intrathekální syntézy. Je jedním z nástrojů uplatňujících se při diagnostice lymeské boreliózy (LB). Diagnostika LB je založena na kombinaci klinického a laboratorního vyšetření. Protilátky IgG se tvoří od 6 týdne po infekci. Ve II. fázi onemocnění jejich hladina zpravidla stoupá, ve III. fázi onemocnění mohou dosahovat vysokých titrů, které mohou přetrvávat několik let. Některé symptomy LB mohou být podobné symptomům jiných nemocí, proto se stanovení protilátek proti boreliím uplatňuje i v rámci diferenciální diagnostiky neuroinfekcí, artropatií, karditid a kožních onemocnění. 3. PRINCIP TESTU: ELISA-VIDITEST anti-borrelia recombinant IgG + VlsE (CSF) je enzymoimunoanalytický test III. generace s vysokou diagnostickou citlivostí a specifitou. Na povrch jamek je navázána směs specifických antigenů. Jsou-li v testovaných vzorcích přítomny příslušné protilátky, navážou se na imobilizovanou směs antigenů. Navázané protilátky pak v dalším kroku reagují s protilátkami proti lidskému IgG značenými křenovou peroxidázou. Množství navázaných značených protilátek se stanoví barevnou enzymatickou reakcí. Negativní vzorky nereagují, mírná změna v zabarvení jamek je pozadím reakce. 4. OBSAH SOUPRAVY: ELISA odlamovací stripy v manipulačním rámečku, potažené směsí specifických antigenů STRIPS Ag 1 x 12 ks 1,3 ml Standardu A=negativní kontrolní sérum STA/CTRL-, r.t.u. 1),2) 1 lahvička 1,3 ml Standardu B ST B, r.t.u. 1 lahvička 1,3 ml Standardu C ST C, r.t.u. 1 lahvička 1,3 ml Standardu D=Standard 1 (kalibrátor) ST D/ST 1, r.t.u. 1 lahvička 1,3 ml Standardu E=Standard 2 (pozitivní kontrolní sérum) ST E/ST 2, r.t.u. 1 lahvička 13 ml protilátek proti lidskému IgG značených peroxidázou (Konjugát anti-igg Px) r.t.u. CONJ 1 lahvička 125 ml Promývacího roztoku 10x konc. WASH 10x 1 lahvička 100 ml Ředicího roztoku anti-borrelia rec. r.t.u. DIL 1 lahvička 13 ml Chromogensubstrátového roztoku TMB r.t.u. TMB 1 lahvička 13 ml Stop roztoku r.t.u. STOP 1 lahvička 1
Sáček se zipem Návod k použití soupravy Certifikát kontroly kvality 1) r.t.u., ready to use (v pracovní koncentraci) 2) koncentrace standardů jsou uvedeny v přiloženém certifikátu kvality pro danou šarži soupravy (AU/ml, arteficiální jednotky/ml) Ředicí roztok r.t.u. DIL pro Borrelia rec. je určen pouze pro soupravy ELISA-VIDITEST anti-borrelia recombinant a NENÍ VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÝ mezi ostatními soupravami ELISA-VIDITEST vyráběných firmou VIDIA spol. s r.o. Chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u. je zaměnitelný pouze mezi soupravami ELISA-VIDITEST, které obsahují TMB, a NENÍ VZÁJEMNĚ ZAMĚNITELNÝ s ostatními roztoky TMB použitými v jiných soupravách ELISA-VIDITEST TMB-O, TMB-BF. 5. POTŘEBNÝ MATERIÁL NEDODÁVANÝ SE SOUPRAVOU: Destilovaná/deionizovaná voda pro ředění promývacího roztoku, pipetovací zařízení, zařízení pro rozplňování roztoků a promývání stripů, spektrofotometr/kolorimetr pro mikrotitrační destičky s filtrem pro vlnovou délku 450 nm a referenčním filtrem 620-690 nm (není podmínkou). 6. PŘÍPRAVA REAGENCIÍ: a. Vytemperujte všechny složky soupravy na laboratorní teplotu. b. Těsně před vyšetřením důkladně zamíchejte vzorky vyšetřovaných sér, mozkomíšních moků, synoviální tekutiny a standardy. Testovaná séra řeďte ředicím roztokem 101x (např. 5 L séra + 500L ředicího roztoku). Mozkomíšní moky řeďte ředicím roztokem 2x (např. 75L mozkomíšního moku + 75 L ředicího roztoku). Synoviální tekutinu řeďte ředicím roztokem 81x (např. 5 L synoviální tekutiny + 400L ředicího roztoku). Kontrolní séra (standardy) neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u., ready to use). c. Připravte pracovní koncentraci promývacího roztoku jeho naředěním 10x ve vhodném objemu destilované/deionizované vody (např. 100 ml promývacího roztoku + 900 ml H 2 O). Pokud jsou v koncentrovaném roztoku krystaly soli, zahřejte ho na vodní lázni na +32 až +37 o C a před naředěním dobře promíchejte. Nespotřebovaný promývací roztok v pracovní koncentraci lze skladovat 1 týden při teplotě +2 až +10 o C. d. Konjugát anti-igg Px, chromogensubstrátový roztok TMB a stop roztok neřeďte, jsou v pracovní koncentraci (r.t.u.). 7. PRACOVNÍ POSTUP: a. Stripy, vakuově zatavené s desikantem, nechte před otevřením sáčku vytemperovat na laboratorní teplotu, aby nedošlo k orosení destičky. Připravte si potřebný počet stripů pro reakci. Nepoužité stripy společně s desikantem dobře uzavřete do sáčku se zipem nebo vakuově zatavte. b. Zvolte způsob, který chcete použít pro hodnocení testu (viz kap. 8) a podle něj aplikujte vzorky na destičku. Naplňte jamky po 100 L jednotlivých standardů a ředěných testovaných vzorků takto: První jamku naplňte samotným ředicím roztokem pro stanovení pozadí reakce DIL. Pro kvalitativní a semikvantitativní hodnocení naplňte dvě jamky Standardem D ST D/ST 1. Další jamku naplňte negativním kontrolním sérem ST A/CTRL-. Pro kontrolu je také vhodné aplikovat pozitivní kontrolní sérum ST E/ST 2. Pro kvantitativní hodnocení naplňte vždy po jedné jamce Standardem A-E (STA/CTRL-, ST B, ST C, ST D/ST 1, ST E/ST 2). Zbývající jamky naplňte ředěnými testovanými vzorky (Vz1 ). Každý vzorek stačí aplikovat na jednu jamku (Vz1, Vz2, Vz3, ). Viz také Schéma aplikace vzorků. Pokud chcete vyloučit případnou laboratorní chybu, vyšetřované vzorky a standardy aplikujte po dvou jamkách, v případě kvalitativního a semikvantitativního hodnocení aplikujte ST D/ST 1 na tři jamky. Inkubujte 60 minut (+/- 5 min.) při laboratorní teplotě. 2
c. Odsajte obsah jamek do pojistné sběrné láhve obsahující vhodný dezinfekční prostředek (viz Bezpečnostní předpisy). Jamky poté 4x promyjte 250 L promývacího roztoku. Vyvarujte se přetékání roztoku ven z jamek. Obsah jamek odsajte a destičku vyklepněte na přířez buničité vaty. d. Důkladně promíchejte lahvičku s konjugátem anti-igg Px r.t.u. CONJ a napipetujte do jamek po 100 L konjugátu anti-igg Px r.t.u. Inkubujte 60 minut ( 5 min.) při laboratorní teplotě. e. Tekutinu z jamek odsajte a promyjte je 4x 250 L promývacího roztoku. Odsajte a vyklepněte. f. Napipetujte do jamek po 100 L chromogensubstrátového roztoku TMB. Inkubujte 10 minut (+/- 30 sec.) při laboratorní teplotě. Dobu inkubace začněte měřit po napipetování 1. stripu destičky. Dodržujte toto pravidlo, vyvarujete se tak nedodržení časového intervalu. Pipetujte rychle v pravidelném rytmu, případně použijte vhodný dispenzor. Překryjte stripy alobalem, neprůhledným víčkem, nebo je po dobu reakce uložte na temné místo. g. Zastavte reakci přidáním 100 L stop roztoku STOP. Pipetujte ve stejném rytmu jako při rozplňování chromogensubstrátového roztoku TMB, aby enzymatická reakce probíhala ve všech jamkách po stejnou dobu. Zkontrolujte, zda nejsou v jamkách bubliny, pokud ano, jemným poklepem na rámeček destičky je odstraňte. h. Intenzitu barevné reakce změřte na spektrofotometru/kolorimetru při 450 nm nejpozději do 10 minut po zastavení reakce. Doporučujeme použít referenční filtr 620-690 nm. Schéma aplikace vzorků pro: Kvalitativní a semikvantitativní hodnocení 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a DIL Vz5 b ST D/ST 1 Vz c ST D/ST 1 d ST A/CTRLe Vz1 f Vz2 g Vz3 h Vz4 Kvantitativní hodnocení 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a DIL Vz3 b ST A/CTRL- Vz4 c ST B Vz5 d ST C Vz... e ST D/ST 1 f ST E/ST 2 g Vz1 h Vz2 8. HODNOCENÍ TESTU: Nejdříve odečtěte absorbanci jamky se samotným ředicím roztokem (DIL = pozadí reakce) od hodnot standardů a testovaných vzorků. 8.1. Kvalitativní orientační hodnocení 1. Spočítejte průměrnou hodnotu OD Standardu D ST D/ST 1. Pokud aplikujete tři jamky Standardu D a některá z těchto hodnot se liší o více než 20% od průměru, nepoužívejte ji k výpočtu a spočítejte průměr ze zbývajících dvou hodnot. 3
2. Stanovte cut-off hodnotu. Cut-off hodnotu stanovíte tak, že průměrnou hodnotu Standardu D vynásobíte korekčním faktorem. Hodnota korekčního faktoru Standardu D se určuje pro každou šarži soupravy a je uvedena v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. 3. Séra s hodnotou OD < 90% cut-off jsou negativní a séra s hodnotou OD > 110% cut-off jsou považována za pozitivní. Hodnocení pro mozkomíšní moky a synoviální tekutiny viz bod 8.2. Semikvantitativní hodnocení. 8.2. Semikvantitativní hodnocení Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky sér, mozkomíšních moků a synoviální tekutiny: 1. Nejdříve stanovte cut-off hodnotu jako v předešlém způsobu hodnocení (čl. 8.1., bod 2). 2. Stanovte hodnotu indexu pro jednotlivé vzorky tak, že vydělíte OD testovaného vzorku cut-off hodnotou. 3. Odečtěte v tabulce (viz HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ) odpovídající stupeň reaktivity vzorku. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: a) séra Hodnota indexu Vyhodnocení < 0,90 Negativní 0,90-1,10 +/- 1,11-2,70 + 2,71-4,30 ++ 4,31-6,00 +++ > 6,00 ++++ Pokud Váš spektrofotometr (ELISA reader) ukáže maximální měřitelnou hodnotu ( over ), považujte tyto výsledky v indexu pozitivity za > 6,00. Příklad: Získaná OD Standardu D = 1,231; 1,198; 1,215 Průměrná hodnota OD = 1,215 OD vzorku séra = 1,587 Korekční faktor = 0,29 Cut-off hodnota = 1,215 x 0,29 = 0,352 Hodnota indexu = 1,587 / 0,352 = 4,51 b) mozkomíšní mok Hodnota indexu Vyhodnocení < 1,00 Negativní 1,00-1,30 +/- > 1,30 Pozitivní Pokud Váš spektrofotometr (ELISA reader) ukáže maximální měřitelnou hodnotu ( over ), považujte tyto výsledky v indexu pozitivity za > 1,30. c) synoviální tekutina Hodnota indexu Vyhodnocení < 1,00 Negativní 1,00-1,30 +/- > 1,30 Pozitivní Pokud Váš spektrofotometr (ELISA reader) ukáže maximální měřitelnou hodnotu ( over ), považujte tyto výsledky v indexu pozitivity za > 1,30. Pozn.: Hodnocení +/- znamená, že vzorek leží v rozmezí šedé zóny. V případě tohoto výsledku test opakujte. Leží-li vzorek po opakovaném testování opět v rozmezí šedé zóny, opakujte testování alternativní metodou, nebo použijte vzorek odebrané od téhož jedince o 1-2 týdny později. 4
8.3. Kvantitativní hodnocení Stanovte arteficiální jednotky (AU/mL) pro jednotlivé vzorky sér, mozkomíšních moků a synoviální tekutiny: 1. Sestrojte kalibrační křivku tak, že na osu x vyneste jednotky standardů (uvedeny v přiloženém certifikátu kvality pro danou šarži soupravy). Na osu y vyneste jejich průměrné absorbance. Je možné použít logaritmickou osu x. 2. Na kalibrační křivce vyhledejte místo, kde absorbance testovaných vzorků protíná kalibrační křivku a spusťte kolmici na osu x. Zde odečtěte titry protilátek testovaných vzorků v AU/mL, pokud ředíte vzorek 101x. Pro vyhodnocení lze využít různé softwarové programy, např. KimQ, Winliana aj. V tom případě je nejpřesnější hodnocení pomocí polynomické (čtyř-parametrové) funkce. 3. Kalibrační křivka a jednotky standardů jsou vztaženy na ředění 101x. Při jiném ředění sér a u vzorků mozkomíšních moků a synoviálních tekutin je pro správné hodnocení podle návodu nutné ředění zahrnout do výpočtu. Pomocí kalibrační křivky získáme počet jednotek ve vzorku (AU/ve vzorku), které je třeba přepočítat na AU/ml (dle následujícího vzorce): AU/ ve vzorku *ředění vzorku AU / ml 101 Rozmezí šedé zóny je uvedeno v certifikátu v AU/ml. Pozn. Pokud bod odpovídající absorbance testovaného vzorku leží mimo kalibrační křivku (nad horní hranicí), je nutno vzorek opakovaně testovat při vyšším ředění, pro séra např. 1: 201 nebo 1:401, pro mozkomíšní mok 1:11 nebo 1:21, pokud leží pod spodní hranicí kalibrační křivky, je nutno použít nižší ředění vzorku, pro séra např. 1:51. Příklad: Sérum č. 1 ředěné 101x má OD 3,600. Toto OD leží mimo lineární část křivky. Sérum je proto vhodné naředit 201x získáme OD např. 1,600; nebo naředit 401x, získáme OD např. 0,800. Z kalibrační křivky standardů odečteme, že hodnotě OD = 1,600 odpovídá hodnota 155 AU, hodnotě OD = 0,800 odpovídá 80 AU. Pokud by byl vzorek ředěn 101x podle předcházejícího vzorce, pak: 155 * 101/ 101 = 155 AU/ml Vzorek je však ředěn 201x, nutno tedy použít výpočet: 155*201/101 = 308,5 AU/ml Je-li vzorek ředěn také 401x, nutno použít výpočet: 80*401/101 = 317,7 AU/ml Hodnoty AU/ml získané z různých ředění vzorku tímto výpočtem by si měly odpovídat s přesností +/- 20%. Toto platí pro výsledky získané z lineární oblasti kalibrační křivky. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ: Hodnocení v arteficiálních jednotkách pro séra, mozkomíšní moky a synoviální tekutiny je uvedeno v certifikátu dané šarže soupravy. 5
8.4. Interpretace výsledků: Diagnóza Klinické projevy (stádium) I. časná lokalizovaná fáze II. časná diseminovaná fáze III. pozdní diseminovaná fáze Erythema migrans Borreliový lymfocytom Myokarditida Oftalmoborreliosa Neuroborreliosa Artritida Acrodermatitis chronica atrophicans Chronická neuroborreliosa základní Laboratorní průkaz IgM pozitivní (3-6 týden po infekci) Často séronegativní IgM pozitivní, IgG poz. nebo IgM neg., IgG poz. Intratekální produkce specif.protilátek u neuroborreliosy. IgM neg., IgG poz. (vysoké hladiny IgG protilátek) Intratekální produkce specif. protilátek u chronické neuroborreliosy. podpůrný kožní biopsie Histologický nález B-buněk pseudo lymphocytoma 9. PRŮKAZ INTRATHEKÁLNÍ SYNTÉZY SPECIFICKÝCH PROTILÁTEK IgG: 9.1 ÚVOD Průkaz intrathekální syntézy protilátek (detekce specifických IgG protilátek produkovaných v mozkomíšním moku) je nezbytný pro diagnostiku časné i pozdní neuroborreliosy. Předpokladem pro její stanovení je paralelní vyšetření séra i mozkomíšního moku na obsah specifických IgG protilátek a stanovení koncentrace celkového albuminu a celkových IgG v obou materiálech. Průkaz intrathekální syntézy specifických protilátek je charakterizován hodnotou protilátkového indexu (antibody index AI) vyjadřujícího poměr koncentrace protilátek v mozkomíšním moku a séru ve vztahu ke stavu hematolikvorové bariéry a koncentraci celkových IgG v séru a mozkomíšním moku (MM). Pozn.: V případě negativního výsledku u párového vzorku (negativní sérum i negativní mozkomíšní mok) nepočítejte antibody index AI (nelze předpokládat intrathekální syntézu specifických protilátek). Pro automatický výpočet k soupravám dodáváme software VIDITAB. 9.2 VÝPOČET PROTILÁTKOVÉHO INDEXU (AI) 9.2.1. Výpočet poměru mezi koncentracemi celkového IgG (Q total IgG ) a celk.albuminu (Q total alb ) v mozkomíšním moku a séru Spočítejte Q total IgG a Q total alb podle vzorce: total IgG v MM total alb vmm Q total IgG = Q total alb = total IgG v séru total alb vséru Příklad: total IgG v MM (koncentrace celkových IgG v mozkomíšním moku) = 0,065 g/l total IgG v séru (koncentrace celkových IgG v séru) = 17,29 g/l total alb v MM (koncentrace celkového albuminu v mozkomíšním moku) = 0,272 g/l total alb v séru (koncentrace celkového albuminu v séru) = 30,64 g/l 0,065 Q total IgG = = 3,76 x 10-3 0,272 Q total alb = = 8,88 x 10-3 17,29 30,64 9.2.2. Výpočet limitního koeficientu Q limigg tj. množství IgG v mozkomíšním moku, které může za daného stavu bariéry pocházet ze systémové cirkulace (Reiberova hyperbolická funkce) Spočítejte Q limigg podle vzorce: 2 6 Q limigg = 0,93 x (Q ) 6 x 10-1,7 x 10-3 totalalb 6
Příklad: -3 2 6 Q limigg = 0,93 x (8,88 x 10 ) 6 x 10-1,7 x 10-3 Q limigg = 6,86 x 10-3 9.2.3. Výpočet koeficientu pathogen - specifických protilátek IgG Q path.-spec.igg, který udává poměr mezi koncentrací specifických IgG v mozkomíšním moku a séru Spočítejte Q path.-spec. IgG podle vzorce: Q path.-spec.igg = c spec.igg MM x ředění c spec.igg sérum x ředění kde c spec.igg MM / sérum je stanovená koncentrace specifických protilátek v AU/ml v mozkomíšním moku/ séru násobená ředěním vzorku (viz kap. 8.3) Příklad: c spec.igg MM = 38 AU/ml, vzorek ředěn 2x v ředicím roztoku c spec.igg sérum = 10 AU/ml, vzorek ředěn 101x v ředicím roztoku 38 x 2 Q path.-spec.igg = 10 x 101 Q path.-spec.igg = 75,2 x 10-3 9.2.4. Výpočet protilátkového indexu AI a) Pokud platí: Q total IgG < Q limigg, spočítejte AI podle vzorce: AI = Q path. -spec.igg Q totaligg Příklad: Q total IgG = 3,76 x 10-3 Q limigg = 6,86 x 10-3 Q path.-spec.igg = 75,2 x 10-3 Q total IgG = 3,76 x 10-3 < Q limigg = 6,86 x 10-3 0,0752 AI = = 20 0,00376 b) Pokud platí: Q total IgG > Q limigg, spočítejte AI podle vzorce: AI = Q path.-spec.igg Q limigg Příklad: Q total IgG = 13,5 x 10-3 Q limigg = 6,86 x 10-3 Q path.-spec.igg = 75,2 x 10-3 0,0752 AI = = 11 0,00686 Pro automatický výpočet k soupravám dodáváme software VIDITAB. Pozn. Pro výpočet protilátkového indexu lze využít různé softwarové programy, např. EPI info 6 aj. 9.3. HODNOCENÍ VÝSLEDKŮ (dle Reibera) Hodnota AI Hodnocení < 1,3 negativní, intrathekální syntéza neprokázána 1,3 1,5 hraniční > 1,5 pozitivní, intrathekální syntéza prokázána Pozn. Pokud absorbance testovaného vzorku leží mimo lineární oblast kalibrační křivky, je nutno vzorek opakovaně testovat v upraveném ředění (viz kap.8.3). 7
9.4. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Diagnostická kriteria pro neuroborreliosu upraveno dle EUCALB Diagnóza (stádium) Časná neuroborreliosa Chronická neuroborreliosa (vzácná forma) Klinické projevy Meningoradiculoneuritida Meningitida Garin-Bujadoux- Bannwarthův syndrom Dlouhotrvající encefalitida, Meningoencefalitida Encefalomyelitida Radiculomyelitida Laboratorní průkaz (sérum + mozkomíšní mok) základní Intrathekální syntéza specifických protilátek Intrathekální syntéza specifických protilátek Lymfocytární pleocytosa v mozkomíšním moku Detekce specifických IgG protilátek v séru podpůrný Specifické oligoklonální pásy v mozkomíšním moku, významný nárůst specifických sérových protilátek Specifické oligoklonální pásy v mozkomíšním moku 10. CHARAKTERISTIKY TESTU: 10.1. Platnost testu Hodnota absorbance samotného ředicího roztoku DIL (DIL = pozadí reakce) by měla být < 0,150. Hodnota OD Standardu D ST D/ST 1 by měla být v rozmezí uvedeném v Certifikátu kontroly kvality dané šarže. Absorbance (OD) Standardů by měly být: OD STA/CTRL- OD ST B OD ST C OD STD/ST1 OD STE/ST2. Test je určen pro stanovení specifických IgG protilátek v lidském séru, mozkomíšním moku a synoviální tekutině. 10.2. Přesnost testu Pro stanovení variability mezi jednotlivými testy - reprodukovatelnost (interassay) a během testu - opakovatelnost (intraassay) bylo provedeno srovnání vzorků s různými hodnotami OD. 10.2.1 Opakovatelnost (intraassay) Variační koeficient opakovatelnosti je maximálně 5%. Je měřen pro každou šarži minimálně na 12 paralelních jamkách téže destičky. Příklad: (n = počet paralelních jamek na téže destičce) n A CV opak. 16 1,335 0,050 3,8 % 16 0,614 0,023 3,7 % 10.2.2. Reprodukovatelnost (interassay) Variační koeficient reprodukovatelnosti je maximálně 15%. Je měřen pro každou šarži porovnáním jamek téhož séra v několika po sobě jdoucích testech. Příklad: (n = počet testů určitého vzorku) n A min max CVrepro 18 1,369 0,064 1,223-1,476 4,7% 18 0,463 0,060 0,337-0,569 12,9% 10.2.3. Recovery test Naměřené hodnoty recovery se pohybují pro každou šarži v rozmezí 80 až 120% očekávané hodnoty. 8
10.3. Diagnostická citlivost a specifita testu Stanovení diagnostické citlivosti bylo provedeno testováním pacientských vzorků, u kterých byl očekáván pozitivní výsledek na IgG proti boreliím. Výsledek byl potvrzen nezávislými komerčními testy v rámci interní studie funkční způsobilosti a externí studie provedené několika klinickými laboratořemi. Diagnostická citlivost je 95%. Specifita testu byla stanovena testováním charakterizovaných vzorků sér, u kterých byla očekávána nepřítomnost IgG proti boreliím. Výsledná specifita testu z daných vzorků byla 99%. 10.4. Mez stanovitelnosti Mez stanovitelnosti je definována jako nejnižší měřitelná koncentrace, která může být s 95% jistotou odlišena od nuly. Tato hodnota činí 2,41 AU/mL. 10.5. Interference Hemolytické a lipemické vzorky nevykazují žádný vliv na výsledek testu minimálně do 50 mg/ml pro hemoglobin, 5 mg/ml pro bilirubin a 80 mg/ml pro triglyceridy. 11. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY: Všechny složky soupravy jsou určeny pouze pro laboratorní účely. Lidská séra použitá v soupravě byla testována na nepřítomnost HBsAg, HCV a protilátek anti-hiv-1,2. Přesto s nimi nakládejte jako s infekčním materiálem a předměty, které s nimi přišly do styku, autoklávujte 1 hodinu při 121 C, nebo dezinfikujte minimálně 30 minut 3% roztokem chloraminu. Odpad vzniklý při promývání stripů dezinfikujte v odpadní nádobě pomocí vhodného dezinfekčního roztoku (např. Incidur, Incidin, chloramin,...) v koncentraci doporučené výrobcem. Tekuté odpady obsahující stop roztok (roztok kyseliny sírové) před likvidací neutralizujte 4% roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Se stop roztokem pracujte opatrně, aby nedošlo k potřísnění kůže nebo sliznice. Stane-li se tak, omyjte postižené místo větším množstvím tekoucí vody. Při práci nejezte, nepijte a nekuřte. Nepipetujte ústy, ale vhodnými pipetovacími zařízeními. Používejte ochranné rukavice a po práci si důkladně umyjte ruce. Dbejte, aby nedošlo k rozlití vzorků a k tvorbě aerosolu. 12. UPOZORNĚNÍ: a. Výrobce zaručuje použitelnost soupravy jako celku. b. Promývací roztok, chromogensubstrátový roztok TMB r.t.u., stop roztok r.t.u. jsou vzájemně zaměnitelné mezi jednotlivými soupravami ELISA-VIDITEST, pokud není v návodu k použití soupravy uvedeno jinak. c. Pracujte asepticky, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci sér a reagencií. d. Při odebírání, ředění a skladování reagencií postupujte tak, aby nedošlo k jejich vzájemné kontaminaci či kontaminaci látkami inhibujícími enzymatickou aktivitu. e. Kontrolní séra (standardy), ředicí roztok, chromogensubstrátový roztok TMB a konjugát anti-igg Px jsou konzervovány ProClinem 300. f. Chromogensubstrátový roztok nesmí přijít do styku s oxidačními látkami a kovovými povrchy. g. Pro aplikaci roztoků a měření absorbance používejte pouze validované měřicí přístroje. h. Dodržujte přesně pokyny uvedené v návodu. Nereprodukovatelné výsledky mohou vzniknout zejména: * nedostatečným promícháním reagencií a vzorků před použitím * nepřesným pipetováním a nedodržováním času inkubací uvedených v bodě 7. * špatnou technikou promývání a potřísněním okrajů jamek vzorky nebo konjugátem * použitím stejné špičky při pipetování různých roztoků nebo záměnou uzávěrů 9
13. SKLADOVÁNÍ A EXPIRACE: a. Soupravu a její složky skladujte v suchu a temnu při teplotě +2 až +10 C. Za těchto podmínek je expirační doba celé soupravy uvedena na centrálním štítku na obalu soupravy, expirace jednotlivých složek je uvedena na jejich obalu. b. Nespotřebované stripy vložte zpět do obalu a zatavte, nebo dobře uzavřete do sáčku se zipem společně s desikantem. Soupravy se přepravují chlazené v termotaškách. Jestliže po obdržení soupravy zjistíte vážné poškození obalu jakékoliv složky soupravy, ihned informujte výrobce. c. Nespotřebovaná testovaná séra, mozkomíšní moky a synoviální tekutiny uchovávejte v neředěném stavu rozplněná na alikvoty a zmrazená při teplotě -18 až -28 C. Časté zmrazování a rozmrazování se nedoporučuje. Pokud skladujete séra při teplotě +2 až +10 C, pak je spotřebujte do jednoho týdne. d. Roztoky testovaných vzorků v pracovní koncentraci nelze skladovat. Připravujte je vždy čerstvé. 14. TESTOVACÍ SCHÉMA: Krok 1. Připravte reagencie a testované vzorky v pracovním ředění Krok 2. Aplikujte standardy a testované vzorky (100 L/ jamku) Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 L/ jamku), vyklepněte Krok 3. Krok 4. Aplikujte konjugát anti-igg Px r.t.u. (100 L/ jamku) Inkubujte 60 minut při laboratorní teplotě 4x promyjte (250 L/ jamku), vyklepněte Aplikujte chromogensubstrátový roztok TMB (100 L/ jamku) Inkubujte 10 minut v temnu při laboratorní teplotě Krok 5. Aplikujte Stop roztok (100 L/ jamku) Krok 6. Změřte absorbanci při 450/ 620-690 nm do 10 minut Datum poslední verze tohoto návodu: 06/2014 Souprava byla vyvinuta za finanční podpory ze státních prostředků poskytnutých prostřednictvím Ministerstva průmyslu a obchodu. 10