VYUŽITÍ MIKROEXTRAKCE NA TUHOU FÁZI PRO STANOVENÍ LINEÁRNÍCH MUSK SLOUČENIN

VYUŽITÍ MIKROEXTRAKCE NA TUHOU FÁZI PRO STANOVENÍ LINEÁRNÍCH MUSK SLOUČENIN PETRA KOMÁRKOVÁ, MILADA VÁVROVÁ b, ZUZANA KRÁLOVÁ, ALICE JÍROVÁ KATEŘINA JÁROVÁ Ústv ekologie chorob zvěře, ryb včel, Fkult veterinární hygieny ekologie, Veterinární frmceutická univerzit Brno, Plckého tř. 1/3, 612 42 Brno, b Ústv chemie technologie ochrny životního prostředí, Fkult chemická, Vysoké učení technické v Brně, Purkyňov 464/118, 612 00 Brno komrkovp@seznm.cz Došlo 21.11.13, přeprcováno 24.4.14, přijto 20.11.14. Klíčová slov: mikroextrkce n tuhou fázi, GC-MS, musk sloučeniny, odpdní vod Úvod Syntetické musk sloučeniny zčly být používány jko lterntiv drhého přírodního pižm zhrnují širokou škálu strukturně heterogenních sloučenin 1. Ve znčné míře jsou používány jko vonné přísdy do různých produktů osobní péče do čisticích prostředků. V součsnosti je zznmenáván hojný výskyt těchto látek v životním prostředí 2, především ve vodním ekosystému. Kontmince všech složek vodního ekosystému, tj. vody, sedimentu i bioty, se již stl závžným problémem i z hledisk ekotoxicity 3. Musk sloučeniny jsou povžovány z nové mikropolutnty 4. Některé z nich jsou díky svým vlstnostem, tj. především perzistenci v prostředí, význmnému biokumulčnímu potenciálu toxickým účinkům n vodní orgnismy, čsto zřzovány mezi perzistentní orgnické polutnty 5,6. Toxicit byl hodnocen především u nitro- polycyklických musk sloučenin. Akutní toxicit posuzovných musk sloučenin je nízká, hodnoty LD 50 se u hlodvců pohybují v jednotkách g kg 1. Musk mbrette vykzuje fototoxické neurotoxické účinky, musk xylen indukuje tvorbu jterních nádorů u myší 7,8. U musk xylenu, musk ketonu, glxolidu tonlidu byl potvrzen toxicit pro vodní orgnismy 9. Estrogenní efekt polycyklických musk sloučenin byl prokázán v in vitro testech s dráptkou vodní (Xenopus levis) pstruhem duhovým (Onchorynchus mykiss). Glxolid tonlid se řdí mezi potencionální endokrinní disruptory 10,11. Musk sloučeniny jsou prvidelně detegovány v odpdních vodách, které tk znmenjí konstntní expoziční zdroj těchto látek. V nízkých koncentrcích se ncházejí v ovzduší prchu. Popsány byly rovněž v tukové tkáni, krvi mteřském mléce 12. N zákldě fyzikálně-chemických vlstností se syntetické vonné látky rozdělují do čtyř skupin: nitro, polycyklické, mkrocyklické licyklické musk sloučeniny 13. Skupin nitromusk sloučenin se skládá ze substituovných dinitro- trinitro- benzenových derivátů s lkyl-, ketonebo methoxyskupinou. K hlvním zástupcům této skupiny syntetických vonných látek ptří musk xylen musk keton 14,15. Vzhledem k jejich toxicitě molekulární nestbilitě se zčlo od jejich produkce ustupovt postupně byly tyto sloučeniny nhrzovány polycyklickými musk sloučeninmi 16. Strukturním prvkem všech polycyklických musk sloučenin je indnový nebo tetrlinový skelet, který je substituovný především methylovými skupinmi 17. Nejčstěji detegovnými sloučeninmi z této skupiny jsou glxolid tonlid 18. Přírodním pižmovým sloučeninám jsou svoji strukturou nejblíže mkrocyklické mošusové látky, které jsou tvořeny velkými kruhy ketonů nebo lktonů 19. Alicyklické musk sloučeniny, známé tké jko lineární musk sloučeniny nebo cyklolkylestery, jsou reltivně novou skupinou syntetických mošusových látek. Hlvním důvodem jejich syntézy byl snh zmezit vysoké produkci nedegrdbilních biokumultivních látek, jkými jsou nitro- polycyklické musk sloučeniny 20. SPME (solid-phse microextrction, mikroextrkce n tuhou fázi) je extrkční technik nvržen J. Pwliszynem v roce 1989. Jedná se o techniku, která má mnoho výhod; je jednoduchá, prktická, bez použití rozpouštědel, přesto všk je dosttečně citlivá pro stnovení stopových množství kontminntů, které jsou v životním prostředí přítomny n úrovni nižší než ng kg 1 (ng l 1 ). SPME v podsttě předstvuje spojení extrkce, zkoncentrování čištění do jednoho kroku. Z tohoto důvodu se snižuje riziko ztrát nlytů, které je jink běžné u trdičních extrkčních metod, jko je npř. extrkce z kpliny do kpliny. Nvíc byl metod SPME již plně utomtizován, tkže je vhodná i pro rutinní nlýzy 21. Pečlivý výběr optimlizce všech extrkčních podmínek, jko je typ vlákn, teplot dob extrkce, míchání vzorku, objem vzorku, objem hed-spce prostoru, přídvek soli nebo úprv ph, vedou ke zvýšení citlivosti reprodukovtelnosti této metody. Obecně pltí, že optimální teplot závisí n složení mtrice použité stcionární fázi. Čs teplot jsou prmetry spolu úzce související, npř. zvýšení teploty umožní krtší expoziční čs, čímž se urychlí celkový čs nlýzy. Přídvek soli zvýší účinnost extrkce snížením rozpustnosti nlytů ve vzorku, což má z následek zvyšující se množství nlytů sorbovných n vlákno 22. HS-SPME (hed-spce SPME) je komplexní multifázový rozdělovcí systém, ve kterém je doshováno rovnováhy ve dvou systémech, to mezi mtricí vzorku plynným prostorem nd vzorkem mezi prostorem nd vzorkem stcionární fází. HS-SPME metod je ve velké míře používán pro stnovení těkvých polotěkvých orgnických sloučenin přítomných v různých mtricích. 625

Ve spojení s GC HPLC byl tto metod použit pro nlýzu látek ve vnitřním ovzduší, ve spodních vrstvách troposféry, průmyslových exhlcích lidském dechu, dále tké ve vodě biologických vzorcích (rostlinných živočišných tkáních orgnismech, mikroorgnismech v krvi) 23. Cílem předložené studie bylo stnovení vybrných zástupců lineárních musk sloučenin ve vzorcích odpdní vody pocházející z čistírny odpdních vod (ČOV) Veterinární frmceutické univerzity Brno posouzení účinnosti čisticího procesu používného n této ČOV. Experimentální část Používné přístroje zřízení SPME držák pro mnuální vzorkování (Supelco, Bellefonte, USA), SPME vlákn (Supelco, Bellefonte, USA): 65 m Polydimethylsiloxn/Divinylbenzen (PDMS/DVB), 100 m Polydimethylsiloxn (PDMS), 50/30 m Divinylbenzen/Crboxen/Polydimethylsiloxn (DVB/CAR/PDMS), 85 m Polykrylát, 7 m Polydimethylsiloxn (PDMS); plynový chromtogrf GC Agilent 6890N (Agilent Technologies, Snt Clr, USA), hmotnostní detektor MSD 5973N (Agilent Technologies, Snt Clr, USA). Chemikálie stndrdy Cyklohexn ceton v čistotě pro plynovou chromtogrfii (Merck, Drmstdt, Německo), chlorid sodný p.. (Sigm-Aldrich, Steinheim, Německo), stndrdy lineárních musk sloučenin (AROMA Prh,.s., ČR): dihydromyrcenol (100 %), cyklohexylethylcetát (100 %), rofir (100 %), cyclcet/jsmocyclen (100 %). Vzorky Vzorky odpdní vody byly odebírány n ČOV situovné v reálu Veterinární frmceutické univerzity Brno v období od 4. 2. do 13. 2. 2013. Odběr probíhl v prvidelných čsových intervlech předstvovl 24hodinové slévné vzorky odebrné n přítoku i n odtoku. Vzorky byly odebírány do speciálně vyčištěných vzorkovnic z hnědého skl o objemu 0,5 l. Po odběru z ČOV byly vzorky neprodleně nlyzovány v lbortoři. V přípdě, že nebylo možné provádět nlýzu ihned, byly vzorky uchovávány při teplotě 4 C, nejdéle všk po dobu 24 hodin. Prcovní postupy Příprv roztoků Z jednotlivých stndrdů lineárních musk sloučenin byly připrveny zásobní roztoky o koncentrci 4 g ml 1 rozpuštěním v cyklohexnu. Z uvedených roztoků byl následně připrven směsný zásobní roztok rozpuštěním v cetonu, ze kterého byl postupným ředěním připrven 6bodová klibrční přímk. Koncentrce jednotlivých stndrdů byly voleny tk, by jejich odezvy odpovídly předpokládné koncentrci v reálných vzorcích. Mikroextrkce n tuhou fázi Metod SPME byl prováděn tk, že do skleněných extrkčních ptron o objemu 22 ml byly předem nváženy 3 g chloridu sodného poté bylo přidáno 14 ml neředěného nefiltrovného vzorku odpdní vody. Extrkční ptrony byly uzvřeny PTFE septem ponořeny do vodní lázně o teplotě 50 C. Vzorky byly předmíchávány po dobu 5 min, přičemž SPME jehl se již ncházel v hed-spce prostoru; poté bylo SPME vlákno (65 m PDMS/DVB) vysunuto následně probíhl po dobu 30 min extrkce. Po uplynutí této doby bylo vlákno vsunuto do dávkovče plynového chromtogrfu proběhl vlstní nlýz. Pro kvntifikci nlytů byl použit metod stndrdního přídvku. Objem stndrdního přídvku byl 100 l pro vzorek odpdní vody n přítoku 50 l pro vzorek odpdní vody n odtoku. Koncentrce jednotlivých stndrdů byl následující: dihydromyrcenol 60 ng ml 1, cyklohexylethylcetát 5 ng ml 1, rofir 0,2 ng ml 1, cyclcet/ jsmocyclen 1 ng ml 1. Plynově-chromtogrfická nlýz Identifikce kvntifikce nlytů byl prováděn n plynovém chromtogrfu s hmotnostním detektorem. Pro seprci byl použit kpilární kolon DB-5MS (20 m 0,18 mm 0,18 m, J. & W. Scientific, Folsom, CA, USA). Podmínky GS-MS byly optimlizovány n prcovišti, kde se prováděly nlýzy následně byly publikovány 24 ; v rámci této studie byl optimlizován pouze teplotní progrm. Použité prmetry GC-MS nlýzy byly následující: teplot dávkovče 250 C, splitless mód; konstntní průtok nosného plynu He (0,8 ml min 1 ); teplotní progrm 50 C (3 min), 15 C min 1 do 80 C (0 min), 5 C min 1 do 120 C (5 min), 20 C min 1 do 280 C (1 min); celkový čs nlýzy 27 min. Anlyty byly kvntifikovány z následujících podmínek: elektronová ionizce při 70 ev, teplot iontového zdroje 230 C, teplot kvdrupolu 150 C, režim SIM (m/z 59 pro dihydromyrcenol, 81 pro cyklohexylethylcett, 71 pro rofir 66 pro cyclcet/ jsmocyclen). Výsledky diskuse Optimlizce mikroextrkce n tuhou fázi Výběr vlákn je jedním z nejdůležitějších prmetrů metody SPME. Při výběru bylo k dispozici pět typů vláken s rozdílnými stcionárními fázemi: 65 m Polydimethylsiloxn/Divinylbenzen (PDMS/DVB), 100 m Polydimethylsiloxn (PDMS), 50/30 m Divinylbenzen/Crboxen/ Polydimethylsiloxn (DVB/CAR/PDMS), 85 m Polykrylát, 7 m Polydimethylsiloxn (PDMS). Pro kždé 626

Abundnce 120 000 80 000 dihydromyrcenol cyklohexylethylcetát rofir cyclcet/jsmocyclen 40 000 4,00 8,00 12,00 16,00 t, min Obr. 1. Chromtogrm směsného stndrdu vlákno bylo porovnáváno provedení hed-spce (HS) přímé ponoření (DI). Postup byl podrobně popsán v metodické části. Bylo prokázáno, že u všech použitých typů vláken byly získány mnohem lepší výsledky při HS. Pro následné nlýzy bylo vybráno vlákno PDMS/DVB, které poskytlo nejvyšší odezvy. Při porovnání vhodnosti SPME vláken byly podmínky sorpce i desorpce pro všechny typy vláken shodné. Rovněž byl sledován vliv vysolování. Byl porovnáván účinnost extrkce při HS provedení pro všechn vlákn s přídvkem bez přídvku soli. Téměř u všech nlytů měl přídvek soli ke vzorku význmný vliv docházelo ke zvýšení odezev. Přídvek soli prvděpodobně zvyšuje iontovou sílu roztoku, čímž se snižuje rozpustnost nlytů zvyšuje se jejich rovnovážná koncentrce v plynné fázi. Pro určení nejvhodnější teploty sorpce byl sledován teplotní řd 20, 40, 50, 60, 70, 80, 90 100 C. Se zvyšující se teplotou docházelo k nárůstu odezev, které se zvyšovly ž do 50 C. Při 100 C už bylo průkzné výrzné snížení odezev u všech nlytů. Po porovnání všech ukztelů souvisejících se zvyšováním teploty byl jko nejvhodnější zvolen teplot sorpce 50 C. Dob vhodná k dosžení rovnováhy mezi mtricí vzorku vláknem je posledním prmetrem, který bylo třeb optimlizovt. Testovná řd byl následující: 10, 20, 25, 30, 40, 50 60 minut. Odezvy stouply s rostoucím čsem sorpce u všech nlytů do 30 min. Jko optimální čs sorpce byl proto zvolen dob 30 min (obr. 1). Stnovení musk sloučenin v odpdní vodě Vyhodnocením výsledků nlýz reálných vzorků bylo zjištěno, že během desetidenního vzorkování byly detegovány kvntifikovány všechny lineární musk sloučeniny n přítoku n ČOV, ztímco n odtoku z ČOV už nebyly prokázány všechny posuzovné nlyty. Nejvyšších koncentrcí n přítoku doshovl po celou dobu vzorkování dihydromyrcenol, mximální zjištěná hodnot byl cc 3 g l 1. U osttních nlytů byly hodnoty výrzně nižší, pohybovly se v rozmezí desetin ž tisícin g l 1. N odtoku byl ze všech vzorků odpdní vody kvntifikován pouze ve dvou přípdech cyclcet/jsmocyclen, žádný jiný nlyt nebyl v průběhu celého sledování n odtoku kvntifiko- Tbulk I Průměrné koncentrce sledovných musk sloučenin n přítoku n odtoku z ČOV Anlyt Přítok [ g l 1 ] Odtok [ g l 1 ] minimum mximum průměr minimum mximum průměr Dihydromyrcenol 0,346 3,008 1,208 <LOD <LOQ <LOQ Cyklohexylethylcetát 0,001 0,117 0,026 <LOD <LOD <LOD Arofir 0,001 0,034 0,008 <LOD <LOQ <LOQ Cyclcet/jsmocyclen 0,002 0,319 0,075 <LOD 0,002 0,188 <LOD pod mezí detekce, <LOQ pod mezí kvntifikce 627

Tbulk II Chrkteristiky metody SPME ve spojení s GC-MS Anlyt LOD LOQ b R 2 c Opkovtelnost [ng l -1 ] [ng l -1 ] RSD [%] Dihydromyrcenol 0,49 1,64 0,9926 5,64 Cyklohexylethylcetát 0,26 0,85 0,9923 5,70 Arofir 0,29 0,97 0,9904 7,26 Cyclcet/jsmocyclen 0,38 1,27 0,9928 6,28 LOD limit detekce, b LOQ limit kvntifikce, c R 2 koeficient determince ván. Cyklohexylethylcetát nebyl n odtoku detegován žádný den. Dihydromyrcenol rofir byly v některých přípdech n odtoku detegovány, nebyly le kvntifikovány, protože se ncházely pod mezí kvntifikce. Minimální, mximální průměrné koncentrce sledovných nlytů n přítoku n odtoku jsou uvedeny v tb. I. N podkldě získných dt byl vyhodnocen účinnost čisticího procesu příslušné ČOV. U všech nlytů, s výjimkou cyclcet/jsmocyclenu, bylo doshováno účinností odstrnění nd 99 %. U cyclcet/jsmocyclenu se účinnost odstrnění pohybovl v rozmezí 49,20 99,50 %. Rozmezí účinnosti je sice vysoké, le zjištěná množství jsou v souldu s používnými komerčními příprvky obshujícími sledovné musk sloučeniny. Opkovtelnost použité nlytické metody byl hodnocen pomocí reltivní směrodtné odchylky. Její hodnoty, spolu s hodnotmi LOD, LOQ koeficientu determince, jsou uvedeny v tb. II. Závěr V předložené studii byl hodnocen výskyt vybrných zástupců lineárních musk sloučenin v odpdních vodách. Součsně byl posuzován tké vliv čistírny odpdních vod n vodní ekosystém, který byl hodnocen n zákldě účinnosti odstrnění sledovných nlytů z odpdní vody. Lineární musk sloučeniny jsou chemické sloučeniny, které v posledních letech nhrzují dříve používné nitro- polycyklické syntetické vonné látky. Hlvním důvodem jejich plikce je jejich snzší odstrnění ze složek životního prostředí. Bylo prokázáno, že čistírn odpdních vod Veterinární frmceutické univerzity Brno je schopná tyto látky z odpdní vody odstrnit, v důsledku čehož se dále nedostávjí do životního prostředí nemohou tk následně negtivně působit n živé orgnismy. Výsledky rovněž prokázly, že syntetické vonné látky se vyskytují téměř ve všech složkách životního prostředí, proto je nutné tuto skupinu látek neustále sledovt. Tto práce byl podpořen projektem IGA VFU Brno č. 21/2013/FVHE. LITERATURA 1. Roosens L., Covci A., Neels H.: Chemosphere 69, 1540 (2007). 2. Yin J., Wng H., Zhng J., Zhou N., Go F., Wu Y., Xing J., Sho B.: Chemosphere 87, 1018 (2012). 3. Vill S., Assi L., Ippolito A., Bonfnti P., Finizio A.: Sci. Totl Environ. 416, 137 (2012). 4. Chse D. A., Krnjnpiboonwong A., Fng Y., Cobb G. P., Morse A. N., Anderson T. A.: Sci. Totl Environ. 416, 253 (2012). 5. Duedhl-Olesen L., Cederberg T., Pedersen K. H., Højgǻrd A.: Chemosphere 61, 422 (2005). 6. Regueiro J., Grci-Jres C., Llomprt M., Lms J. P., Cel R.: J. Chromtogr. A 1216, 2805 (2009). 7. Christin M. S., Prker R. M., Hobermn A. M., Diener R. M., Api A. M.: Toxicol. Lett. 111, 169 (1999). 8. Steinberg P., Fischer T., Arnd M., Prk E., Elmdf I., Rimkus G., Brunn H., Dienes H. P.: Toxicol. Lett. 111, 151 (1999). 9. Doležlová Weissmnnová H., Štěpánková I., Vávrová M., Lpčíková A.: Chem. Listy 107, 172 (2013). 10. Shek W. M., Murphy M. B., Lm J. C. W., Lm P. K. S.: Mr. Pollut. Bull. 57, 373 (2008). 11. Bitsch N., Duds C., Körner W., Filing K., Biselli S., Rimkus G., Brunn H.: Arch. Environ. Contm. Toxicol. 43, 257 (2002). 12. Hutter H. P., Wllner P., Moshmmer H., Hrtl W., Sttelberger R., Lorbeer G., Kundi M.: Sci. Totl Environ. 407, 4821 (2009). 13. Arbulu M., Smpedro M. C., Uncet N., Gómez- Cbllero A., Goicole M. A., Brrio R. J.: J. Chromtogr. A 1218, 3048 (2011). 14. Schmeiser H. H., Gminski R., Mersch-Sundermnn V.: Int. J. Hyg. Environ. Helth 203, 293 (2001). 15. Sommer C.: Hndb. Environ. Chem. 3, 1 (2004). 16. Rimkus G. G.: Toxicol. Lett. 111, 37 (1999). 17. Ricking M., Schwrzbuer J., Hellou J., Svenson A., Zitko V.: Mr. Pollut. Bull. 46, 410 (2003). 18. Bester K.: J. Chromtogr. A 1216, 470 (2009). 19. Sumner N. R., Guitrt C., Fuentes G., Redmn J. W.: Environ. Pollut. 158, 215 (2010). 628

20. Eh M.: Chem. Biodiversity. 12, 1975 (2004). 21. Rinwti E., Blsubrmnin R.: Phys. Chem. Erth 34, 857 (2009). 22. Blsubrmnin S., Pnigrhi S.: Food Bioprocess Technol. 4, 1 (2011). 23. Kotowsk U., Zlikowski M., Isidorov V. A.: Environ. Monit. Assess. 184, 2893 (2012). 24. Zouhr L., Vávrová M., Mrvcová L., Kubíčková K., Večerek V.: Fresenius Environ. Bull. 21, 3352 (2012). P. Komárková, M. Vávrová b, Z. Králová, A. Jírová, nd K. Járová ( Deprtment of Ecology nd Diseses of Gme, Fish nd Bees, University of Veterinry nd Phrmceuticl Sciences, Brno; b Deprtment of Chemistry nd Technology of Environmentl Protection, University of Technology Brno): Utiliztion of Solid- Phse Microextrction in Determintion of Liner Musk Compounds This study is focused on the determintion of four liner musk compounds in wstewter. Solid phse microextrction ws used for isoltion of the nlytes nd GC-MS for the detection nd quntifiction of nlytes. pátek 25. 9. 2015 od 17:00 do 22:00 hod. Technická 3, Prh 6 Noc vědců 2015 opět n VŠCHT Prh Letos stejně jko v předchozích letech se i VŠCHT Prh připojuje k celoevropské Noci vědců, která se temticky váže k Mezinárodnímu roku světl světelných technologií vyhlášenému OSN. N VŠCHT Prh se můžete těšit n ukázky zjímvých experimentů, celý večer přednášek diskuzí, při nichž se nejen dozvíte něco zjímvého nového, le zároveň se i pobvíte. Letošní přehlídk se n VŠCHT Prh nese v duchu názvu Budiž noc budiž světlo! N populárně nučných přednáškách, které zčínjí kždou celou hodinu od 17 do 21 hodin, se návštěvníci dozvědí, kde všude v běžném životě se mohou potkt s chemo- či fotoluminiscencí ( co to vlstně je) dlší zjímvosti ze svět chemie. Ti nejmldší si u stánku nšeho dětského koutku Zkumvk budou moci vlstnoručně vyrobit lmpión. Pro všechny věkové ktegorie jsou připrveny drobné dárky, ti strší budou moci ochutnt nše vlstní pivo Lchout, protože uvřit dobré pivo je tké věd! Noc vědců je trdiční celoevropskou kcí, při níže se čtvrtý zářijový pátek otevírjí prcoviště různých vědeckých institucí, lbortoří i vysokých škol. Studenti i vědci přibližují návštěvníkům vědu z populárnější stránky, ukzují, kde její výsledky pomáhjí dávjí lidem z ulice možnost popovídt si s vědci smotnými. Akce je určen všem bez rozdílu věku vstup n kci je zdrm. Věříme, že Vás pro vědu ndchneme stejně, jko v předchozích letech! Progrm dlší informce n http://www.noc-vedcu.cz/. Kontkt VŠCHT Prh: Ing. Hn Brtková, PhD., hn.brtkov@vscht.cz 629