Biogenní aminy a polyaminy ve vybraných fermentovaných potravinách

Mendelova univerzita v Brně gronomická fakulta Ústav technologie potravin Biogenní aminy a polyaminy ve vybraných fermentovaných potravinách Diplomová práce Vedoucí práce: prof. MVDr. Ing. Tomáš Komprda, CSc. Vypracovala: Bc. Monika Brázdová Brno 2011

Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Biogenní aminy a polyaminy ve vybraných fermentovaných potravinách vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana F MU v Brně. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Brně, dne.. Podpis

Poděkování Touto cestou bych chtěla poděkovat prof. MVDr. Ing. Tomáši Komprdovi, CSc. za odborné vedení při zpracování diplomové práce, za všechen jeho věnovaný čas a poskytnuté informace. Děkuji paní Ing. Evě Rejchrtové za pomoc při práci v laboratoři, za poskytnuté materiály a cenné rady. Dále děkuji tvarůžkárnám. W. spol. s. r. o., zejména panu Ing. Pospíšilovi za poskytnuté vzorky sýrů a organizaci IG MZLU v Brně za poskytnutou finanční podporu pro tento výzkum.

bstrakt Diplomová práce se zabývá obsahem biogenních aminů (tryptamin, 2- fenyletylamin, tyramin, histamin) a polyaminů (putrescin, spermin, spermidin) v sýrech zrajících pod mazem konkrétně v olomouckých tvarůžkách. Práce je zaměřena také na mikroorganismy (enterokoky, bakterie mléčného kvašení, celkový počet mikroorganismů), které mohou biogenní aminy v sýrech produkovat. Sleduje se vliv několika faktorů jak na obsah aminů, tak na obsah zmíněných skupin mikroorganismů. V největších koncentracích se v detekovaných sýrech tvořil tyramin, putrescin, kadaverin a histamin. Množství polyaminů sperminu a spermidinu bylo nízké a významně se neměnilo. Počty bakterií mléčného kvašení se v průběhu celého výrobního procesu výrazně neměnily, celkové počty mikroorganismů klesaly a enterokoky nejdříve narůstaly, poté klesaly. Byly stanoveny většinou nízké hodnoty korelačních koeficientů mezi mikroorganismy a stanovovanými aminy. bstract The thesis dwells on content of biogenic amines (tryptamin, 2 fenylethylamin, tyramin, histamin), polyamines (putrescin, spermin, spermidin) in Olomouc curd cheese and microorganisms (enterococcus, lactic acid bakteria, total count of microorganism), which the amines can produce in the cheese. There is shown to influence of several factors both on the content of amines and the content of certain groups of microorganisms. In detected cheese there were formed tyramin, putrescin, cadaverin and histamin in the largest concentrationes. The amount of polyamines spermin and spermidin was low and without change. During of all technological process the content lactic acid bakteria didn t show any substantial change. Total count of microorganism went down and enterococci after primary increase also went down. There were defined mostly low values of correlative coefficient between microorganisms and amines. Keywords: biogenic amines, polyamines, microorganism, Olomouc curd cheese

OBSH 1 ÚVOD... 8 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 9 2.1 Mléko... 9 2.1.1 Definice mléka... 9 2.1.2 Složení mléka... 9 2.1.3 Dusíkaté látky v mléce... 9 2.1.4 Srážení bílkovin... 10 2.2 Sýr... 11 2.2.1 Definice sýra... 11 2.2.2 Rozdělení sýrů... 12 2.2.3 Požadavky na mléko pro výrobu sýrů... 12 2.3 Tvaroh... 13 2.3.1 Definice tvarohu... 13 2.3.2 Rozdělení tvarohů... 13 2.3.3 Výroba tvarohů (kyselých sýrů)... 13 2.3.4 Složení a znaky průmyslového tvarohu... 15 2.3.5 Olomoucké tvarůžky... 15 2.3.5.1 Výroba olomouckých tvarůžků... 16 2.3.5.2 Vady olomouckých tvarůžků... 17 2.3.5.3 Složení olomouckých tvarůžků... 17 2.3.6 Mikrobiologie sýrů zrajících pod mazem... 18 2.4 Biogenní aminy a polyaminy... 20 2.4.1 Charakteristika biogenních aminů... 20 2.4.2 Dělení biogenních aminů podle chemické struktury... 20 2.4.3 Charakteristika polyaminů... 20 2.4.4 Vznik biogenních aminů a polyaminů... 21 2.5 Faktory ovlivňující tvorbu biogenních aminů v potravinách... 23 2.5.1 Faktory ovlivňující tvorbu biogenních aminů v potravinách... 23 2.5.2 Výskyt biogenních aminů a polyaminů v potravinách... 24 2.5.2.1 Výskyt biogenních aminů a polyaminů v sýrech... 25 2.6 Fyziologické funkce a toxikologické účinky biogenních aminů a polyaminů v organismu člověka... 27 2.6.1 Fyziologické funkce biogenních aminů a polyaminů... 27 2.6.2 Toxikologické účinky a toxické dávky biogenních aminů a polyaminů 27 2.6.2.1 Toxicita histaminu... 30 2.6.2.2 Toxicita tyraminu... 30 2.7 Hygienický význam biogenních aminů a polyaminů v potravinách... 31 2.8 Mikroorganismy produkující biogenní aminy... 32 2.8.1 Mikroorganismy s dekarboxylázovou aktivitou... 32 2.8.2 Mikroorganismy produkující biogenní aminy v sýrech... 33 2.8.3 Charakteristika významných mikroorganismů produkujících biogenní aminy.34 2.8.3.1 Bakterie mléčného kvašení (BMK)... 34 2.8.3.2 Bakterie rodu Enterococcus (ENC)... 35 2.9 Metody stanovení biogenních aminů a polyaminů... 35 2.9.1 Obecný princip chromatografie... 36 2.9.2 Rozdělení chromatografických metod... 36 2.9.3 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC)... 37

3 CÍL PRÁCE... 38 4 MTERIÁL METODIK... 39 4.1 Materiál... 39 4.2 Metodika... 40 4.2.1 Stanovení biogenních aminů metodou HPLC... 40 4.2.2 Stanovení mikroorganismů... 41 4.2.2.1 Celkový počet mikroorganismů (CPM)... 41 4.2.2.2 Bakterie mléčného kvašení (BMK)... 41 4.2.2.3 Bakterie rodu Enterococcus (ENC)... 42 4.2.2.4 Plísně a kvasinky... 43 4.2.2.5 Bakterie rodu Brevibacterium (BREVI)... 44 4.2.2.6 E. coli... 44 4.2.3 Přístroje a pomůcky... 45 4.2.4 Vyhodnocení výsledků mikrobiologických stanovení... 46 4.2.5 Statistické zpracování výsledků... 47 5 VÝSLEDKY DISKUZE... 48 5.1 Vliv tvaru výrobku, teploty a doby skladování na obsah B a P... 48 5.2 Současný vliv teploty a doby skladování na obsah B a P... 54 5.3 Množství B a P ve vstupní surovině... 57 5.4 Vliv stáří výrobku na obsah B a P... 59 5.5 Vliv tvaru výrobku, teploty a doby skladování na počet mikroorganismů... 62 5.6 Počet mikroorganismů ve vstupní surovině... 66 5.7 Počet mikroorganismů v průběhu výroby... 66 5.8 Počet mikroorganismů rodu Brevibacterium v průběhu výroby... 68 5.9 Korelační vztahy mezi obsahem B, P a počty mikroorganismů... 69 5.10 Korelační vztahy mezi jednotlivými skupinami mikroorganismů... 71 6 ZÁVĚR... 72 7 SEZNM POUŽITÉ LITERTURY... 74 8 SEZNM TBULEK OBRÁZKŮ... 80 8.1 Seznam tabulek... 80 8.2 Seznam obrázků... 80 9 SEZNM POUŽITÝCH ZKRTEK... 82

1 ÚVOD Biogenní aminy jsou organické sloučeniny odvozené od aminokyselin, které se uplatňují v metabolismu zvířat, rostlin, lidí a vykazují různé fyziologické účinky. V malém množství se vyskytují jako přirozené složky řady potravin. Ve vyšším množství se nacházejí ve fermentovaných potravinách, kde vznikají činností mikroorganismů. Schopnost mikroorganismů produkovat biogenní aminy je dána přítomností specifických dekarboxyláz. Nejčastěji se tato dekarboxylázová aktivita vyskytuje u laktobacilů, pediokoků, enterokoků a bakterií čeledi Enterobacteriaceae. Polyaminy, které byly původně klasifikovány do skupiny biogenních aminů, se nyní řadí jako samostatná skupina, která se odlišuje vznikem a fyziologickými účinky v organismu. Polyaminy spermidin a spermin nevznikají činností mikroorganismů, ale biosyntézou z putrescinu. Putrescin, přestože se strukturně řadí mezi diaminy, protože je prekurzorem sperminu a spermidinu, je zahrnován do polyaminů. Většinou nepředstavují biogenní aminy a polyaminy v potravinách pro zdravé jedince žádné riziko, avšak při nadměrném příjmu se mohou projevit nežádoucí účinky. Z důvodu negativního vlivu biogenních aminů a polyaminů na lidské zdraví je žádoucí, aby se tyto aminy v potravinách vyskytovaly v co nejmenším množství. Vedle ryb jsou sýry nejčastěji uváděnou potravinou spojovanou s intoxikací biogenními aminy a polyaminy. Sýr vytváří ideální prostředí pro tvorbu aminů. Tvarůžky jsou sýry zrající pod mazem a mohou obsahovat značné množství biogenních aminů a polyaminů. Na vzniku biogenních aminů v sýrech se často uplatňují kromě mikroorganismů kulturní mikroflóry i kontaminující mikroflóra. Obsah biogenních aminů a polyaminů je značně ovlivněn ošetřením a zacházením s výchozí surovinou a dalšími technologickými faktory, jako je koncentrace volných aminokyselin nebo peptidů, přítomnost bakterií schopných dekarboxylovat aminokyseliny, ph, koncentrace solí, vodní aktivitě apod. 8

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Mléko 2.1.1 Definice mléka Syrovým mlékem se dle vyhlášky č. 203/2003 Sb. rozumí mléko produkované sekrecí jedné nebo více krav, ovcí, koz nebo buvolích krav, které nebylo zahřáto na více než 40 C nebo nebylo podrobeno žádnému jinému ošetření majícímu srovnatelný účinek. 2.1.2 Složení mléka Tabulka č. 1 Základní složení kravského mléka (Simeonová, Ingr, Gajdůšek, 2008) Složka Průměrný obsah (%) Voda 87,50 Sušina 12,50 Tuk 3,80 Bílkoviny 3,20 Laktosa 4,70 Minerální látky 0,70 2.1.3 Dusíkaté látky v mléce Dusíkaté látky tvoří nejkomplexnější složku mléka. Jako bílkoviny mléka jsou tradičně označovány všechny dusíkaté látky v mléce, stanovené po mineralizaci Kjeldahlovou metodou. Z celkového množství dusíku však tvoří kolem 5 až 7% nebílkovinné dusíkaté látky. Proto se pro rozlišení používají názvy hrubá neboli celková bílkovina (tj. dusík bílkovin i nebílkovinných dusíkatých látek faktor 6,37) a čistá bílkovina (Simeonová, Ingr, Gajdůšek, 2008). Z nutričního hlediska jsou bílkoviny nejdůležitější součástí mléka a jejich obsah v mléce je proti vnějším vlivům poměrně stálý. Mléčné proteiny se dělí na dvě základní frakce: kaseiny a syrovátkové (sérové) bílkoviny (Velíšek, 2002). Kasein Kasein je hlavní bílkovinná složka kravského mléka. Tvoří asi 80% mléčných proteinů. Kromě prvků charakteristických pro složení bílkovin obsahuje i fosfor, patří 9

tedy mezi fosfoproteiny. Kaseinový komplex kravského mléka se skládá ze tří základních frakcí α, β a κ-kasein. γ-frakce je pouze výsledkem degradace β-kaseinu proteolytickými enzymy. Jednotlivé kaseinové frakce se navzájem liší nejen hodnotami poměrné molekulové hmotnosti, ale i elementárním složením, obsahem aminokyselin a hodnotami izoelektrického bodu (Lukášová a kol., 1999). Převážná část kaseinových frakcí je v mléce vázána do velkých koloidních útvarů neboli kaseinových micel. Kromě kaseinu tyto micely obsahují vápník, hořčík, citráty a fosfáty, souhrnně označované jako koloidní kalcium fosfát. Díky zápornému náboji jsou na povrchu micel elektrostaticky vázány molekuly vody, které tvoří hydratační obal. Základní význam pro stabilitu kaseinových micel má κ-kasein, který se na rozdíl od ostatních frakcí nesráží působením iontů vápníku a má tedy v mléce ochranou funkci před vysrážením. Syrovátkové bílkoviny Jako syrovátkové bílkoviny se souhrnně označuje skupina bílkovin, které zůstávají v roztoku (syrovátce) po vysrážení kaseinu. Jejich množství v kravském mléce se pohybuje asi kolem 20%, přičemž jejich zvýšená koncentrace je v mlezivu a v mléce od krav vykazující poruchy mléčné žlázy. Syrovátkové bílkoviny mají vyšší nutriční hodnotu než kasein. Nejvyšší podíl tvoří β-laktoglobulin, který je zastoupen asi z 50%, dále je to α-laktalbumin, imunoglobuliny, proteozopeptony a sérový albumin. Nebílkovinné dusíkaté látky Tyto látky zůstávají v roztoku po vysrážení veškerých bílkovin 12% kyselinou trichloroctovou. Největší podíl tvoří močovina, její obsah je asi 50% z celkových nebílkovinných dusíkatých látek. Patří sem i volné aminokyseliny, amoniak, kreatin, kyselina močová, hippurová apod. 2.1.4 Srážení bílkovin Sladké srážení bílkovin Sladké srážení bílkovin je srážení syřidlem, které můžeme obecně rozdělit do tří fází. V primární fázi dochází k proteolýze κ-kaseinu, čímž ztrácí svou ochrannou funkci při stabilizaci α- a β-kaseinu proti vysrážení volnými vápenatými ionty v mléce. Štěpením κ-kaseinu vzniká para-κ-kasein, který odpovídá 1 105 aminokyselině v 10

peptidu. Tento řetězec je hydrofobní a je zadržován ve vytvořené sýřenině. Část peptidu od 106 do 169 aminokyseliny označujeme jako κ-kaseinglykomakropeptid, který je hydrofilní a zůstává rozpuštěný v syrovátce. V sekundární fázi se mění micelární uspořádání kaseinového komplexu, který koaguluje v přítomnosti volných iontů vápníku. Koagulace je závislá na ztrátě vodného obalu micel a na snížení jejich záporného náboje. Dochází k tvorbě nové trojrozměrné struktury gelu, kde se kromě těchto účinků iontů vápníku uplatňují i hydrofobní interakce, vodíkové můstky či S-S vazby. Terciární fáze zahrnuje pokračující proteolýzu kaseinu, tedy vlastní zrání sýrů. Ukončení sýření lze podpořit pokrájením sýřeniny a zvětšením povrchu, přičemž se jednotlivá vlákna vysrážených bílkovin smršťují, zmenšuje se objem sraženiny a současně se uvolňuje syrovátka. Tento jev se nazývá synereze a lze jej podpořit záhřevem. Kyselé srážení bílkovin Přídavkem kyselin do mléka (kyselina octová, citronová) nebo mléčným kvašením, při kterém bakterie mléčného kvašení rozkládají laktózu na kyselinu mléčnou, dochází k okyselování mléka a po dosažení ph 4,6 kasein vyvločkuje a mléko se sráží. Vzniká gel, který má odlišné vlastnosti od gelu získaného enzymovým srážením. Tento gel se vyznačuje malou tuhostí a tříštivostí. Působením kyselin v mléce dochází ke ztrátě koloidní stability bílkovinné disperze kaseinového komplexu. Z hlediska micelární struktury znamená snížení ph k izoelektrickému bodu snížení celkového záporného náboje micel. Následkem toho se snižuje i povrchová hydratační vrstva kaseinu, který se po ztrátě náboje a vodného obalu snadno sráží. Největší množství kaseinu se vysráží z mléka o ph 4,2 4,6 a teplotě 40 C. 2.2 Sýr 2.2.1 Definice sýra Jako sýr se dle vyhlášky č. 77/2003 Sb. označuje mléčný výrobek vyrobený vysrážením mléčné bílkoviny z mléka působením syřidla nebo jiných vhodných koagulačních činidel, prokysáním a oddělením podílu syrovátky. 11

2.2.2 Rozdělení sýrů Rozdělení sýrů podle způsobu srážení mléka Tzv. sladké sýry sýry vznikají sladkým, neboli syřidlovým srážením (většina sýrů, zejména tvrdé a polotvrdé sýry) Tzv. kyselé sýry sýry vznikají kyselým srážením (průmyslový tvaroh a výrobky z něj) Sýry se smíšeným srážením jde o měkké sýry a tvarohy Rozdělení přírodních sýrů podle zrání Tabulka č. 2 Klasifikace přírodního sýra podle zrání (Vyhláška č. 77/2003Sb.) Sýr Charakteristika Sýr nezrající Čerstvý Termizovaný Sýr zrající Na povrchu S mazem na povrchu V celé hmotě Z toho plísňový sýr S tvorbou charakteristické plísně na povrchu S tvorbou charakteristické plísně uvnitř hmoty Dvouplísňový 2.2.3 Požadavky na mléko pro výrobu sýrů Požadavky na jakost mléka jako suroviny pro výrobu sýrů jsou v podstatě stejné jako pro konzumní mléko, jsou však doplněny ještě o další důležité speciální požadavky, které rozhodují o vhodnosti mléka k výrobě jednotlivých druhů sýrů. Je to syřitelnost mléka, neboli schopnost mléka k sýření syřidlem a vytváření sraženiny vhodné pevnosti a pružnosti. Dále kysací schopnost, což je aktivita ušlechtilých bakterií mléčného kvašení rozmnožovat se v mléce, a mikrobiologická čistota, která je ovlivněna zejména hygienou získávání a ošetřování mléka. Chemické složení mléka má zásadní význam pro výtěžnost výroby a složení sýra. Výtěžnost určuje především obsah kaseinu. Poměr tuku a kaseinu je rozhodující pro výsledný obsah tuku v sušině (Kadlec a kol., 2009). 12

Celkově je tedy možné definovat pojem technologické vhodnosti mléka pro výrobu sýrů jako soubor chemických, fyzikálních a mikrobiologických vlastností mléka, které příznivě ovlivňují jeho syřitelnost a kysací schopnost (Teplý a kol., 1985). 2.3 Tvaroh 2.3.1 Definice tvarohu Podle vyhlášky č. 77/2003 Sb. charakterizujeme tvaroh jako nezrající sýr získaný kyselým srážením, které převládá nad srážením pomocí syřidla. 2.3.2 Rozdělení tvarohů Tabulka č. 3 Rozdělení tvarohů (Vyhláška č. 77/2003 Sb.) Měkký nebo odtučněný Termizovaný Nízkotučný nebo jemný Polotučný Tvaroh Tučný Tvrdý nebo na strouhání nebo ke strouhání 2.3.3 Výroba tvarohů (kyselých sýrů) Úprava mléka před zpracováním Tvaroh se vyrábí většinou z odtučněného mléka šetrně pasterovaného při teplotě 74 76 C nebo vysokopasterovaného při teplotě 85 C po dobu 15 20 s. Při vysoké pasteraci dochází ke zvýšené denaturaci syrovátkových bílkovin, které přecházejí do tvarohové sraženiny. Zvyšuje se výtěžnost tvarohů, avšak vazbou vody se snižuje jejich sušina, konzistence tvarohů je jemnější. Ke zlepšení syřitelnosti mléka je možné přidat krystalický chlorid vápenatý. Přídavek CaCl 2 se však většinou používá jen vyjímečně a to v množství maximálně 5 až 10 g na 100 l mléka (Gajdůšek, 2002). Výroba tvrdého tvarohu Tvrdý tvaroh se připravuje kyselým srážením pasterovaného odstředěného mléka mezofilní kulturou bez přídavku syřidla a následným zpracováním sraženiny. Tvrdý 13

tvaroh zahrnuje tvaroh pro přímý konzum, neboli tvaroh na strouhání, který se používá hlavně na posyp ovocných knedlíků či jiných sladkých pokrmů a tvaroh k dalšímu zpracování tzv. průmyslový tvaroh. Sušina tvrdého tvarohu je běžně 32%. Při výrobě tvrdého tvarohu se používá dvoutepelný způsob, který je totožný s dvoutepelnou výrobou průmyslového tvarohu. Výroba průmyslového tvarohu Průmyslový tvaroh je základní surovinou pro výrobu olomouckých tvarůžků. Vyrábí se nejčastěji dvoutepelným, případně jednotepelným způsobem. Při využití termofilních kultur je možné provádět termofilní způsob výroby. Zjednodušení představuje kontinuální výroba odstřeďováním. Dvoutepelný způsob výroby: Teplota mléka se upravuje na 22 30 C. Přidá se mezofilní zákys v množství 0,5 2% a nechá se prokysat 14 18 hodin. Po vysrážení se sraženina pokrájí sýrařským nožem na hranoly. Po dosažení kyselosti syrovátky 24 28 SH se sraženina začne zahřívat za občasného míchání na teplotu 38 42 C. Po dosažení požadované teploty se nechá sraženina vystoupit na povrch, po jedné až dvou hodinách se odpustí syrovátka a sraženina se přepouští do tvarožníků, případně do lisovací vany a lisuje se. Vylisovaný tvaroh se rozemele nebo se ručně rozdrtí a vychladí se na teplotu 10 C. Vychlazený tvaroh se plní do polyethylenových pytlů, ve kterých se dokonale udusá, aby se vypudil vzduch, který by způsobil oklihnutí tvarohu. Naplněné pytle se nechají v chladírně, před uzavřením se může tvaroh mírně prosypat solí. Pytle se uzavřou a až do expedice zůstávají v chladírně. Jednotepelný způsob výroby: Od dvoutepelného způsobu výroby se tento postup liší prvotním zahřátím mléka na 32 38 C. K mléku se přidá mezofilní kultura v množství asi 1%. Za 7 12 hodin, kdy titrační kyselost sraženiny dosáhne 22 24 SH, se začne opatrně promíchávat až do té doby, než kyselost syrovátky dosáhne 25 27 SH. Následně se odpustí uvolněná syrovátka a sraženina se přepouští do filtračních pytlů nebo lisovacích van. Po vylisování se mele, chladí a balí. Před plněním do expedičních obalů musí být tvaroh dobře vychlazený, neboť má sklon k zapařování. 14

Termofilní způsob výroby: Při tomto způsobu výroby se mléko zahřeje na teplotu 38 44 C a probíhá srážení přidanými termofilními kulturami v množství asi 2%. Srážení trvá 2 až 4 hodiny, což je podstatně méně než při použití mezofilního zákysu. Jakmile sraženina dosáhne kyselosti 23 25 SH, ihned se krájí, lisuje a chladí. Celé zpracování trvá 4 6 hodin a umožňuje tak zvýšení kapacity tvarohárny. Kontinuální způsob výroby: Výrobu průmyslového tvarohu je také možno provádět kontinuálně odstřeďováním. Vhodným typem pro výrobu průmyslového tvarohu jsou odstředivky dekantační šnekové (Strmiska, Hušek, Minařík, 1991). 2.3.4 Složení a znaky průmyslového tvarohu Tabulka č. 4 Složení a znaky průmyslového tvarohu (Strmiska, Hušek, Minařík, 1991) Obsah sušiny 32 % Kyselost 120 160SH Chuť Mléčně nakyslá Konzistence Hrudkovitá 2.3.5 Olomoucké tvarůžky Tvarůžky jsou domácí sýry s velmi starou tradicí. Podle písemných záznamů se vyráběly v olomouckém kraji na Hané již v 15. století (Bílek a Pospěch, 1986). Pravé olomoucké tvarůžky jsou odtučněný měkký, pod mazem zrající sýr z netučného kyselého tvarohu. Mají zcela ojedinělou pikantní chuť, typickou vůni, povrch se zlatožlutým mazem a soudržnou poloměkkou až měkkou konzistenci s patrným světlejším jádrem. Tvar má zpravidla podobu kotoučků, kroužků, tyčinek nebo nepravidelných kousků. V roce 2010 olomoucké tvarůžky získaly chráněné zeměpisné označení Evropské unie. Dříve výrazná proteolýza umožnila dosažení silně ostré pikantní chuti olomouckých tvarůžků. Časem došlo z důvodu požadavku menší vyzrálosti, kvůli možnosti výskytu biogenních aminů, k tvorbě chuti méně výrazné. V současnosti se 15

tvarůžky vyrábí z průmyslového tvarohu, který se získává zejména v období nadbytečné produkce mléka. Monopolní výrobce tvarůžků v ČR je tvarůžkárna. W. spol. s.r.o. v Lošticích. Jde o firmu s dlouholetou tradicí, která vyrábí asi 2400 tun ročně. 2.3.5.1 Výroba olomouckých tvarůžků Surovinou pro výrobu tvarůžků je nesýřený (kysele srážený) průmyslový tvaroh z odstředěného mléka. Tvaroh se opakovaně mele, prosoluje 4 5% kuchyňské soli a skladuje v kontejnerech 1 2 týdny při teplotě 15 C (Kadlec a kol., 2009). Ve zhutnělém stavu a bez přístupu kyslíku dochází k samovolné homogenizaci a získání požadovaných vlastností. Před zpracováním se upravuje kyselost, sušina a obsah soli. Kyselost se snižuje hydrogenuhličitanem sodným či uhličitanem vápenatým. Sodné soli způsobují měkkou konzistenci a roztékání, vápenaté soli zase tuhou a pevnou konzistenci, proto se obě soli přidávají v požadovaném poměru. Sušina se upraví na 32%. Skladovaný tvaroh se před zpracováním míchá s čerstvým. Následně se hmota řádně promíchá, pomele na válcovém mlýnu a formuje se na formovacím stroji do tvaru koleček či tyčinek. Vytvarované tvarůžky se uloží na podložky a přemístí se do sušáren, kde se suší při teplotě 22 24 C a relativní vlhkosti vzduchu 80 až 85% po dobu tří až čtyř dnů. Dochází ke zvýšení sušiny a na povrchu se vytvoří povlak kvasinek (např. Torulopsis, Candida, Oospora nebo bílá plíseň Geotrichum), které rozkládají kyselinu mléčnou na oxid uhličitý a vodu, proto je při sušení důležitý dostatečný přísun kyslíku. Po dosažení požadované sušiny 36 38% probíhá praní tvarůžků ve speciálních pračkách vodou o teplotě 13 17 C, do níž se přidává mazová kultura (Brevibacterium linens, mikrokoky). Praním tvarůžků se odstraní z povrchu vzniklý křís a tvarůžky po odkapání zrají 4 až 8 dnů při teplotě 15 20 C a relativní vlhkosti 80 90% (Gajdůšek, 2002). Ve zracích místnostech dochází k vlastnímu proteolytickému zrání od povrchu směrem do středu. Na povrchu se vytvoří maz a tvarůžky získávají zcela ojedinělou a typickou chuť, vůni a barvu. Po dosažení požadovaného stupně zrání se tvarůžky balí. Zabalené tvarůžky se skladují do doby expedice při 10 C, přičemž pořád dozrávají. 16

2.3.5.2 Vady olomouckých tvarůžků Při výrobě i samotném zrání tvarůžků za nevhodných podmínek mohou vzniknout některé chyby těchto produktů. Roztékání tvarůžků na vzniku této vady se mohou podílet aerobní sporotvorné proteolytické bakterie Bacillus cereus, B. subtilis a jiné. Tyto bakterie se v tvarohu mohou rozmnožovat zejména při zvýšených teplotách (při zapaření). Nežádoucí je také pomnožení plísní Geotrrichum candidum. Tato plíseň je poměrně nenáročná na přítomnost vzdušného kyslíku a tudíž může růst i ve vnitřním tvarohu. Bílá mazovitost vzniká při vysoké vlhkosti (uvolňování volné vody) a současném zrání při nízkých teplotách. Místo žlutého mazu se tvoří bílý až hnědý maz, tvarůžky nezrají a nepříjemně páchnou. Černání tvarůžek bývá způsobené příliš vysokým obsahem železa a mědi v surovině, či v tvarohu. Kyselé prostředí tvarohu působí agresivně na železo a měď z nevhodného nářadí a zařízení. Při zrání se z tvarůžků uvolňují sirné sloučeniny včetně sirovodíku, který dává se železem nebo mědí tmavé sulfidy. Udává se, že surovina nesmí obsahovat více než 1 mg Fe.kg -1 a 5 mg Cu. kg -1. Tvarohovitost tvarůžků jde o nezralý produkt. Tato vada se projevuje, pokud jsou tvarůžky příliš brzo zabaleny a chybí vzdušný kyslík, nebo když vyschne povrch tvarůžek a kulturní mikroflóra odumře. Hořká chuť vzniká nesprávným zráním spojeným s roztékáním tvarůžků, které bývá způsobené přítomností a aktivitou aerobních sporotvorných bacilů B. cereus a jiných. Zatuchlá chuť je způsobená nedostatečným přístupem vzduchu při sušení sýrů nebo přílišným pomnožením plísně Geotrichum candidum (Görner a Valík, 2004). 2.3.5.3 Složení olomouckých tvarůžků Tvarůžky se vyrábějí z nesýřeného kyselého tvarohu a kromě soli a regulátorů kyselosti se na výrobu nepoužívají žádné další konzervační látky. Díky velmi nízkému obsahu tuku jsou vhodné pro dietetickou stravu. Průměrná výživová hodnota tvarůžků na 100 g je 532 kj (125 kcal). 17

Tabulka č. 5 Složení olomouckých tvarůžků Složení Množství (100 g) Bílkoviny 29,0 g Tuky 0,6 g Sacharidy 1,0 g 2.3.6 Mikrobiologie sýrů zrajících pod mazem Pro sýry zrající pod mazem se využívají mazové kultury. Zahrnují koryneformní bakterie, Gram-pozitivní koky a kvasinky. Do skupiny koryneformních bakterií se řadí rody rthrobacter, Brevibacterium, Corynebacterium a Microbacterium. Grampozitivní koky jsou reprezentovány rody Micrococcus, Staphylococcus a Kocuria. Z kvasinek jsou zastoupeny především rody Candida, Kluyveromyces a Debaryomyces (Kadlec a kol., 2009). V první fázi se uplatňuje aerobní zrání, kdy se v kyselém prostředí na povrchu tvoří kvasinky. Mezi nejvýznamnější z pohledu zrání sýrů od povrchu dovnitř patří Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Debaryomyces hanseni, Sacharomyces cerevisce, Geotrichum candidum, Cryptococcus catenulata, Yarovia lipolitica. Oxidačně odkyselují povrch sýrů přeměnou kyseliny mléčné a mléčnanů na CO 2 a H 2 O. Pomocí proteolytických a lipolytických enzymů kvasinek se tvoří různé sloučeniny, které difundují dovnitř sýra. Kvasinky asimilují laktáty, tvoří alkalické metabolity (NH 3 ), produkují potřebné růstové faktory pro bakterie, působí lipolyticky a proteolyticky a různými metabolity přispívají k tvorbě aroma těchto sýrů. Kvasinky proto nejsou pouze spřaženou mikroflórou v procesu zrání sýrů, ale působí i jako kulturní mikroorganismy pro jejich zrání a tvorbu aroma (Görner a Valík, 2004). Po čase jejich počty klesají a následně se rozvíjí bakteriální složka mazových kultur. Pro správný průběh zracího procesu je nejdůležitějším mikroorganismem Brevibacterium linens, který se může uplatnit na povrchu sýra poté, co přítomná kyselina mléčná je metabolizovaná a neutralizovaná kvasinkami a koky a ph povrchu sýra stoupne k hodnotám ph 6,0 (Bockelmann, 2002). Brevibacterium linens je G- pozitivní halotolerantní až halofilní proteolytická krátká tyčinka s teplotním optimem kolem 21 C. Dobře roste i v prostředí s 15% NaCl při ph 6,0 9,8. Brevibacterium linens i bakterie rodu rthrobacter jsou výrazně proteolytické. Degradují kasein, bílkoviny syrovátky a aminokyseliny za vzniku amoniaku, metioninu a methanthiolu, 18

které vytváří výslednou chuť a vůni sýra. Z ostatních těkavých sloučenin ke vzniku typické chuti a vůně přispívá zejména kyselina máselná, kapronová, fenylmethanol, dimethyldisulfid a dimethyltrisulfid. Brevibacterium linens a zástupci rodu Micrococcus a Corynebacterium zase produkují typické žlutooranžové pigmenty a vytváří tak charakteristické zbarvení povrchu. 19

2.4 Biogenní aminy a polyaminy 2.4.1 Charakteristika biogenních aminů Biogenní aminy (B) jsou nízkomolekulární organické báze, které vykazují různou biologickou aktivitu. Jde o produkty metabolismu všech živých organismů. V potravinách a potravinových surovinách vznikají především působením hnilobných a některých mléčných bakterií, jejichž enzymy dekarboxylázy odštěpují karboxyl z aminokyselin. Takto vznikají zejména histamin z histidinu, tyramin z tyrosinu, 2-fenyletylamin z fenylalaninu, tryptamin z tryptofanu a kadaverin z lysinu (Kalač a Křížek, 2002). 2.4.2 Dělení biogenních aminů podle chemické struktury lifatické: kadaverin (CD) romatické: tyramin (TYR), 2-fenyletylamin (PE) Heretocyklické: histamin (HIS), tryptamin (TRY) Polyaminy: putrescin (PUT), spermidin (SPD), spermin (SPM), agmatin (GM) 2.4.3 Charakteristika polyaminů Dříve byly biogenní aminy a polyaminy (P) zahrnovány do jedné skupiny, nyní se však uvádějí jako dva typy látek, které se odlišují vznikem a biologickým účinkem. Polyaminy jsou bazické sloučeniny s alifatickou strukturou, které se vyskytují ve všech živých organismech. Uplatňují se zejména při buněčném růstu a proliferaci. V organismu existuje určitá zásoba neboli pool polyaminů, které vznikají endogenní biosyntézou, činností intestinální mikroflóry či příjmem z potravy. Mezi polyaminy patří putrescin, spermidin a spermin. V poslední době byl jako polyamin klasifikován i agmatin, derivát argininu, působící jako neurotransmitér (Larqué, Sabater-Molina, Zamora, 2007). Putrescin se se svým vznikem a strukturou řadí mezi B, ale protože je prekurzorem spermidinu a sperminu (PUT SPD SPM), je zahrnován i do P (Kalač, 2009). 20

2.4.4 Vznik biogenních aminů a polyaminů Histidin Histamin Obrázek č. 1 Vznik histaminu z histidinu Tyrosin Tyramin Obrázek č. 2 Vznik tyraminu z tyrosinu Lysin Kadaverin Obrázek č. 3 Vznik kadaverinu z lysinu Tryptofan Tryptamin Obrázek č. 4 Vznik tryptaminu z tryptofanu 21

rginin Citrulin GMTIN Ornithin N karbamoylputrescin S adenosylmetionin PUTRESCIN Dekarboxylovaný S- adenosylmethionin minpropyl SPERMIDIN SPERMIN Obrázek č. 5 Biosyntéza polyaminů (upravený obrázek dle Lima a Glória, 1999 cit. dle Önal, 2007) 22

2.5 Faktory ovlivňující tvorbu biogenních aminů v potravinách 2.5.1 Faktory ovlivňující tvorbu biogenních aminů v potravinách Podmínky vzniku biogenních aminů v potravinách jsou následující: Přítomnost aminokyselin v substrátu Přítomnost mikroorganismů s dekarboxylázovou aktivitou Nastolení vhodných podmínek pro růst, množení mikroorganismů a syntézu dekarboxyláz Biogenní aminy se tvoří v potravinách na základě dekarboxylační aktivity bakteriálních enzymů nebo enzymů přítomných v potravinách. Tvorbu biogenních aminů lze tedy ovlivnit omezením bakteriálního růstu nebo inhibicí aktivity daných enzymů. Mikroorganismy a jejich enzymovou aktivitu je možno ovlivnit celou řadou faktorů jako je teplota, doba skladování, ph, obsah solí, přítomnost kyslíku, vodní aktivita nebo přítomnost kofaktorů dekarboxyláz např. pyridoxal, pyridoxin (Bover-Cid a Holzapfel, 1999). Jedním z nejvýznamnějších faktorů, které ovlivňují aktivitu mikrobiálních dekarboxylačních enzymů, je dostupnost substrátu. Význam má nejen přítomnost volných aminokyselin, ale také přítomnost využitelných cukrů v potravině. Jako optimální se uvádí koncentrace glukózy v rozmezí od 0,5 do 2,0%. Zatímco 3,0% glukózy v substrátu již inhibuje syntézu enzymů (Silla Santos, 1996). Dalším významným faktorem je teplota. Obecně platí, že množství B se zvyšuje s dobou skladování a se zvyšující se teplotou. Tepelná úprava ovlivňuje množství vznikajících B a P v potravinách jen nepatrně. Obsah sperminu při vaření klesá, kdežto histamin je termostabilní a jeho koncentrace se během vaření nemění (dams a Nout, 2001). Optimální hodnota ph pro aktivitu většiny dekarboxylačních enzymů a produkci biogenních aminů je slabě kyselá (5,0 5,5). Závisí také na druhu dekarboxylačního mikroorganismu. Nižší hodnoty ph inhibují bakterie čeledi Enterobacteriaceae, zatímco bakterie mléčného kvašení jsou tolerantní proti kyselejšímu prostředí (Bover- Cid a Holzapfel, 1999). 23

Přítomnost solí obecně inhibuje tvorbu biogenních aminů, ale na druhé straně histamin nebo tyramin působí na některé bakterie osmoprotektivně a jeho syntéza je tedy v přítomnosti NaCl v některých případech zvýšena (Komprda, 2005). Dalším faktorem je kyslík, ten může podporovat nebo omezovat tvorbu B v závislosti na mikroorganismech aerobních, anaerobních a fakultativně anaerobních. Omezení růstu mikroorganismů s dekarboxylázovou aktivitou a tím i výskyt B je podmíněn také přítomností konzervačních prostředků v potravinách. Např. některé koření a bylinky mohou mít antibakteriální vlastnosti. Také antibiotika v potravinách potlačují vznik B (dam a Nouts, 2001). Odstranění již jednou vzniklých biogenních aminů a polyaminů je velmi obtížné. K částečnému snížení obsahu aminů dochází v tepelně zpracovaných výrobcích jejich reakcí s redukujícími cukry, respektive s rozkladnými produkty cukrů v reakci Maillarda. Nejvhodnějším způsobem výroby potravin obsahujících malé množství B je však dodržování technologických postupů a hygienických podmínek výroby, které brání jejich vzniku (Velíšek, 2002). 2.5.2 Výskyt biogenních aminů a polyaminů v potravinách Výskyt B lze očekávat v každé potravině, která obsahuje proteiny či volné aminokyseliny a jsou-li v ní vhodné podmínky pro rozvoj mikroorganismů. Celkové množství B se liší v závislosti na původu potraviny a přítomnosti mikroorganismů. B mohou být přítomny v mnoha potravinách jako jsou ryby a rybí produkty, masné výrobky, mléčné výrobky, vejce, víno, pivo, zelenina, ovoce, ořechy a čokoláda (Silla Santos, 1996). Z hlediska výskytu se obvykle potraviny dělí na nefermentované, v nichž B vznikají především činností hnilobných bakterií, a na fermentované, v nichž je rozhodující působení bakterií mléčného kvašení. Vyšší hladiny spermidinu lze očekávat v potravinách rostlinného původu (květák, luštěniny, brokolice), zatímco spermin je typický pro potraviny živočišného původu (maso, masné výrobky). Vyšší množství putrescinu bylo zaznamenáno v citrusových plodech, džusech, kyselém zelí, kečupu, fermentovaných sójových produktech, rybách. Obsah všech polyaminů byl detekován i v sýrech, a to hlavně zrajících (Kalač a Krausová, 2005). Obvyklé obsahy jednotlivých aminů v potravinách se pohybují v řádu jednotek až desítek miligramů v kilogramu, hodnoty ve stovkách mg.kg -1 se již pokládají za vysoké 24

až velmi vysoké. Vyjímečně dochází i k překročení hladiny 1000 mg.kg -1 (Kalač a Křížek, 2005). 2.5.2.1 Výskyt biogenních aminů a polyaminů v sýrech Vedle ryb jsou sýry nejčastěji uváděnou potravinou spojovanou s intoxikací B. Sýry představují ideální prostředí pro tvorbu B, které vznikají převážně dekarboxylací volných aminokyselin za působení bakteriálních dekarboxyláz. Koncentrace volných aminokyselin v původní surovině i v nezrajícím sýru jsou tak nízké, že působením dekarboxyláz by vzniklo netoxické množství B. V nekontaminovaném mléce obsah B nepřesahuje 1mg.kg -1 (Standarová, Borkovcová, Vorlová, 2008). Proteolýza je tedy podmínkou vzniku toxického množství B v sýrech. Při zrání sýru je proteolýza mléčných bílkovin považovaná za jeden z nejdůležitějších pochodů, které ovlivňují výslednou kvalitu sýra. Působením nativních enzymů z mléka, proteáz zákysových kultur, syřidlových enzymů a proteáz kontaminující mikroflóry probíhá rozsáhlá proteolýza, při které jsou mléčné bílkoviny rozkládány až na aminokyseliny (Greif a Greifová, 2006). Sýry obvykle obsahují jednotky až stovky mg.kg -1 histaminu, tyraminu, putrescinu a kadaverinu, jednotky až desítky mg.kg -1 2-fenyletylaminu a velmi malá množství tryptaminu. Obsahy B však mohou vyjímečně dosáhnout až gramových množství v 1 kg sýra, což závisí na ošetření výchozí suroviny a technologických faktorech, jako jsou teplota sýřeniny, použití startovacích a plísňových kultur. Významné množství bylo zjištěno u sýrů z nepasterovaného mléka (Standarová, Borkovcová, Vorlová, 2008). Využitím vhodných startovacích kultur v sýrařské technologii je možné významně snížit koncentraci histaminu, ale i putrescinu a kadaverinu v sýrech. Nizin produkovaný Lactococcus Lactis a Enterococcus EFS 2 a Enterocin 4 produkovaný Enterococcus faecalis výrazně inhibují růst mikroorganismů produkujících histamin v sýrech, jehož producenti jsou zejména Lactobacillus buchneri a Lactobacillus brevis. B lze fyziologicky deaktivovat použitím mikroorganismů, které mají aminooxidázovou aktivitu, kam patří např. Brevibacterium linens, který snižuje množství tyraminu a histaminu během zrání sýrů (Leuschner a kol., 1998). Příčinou otrav ze sýrů jsou vysoké obsahy tyraminu nebo histaminu. Nejvyšší obsahy těchto aminů jsou v sýrech zrajících pod mazem (typu tvarůžků, romaduru) a v sýrech poloměkkých a plísňových. Další skupinou jsou sýry vyráběné 25

z nepasterovaného mléka a za zhoršených hygienických podmínek, např. brynza. V tvrdých sýrech holandského typu jsou hladiny aminů nižší (Křížek a Kalač, 2005). I přestože jsou sýry vhodným substrátem pro tvorbu biogenních aminů, minimální výskyt otrav ukazuje, že při zachování správných technologických postupů se možnosti jejich tvorby minimalizují (Görner a Valík, 2004) Tabulka č. 6 Koncentrace B a P ve vybraných typech sýrů (Standarová, Borkovcová, Vorlová, 2008) Koncentrace B mg.kg -1 Vzorek TRY PE PUT CD HIS TYR SPD SPM x 7,7 4,8 29,5 20,8 37,8 206 3,5 3,8 Sýry s vysokodohřívanou sýřeninou x min 1,2 ND 1,2 1,1 1,4 3,4 0,8 0,8 (a=32) x max 31,2 6,2 223 233 151 1123 6,7 9,1 x 2,0 1,5 37,7 66,9 12,6 70,2 1 2,4 Sýry s nízkodohřívanou sýřeninou x min 0,6 0,6 0,7 ND 0,6 3,4 0,4 0,6 (a=21) x max 8,2 5,8 184 432 58 360 2,7 11,3 x 2,3 1,8 61,3 51,5 8,2 12,9 5,3 0,9 Sýry s plísní na povrchu x min 0,4 0,3 17,9 0,3 0,6 0,4 0,6 0,1 (a=25) x max 8,8 9 266 388 116 187 12,5 29,8 x 2 5,6 28,5 37,9 8,3 63 17,7 1,8 Sýry s plísní uvnitř hmoty x min 0,6 0,3 7,3 ND 0,6 3,4 0,4 0,6 (a=24) x max 26 30,5 123 699 38 444 39,7 2,9 x 3,1 13 161 300 56,1 121 8,1 7,2 Měkké zrající sýry x min 0,5 5,5 4,2 7,8 8,1 28,1 ND 0,8 (a=35) x max 49,2 53,2 591,1 1110 283 417 26,1 10,8 x 4,2 1,3 22 70,2 74 109 1,2 1 Kozí sýry x min 1,2 ND 1,4 ND 3 3 ND ND (a=10) x max 8 2,8 66,2 296 272 326 2 2 x 1,2 1,1 12,9 3,4 1,1 7,2 0,6 0,8 Tavené sýry přírodní x min 0,6 0,4 0,6 0,3 0,6 0,5 0,2 0,3 (a=12) x max 6,1 2,1 55,8 13,8 6,4 27,8 3,6 1,7 x 1,9 3,9 86,2 28,2 2,5 38,8 1,3 2,9 Tavené sýry ochucené x min 0,4 0,3 0,6 0,1 0,6 0,4 0,4 0,5 (a=12) x max 11,8 34,8 4219 242 16,7 161 5,5 6,8 Vysvětlivky: x průměrná hodnota, x min minimální naměřená hodnota, x max maximální naměřená hodnota, ND nedetekováno 26

2.6 Fyziologické funkce a toxikologické účinky biogenních aminů a polyaminů v organismu člověka 2.6.1 Fyziologické funkce biogenních aminů a polyaminů B mají v organismu významnou roli, neboť jsou zdrojem dusíku a prekurzory hormonů, nukleových kyselin či proteinů. V potravinách jsou zase nositely aroma. Katecholamin, indolamin a histamin mají významné funkce v metabolismu, zejména v nervovém systému a při ovlivňování krevního tlaku. 2-fenyletylamin a tyramin způsobují zvýšení krevního tlaku a histamin naopak jeho snížení. Histamin se také účastní primární alergické odezvy organismu. Polyaminy jsou nepostradatelnou složkou pro růst a proliferaci buněk a pro normální funkci imunologického systému střeva. Přestože si tělo dokáže polyaminy samo syntetizovat, určité množství je přijímáno z potravy. Významné jsou i jejich antioxidační účinky. Polyaminy působí příznivě při zpomalování procesu opotřebování a stárnutí buněk. Jejich účinky spočívají ve schopnosti vychytávání volných radikálů. Spermidin a spermin stabilizují hydroperoxid a zháší singletový kyslík. Tyto účinky jsou patrně příčinou protizánětlivého působení při akutních či chronických zánětech v organismu (Kalač, 2009). Bylo prokázáno, že antioxidační efekt je přímo úměrný počtu amino skupin v těchto sloučeninách (Silla Santos, 1996). 2.6.2 Toxikologické účinky a toxické dávky biogenních aminů a polyaminů Přestože jsou biogenní aminy a polyaminy nezbytné v mnoha funkcích organismu, jejich vysoký příjem v potravinách má toxický efekt. V organismu člověka působí jako látky vasoaktivní a psychoaktivní. Psychoaktivní aminy (histamin putrescin, kadaverin) ovlivňují nervový systém a působí jako neurální tranzmitéry, zatímco vasoaktivní aminy (2-fenylethylamin, tyramin, tryptamin) jsou součástí vaskulárního systému (McCabe-Sellers a kol., 2006). Konzumace potravy s vyšším obsahem biogenních aminů a polyaminů může vést k různým reakcím v organismu (viz. tabulka č. 7), může dojít i k alimentární intoxikaci (Shalaby, 1996). Histamin způsobuje vazodilataci cév a snížení krevního tlaku, je příčinou otravy z ryb (scombroid poisoning). Tyramin je příčinou migrén a hypertenzních krizí, tzv. reakce na sýr (cheese reaction), zejména u pacientů užívající antidepresiva. 27

Toxikologický význam polyaminů spočívá v jejich schopnosti vytvářet karcinogenní N-nitrososloučeniny a zvýšit růst chemicky indukovaných (aberativních) ložisek krypt v kolonu. V důsledku účasti P v buněčném růstu a proliferaci se P hromadí v nádorové tkáni a jejich obsah se zvyšuje v tělních tekutinách u pacientů s rakovinou. V takovém případě může podávání léků inhibujících biosyntézu P sloužit k zabránění rozšíření nádorového bujení (Kalač, 2009). Je také nutná kontrola polyaminů přijatých potravou u pacientů s rakovinou (Komprda a kol., 2008). Toxicita polyaminů se zvyšuje s jejich rostoucí molekulovou hmotností a nábojem (Komprda, 2005). Je však nutné uvést, že samy polyaminy nejsou karcinogeny, tudíž nejsou iniciátory nádorového bujení (Kalač a Křížek, 2005). U zdravých jedinců existuje v trávícím traktu poměrně účinný detoxifikační systém, který je schopen metabolizovat normální příjem B a P potravou. Rozhodující cestou odbourávání aminů v organismu člověka je oxidace: R-CH 2 - NH-R + O 2 + H 2 O R-CHO +H 2 N-R + H 2 O 2 (Leuschner a kol., 1998). Příslušné enzymy je možno rozdělit na monoaminooxidázy (MO), diaminooxidázy (DO) a polyaminooxidázy (PO). MO odbourávají především aromatické monoaminy. Jde o mitochondriální enzymy exprimované v játrech, slezině, ledvinách, mozku, plicích a především ve střevě. DO oxidativně deaminují diaminy (PUT, CD), nejvyšší aktivitu vykazují v tenkém střevě, v ledvinách a placentě. PO používají jako substrát především polyaminy spermin a spermidin, mohou však odbourávat i mono a diaminy (Komprda, 2005). Detoxikační kapacita je však značně individuální. Navíc je omezená v dětství a snižuje se s rostoucím věkem (Kalač a Křížek, 2005). Detoxifikační systém může selhávat zejména u alergických jedinců, při příjmu vysokého množství biogenních aminů potravou nebo vlivem inhibitorů aminooxidáz (dams a Nout, 2001). Jako inhibitory aminooxidačních enzymů působí některé léky ze skupiny psychofarmak, alkohol, kouření apod. Přestože mají putrescin a kadaverin nízkou toxickou aktivitu, vstupují do reakcí s aminooxidázami, inhibují je a násobí toxický efekt histaminu a tyraminu (Novella- Rodríguez a kol., 2003). Halász a kol. (1994) popsali obdobné účinky u sperminu a spermidinu, které zvyšují transport histaminu ve střevní stěně a mohou taktéž působit jako potenciátoty účinku histaminu. 28

Podle Halásze a kol. (1994) je toxická dávku histaminu v potravinách 100 mg.kg 1, u tyraminu se pohybuje v rozmezí 100 800 mg.kg -1 a u 2-fenyletylaminu 30 mg.kg -1. Množství 1000 mg.kg -1 celkové sumy aminů v jídle je považováno pro zdraví nebezpečné (Taylor, 1985 cit. dle Silla Santos, 1996). U citlivých jedinců může 3 mg 2-fenyletylaminu způsobit bolesti hlavy a migrény. Pro osoby požívající léky s inhibitory monoaminooxidáz je nebezpečná dávka 6 mg tyraminu (Vale a Glória, 1998). Tabulka č. 7 Fyziologické funkce biogenních aminů a polyaminů (Shalaby, 1996) Biogenní aminy, Prekurzor Fyziologický efekt v organismu polyaminy Histamin Histidin Uvolňování adrenalinu, noradrenalinu Kontrakce hladké svaloviny dělohy, střeva a dýchacího ústrojí Stimulace senzorů a motorických neuronů Sekrece žaludečních šťáv Tyramin Tyrosin Periferní vasokonstrikce Zvýšení srdečního minutového objemu Slzení a slinění Zrychlení dýchání Zvýšení hladiny cukru v krvi Uvolnění noradrenalinu ze sympatického nervového systému Migrény Putrescin a kadaverin Ornitin a lysin Hypotenze Bradykardie Tonická křeč čelistních svalů Paréze okončetin Toxicita dalších aminů 2-fenyletylamin Fenylalanin Uvolnění noradrenalinu ze sympatického nervového systému Zvýšení krevního tlaku Migrény Tryptamin Tryptofan Zvýšení krevního tlaku 29

2.6.2.1 Toxicita histaminu Histamin se účastní mnoha reakcí v organismu. Je součást granulí žírných buněk a krevních basofilů. Kromě toho, že vyvolává imunologické reakce organismu (alergické reakce), uvolňuje se do krevního oběhu, kde se váže na membránové receptory a působením na sekreční žlázy ovlivňuje kardiovaskulární systém. Histamin přímo stimuluje srdeční činnost jako výsledek uvolňování adrenalinu a noradrenalinu z nadledvin a způsobuje stahy hladké svaloviny dělohy, střeva, dýchacího ústrojí, stimuluje motorické neurony a řídí sekreční činnost žaludku. Negativní účinky histaminu na organismus člověka se vyznačují kožními projevy, jako je vyrážka, kopřivka, edémy a lokální záněty. Mezi střevní potíže patří nevolnost, zvracení, průjem a břišní křeče. Další příznaky zahrnují hypotenzi, bolesti hlavy, brnění a červenání. V jiných případech se projevily pocity návalu tepla, bronchospasmus, potíže s dýcháním a dušnost. V letech 1976 1986 bylo ve Velké Británii vyšetřováno 250 lidí v souvislosti s otravami histaminu a jako nejčastější projevy byly zaznamenány vyrážka, průjem, červenání, pocity tepla a bolesti hlavy (Shalaby, 1996). Histamin je nejběžnější amin, který způsobuje otravy z potravin. Toxický efekt závisí na množství histaminu přijatého potravou, působení jiných aminů, aktivitě aminooxidáz a fyziologickém stavu střeva (dams a Nout, 2001). Nicméně histamin je běžná součást těla a jeho koncentrace v krvi je přísně regulována (Fox a kol., 2004). 2.6.2.2 Toxicita tyraminu Význam tyraminu přijímaného potravou souvisí zejména s jeho schopností interagovat s inhibitory monoaminooxidáz (MOI), což jsou léky ze skupin antidepresiv, a následně zvyšovat riziko hypertenzních krizí. Tyramin nepřímo uvolňuje noradrenalin ze sympatického nervového systému a tím způsobuje zvýšení krevního tlaku, zrychlení srdeční činnosti a periferní vasokonstrikci. Tyramin také rozšiřuje zornice, cévy víčka, způsobuje slzení, slinění, zrychlení dechu a zvýšení glykémie. MOI inhibují enzymy monoaminooxidázy ve střevě, které by normálně odbourávaly tyramin přijatý potravou. To způsobí nárůst tyraminu v krevním oběhu, vzestup krevního tlaku a riziko hypertenzních krizí (Lawley, Curtis, Davis, 2008). Mohou se objevit silné bolesti hlavy, dojít ke krvácení do mozku či k srdečnímu infarktu. Zpočátku byly tyto projevy charakterizovány jako otravy ze sýrů (cheese 30

reaction), ukázalo se však, že stejné příznaky se mohou objevit i po požití jiných potravin jako jsou marinovaní sledi, masné výrobky či kuřecí játra (Shalaby, 1996). 2.7 Hygienický význam biogenních aminů a polyaminů v potravinách Z hygienického hlediska mohou B u nefermentovaných potravin sloužit jako indikátory nežádoucí mikrobiální činnosti a jejich stanovení může být využito k posouzení míry rozkladu sledovaného materiálu. V případě skladování potravin může být obsah B ukazatelem jakosti vstupní suroviny a úrovně hygieny během výrobního procesu a skladování (Standarová, Borkovcová, Vorlová, 2008). V této souvislosti byl zaveden tzv. index biogenních aminů (BI), který využívá skutečnosti, že obsah histaminu, putrescinu a kadaverinu se v průběhu skladování daného produktu zvyšuje, na druhé straně se však množství polyaminů spermidinu a sperminu nemění nebo dokonce snižuje. SPD a SPM totiž primárně nevznikají činností mikrobiálních dekarboxyláz v potravině, ale vstupují do ní jako původní látky z použité suroviny. Index biogenních aminů se uvádí jako: BI = HIS + PUT + CD ( 1+ SPD + SPM ) [mg.kg -1 ], čím je podíl indexu biogenních aminů vyšší, tím je kvalita a senzorické vlastnosti potravin horší (Komprda, 2004). V některých zemích byly maximální limity B v určených potravinách stanoveny zákonem. Česká legislativa do roku 2004 obsahovala legislativní limity pro vybrané biogenní aminy v rybách, sýrech, pivu a vínu, ale nyní je v České republice platný pouze hygienický limit pro nejvyšší přípustné množství histaminu v rybách a rybích výrobcích 100 mg.kg -1, uvedený v Nařízení komise (ES) č. 2073/2005. Tento limit může být ve dvou vzorcích z devíti z jedné šarže překročen až do hodnoty 200 mg.kg -1. Legislativa neurčuje povinnost výrobcům uvádět množství biogenních aminů na obale. 31

2.8 Mikroorganismy produkující biogenní aminy 2.8.1 Mikroorganismy s dekarboxylázovou aktivitou Mezi bakterie schopné produkovat biogenní aminy patří mnoho druhů mikroorganismů, které mají specifické dekarboxylázy. Dekarboxylázy jsou enzymy spadající do tříd lyáz. Existuje šest aminokyselinových dekarboxyláz, které jsou specificky orientované na L-izomery aminokyselin tyrosinu, lysinu, ornithinu, argininu, histidinu a kyseliny glutamové. Tyto enzymy jsou rozšířené u živočichů, rostlin i mikroorganismů, zejména u bakterií vykazují dekarboxylázy výraznou aktivitu. Dekarboxylační aktivitu vykazují rody Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Pediococcus, Streptococcus, Laktobacillus, Photobacterium (Silla Santos, 1996), Enterococcus, Hafnia, Morganella (Halász a kol., 1994). Schopnost dekarboxylázové aktivity je nejčastější u laktobacilů, pediokoků, enteroků a bakterií čeledi Enterobacteriaceae (Halász a kol., 1994). 32

Tabulka č. 8 Významné mikroorganismy produkující biogenní aminy (Velíšek, 2002) Potravina Mikroorganismy Produkované aminy Ryby Morganella morganii, Klebsiella pneumonia, Hafnia alvei, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Clostridium perfringens, Enterobacter aerogenes, Bacillus sp., Staphylococcus xylosus Sýry Lactobacillus buchneri, L. bulgaricus, L. plantarum, L. casei, L. acidophilus, L. arabinosae, Streptococcus faecium, S. mitis, Bacillus macerans, Propionibacterium sp. Maso a masné Pediococcus sp., Lactobacillus sp., výrobky Pseudomonas sp., Streptococcus sp., Micrococcus sp., čeleď Enterobacteriaceae Fermentovaná Lactobacillus plantarum, Leuconostoc zelenina mesenteroides, Pediococcus sp. Fermentované Rhizopus oligosporus, Trichosporon produkty ze sóji beiglii, Lactobacillus plantarum Histamin, tyramin, kadaverin, putrescin, agmatin, spermin, spermidin Histamin, kadaverin, putrescin, tyramin, tryptamin Histamin, kadaverin, putrescin, tyramin, 2- fenylethylamin, tryptamin Histamin, kadaverin, putrescin, tyramin, 2- fenylethylamin, tryptamin Histamin, kadaverin, putrescin, tyramin, tryptamin 2.8.2 Mikroorganismy produkující biogenní aminy v sýrech Mezi hlavní mikroorganismy produkující biogenní aminy v sýrech jsou bakterie mléčného kvašení přidávané jako startovací kultury (Fernandéz-Garcia, 2000 cit. dle Komprdy a kol., 2007). Jde zejména o Lactobacillus lactis, L. bulgaricus atd. Dále jsou to nezákysové bakterie mléčného kvašení, které jsou tvořeny zejména mezofilními laktobacily (Latobacillus casei, L. rhamnosus, L. paracasei, L. plantarum. L. curvatus) a pediokoky (P. acidilactici, P. pentosaceus). Tyto bakterie pochází zejména z nepasterovaného mléka, u sýrů vyráběných z mléka pasterovaného je jejich zdrojem 33