Elektronová mikroskopie v přímé diagnostice bakteriálních a virových infekcí Dagmar Hulínská NRL ELM, NRL LB, WHO Centrum, CLČ Státní zdravotní ústav Praha
Patogenní bakterie a viry- v NRL ELM Borrelia burgdorferi s.l. (ELM, ISEM) Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia sp Rickettsia helvetica, R. monacensis Bartonella henselae, Neisseria meningitis Rozpoznává: Virus TBE, Coronavirus, EBV, HSV, C6, vakcinia, Leukoviruses,Reoviruses, Adenoviruses, Poxviruses, Parvoviruses, Enterovirus, Myxoviruses Picornavirus,Paramyxovirus (Dr.J. Schramlová, CSc)
ELM přímý průkaz v krátkém čase- přímo z léze, tělní tekutiny, biopsie, autopsie Negativní barvení PTA, MTA- rychlá, neselektivní morfologická identifikace frontline, open view method (P.R.Hazelton, R Emerg. Infect.Dis. 9, 3, 2003) Imunosorbentní mikroskopie ISEM- identifikace patogena polyklonální nebo monoklonální protilátkou Imunohistologie i na polosilných a ultratenkých řezech pro studium patogeneze Aplikace : v klinicky nebo epidemiologicky kritické situaci, při bioterorismu, kontrola kvality kontrola vakcin
Negativní barvení- PTA B. garinii a B. afzelii krev
ISEM diagnostika pomocí Mab
B. garinii centrifugace v 34 000x g, 20 min, -10 C, uvolnění mikrovesiklů
Vznik bakteriemie Bb z kůže do krveuvolní aktivní OspA mikrovesikly adhesin OspA a) Inhibuje fagosom- lysosom funkci makrofágu b) Aktivuje produkci IL 1 c) IL1- > dekorin Aktivace fibroblastů endocytosa
Lokalizova fáze Bb a HGA v kůži ANAPLASMA Hulínská et al. J.Basic.Microbiol. (NSR), 29, 73-83 (1989) BORRELIA V endotelii
Uloha Bičíků : pohyb, dělení ztrátou vznik cysty L formy antigenní struktury x anti-axonální axonální protilátky- mimikry-persistentní neurologic dysfunction (Sigal, Williams, Infect Immun,2006) kůra Víko -obal rotor báse
důsledek ztráty bičíků - antigenní rozdíly povrchu Bb pod vlivem protilátek a antibiotik WWW.DYNEX.CZ Plaky- mrtvé L formy
Vegetativní formy B. garinii vytvoření L formy - vliv hyperimunního séra ELM IFA
Vegetativní formy ( Nelson, 1999 Nelson, 1999; Duray 1994 McDonald, 2000; Cinco 2004) ) alterované Bb vlivem stresu (teplota, antibiotika, protilátky atd.) WWW.DYNEX.CZ
ELM detekce alterovaných borrelií, cyst, granul a zárodků v klinických vzorcích WWW.DYNEX.CZ X 29 000 ISEM, Mab anti-ospa
Rozdělení Bb v germinativní zárodky CSF 78 000x Germinativní zárodky v CSF
Ixodes ricinus slinné žlázy Borrelia garinii- ultrathin section, Eppon, UALC, 54000x
Kontrola ELM Členství t í : Directory of Electronmicroscopy facilities for emergency, DEF,CA-USA External Quality Assessment (EQA) pro ELM,- Kochův Institut, Berlin EU Network in Diagnostic ELM in Infectious Diseses- EUROTOM7 PCR, RT-PCR, Sekvenace pozitivních vzorků Atlas ELM- CDC- NASA
Přímá sekvenační analýza produktů OspA různých kmenů 0.020 98 Subtyp 3 44 55 A01-K275 A05-2B 100 A04-3B Subtyp 2 A10-A541 strain-ba-93m 100 91 100 WWW.DYNEX.CZ 1998A3 57 1992A3 86 1921A3 Subtyp 1 1988A3 47 1996A3 76 1994A3 52 1997A3 176A_patient 82 1922A3 100 A08-336M A07-K4 Subtyp 7 100 A09-261M Subtyp 6 A06-K32 1358A3 Subtyp 5 99 strain57m Subtyp 4 strain-e50 B. bissettii
Vyšetření ELM- v r. 2005 a 2006 (1 256 pacientů) Procento pozitivity v r.2006 podle měsíců - bílé sloupce, srovnání s rokem 2005 tmavé sloupce vpravo 25 23 20 19.07 17.13 17.13 16.3 15 14.2 13.97 13.8 10 11.82 10 11.8 8.7 WWW.DYNEX.CZ 9.5 9.23 5 6 3 0 leden únor březen duben květen červen červec srpen
Kapilára Borrelie v endotelii a lumen krevní kapiláry v srdci
Bb ve stěně endotelie myokardu EN Bartůněk P., Hulínská D., Paleček P. Clin.Res.Cardiology 96,6: 410-11, 2007
SYNOVIUM- LA WWW.DYNEX.CZ
EM jaterní biopsie, hepatitis hepatitis - cysty MAb anti OspA-peroxidase peroxidase-diaminobenzidine diaminobenzidine i idi makrofág jater Mab anti OspA v cystách Cysta se zárodky
Procento pozitivity PCR na LB tkání v r.2003-2008 80 70 60 50 pozitivní 40 negativni 30 % 20 10 0 srdce placenta kůže synovium tkáň jiná
2008 Spojitost výše m axim ální teploty a srážek v m m na pozitivitu DNA Borrelia burgdorferi s.l. u k líš at 70 60 50 40 30 20 10 0 bøezen duben kvì ten èerven èervenec srpen max.tepl. srážky mm pozit.bb 6 5 4 3 2 1 0
Ko-infekce při LB- Anaplasma, Rickettsia spp.
Persistence : snížení imunity hostitele- těhotenstvím koinfekce- Anaplasma HGA
Anaplasma sp. Ko-infekce v srdci : myokard srdce DKMP (č.222)- PCR+,ELM+ Ložiska leukocytů v polosilném řezu s Mab P44 (histochemie Silver- methenamin) WWW.DYNEX.CZ Bartunek P., Hulínská D., et al. Medical Res.2006,107: 213-226226
RT-PCR maxima pozitivity klíšťat na HGA a Bb v r.2007 WWW.DYNEX.CZ
Rickettsia helvetica sekvenací OmpA WWW.DYNEX.CZ X 23 000 PTA,UA,LC, x 38 000 Rickettsia v endotelové buňce Rickettsia uvolněná v kultuře Vero buněk (x1100) Č.121,
RT-PCR kvantifikuje agens cykly versus logaritmus koncentrací gen r ompb Melting curve analysis Amplifikační lineární vztah ( logaritmus fluorescence versus počet cyklů)
Bartonella henselae z pacientů s endomyokarditidou ditid
Bartonella henselae izolovaná z klíšťat
Bartonella henselae (MVDr O.Melter)
Přímý průkaz virů v negativním barvení Rickettsia sp.+ TBE a neznámý virus v CSF WWW.DYNEX.CZ X 110 000 x 120 000
Virus chřipky a ptačí chřipky x 100 000 X 120 000
Virus HIV, negativní barvení nativního preparátu a ultratenký řez lymfocytem WWW.DYNEX.CZ X 75 000
negativní barvení PTA Virus příušnic Virus neštovic, X 100 000 X 110 000
Virus klíšťové encefalitidy (TBE) X 110 000 kůň Ebola- sbírka Koch Inc. X 135 000 Dr.J. Schramlová
Viry přenosné ze zvířat ohrožující život 100 000x 120 000x Virus vztekliny Marbursky virus
Děkuji za pozornost