STANOVENÍ AZOBARVIV VE SMĚSI METODOU RP-HPLC SE SPEKTROFOTOMETRICKOU DETEKCÍ 1 Úkol Separovat a metodou kalibrační křivky stanovit azobarviva (methyloranž - MO, dimethylová žluť - DMŽ) ve směsi metodou RP-HPLC se spektrofotometrickou detekcí, určit meze detekce (LOD) a meze stanovitelnosti (LOQ), stanovit koeficienty linearity detektoru a ověřit jeho lineární dynamický rozsah pro obě barviva. 2 Princip Netěkavé a polární látky, jejichž analýza plynovou chromatografií je velmi obtížná, lze s výhodou analyzovat metodou HPLC. Pricnipiálně rozlišujeme dva druhy HPLC: - kapalinovou chromatografii na normálních fázích (NP-HPLC), kdy stacionárními fázemi jsou polární oxid křemičitý (silikagel) nebo oxid hlinitý (alumina) a mobilní fází je nepolární kapalina, nejčastěji uhlovodík - HPLC na obrácených (reverzních) fázích (RP-HPLC), kde separace probíhá na nepolární stacionární fázi, nejčastěji na silikagelu chemicky modifikovaném nepolárními skupinami, jako jsou C 8 (oktyl) nebo C 18 (oktadecyl), přičemž jako mobilní fáze se používá polárnějších kapalin (methanol, acetonitril) a jejich směsí s vodou či vodnými pufry. K separaci studovaných azobarviv vyhovuje ve spojení s C 18 stacionární fází směs methanolu s vodou (9:1). Studovaná barviva lze detegovat fotometrickým detektorem při vlnové délce 290 nm, kde všechna vykazují dostatečně silnou absorbci záření. Identifikace se provádí na základě shody retenčních časů, t R, případně retenčních faktorů, k, měřených látek a standardů. Kvantitativní složení vzorku se zjistí metodou absolutní kalibrace na základě proměření kalibračních křivek pro jednotlivé standardní roztoky čistých azobarviv. Pokročilé praktikum - HPLC 1
3 Pracovní postup 3.1 Příprava mobilní fáze Katedra analytické chemie PřF UK Praha Pokud není k dispozici dostatek mobilní fáze, připravte asi 500 ml mobilní fáze o složení methanol + voda (9:1) - smíchejte 450 ml methanolu a 50 ml destilované vody odměřené příslušnými odměrnými válci; nedoplňujte - při míšení methanolu a vody není v důsledku vysoké polarity obou kapalin plně zachována aditivita objemů - přefiltrujte připravenou mobilní fázi - pokud je to nutné, odplyňte mobilní fázi (mf) v ultrazvukové lázni asi 10 min 3.2 Příprava měřícího zařízení - zapněte pumpu a detektor alespoň 20-30 min před první analýzou - zapněte lampu detektoru a nechte systém stabilizovat; před první analýzou detektor vynulujte (ZERO, AUTOZERO) - naplňte pístovou pumpu mobilní fází, popř. propojte láhev s mf s pumpou - odstraňte vzduchové bubliny ze všech propojovacích trubiček a z pumpy - nastavte a zapněte průtok mf 0,5 až 1 ml/min - zapněte počítač, nastartujte program Clarity a připravte ho pro sběr dat pod vaším jménem 3.3 Příprava vzorků Pokud nejsou vzorky v odměrných baňkách, jsou připraveny přímo k měření, není třeba žádné operace a lze je přímo použít k dávkování. Pokud jsou v odměrných baňkách je třeba je doplnit mobilní fází po rysku. Vzorky jsou směsné a obsahují obě barviva. 3.4 Příprava kalibračních roztoků - zásobní roztoky standardů azobarviv mají koncentraci 1.10-3 mol/l - vhodným ředěním připravte do odměrných baněk roztoky jednotlivých azobarviv o vhodných koncentracích (rozsah sdělí dozor). Pozor, ředíme mobilní fází, nikoliv vodou! Pokročilé praktikum - HPLC 2
3.5 Dávkování - dávkování se provádí dávkovacími ventily vybavenými dávkovacími smyčkami o velikosti 20 nebo 10 μl - dávkovací smyčky plníme plastovými stříkačkami o vhodném objemu, když je dávkovací ventil v poloze pro plnění smyčky (LOAD); smyčku bychom měli proplachovat alepoň 10ti násobným objemem smyčky - po naplnění smyčky vzorkem přepneme rychlým a plynulým pohybem páky dávkovací ventil do dávkovací polohy (INJECT) a spustíme okamžitě sběr dat počítačem - po ukončení analýzy zastavíme sběr dat a zapíšeme retenční čas, plochu a výšku píků 4 Provedení 4.1 Identifikace azobarviv - analýzou libovolného roztoku z kalibrační řady samostatných standardů azobarviv určete jejich retenční časy, t R 4.2 Kalibrace - proměřte všechny připravené kalibrační roztoky azobarviv a zaznamenejte plochy a výšky píků; každý roztok změřte 3 krát, výsledná data statisticky zpracujte a zapište do výsledkových listů - ze získaných dat sestrojte pro obě barviva grafy kalibračních závislostí, jednu pro plochy píků a jednu pro výšky píků; k jednotlivým bodům kalibračních závislostí udejte směrodatné odchylky ve formě chybových úseček (jen pro y osu) - analýzou rozptylu experimentálních dat kolem kalibrační přímky vypočítejte meze detekce a meze stanovitelnosti metody - sestrojte příslušné grafy a vypočítejte z nich koeficienty linearity detektoru jak pro výšky tak i pro plochy píků - graficky ověřte a doložte, že vaše kalibrační řady leží v lineárním dynamickém rozsahu detektoru 4.3 Analýza vzorků - stejným způsobem jako kalibrační roztoky proměřte vaše vzorky azobarviv a zaznamenejte příslušné t R, výšky a plochy píků; měření opakujte min. 3 krát - dosazením do regresních rovnic či odečtem z kalibračních závislostí pro plochu a pro výšku určete koncentraci azobarviv ve vašem vzorku v jednotkách mol/l Pokročilé praktikum - HPLC 3
- pro obě barviva srovnejte na α = 0,05 zda jsou výsledky získané z kalibračních závislostí pro plochu a pro výšku statisticky rozdílné - dejte pozor, zda vaše naměřené koncentrace vzorků neleží pod mezemi detekce či stanovitelnosti - pokud ano, vyvoďte z toho patřičné závěry a důsledky K protokolu se odevzdává 6 grafů: 2 x kalibrace, 2 x linearita, 2 x lin. dynamický rozsah (každý graf se dvěma barvivy). Poděkování Tato úloha je prováděna na přístrojovém vybavení získaném díky Fondu rozvoje vysokých škol v rámci projektu FRVŠ 275/2006. Pokročilé praktikum - HPLC 4
VÝSLEDKOVÉ LISTY HPLC Stanovení azobarviv ve směsi metodou RP-HPLC se spektrofotometrickou detekcí Úloha vypracována dne: Turnus číslo: Datum odevzdání protokolu: Studijní obor: V pořádku dne: Přepracovat a doplnit (+ datum): Výsledky: formát ( výsledek ± L 1,2 ). společný exponent mol/l (RSD %) Vzorek obsahuje: z výšky píku MO (... ±... )... mol/l (... % ) DMŽ (... ±... )... mol/l (... % )... z plochy píku MO (... ±... )... mol/l (... % ) DMŽ (... ±... )... mol/l (... % ) Statistická shoda výsledků počítaných z výšky a z plochy : methyloranž - ANO / NE, dimethylová žluť - ANO/NE (zakroužkujte) Pokročilé praktikum - HPLC -Výsledkový list 1
VÝSLEDKOVÝLIST HPLC Experimentální podmínky Typ přístroje: HPLC Pumpa:... HPLC Detektor:... HPLC kolona: název..., délka:... cm, průměr:... mm, velikost částic nosiče sf:... μm, výrobce:... Průtoková rychlost mf:... ml/min Citlivost detektoru:... Vlnová délka:... nm Objem dávkovací smyčky:... μl Pokročilé praktikum - HPLC -Výsledkový list 2
VÝSLEDKOVÝLIST HPLC Tabulka 1: Data kalibrační závislosti pro azobarviva Koncentrace (mol/l) Měření 1 Retenční čas (min) MO Plocha píku (a.u.) Výška píku (mv) Retenční čas (min) DMŽ Plocha píku (a.u.) Výška píku (mv) 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 - - Blank 2 - - 3 - - Pokročilé praktikum - HPLC -Výsledkový list 3
VÝSLEDKOVÝLIST HPLC Tabulka 2: Směrodatné odchylky dat kalibrační závilsosti pro MO Koncentrace (mol/l) Retenční čas (min) Směrodatná odchylka Relativní směrodatná odchylka (%) Plocha píku (a.u.) Výška píku (mv) Retenční čas Plocha píku Výška píku Blank - - Pokročilé praktikum - HPLC -Výsledkový list 4
VÝSLEDKOVÝ LIST HPLC Tabulka 3: Směrodatné odchylky dat kalibrační závilsosti pro DMŽ Koncentrace (mol/l) Retenční čas (min) Směrodatná odchylka Relativní směrodatná odchylka (%) Plocha píku (a.u.) Výška píku (mv) Retenční čas Plocha píku Výška píku Blank - - Pokročilé praktikum - HPLC -Výsledkový list 5
VÝSLEDKOVÝ LIST HPLC Tabulka 4: Kalibrační rovnice pro azobarviva - plochy píků Barvivo MO DMŽ Směrnice (l/mol) SD Směrnice (l/mol) Kalibrační rovnice Úsek na ose y (a.u.) SD úseku (a.u.) Chyba střední hodnoty kalibrační přímky, S y,x Korelační koeficient, R Koeficient linearity detektoru, l Mez (mol/l) Detekce (LOD) Stanovitelnosti (LOQ) SD... směrodatná odhylka; měřené veličiny a jejich SD musejí být uváděny se stejnou přesností; R a l uvádějte na 4 desetinná místa Pokročilé praktikum - HPLC -Výsledkový list 6
VÝSLEDKOVÝ LIST HPLC Tabulka 5: Kalibrační rovnice pro azobarviva - výšky píků Barvivo MO DMŽ Směrnice (mv.l/mol) SD Směrnice (mv.l/mol) Kalibrační rovnice Úsek na ose y (mv) SD úseku (mv) Chyba střední hodnoty kalibrační přímky, S y,x Korelační koeficient, R Koeficient linearity detektoru, l Mez (mol/l) Detekce (LOD) Stanovitelnosti (LOQ) SD... směrodatná odhylka; měřené veličiny a jejich SD musejí být uváděny se stejnou přesností; R a l uvádějte na 4 desetinná místa Pokročilé praktikum - HPLC -Výsledkový list 7
VÝSLEDKOVÝ LIST HPLC Tabulka 6: Experimentální data naměřená pro vzorek Barvivo Měření Retenční čas (min) Vzorek Plocha píku (a.u.) Výška píku (mv) 1 MO 2 3 1 DMŽ 2 3 Pokročilé praktikum - HPLC -Výsledkový list 8
VÝSLEDKOVÝ LIST HPLC Tabulka 7: Statistické hodnocení experimentálních dat naměřených pro vzorek z ploch píků Barvivo MO DMŽ Aritmetický průměr (a.u.) Medián (a.u.) Plocha píku SD (a.u.) RSD (%) L 1 L 2 Aritmetický průměr (mol/l) Koncentrace SD (mol/l) RSD (%) L 1 L 2 L 1 a L 2 jsou dolní a horní hranice intervalu spolehlivosti příslušné veličiny Pokročilé praktikum - HPLC -Výsledkový list 9
VÝSLEDKOVÝ LIST HPLC Tabulka 8: Statistické hodnocení experimentálních dat naměřených pro vzorek z výšek píků Barvivo MO DMŽ Aritmetický průměr (mv) Medián (mv) Výška píku SD (mv) RSD (%) L 1 L 2 Aritmetický průměr (mol/l) Koncentrace SD (mol/l) RSD (%) L 1 L 2 L 1 a L 2 jsou dolní a horní hranice intervalu spolehlivosti příslušné veličiny Pokročilé praktikum - HPLC -Výsledkový list 10