CAPILLARYS / MINICAP URINE

CAPILLARYS / MINICAP URINE Ref. 2013 2014/06

ÚČEL POUŽITÍ Sada CAPILLARYS / MINICAP URINE je navržena pro přípravu vzorků moči před separací proteinů lidské moči v alkalickém tlumivém roztoku (ph 9,9) přístroji CAPILLARYS a MINICAP. Přístroje CAPILLARYS a MINICAP automaticky provádí celý postup k získání profilu proteinů moči pro kvalitativní analýzu nebo pro kvantitativní analýzu přístrojem CAPILLARYS (s programem PHORESIS verze 8.61). Proteiny separované v silika (kysličník křemičitý) kapilárách, jsou přímo detekovány při 200 nm. Elektroforeogramy mohou být vyhodnoceny vizuálně, aby byly vyšetřeny veškeré abnormality obrazu. Pro diagnostické použití In Vitro. PRINCIP TESTU Elektroforéza bílkovin je zavedená technika běžně používaná v klinických laboratořích pro vyšetření vzorků pro zjištění proteinových abnormalit (3, 4, 6, 12). Systémy CAPILLARYS a MINICAP byly vyvinut ke kompletní automatizaci s rychlým dělením a přijatelným rozlišením. V mnoha ohledech může být metodologie považována za typ mezičlánku mezi zónovou elektroforézou a kapalinovou chromatografií (4, 14). Přístroje CAPILLARYS a MINICAP používají princip kapilární elektroforézy ve volném roztoku. Elektricky nabité molekuly jsou děleny podle elektroforetické pohyblivosti v alkalickém tlumivém roztoku o určitém ph. Separace také probíhá podle ph elektrolitu a elektroosmotického toku (12). Přístroj CAPYLARYS má 8 kapilár pracujících souběžně, což umožňuje provádět 8 analýz současně. Přístroj MINICAP má 2 kapiláry pracující souběžně, což umožňuje provádět 2 analýzy současně. Vzorek je před analýzou připraven dialýzou a koncentrovány tlumivým roztokem a poté nastříknuty nasáním na anodickém konci kapiláry. Potom následuje vysokonapěťové dělení bílkovin a jejich přímá detekce při 200 nm na katodovém konci kapiláry. Kapiláry jsou ihned promývány promývacím roztokem a promytím tlumivým roztokem připraveny k další analýze. Bílkoviny v moči jsou separovány v alkalickém tlumivém roztoku do pěti různých zón a detekovány v následujícím pořadí: gamma zóna, beta zóna, alfa-2 zóna, alfa-1 zóna a albumin, kde každá zóna obsahuje jeden nebo více bílkovin. ČINIDLA A MATERIÁLY DODÁVANÉ V SADĚ CAPILLARYS / MINICAP URINE VAROVANÍ: Viz bezpečnostní listy. POLOŽKA KAT. Č. 2013 Tlumivý roztok pro dialýzu (zásobní roztok) 1 lahvička, 480 ml PRO DOSAŽENÍ OPTIMÁLNÍCH VÝSLEDKŮ: Všechny reagenty ze stejné sady musí být vždy používány společně a podle pokynů uvedených v příbalovém letáku. PROSÍME, ČTĚTE PEČLIVĚ PŘÍBALOVÝ LETÁK. VAROVANÍ: Nepoužívejte standardně prodávanou deionizovanou vodu, jako např. na žehlení (nebezpečí poškození důležitých kapilár). Používejte výhradně ultračistou vodu, jako je např. voda používaná k výrobě injekčních roztoků. TLUMIVÝ ROZTOK PRO DIALÝZU Příprava Lahvičku zásobního tlumivého roztoku pro dialýzu je třeba dvakrát zředit (obj./obj.) destilovanou nebo deionizovanou vodou (1 objemová jednotka tlumivého roztoku + 1 objemová jednotka destilované nebo deionizované vody). Po zředění obsahuje: tlumicí roztok s ph 9,9 ± 0,5; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Použití Tlumivý roztok pro dialýzu vzorků moči pro analýzu bílkovin v moči kapilární elektroforézou (viz "Příprava vzorku"). Skladování, stabilita a známky zhor šování Zásobní tlumivý roztok pro dialýzu skladujte při pokojové teplotě (15 až 30 C) nebo v chladničce (2 až 8 C). Roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky tlumivého roztoku. Neskladovat v blízkosti okna nebo tepelného zdroje. Zředěný tlumivý roztok pro dialýzu je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítcích lahviček tlumivého roztoku, a to při pokojové teplotě nebo v chladničce. POZNÁMKA: Pokud je tlumivý roztok pro dialýzu skladován při 2 8 C, doporučuje se nechat činidlo vytemperovat na pokojovou teplotu před použitím pro analýzu. NEZMRAZUJTE. Zředěný tlumivý roztok zneškodněte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku bakteriální kontaminace. POZNÁMKA: Během skladování se může barva zásobního tlumivého roztoku změnit na žlutou, což nemá nepříznivý vliv na jeho vlastnosti. - 327 - SEBIA NÁVOD - Czech

POSTUP POUŽITÍ PŘÍSTROJE CAPILLARYS URINE CAPILLARYS 1 a 2 verze 5.4x VAROVANÍ: Imunotypizaci vzorku moči není možné s touto verzí provést. POTŘEBNÁ ČINIDLA (ale neobsažená v sadě CAPILLARYS / MINICAP URINE) VAROVANÍ: Viz bezpečnostní listy. 1. SADA CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 (SEBIA, KAT. Č. 2003) Příprava, použití, skladování, stabilita a známky znehodnocení Viz návody obsažené v sadě. DŮLEŽITÉ: Součásti sady CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 jsou nezbytné pro provedení postupu použití přístroje CAPILLARYS URINE. Bezbarvé diluční segmenty dodané v sadě CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 nemohou být použity pro analýzu vzorků připravených 6 ml zkumavkami Vivaspin. 2. DESTILOVANÁ NEBO DEIONIZOVANÁ VODA Použití Pro ředění vzorků moči, je-li to nezbytné, a pro první dialýzu (viz "Příprava vzorků"). K vyplachování kapilár v přístroji SEBIA CAPILLARYS pro kapilární elektroforézu. Je doporučeno používat filtrovanou, destilovanou nebo deionizovanou vodu (na filtr o porozitě 0.45 μm) a s odporem vyšším než 10 megaohmů x cm. Vodu je nutno denně měnit, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci. Pro optimální provoz přidejte 35 µl/dl roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, kat. č. 2059, 1 lahvička obsahuje 5 ml). DŮLEŽITÉ: Před naplněním se doporučuje vyplachovací nádobu vymýt větším množstvím destilované nebo deionizované vody. 3. CAPICLEAN Složení Lahvička koncentrovaného roztoku CAPICLEAN (SEBIA, kat. č. 2058, 25 ml) obsahuje: proteolytické enzymy, povrchově aktivní láky a přídavné látky, nezbytné pro optimální provedení, v neškodných koncentracích. Použití K čištění vzorkovací sondy v automatickém přístroji CAPILLARYS SEBIA pro kapilární elektroforézu během čisticí sekvence CAPICLEAN. DŮLEŽITÉ : - Je-li během týdne analyzováno méně než 500 vzorků, spusťte alespoň jednou týdně sekvenci čištění CAPICLEAN. - Jestliže je během jednoho dne analyzováno méně než 500 vzorků, ale během týdne je analyzováno více než 500 vzorků, spusťte čistící sekvenci CAPICLEAN po každých 500 analýzách. - Je-li během dne analyzováno více než 500 vzorků, spusťte sekvenci čištění CAPICLEAN jednou denně. Viz návod k CAPICLEAN, SEBIA. DŮLEŽITÉ: Nepoužívejte opakovaně diluční segment po vyčištění vzorkovací sondy. Skladování, stabilita a známky zhoršování Roztok CAPICLEAN skladujte v chladničce (2 8 C). Je stabilní do data exspirace vyznačeného na štítku lahvičky. NEZMRAZUJTE. V lahvičce roztoku CAPICLEAN může být vidět sraženina nebo částice spojené v suspenzi (vločky) bez nežádoucích účinků na jeho použitelnost. Nerozpouštějte tuto sraženinu ani částice. Doporučuje se odebrat pouze supernatant. 4. ROZTOK CHLORNANU SODNÉHO (k čištění vzorkovací sondy) Příprava Připravte 9 chlorovaný roztok chlornanu sodného (2 až 3 % chlorid) naředěním 250 ml 9,6 % chlorovaného koncentrovaného roztoku v 1 litru studené destilované nebo deionizované vody. Použití Pro čištění vzorkovací sondy přístroje CAPILLARYS (každotýdenní údržba pro odstranění proteinů nasorbovaných na sondu). Viz návod k systému SEBIA CAPILLARYS. Použijte stojan na vzorky, určený k čištění kapilár (č. 100). Umístěte zkumavku obsahující 2 ml (2 3 %) zředěného chlorovaného roztoku na pozici č. 1 stojanu na vzorky. Pro údržbu v přístroji CAPILLARYS vsuňte stojan na vzorky č. 100. V okénku "MAINTENANCE", které se objeví na obrazovce, zvolte "Launch the probe cleaning (chlorinated sodium hypochlorite solution or CDT wash solution)" a potvrďte. Skladování, stabilita a známky zhoršování Pracovní chlorovaný roztok skladujte v uzavřené nádobě při teplotě místnosti. Roztok je stabilní 3 měsíce. Roztok neskladujte na slunečním světle, blízko tepelného nebo zápalného zdroje, kyselin a amoniaku. 5. PROMÝVACÍ ROZTOK CAPILLARYS / MINICAP Příprava Každá lahvička promývacího roztoku CAPILLARYS / MINICAP (SEBIA, kat č. 2052, 2 lahvičky, 75 ml) může být zředěna destilovanou nebo deionizovanou vodou na 750 ml. Po zředění vznikne promývací roztok obsahující zásaditý roztok ph 12. - 328 -

Použití Promývání kapilár CAPILLARYS. Tento doplňkový promývací roztok je potřebný, je-li počet testů v sérii menší než 40. DŮLEŽITÉ: Před naplněním nádoby na promývací se roztok se doporučuje vymýt otvor nádoby a zkumavku větším množstvím destilované nebo deionizované vody, aby se zabránilo srážení solí. Podrobné informace viz pokyny. Skladování, stabilita a známky zhoršování Zαsobní i pracovní roztok skladujte v uzavřených nádobách při pokojové teplotě nebo v chladničce. Zásobní promývací roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky promývacího roztoku. Pracovní promývací roztok je stabilní 3 měsíce. Pracovní promývací roztok zlikvidujte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku mikrobiální kontaminace. POZNΑMKY: Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda použitá pro rekonstituci roztoků musí být bez přítomnosti bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0.45 µm) a musí mít odpor vyšší než 10 megaohmů na cm. POTŘEBNÉ VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ 1. Přístroj CAPILLARYS SEBIA: CAPILLARYS, kat. č. 1220 nebo CAPILLARYS 2, kat. č. 1222. 2. Stojan na vzorky dodávaný se systémem CAPILLARYS. 3. Souprava nádob dodávaná se systémem CAPILLARYS: Vyplachovací nádoba (pro naplnění destilovanou nebo deionizovanou vodu) a nádoba na odpad. 4. Pro dialýzu a koncentraci vzorků moči : - Systém pro dialýzu SEBIA, kat. č. 9200: 24 zkumavek o objemu 20 ml s PES membránou 10 000 MWCO (mezní molekulová hmotnost 10 KDa), nebo - Systém pro dialýzu a koncentraci, typ Vivaspin 6 ml, s PES membránou 10 000 MWCO (mezní molekulová hmotnost 10 KDa), VIVASCIENCE, nebo obdobným prostředkem se stejnými parametry schváleným pro klinické použití. DŮLEŽITÉ: Přečtěte si, prosím, pozorně návody všech dialyzačních a koncentračních prostředků. 5. Swing-bucket centrifuga s rotory pro zkumavky o průměru 17 mm a délce 122 mm (za použití 6 ml zkumavek Vivaspin ) nebo pro zkumavky o průměru 30 mm a délce 116 mm (za použití dialyzačních systémů SEBIA). 6. Zelené diluční segmenty SEBIA, kat.č 2081, pro přístroje CAPILLARYS pro analýzy vzorků připravených v 6 ml zkumavkách Vivaspin. 7. Pipety: 200 µl, 1 ml a 5 ml. VZORKY PRO ANALÝZU Odběr a skladování vzorků Analýza se přednostně provádí s čerstvou močí odebranou během 24 hodin. Odběr moči musí být v souladu s následujícími postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. POZNÁMKA: Pro analýzu je nejvhodnější vzorek moči odebraný během 24 hodin, ale pro kvalitativní analýzu je také možné použít náhodný vzorek moči. Vzorky je možno skladovat chlazené mezi 2 až 8 C po dobu jednoho týdne. Pro skladování na delší dobu se doporučuje skladovat moč zmraženou na 70 C (stabilní nejméně jeden měsíc). DŮLEŽITÉ: Neskladujte vzorky při teplotě 20 C. Roztáté či nevhodně skladované vzorky mohou vzhledem k degradaci proteinů vykazovat modifikované a jiné další struktury. POZNÁMKA: Vzorky by neměly být skladovány při pokojové teplotě! Příprava vzorků Pro nejlepší regeneraci bílkovin moči se velmi doporučuje použít centrifugační prostředky pro odsolení / koncentraci vzorku, jako krok při zpracování v rámci této analýzy. DŮLEŽITÉ: Technika analýzy moči kapilární elektroforézou vyžaduje 2 kroky: dialyzační krok a koncentrační krok vzorků moči pomocí dialyzačních systémů SEBIA (zkumavky 20 ml) nebo se zkumavkami Vivaspin o objemu 6 ml. Použijte pouze jednu zkumavku na vzorek. Následující parametry jsou indikovány pro použití dialyzačních systémů SEBIA nebo zkumavek Vivaspin o objemu 6 ml s použitím swingbucket centrifugy. Důkladně si, prosím, projděte návody ke každému dialyzačnímu a koncentračnímu prostředku, týkající se použití s centrifugou s pevným úhlem. Než přikročíte k analýze, připravte každý vzorek podle jednoho z následujících postupů: POZNÁMKA: Zásobní dialyzační tlumivý roztok zřeďte dvakrát (obj./obj.) destilovanou nebo deionizovanou vodou a získejte tak pracovní dialyzační tlumivý roztok (1 objemová jednotka tlumivého roztoku + 1 objemová jednotka destilované nebo deionizované vody). Příprava vzorků s dialyzačním systémem SEBIA (a pouze bezbarvé diluční segmenty dodané v sadě CAPILLARYS PROTEIN(E) 6) 1. Kvantifikujte celkovou koncentraci bílkovin v analyzovaném vzorku moči. 2. Odstřeďte 5 ml čisté moči při 4 300 g* po dobu 10 minut. 3. Odeberte supernatant. - 329 -

4. Každý vzorek připravte v novém dialyzačním systému podle jeho celkové koncentrace bílkovin: - Jestliže je celková koncentrace bílkovin 100 mg/dl: smíchejte ve zkumavce 1 ml moči s 9 ml destilované nebo deionizované vody. - Jestliže je celková koncentrace bílkovin v rozmezí 100 a 300 mg/dl: smíchejte ve zkumavce 0,25 ml moči s 10 ml destilované nebo deionizované vody. - Jestliže je celková koncentrace bílkovin nad 300 mg/dl: zřeďte nejprve moč destilovanou nebo deionizovanou vodou na koncentraci bílkovin 300 mg/dl; poté smíchejte ve zkumavce 0,25 ml zředěné moči s 10 ml destilované nebo deionizované vody. 5. Homogenizujte zředěnou moč. 6. Vyrovnejte obsah zkumavek destilovanou nebo deionizovanou vodou a odstřeďte je při 4 000 g* po dobu 30 minut. VAROVANÍ: Po zkoncentrování odstředěním musí být získaný objem do 0,2 ml. 7. Přidejte 10 ml pracovního dialyzačního tlumivého roztoku na dialyzační systém. 8. Vyrovnejte obsah zkumavek pracovním dialyzačním tlumivým roztokem a odstřeďte je při 4 000 g* po dobu 30 minut. 9. Po odstředění, je-li konečný objem nižší než 0,2 ml, přidejte do konečného objemu 0,2 ml pracovní dialyzační tlumivý roztok (poté, co se vyrovnala spodní úroveň menisku). 10. Homogenizujte vzorek ve zkumavce. 11. Odeberte 200 µl dialyzované moči a převeďte ji přímo do komory nového bezbarvého dilučního segmentu. 12. Zlikvidujte dialyzační systém. nebo CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06 Příprava vzorků se zkumavkami Vivaspin o objemu 6 ml (a pouze zelené diluční segmenty) 1. Kvantifikujte celkovou koncentraci bílkovin v analyzovaném vzorku moči. 2. Odstřeďte 5 ml čisté moči při 4 300 g* po dobu 10 minut. 3. Odeberte supernatant. 4. Podle jeho celkové koncentrace bílkovin připravte každý vzorek v nové zkumavce Vivaspin o objemu 6 ml: - Jestliže je celková koncentrace bílkovin 100 mg/dl: smíchejte ve zkumavce 0,5 ml moči s 5,5 ml destilované nebo deionizované vody. - Jestliže je celková koncentrace bílkovin v rozmezí 100 a 300 mg/dl: smíchejte ve zkumavce 0,125 ml moči s 6 ml destilované nebo deionizované vody. - Jestliže je celková koncentrace bílkovin nad 300 mg/dl: zřeďte nejprve moč destilovanou nebo deionizovanou vodou na koncentraci bílkovin 300 mg/dl; poté smíchejte ve zkumavce 0,125 ml zředěné moči s 6 ml destilované nebo deionizované vody. 5. Homogenizujte zředěnou moč. 6. Vyrovnejte obsah zkumavek destilovanou nebo deionizovanou vodou a odstřeďte je při 3 500 g* po dobu 30 minut. VAROVANÍ: Po zkoncentrování odstředěním musí být získaný objem do 0,1 ml. 7. Zlikvidujte roztok obsažený ve spodní části zkumavky Vivaspin. 8. Přidejte 6 ml pracovního dialyzačního tlumivého roztoku na zkumavku Vivaspin. 9. Vyrovnejte obsah zkumavek pracovním dialyzačním tlumivým roztokem a odstřeďte je při 3 500 g* po dobu 30 minut. 10. Po odstředění, je-li konečný objem nižší než 0,1 ml, přidejte pracovní dialyzační tlumivý roztok do konečného objemu 0,1 ml (poté, co se vyrovnala spodní úroveň menisku). 11. Homogenizujte vzorek ve zkumavce. 12. Odeberte 100 µl dialyzované moči a převeďte ji přímo do komory nového zeleného dilučního segmentu. 13. Zlikvidujte zkumavku Vivaspin. DŮLEŽITÉ: Analýzu vzorků moči proveďte nejdéle jeden den po jejich přípravě. Z důvodu omezení adsorpce bílkovin na membráně dialyzačního a koncentračního prostředku (zkumavka Vivaspin o objemu 6 ml tube nebo dialyzační systém SEBIA), se nedoporučuje uchovávat vzorek po odstředění ve zkumavce, ale v mikrozkumavce skladované v chladničce (při teplotě mezi 2 a 8 C). * Pro vypočítání číselné hodnoty ot./min. odpovídající rotoru nahlédněte do návodu centrifugy. Pokyny k použití dialyzačního a koncentračního prostředku s swing-bucket centrifugou a centrifugou s pevným úhlem se liší. Pečlivě si projděte odpovídající návody. Vzorky, které není vhodné používat Nepoužívejte staré, nesprávně skladované vzorky moči, mohl by se změnit obsah frakce v důsledku denaturace. Doporučuje se pozorovat vlastnosti vzorku moči po prvním odstředění (4 300 g po dobu 10 minut) (např. známky hemolýzy nebo turbidity). Neskladujte vzorky v dialyzačních a koncentračních zařízeních, některé bílkoviny by se mohly vázat na membránu. Dialyzované vzorky moči neuchovávejte v dilučním segmentu déle než 30 minut. POSTUP Přístroj CAPILLARYS je multiparametrovým zařízením pro analýzu bílkovin v moči na 8 paralelních kapilárách v následujícím pořadí: přečtení čárového kódu stojanu se vzorky, promytí kapilár, nastříknutí vzorků, analýza bílkovin a přímá detekce v kapilárách. - 330 -

Manuální kroky zahrnují: přípravu vzorků (dialýza a koncentrace), aplikace vzorků do komor dilučních segmentů (bezbarvý nebo zelený diluční segment podle použitého dialyzačního a koncentračního prostředku), umístění dilučních segmentů se vzorky do stojanu na vzorky a identifikace vzorků, umístění stojanů do přístroje CAPILLARYS, vyjmutí stojanů se vzorky po provedení analýzy. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K SYSTÉMU CAPILLARYS. I. PŘÍPRAVA ELEKTROFORETICKÉ ANALÝZY 1. Zapněte přístroj a počítač CAPILLARYS 2. Spusťte software a automaticky se spustí přístroj. 3. Proveďte analýzu vzorků moči připravených pomocí sady CAPILLARYS URINE analytickým programem "URINE" na přístroji CAPILLARYS s tlumivým roztokem CAPILLARYS PROTEIN(E) 6. Pro informace jak zvolit analytický program "URINE" a jak umístit lahvičky s tlumivým roztokem CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 do přístroje si přečtěte návod k obsluze zařízení CAPILLARYS. 4. Naplňte stojan na vzorky novými dilučními segmenty naplněnými vzorky dialyzované moči. 100 µl vzorku do komory zeleného dilučního segmentu nebo 200 µl vzorku do komory bezbarvého dilučního segmentu. Jestliže segment chybí, bude stojan se vzorky vysunut. DŮLEŽITÉ: Je-li počet vzorků k analýze nižší než 8, doplňte diluční segment destilovanou nebo deionizovanou vodou. 5. Otvorem ve střední části přístroje zasuňte celý stojan na vzorky do přístroje CAPILLARYS. Postupně v jednom sledu lze umístit do přístroje až 4 stojany se vzorky. 6. Stojany s již analyzovanými vzorky vyjměte z prostoru na levé straně přístroje. 7. Pečlivě odstraňte diluční segmenty ze stojanů na vzorky a zlikvidujte je. VAROVANÍ: S diluční segmenty s biologickými vzorky je třeba zacházet opatrně. ŘEDĚNÍ - MIGRACE - POPIS AUTOMATICKÝCH KROKŮ 1. Jsou přečteny čárové kódy na stojanech se vzorky obsahujícími diluční segmenty a vzorky moči k analýze. 2. Kapiláry jsou promyty. 3. Vzorky jsou nastříknuty do kapilár. 4. Migrace probíhá za konstantního napětí po dobu 4 minut a je řízena Peltiérovým jevem. 5. Bílkoviny se detekují přímo skenováním při 200 nm a na obrazovce přístroje se objeví elektroforetický profil. POZNÁMKA: Tyto kroky jsou popsány pro první stojan se vzorky. Výsledky elektroforézy se objeví po 10 minutách. První krok (čtení čárového kódu) je prováděn vždy během analýzy předchozího stojanu se vzorky. II. VÝSLEDEK ANALÝZY Po skončení analýzy mohou být analyzovány elektroforetické profily a vizuálně vyhodnoceny abnormality obrazu. Pozice různých zón (albumin, alfa 1, alfa 2, beta a gama) jsou identifikovány na obrazovce a ve zprávě o výsledcích. POZNÁMKA: Pro každý ze 3 postupů přípravy je u rozsahu obrazu vizualizovaného na ose y brána v úvahu celková koncentrace bílkovin každého analyzovaného vzorku. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K SYSTÉMU CAPILLARYS. III. UKONČENÍ SÉRIE ANALÝZ Po ukončení každé sekvence analýzy musí operátor zahájit postup "stand by" (přepnutí do pohotovostního režimu) nebo "shut down" (vypnutí) přístroje CAPILLARYS, aby se kapiláry uložily v optimálních podmínkách. IV. PLNĚNÍ REAGENČNÍCH NÁDOB Přístroj CAPILLARYS automaticky kontroluje přítomnost reagentů. DŮLEŽITÉ: Dodržujte pokyny pro výměnu reagenčních nádob s ohledem na barevný kód pro lahvičky a spojovací části. V případě nezbytného provedení jednoho z následujících úkonů bude zobrazena zpráva: Vložte novou lahvičku s tlumivým roztokem a / nebo, Naplňte nádobu pracovním promývacím roztokem a / nebo, Naplňte nádobu filtrovanou destilovanou nebo deionizovanou vodou k vyplachování kapilár a / nebo, Vyprázdněte odpadní nádobu. CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06 VAROVANÍ: Nepoužívejte standardně prodávanou deionizovanou vodu, jako např. na žehlení (nebezpečí poškození důležitých kapilár). Používejte výhradně ultračistou vodu, jako je např. voda používaná k výrobě injekčních roztoků. DŮLEŽITÉ: Před naplněním se doporučuje vyplachovací nádobu vymýt větším množstvím destilované nebo deionizované vody. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K SYSTÉMU CAPILLARYS. VÝSLEDKY Interpretace Interpretace je kvalitativní. Jako pomoc při interpretaci obrazu je možné přiložit kontrolní sérum Normal Control Serum (SEBIA, kat. č. 4785) a získat tak referenční obraz. Rekonstituujte lyofilizované sérum destilovanou nebo deionizovanou vodou, zřeďte jej 40 krát v pracovním dialyzačním tlumivém roztoku a zředěné sérum přímo analyzujte, stejně jako vzorek moči. - 331 -

Fyziologická proteinurie (1, 2, 7, 8, 9, 13) : Obvykle je slabá, méně než 120 mg / 24 hodin a nejsou významné rozdíly mezi elektroforetickými profily mužů a žen. Hlavním proteinem je albumin, společně se stopami transferinu a imunoglobulinů. Proteinurii vyšší než 120 mg / 24 hodin je třeba považovat za patologickou. Pozitivní proteinurie (> 120 mg / 24 hodin) by měla být následována kvalitativní analýzou eliminovaných proteinů (5). Elektroforéza moči je prováděna za účelem zjištění monoklonálních komponent, zejména Bence-Jonesových bílkovin (volný lehký řetězec) a dalších proteinů v moči. Při srovnání s normálním obrazem se zejména v zóně gamaglobulinu nebo betaglobulinu nachází další frakce, která má souvislost s poruchou (9, 10, 11). Elektroforéza moči je účinná při detekci monoklonálních komponent (monoklonálních imunoglobulinů nebo volných lehkých řetězců) s nízkou koncentrací přibližně okolo 2,0 mg/dl. Pro charakterizaci monoklonálních a oligoklonálních komponent je doporučena identifikace imunofixací pomocí sad HYDRAGEL BENCE JONES, HYDRAGEL IF a HYDRAGEL URINE PROFIL(E) SEBIA a specifického antiséra volných lehkých řetězců anti-kappa a anti-lambda. Pro charakterizaci podezřelých tubulárních, glomerulárních nebo smíšených proteinurií po kapilární elektroforéze, jsou nezbytné doplňkové testy, jako je například elektroforéza pomocí sad SEBIA HYDRAGEL PROTEINURIE nebo HYDRAGEL URINE PROFIL(E) nebo nefelometrická imunoanalýza (3). Pro pomoc při interpretaci výsledků elektroforézy močových bílkovin, viz LITERATURA. Zvláštní případy: - U vzorků moči s celkovou koncentrací bílkovin nižší než 15 mg/dl (před přípravou na analýzu) je možné zobrazit proteinové pozadí (smear) na celém obrazu. - Jestliže se v beta a gamma zóně vyskytují podezřelé abnormality, je doporučeno provést další analýzu Bence-Jonesových bílkovin, a to bez ohledu na celkovou koncentraci bílkovin. Rušení a omezení Viz VZORKY PRO ANALÝZU. Analyzuje pouze vzorky připravené dialyzačními a koncentračními prostředky, viz část POTŘEBNÉ VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ, jako jsou zkumavky Vivaspin o objemu 6 ml, dialyzační systémy SEBIA nebo obdobným prostředkem se stejnými parametry schváleným pro klinické použití. Chybná dialýza vzorků může způsobit nebílkovinné zbytkové frakce. Pokud je podezření na výskyt rušivé frakce, doporučuje se provést dialýzu vzorku moči znovu. Rušení, například zbytky léků nebo soli, jsou odstraněna během dialyzačního kroku. Pokud není tento krok pečlivě dodržován, mohou být pozorovány umělé píky. Vzhledem k omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy je možné, že některé bílkoviny v moči nebudou touto metodou detekovány. Odstraňování závad a řešení problémů Jestliže se test nepovede provést, přestože byly přísně dodržovány veškeré pokyny týkající se přípravy, skladování materiálů a samotného postupu, obraťte se na společnost SEBIA. Bezpečnostní datové listy sady reagentů a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostních pravidlech používaných společností SEBIA a obalech pro přepravu biologických vzorků a čištění přístrojů jsou k dispozici na DVD s "NΑVODY A BEZPEČNOSTNÍMI DATOVÝMI LISTY". - 332 -

CAPILLARYS 1 & 2 (PHORESIS verze 6.x) CAPILLARYS 2 FLEX-PIERCING (PHORESIS verze 8.60) POZNÁMKA: V tomto návodu se název "CAPILLARYS" používá pro automatické přístroje CAPILLARYS, CAPILLARYS 2 a CAPILLARYS 2 FLEX- PIERCING od společnosti SEBIA. POTŘEBNÁ ČINIDLA (ale neobsažená v sadě CAPILLARYS / MINICAP URINE) VAROVANÍ: Viz bezpečnostní listy. 1. SADA CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 (SEBIA, KAT. Č. 2003) Příprava, použití, skladování, stabilita a známky znehodnocení Viz návody obsažené v sadě. DŮLEŽITÉ: Součásti sady CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 jsou nezbytné pro provedení postupu použití přístroje CAPILLARYS URINE. VAROVANÍ: Pro analýzu vzorků technikou CAPILLARYS URINE nepoužívejte bezbarvé diluční segmenty dodávané v sadě CAPILLARYS PROTEIN(E) 6. 2. KONTROLNÍ SÉRUM NORMAL CONTROL SERUM Složení Sérum Normal Control Serum (SEBIA, kat. č. 4785) se získává ze zásobního normálního lidského séra. Sérum Normal Control Serum je ve stabilizované lyofilní formě. Zamýšlené použití Normal Control Serum je určeno k použití před započetím nového postupu analýzy, pro normalizaci kapilár a pro kontrolu migrace bílkovin lidské moči při elektroforetické proceduře CAPILLARYS URINE. Rekonstituujte obsah každé lahvičky Normal Serum Control v 1 ml destilované nebo deionizované vody. Nechte 30 minut stát a lehce zamíchejte (zamezte tvorbě pěny). Rekonstituovaný roztok séra Normal Control Serum lze používat jako normální lidské sérum. Normalizace kapilár viz odstavec "Příprava elektroforetické analýzy". Skladování, stabilita a známky zhoršování Před přípravou skladujte lyofilizované Normal Control Serum v chladničce (2 až 8 C). Je stabilní do data exspirace vyznačeného na krabici nebo na štítku lahvičky. Rekonstituované Normal Control Serum skladujte při teplotě 2 8 C. Vzhledem k riziku mikrobiologické kontaminace a denaturace jej použijte během jednoho týdne. Rekonstituované sérum může být rovněž zmraženo (v alikvotních podílech) a uloženo při teplotě - 18 / - 30 C po dobu nejvýše 6 měsíců. Před použitím uložte rozmražené Normal Control Serum při teplotě 2 8 C a použijte jej během jednoho dne. POZNÁMKA: Pro nejlepší použití přístrojem CAPILLARYS se doporučuje před zmražením rozdělit alikvotní podíly séra Normal Control Serum do zkumavek. POZNÁMKA: Během přepravy může být lyofilizované Control Serum uchováno bez chlazení (15 až 30 C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti. Žádná zkušební metoda nemůže poskytnout absolutní důkaz o nepřítomnosti HIV, hepatitidy B nebo C a dalších infekčních činitelů. Proto je nutné zacházet s kontrolním sérem jako s nebezpečným biologickým materiálem. Tato šarže kontrolního séra je na základě zkoušky schválené FDA nebo ekvivalentním regulačním orgánem EU negativní na: - povrchový antigen hepatitidy B; - protilátky HCV; - protilátky HIV1 a HIV2. 3. DESTILOVANÁ NEBO DEIONIZOVANÁ VODA Použití Pro ředění vzorků moči, je-li to nezbytné, a pro první dialýzu (viz "Příprava vzorků"). K vyplachování kapilár v přístroji SEBIA CAPILLARYS pro kapilární elektroforézu. Je doporučeno používat filtrovanou, destilovanou nebo deionizovanou vodu (na filtr o porozitě 0.45 μm) a s odporem vyšším než 10 megaohmů x cm. Vodu je nutno denně měnit, aby nedošlo k mikrobiální kontaminaci. Pro optimální provoz přidejte 35 µl/dl roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, kat. č. 2059, 1 lahvička obsahuje 5 ml). DŮLEŽITÉ: Před naplněním se doporučuje vyplachovací nádobu vymýt větším množstvím destilované nebo deionizované vody. 4. CAPICLEAN Složení Lahvička koncentrovaného roztoku CAPICLEAN (SEBIA, kat. č. 2058, 25 ml) obsahuje: proteolytické enzymy, povrchově aktivní láky a přídavné látky, nezbytné pro optimální provedení, v neškodných koncentracích. Použití K čištění vzorkovací sondy v automatickém přístroji CAPILLARYS SEBIA pro kapilární elektroforézu během čisticí sekvence CAPICLEAN. - 333 -

DŮLEŽITÉ : - Je-li během týdne analyzováno méně než 500 vzorků, spusťte alespoň jednou týdně sekvenci čištění CAPICLEAN. - Jestliže je během jednoho dne analyzováno méně než 500 vzorků, ale během týdne je analyzováno více než 500 vzorků, spusťte čistící sekvenci CAPICLEAN po každých 500 analýzách. - Je-li během dne analyzováno více než 500 vzorků, spusťte sekvenci čištění CAPICLEAN jednou denně. Viz návod k CAPICLEAN, SEBIA. DŮLEŽITÉ: Nepoužívejte opakovaně diluční segment po vyčištění vzorkovací sondy. Skladování, stabilita a známky zhoršování Roztok CAPICLEAN skladujte v chladničce (2 8 C). Je stabilní do data exspirace vyznačeného na štítku lahvičky. NEZMRAZUJTE. V lahvičce roztoku CAPICLEAN může být vidět sraženina nebo částice spojené v suspenzi (vločky) bez nežádoucích účinků na jeho použitelnost. Nerozpouštějte tuto sraženinu ani částice. Doporučuje se odebrat pouze supernatant. 5. ROZTOK CHLORNANU SODNÉHO (k čištění vzorkovací sondy) Příprava Připravte 9 chlorovaný roztok chlornanu sodného (2 až 3 % chlorid) naředěním 250 ml 9,6 % chlorovaného koncentrovaného roztoku v 1 litru studené destilované nebo deionizované vody. Použití Pro čištění vzorkovací sondy přístroje CAPILLARYS (každotýdenní údržba pro odstranění proteinů nasorbovaných na sondu). Viz návod k systému SEBIA CAPILLARYS. Použijte stojan na vzorky, určený k čištění kapilár (č. 100). Umístěte zkumavku obsahující 2 ml (2 3 %) zředěného chlorovaného roztoku na pozici č. 1 stojanu na vzorky. Pro údržbu v přístroji CAPILLARYS vsuňte stojan na vzorky č. 100. V okně "MAINTENANCE" (Údržba), které se objeví na obrazovce, zvolte "Launch the probe cleaning (chlorinated sodium hypochlorite solution" (Spustit čištění sondy roztokem chlornanu sodného) a potvrďte. Skladování, stabilita a známky zhoršování Pracovní chlorovaný roztok skladujte v uzavřené nádobě při teplotě místnosti. Roztok je stabilní 3 měsíce. Roztok neskladujte na slunečním světle, blízko tepelného nebo zápalného zdroje, kyselin a amoniaku. 6. PROMÝVACÍ ROZTOK CAPILLARYS / MINICAP Příprava Každá lahvička promývacího roztoku CAPILLARYS / MINICAP (SEBIA, kat č. 2052, 2 lahvičky, 75 ml) může být zředěna destilovanou nebo deionizovanou vodou na 750 ml. Po zředění vznikne promývací roztok obsahující zásaditý roztok ph 12. Použití Promývání kapilár CAPILLARYS. Tento doplňkový promývací roztok je potřebný, je-li počet testů v sérii menší než 40. DŮLEŽITÉ: Před naplněním nádoby na promývací se roztok se doporučuje vymýt otvor nádoby a zkumavku větším množstvím destilované nebo deionizované vody, aby se zabránilo srážení solí. Podrobné informace viz pokyny. Skladování, stabilita a známky zhoršování Zásobní i pracovní roztok skladujte v uzavřených nádobách při pokojové teplotě nebo v chladničce. Zásobní promývací roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky promývacího roztoku. Pracovní promývací roztok je stabilní 3 měsíce. Pracovní promývací roztok zlikvidujte, pokud se změní jeho vzhled, například se zakalí v důsledku mikrobiální kontaminace. POZNΑMKY: Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda použitá pro rekonstituci roztoků musí být bez přítomnosti bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0.45 µm) a musí mít odpor vyšší než 10 megaohmů na cm. POTŘEBNÉ VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ 1. Přístroje SEBIA CAPILLARYS: CAPILLARYS, kat. č. 1220, CAPILLARYS 2, kat. č. 1222 nebo CAPILLARYS 2 FLEX-PIERCING, kat. č. 1227. 2. Stojan na vzorky dodávaný se systémem CAPILLARYS. 3. Souprava nádob dodávaná se systémem CAPILLARYS: Vyplachovací nádoba (pro naplnění destilovanou nebo deionizovanou vodu), nádoba na promývací roztok a odpadní nádoba. 4. Dialyzační systém SEBIA, kat. č. 9200, 24 zkumavek o objemu 20 ml s PES membránou 10 000 MWCO (mezní molekulová hmotnost 10 KDa) pro dialýzu a koncentraci vzorků moči, nebo obdobný prostředek se stejnými parametry schválený pro klinické použití, s jehož použitím dosáhneme konečného objemu dialyzovaného a koncentrovaného vzorku moči 500 µl (objem vzorku nezbytný pro provedení analýzy technikami CAPILLARYS URINE a IMMUNOTYPING URINE). DŮLEŽITÉ: Přečtěte si, prosím, pozorně návody všech dialyzačních a koncentračních prostředků. 5. Swing-bucket centrifuga s rotory pro zkumavky o průměru 30 mm a délce 116 mm, při použití dialyzačního systému SEBIA. 6. Zelený diluční segment SEBIA, kat. č. 2081, pro přístroj CAPILLARYS. 7. Pipety: 200 µl, 1 ml a 5 ml. 8. Mikrozkumavky 1,5 ml. 9. Hemolyzační zkumavky (75 mm vysoká a 13 mm průměr). - 334 -

VZORKY PRO ANALÝZU Odběr a skladování vzorků Analýza se přednostně provádí s čerstvou močí odebranou během 24 hodin. Odběr moči musí být v souladu s následujícími postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. POZNÁMKA: Pro analýzu je nejvhodnější vzorek moči odebraný během 24 hodin, ale pro kvalitativní analýzu je také možné použít náhodný vzorek moči. Vzorky je možno skladovat chlazené mezi 2 až 8 C po dobu jednoho týdne. Pro skladování na delší dobu se doporučuje skladovat moč zmraženou na 70 C (stabilní nejméně jeden měsíc). DŮLEŽITÉ: Neskladujte vzorky při teplotě 20 C. Roztáté či nevhodně skladované vzorky mohou vzhledem k degradaci proteinů vykazovat modifikované a jiné další struktury. POZNÁMKA: Vzorky by neměly být skladovány při pokojové teplotě! Příprava vzorku (s dialyzačním systémem SEBIA) Pro nejlepší regeneraci bílkovin moči se velmi doporučuje použít centrifugační prostředky pro odsolení / koncentraci vzorku, jako krok při zpracování v rámci této analýzy. DŮLEŽITÉ: Technika analýzy moči kapilární elektroforézou vyžaduje 2 kroky: dialyzační krok a koncentrační krok vzorků moči pomocí dialyzačních systémů SEBIA (zkumavky 20 ml). Použijte pouze jednu zkumavku na vzorek. Následující parametry jsou indikovány pro použití dialyzačních systémů SEBIA s použitím swing-bucket centrifugy. Důkladně si, prosím, projděte návody ke každému dialyzačnímu a koncentračnímu prostředku, týkající se použití s centrifugou s pevným úhlem. Než přikročíte k analýze, připravte každý vzorek podle následujícího postupu: POZNÁMKA: Zásobní dialyzační tlumivý roztok zřeďte dvakrát (obj./obj.) destilovanou nebo deionizovanou vodou a získejte tak pracovní dialyzační tlumivý roztok (1 objemová jednotka tlumivého roztoku + 1 objemová jednotka destilované nebo deionizované vody). 1. Kvantifikujte celkovou koncentraci bílkovin v analyzovaném vzorku moči. VAROVÁNÍ: Pro kvantitativní určení monoklonálních komponent určené pro sledování pacienta je nezbytné vždy používat stejnou techniku kvantifikace bílkovin v moči. 2. Odstřeďte 5 ml čisté moči při 4 300 g* po dobu 10 minut. 3. Odeberte supernatant. 4. Každý vzorek připravte v novém dialyzačním systému podle jeho celkové koncentrace bílkovin: - Jestliže je celková koncentrace bílkovin 100 mg/dl: smíchejte ve zkumavce 2 ml moči s 18 ml destilované nebo deionizované vody. - Jestliže je celková koncentrace bílkovin v rozmezí 100 a 300 mg/dl: smíchejte ve zkumavce 0,5 ml moči s 19,5 ml destilované nebo deionizované vody. - Jestliže je celková koncentrace bílkovin nad 300 mg/dl: zřeďte nejprve moč destilovanou nebo deionizovanou vodou na koncentraci bílkovin 300 mg/dl; poté smíchejte ve zkumavce 0,5 ml zředěné moči s 19,5 ml destilované nebo deionizované vody. 5. Homogenizujte zředěnou moč. 6. Vyrovnejte obsah zkumavek destilovanou nebo deionizovanou vodou a odstřeďte je při 4 000 g* po dobu 40 minut. VAROVANÍ: Po zkoncentrování odstředěním musí být získaný objem do 0,5 ml. 7. Pro dialýzu přidejte 20 ml pracovního dialyzačního tlumivého roztoku na dialyzační systém. 8. Vyrovnejte obsah zkumavek pracovním dialyzačním tlumivým roztokem a odstřeďte je při 4 000 g* po dobu 40 minut. 9. Po odstředění se může část vzorku zachytit v horní ploché části dialyzačního systému (viz přiložený obrázek). Odeberte tento vzorek pomocí mikropipety a přemístěte jej do spodní komory dialyzačního systému. Je-li konečný objem nižší než 0,5 ml, přidejte pracovní dialyzační tlumivý roztok do konečného objemu 0,5 ml (poté, co se vyrovnala spodní úroveň menisku). 1 0.75 0.5 0.2 10. Homogenizujte vzorek ve zkumavce. 11. Odeberte zbývající dialyzovanou moč ze zkumavky a převeďte ji do mikrozkumavky o objemu 1,5 ml. 12. Zlikvidujte dialyzační systém. DŮLEŽITÉ: Analýzu vzorků moči proveďte nejdéle jeden den po jejich přípravě. Z důvodu omezení adsorpce bílkovin na membráně dialyzačního a koncentračního zařízení (dialyzační systém SEBIA) se nedoporučuje uchovávat po odstředění vzorky v dialyzačním systému, ale v mikrozkumavce skladované v chladničce (mezi 2 a 8 C). * Pro vypočítání číselné hodnoty ot./min. odpovídající rotoru nahlédněte do návodu centrifugy. - 335 -

Pokyny k použití dialyzačního a koncentračního prostředku s swing-bucket centrifugou a centrifugou s pevným úhlem se liší. Parametry popsané výše jsou indikovány pro použití dialyzačních systémů SEBIA s použitím swing-bucket centrifugy. Důkladně si, prosím, projděte návody ke každému dialyzačnímu a koncentračnímu prostředku, týkající se použití s centrifugou s pevným úhlem. Vzorky, které není vhodné používat Nepoužívejte staré, nesprávně skladované vzorky moči, mohl by se změnit obsah frakce v důsledku denaturace. Doporučuje se pozorovat vlastnosti vzorku moči po prvním odstředění (4 300 g po dobu 10 minut) (např. známky hemolýzy nebo turbidity). Neskladujte vzorky v dialyzačních a koncentračních zařízeních, některé bílkoviny by se mohly vázat na membránu. Nepoužívejte opakovaně vzorek moči převedený do dilučního segmentu. POSTUP Přístroj CAPILLARYS je multiparametrovým zařízením pro analýzu bílkovin v moči na 8 paralelních kapilárách v následujícím pořadí: čtení čárového kódu stojanu se vzorky a analyzovaných vzorků, převedení vzorků z mikrozkumavek obsahujících dialyzované vzorky do komor dilučních segmentů, promytí kapilár, nastříknutí vzorků, analýza bílkovin a přímá detekce v kapilárách. Manuální kroky zahrnují: přípravu vzorku (dialýza a koncentrace), umístění mikrozkumavek (bez víček) obsahujících vzorky pro analýzu do hemolyzační zkumavky do stojanu na vzorky; každá zkumavka je označena čárovým kódem identifikujícím konkrétní vzorek, který odpovídá vzorku k analýze, umístění nových dilučních segmentů do stojanů na vzorky, umístění stojanů do přístroje CAPILLARYS, přemístění stojanu se vzorky a mikrozkumavek po analýze k potenciální analýze imunotypizací. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K SYSTÉMU CAPILLARYS. I. PŘÍPRAVA ELEKTROFORETICKÉ ANALÝZY 1. Zapněte přístroj a počítač CAPILLARYS. 2. Spusťte software a automaticky se spustí přístroj. 3. Přístroj CAPILLARYS je nutné použít s analytickým programem "URINE" a s tlumivým roztokem CAPILLARYS PROTEIN(E) 6. Pro informace jak zvolit analytický program "URINE" a jak umístit lahvičky s tlumivým roztokem CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 do přístroje si přečtěte návod k obsluze zařízení CAPILLARYS. 4. Normalizujte kapiláry sérem Normal Control Serum (viz odstavec "Potřebná činidla neobsažená v sadě"). DŮLEŽITÉ: Je nezbytné před analýzou vzorků moči v přístroji CAPILLARYS kapiláry normalizovat, aby poté mohly být analyzovány procedurou CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE. - Převeďte do zkumavky 25 µl rekonstituovaného séra Normal Control Serum do hemolyzační zkumavky označené čárovým kódem pro Normal Control Serum a 2 ml pracovního dialyzačního tlumivého roztoku, poté homogenizujte. - Tuto zkumavku umístěte do pozice č. 1 ve stojanu na vzorky č. 0 přístroje CAPILLARYS určeného pro kontrolní vzorek a vložte nový zelený diluční segment. Absence segmentu bude zobrazena na displeji přístroje. - Spusťte analýzu: Zasuňte vzorkovací stojan č. 0 do přístroje CAPILLARYS, v okně, které se zobrazí na obrazovce, zvolte možnost "Normal Control" a potvrďte. Výsledky jsou potom automaticky vyhodnoceny softwarem pro analýzu dat. 5. Analyzujte vzorky moči připravené pomocí sady CAPILLARYS / MINICAP URINE: - Stojan na vzorky obsahuje osm pozic k uložení zkumavek. Vložte osm prázdných hemolyzační zkumavek (slouží jako držáky) do každého stojanu na vzorky, a poté do nich umístěte mikrozkumavky obsahující dialyzované vzorky moči. Před použitím uřízněte víčko každé mikrozkumavky. - Víčko každé mikrozkumavky pro další skladování vzorků uschovejte, pokud je to zapotřebí. DŮLEŽITÉ: Doporučuje se identifikovat každou hemolyzační zkumavku obsahující mikrozkumavku se vzorkem k analýze štítkem s čárovým kódem specifickým pro každý vzorek. Tato identifikace umožňuje určit nezbytný program ředění, který bude použit při provádění techniky CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE. - Čárové kódy musí být viditelné v otvorech stojanů. POZNÁMKA: Pokud je počet vzorků k analýze menší než 8, doplňte stojan zkumavkami obsahujícími destilovanou nebo deionizovanou vodu. - Na každý stojan umístěte nový diluční segment. Jestliže segment chybí, bude stojan se vzorky vysunut. - Otvorem ve střední části přístroje zasuňte celý stojan na vzorky do přístroje CAPILLARYS. Postupně v jednom sledu lze umístit do přístroje až 13 stojanů se vzorky. 6. Stojany s již analyzovanými vzorky vyjměte z prostoru na levé straně přístroje. 7. Pečlivě odstraňte diluční segmenty ze stojanů na vzorky a zneškodněte je. VAROVANÍ: S diluční segmenty s biologickými vzorky je třeba zacházet opatrně. 8. Sejměte mikrozkumavky obsahující analyzované vzorky moči ze stojanu na vzorky a je-li to nezbytné, uložte je do chladničky (při teplotě 2 až 8 C) pro další analýzu technikou CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE. - 336 -

ŘEDĚNÍ - MIGRACE - POPIS AUTOMATICKÝCH KROKŮ 1. Jsou přečteny čárové kódy na stojanech a na zkumavkách se vzorky moči k analýze. 2. Vzorky jsou jsou převedeny do dilučního segmentu a vzorkovací sonda je po každém vzorku opláchnuta. 3. Kapiláry jsou promyty. 4. Vzorky jsou nastříknuty do kapilár. 5. Migrace probíhá za konstantního napětí po dobu 4 minut a je řízena Peltiérovým jevem. 6. Bílkoviny se detekují přímo, skenováním při 200 nm a na obrazovce přístroje se objeví elektroforetický profil. POZNÁMKA: Tyto kroky jsou popsány pro první stojan se vzorky. Výsledky elektroforézy se objeví po 10 minutách. První následující stojan na vzorky jsou kroky 1 a 2 (čtení čárového kódu a převedení vzorku) prováděny během kroku 5 předchozího stojanu se vzorky. II. VÝSLEDEK ANALÝZY Po skončení analýzy mohou být analyzovány elektroforetické profily a vizuálně vyhodnoceny abnormality obrazu. Pozice různých zón (albumin, alfa 1, alfa 2, beta a gama) jsou identifikovány na obrazovce a ve zprávě o výsledcích. POZNÁMKA: Pro každý ze 3 postupů přípravy je u rozsahu obrazu vizualizovaného na ose y brána v úvahu celková koncentrace bílkovin každého analyzovaného vzorku. Pro imunotypizaci musí být integrovány abnormální frakce pomocí nástroje "quantify peaks"(kvantifikovat píky) v softwaru, a poté je automaticky spočítán "ratio urine"(poměr bílkovin v moči), definovaný rozměrem oblasti abnormální frakce vztaženým k celkové ploše bílkovin séra Normal Control Serum; výsledek bude zobrazen v okně modifikovaných křivek. Tento poměr bude použit v technice CAPILLARYS IMMUNOTYPING URINE pro určení použitého programu ředění vzorku ("HYPOGAMMA", "STANDARD" nebo "HYPERGAMMA"). Jestliže imunotypizace umožní odhalení monoklonální komponenty, může být tato komponenta kvantifikována (v programu PHORESIS verze 8.61). Pro kvantitativní stanovení musí být abnormální frakce integrována pomocí nástroje "quantify peaks" (kvantifikovat píky) a funkce "peak quantification" (kvantifikace píku) v softwaru. Obsluze jsou nabídnuty dva způsoby integrace: integrace "valley to valley" (mezi sedly) nebo integrace "from bottom to top" (zdola nahoru). Výběr způsobu integrace závisí na charakteru elektroforetického obrazu (poloha integrovaného píku vzhledem k základní linii) a na obvyklých postupech laboratoře. Výsledky kvantifikace píku jsou uvedeny: - procentuálně nebo, - v koncentracích v g/dl nebo g/24 hodin (v takovém případě musí být předtím koncentrace bílkovin v moči označena v pracovním listu). POZNÁMKA: Výsledky získané pro kvantifikaci monoklonálních komponent jsou zcela závislé na hodnotě proteinurie, která byla zadána do softwaru PHORESIS; jestliže obsluha udělá při zadávání hodnoty proteinurie chybu, ovlivní tato chyba výsledky měření. Při malém množství monoklonálních komponent může dojít k velkému nadhodnocení při použití integrační metody "from bottom to top". Při sledování pacienta musí být integrační metoda pro monoklonální komponenty v elektroforetickém obrazu pro různé analýzy stejná a je třeba pečlivě sledovat předchozí analýzy, aby byly sledované monoklonální komponenty integrovány stejným způsobem. Je-li navíc pozorována nová abnormalita obrazu (mimo zónu albuminů), je doporučeno imunotypizační analýzu vzorku zopakovat. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K SYSTÉMU CAPILLARYS. III. UKONČENÍ SÉRIE ANALÝZ Po ukončení každé sekvence analýzy musí operátor zahájit postup "stand by" (přepnutí do pohotovostního režimu) nebo "shut down" (vypnutí) přístroje CAPILLARYS, aby se kapiláry uložily v optimálních podmínkách. IV. PLNĚNÍ REAGENČNÍCH NÁDOB Přístroj CAPILLARYS automaticky kontroluje přítomnost reagentů. DŮLEŽITÉ: Dodržujte pokyny pro výměnu reagenčních nádob s ohledem na barevný kód pro lahvičky a spojovací části. V případě nezbytného provedení jednoho z následujících úkonů bude zobrazena zpráva: Vložte novou lahvičku s tlumivým roztokem a / nebo, Naplňte nádobu pracovním promývacím roztokem a / nebo, Naplňte nádobu filtrovanou destilovanou nebo deionizovanou vodou k vyplachování kapilár a / nebo, Vyprázdněte odpadní nádobu. CAPILLARYS / MINICAP URINE - 2014/06 VAROVANÍ: Nepoužívejte standardně prodávanou deionizovanou vodu, jako např. na žehlení (nebezpečí poškození důležitých kapilár). Používejte výhradně ultračistou vodu, jako je např. voda používaná k výrobě injekčních roztoků. DŮLEŽITÉ: Před naplněním se doporučuje vyplachovací nádobu vymýt větším množstvím destilované nebo deionizované vody. PEČLIVĚ SI PROSTUDUJTE NÁVOD K SYSTÉMU CAPILLARYS. VÝSLEDKY Interpretace Interpretace je kvalitativní. Jako pomoc při interpretaci obrazu je doporučeno přiložit obraz získaný po normalizaci kapilár sérem Normal Control Serum, čímž je získán referenční obraz. Z programu PHORESIS verze 8.61 je procedura CAPILLARYS URINE také kvantitativní. Je-li pozorován abnormální elektroforetický obraz, proveďte imunotypizaci vzorku, a je-li poté zjištěna a charakterizována monoklonální komponenta, kvantifikujte tuto komponentu podle výše popsaného postupu. - 337 -

Fyziologická proteinurie (1, 2, 7, 8, 9, 13) : Obvykle je slabá, méně než 120 mg / 24 hodin a nejsou významné rozdíly mezi elektroforetickými profily mužů a žen. Hlavním proteinem je albumin, společně se stopami transferinu a imunoglobulinů. Proteinurii vyšší než 120 mg / 24 hodin je třeba považovat za patologickou. Pozitivní proteinurie (> 120 mg / 24 hodin) by měla být následována kvalitativní analýzou eliminovaných proteinů (5). Elektroforéza moči je prováděna za účelem zjištění monoklonálních komponent, zejména Bence-Jonesových bílkovin (volný lehký řetězec) a dalších proteinů v moči. Při srovnání s normálním obrazem se zejména v zóně gamaglobulinu nebo betaglobulinu nachází další frakce, která má souvislost s poruchou (9, 10, 11). Elektroforéza moči je účinná při detekci monoklonálních komponent (monoklonálních imunoglobulinů nebo volných lehkých řetězců) s nízkou koncentrací přibližně okolo 2,0 mg/dl s kvalitativní analýzou. Doporučuje se provést identifikaci monoklonálních nebo oligoklonálních složek: - imunotypizací pomocí sady SEBIA CAPILLARYS IMMUNOTYPING nebo, - imunofixací sadami SEBIA HYDRAGEL BENCE JONES, HYDRAGEL IF a HYDRAGEL URINE PROFIL(E) a specifického antiséra volných lehkých řetězců anti-kappa a anti-lambda. Pro charakterizaci podezřelých tubulárních, glomerulárních nebo smíšených proteinurií po kapilární elektroforéze, jsou nezbytné doplňkové testy, jako je například elektroforéza pomocí sad SEBIA HYDRAGEL PROTEINURIE nebo HYDRAGEL URINE PROFIL(E) nebo nefelometrická imunoanalýza (3). Pomoc při interpretaci výsledků elektroforézy močových bílkovin, viz LITERATURA. Zvláštní případy: - U vzorků moči s celkovou koncentrací bílkovin nižší než 15 mg/dl (před přípravou na analýzu) je možné zobrazit proteinové pozadí (smear) na celém obrazu. - Jestliže se v beta a gamma zóně vyskytují podezřelé abnormality, je doporučeno provést další analýzu Bence-Jonesových bílkovin, a to bez ohledu na celkovou koncentraci bílkovin. Rušení a omezení Viz VZORKY PRO ANALÝZU. Analyzujte pouze vzorky připravené dialyzačními a koncentračními prostředky označené v odstavci "POTŘEBNÉ VYBAVENÍ A PŘÍSLUŠENSTVÍ", jako například dialyzační systém SEBIA nebo obdobným zařízením se stejnými parametry schváleným pro klinické použití. Chybná dialýza vzorků může způsobit nebílkovinné zbytkové frakce. Pokud je podezření na výskyt rušivé frakce, doporučuje se provést dialýzu vzorku moči znovu. Rušení, například zbytky léků nebo soli, jsou odstraněna během dialyzačního kroku. Pokud není tento krok pečlivě dodržován, mohou být pozorovány umělé píky. Vzhledem k omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy je možné, že některé bílkoviny v moči nebudou touto metodou detekovány. Pro kvantitativní určení monoklonálních komponent určené pro sledování pacienta je nezbytné vždy používat stejnou techniku kvantifikace bílkovin v moči. Výsledky získané pro kvantifikaci monoklonálních komponent jsou zcela závislé na hodnotě proteinurie, která byla zadána do softwaru PHORESIS; jestliže obsluha udělá při zadávání hodnoty proteinurie chybu, ovlivní tato chyba výsledky měření. Odstraňování závad a řešení problémů Jestliže se test nepovede provést, přestože byly přísně dodržovány veškeré pokyny týkající se přípravy, skladování materiálů a samotného postupu, obraťte se na společnost SEBIA. Bezpečnostní datové listy sady reagentů a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostních pravidlech používaných společností SEBIA a obalech pro přepravu biologických vzorků a čištění přístrojů jsou k dispozici na DVD s "NΑVODY A BEZPEČNOSTNÍMI DATOVÝMI LISTY". ÚDAJE O VÝKONU Kvalitativní analýza Byly použity standardní materiály, příprava vzorku a postupy. Všechny elektroforetické záznamy byly vyhodnoceny vizuálně. Reprodukovatelnost na gelu Reprodukovatelnost v rámci analýzy byla demonstrována na dvou různých patologických vzorcích moči (jeden vzorek moči obsahující pět frakcí bílkovin a jeden vzorek s Bence-Jonesovým proteinem) a na jednom normálním vzorku (fyziologická moč). Každý ze vzorků byl připraven s dialyzačním tlumivým roztokem ze dvou různých šarží, poté byl převeden do všech komor dilučních segmentů a analyzován pomocí procedury CAPILLARYS URINE se stejným analyzačním tlumivým roztokem. Všechny opakování dala shodné výsledky, jak v rámci analýzy, tak v rámci dvou šarží dialyzačního tlumivého roztoku. Vzory odpovídaly typu každého testovaného vzorku. Procedurou CAPILLARYS URINE byly ve dvou patologických vzorcích správně identifikovány bílkoviny moči, nedošlo k žádným falešně pozitivním identifikacím a mezi jednotlivými opakováními nebyly pozorovány žádné rozdíly. V normálním vzorku nebyla zjištěna žádná bílkovina. Reprodukovatelnost mezi vzorky a mezi šaržemi Reprodukovatelnost mezi jednotlivými analýzami byla demonstrována na šesti různých patologických vzorcích moči obsahujících jednu až sedm proteinových frakcí a dvou normálních vzorcích (fyziologická moč), kdy byl každý připraven s dialyzačním tlumivým roztokem ze tří různých šarží. Tyto vzorky byly desetkrát analyzovány pomocí procedury CAPILLARYS URINE pro každou šarži dialyzačního tlumivého roztoku se stejným analyzačním tlumivým roztokem. Všechna opakování poskytla identické výsledky mezi analýzami a mezi šaržemi. Procedurou CAPILLARYS URINE byly v šesti patologických vzorcích správně identifikovány bílkoviny moči, nedošlo k žádným falešně pozitivním identifikacím a mezi jednotlivými opakováními nebyly pozorovány žádné rozdíly. V každém vzorku moči byly zjištěny očekávané specifické bílkoviny v moči pro každý typ vzorku. V normálních vzorcích nebyla zjištěna žádná abnormální bílkovina. - 338 -