PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE Princip a využití Lucie Říhová OKH, FN Brno
Průtokový cytometr flow cytometrie (flow+cyto+metrie) specializovanější varianta fluorescenčního mikroskopu v kombinaci s krevním analyzátorem měření fyzikálních, chemických a biologických vlastností až 10 6 buněk v suspenzi FACSCantoII (Becton-Dickinson) Cytomics FC500 (Beckman Coulter)
Složení průtokového cytometru 1. Zdroj světla - signál z rozptylu na buňkách a aktivace fluorescence navázaných barev 2. Fluidika - směřování vzorku do laserového paprsku a usměrňování jeho toku 3. Optika - sdružení a rozdělení rozptýlených paprsků dle l pomocí filtrů a zrcadel na příslušné detektory 4. Elektronika a počítačový systém - převod optického signálu na elektronický a další zpracování
Složení průtokového cytometru 1. Zdroj světla - signál zrcadla z rozptylu na buňkách a aktivace nosná kapalina buněčná suspenze polopropustná fluorescence navázaných barev 2. Fluidika - směřování vzorku do laserového paprsku a usměrňování jeho toku optické filtry 3. Optika - sdružení a rozdělení rozptýlených paprsků dle l pomocí filtrů a zrcadel na příslušné detektory SS detektor 4. Elektronika a počítačový systém - převod optického signálu na elektronický a další FS detektor zpracování detektory fluorescencí http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/tutorials.html
Světlo vs. buňka detektor detektor Forward Scatter - rozptyl světla v malém úhlu - velikost buňky Side Scatter - rozptyl světla pod úhlem 90 - komplexita buňky detektor Fluorescence - přítomnost fluorochromu
Fluorochromy excitace UV/violet diode (fialový laser) - 405 nm - DAPI, Hoechst/Pacific Blue (452), AmCyan (491), BD Horizon 450 a 500 excitace Ar-iontovým laserem (modrý) - 488 nm FITC - fluorescein isothiokyanát (530 nm) Alexa Fluor 488 (519 nm) PE, RD1 - phycoerythrin (580 nm) ECD - tandem. konjugát PE-texaská červeň (620 nm) PerCP - perridin chlorophyl (678 nm) PerCPCy5.5 - tandem. konjugát PerCP-Cy5.5 (696 nm) PC5 - tandem PE-cyanine 5 (620 nm) PC7 - tandem PE-cyanine 7 (778 nm) PI - propidium jodid, široký peak okolo 620 nm excitace He-Ne laserem/red diode (červený) - 633 nm APC - allophycocyanin (670 nm) APC-Cy7 - tandem APC-cyanine 7 (778 nm)
Analýza a zobrazení leukocytární gate monocytární gate A B lymfocytární gate debris FS lin C SS lin FS - forward scatter - velikost buněk SS - side scatter - granularita/komplexita
počet buněk 1-parametrová analýza Histogram osa x - intenzita fluorescence, osa y počet buněk hodnocení - odečet % pozitivních buněk neg. peak = autofluorescence, izotypová kontrola poz. peak - různá intenzita exprese low (+/-) < dim ( + ) < high, bright ( ++ ) < very high ( +++ ) porovnávání intenzity exprese Intenzita fluorescence (lineární nb logaritmická stupnice)
2-parametrová analýza Dot plot dva parametry proti sobě - FLx vs. FLy, FLx vs. FS či SS procentuální hodnocení - nejčastěji kvadrantová analýza PE I. II. I. kvadrant FITC - PE + II. kvadrant FITC + PE + III. kvadrant FITC - PE - IV. kvadrant FITC + PE - III. IV. FITC
Sortování subpopulací Bezprostředně po analýze dochází piezoelektricky k trhání proudu vzorku na kapky - obsahující jednu buňku - přičemž požadovaným buňkám = kapkám je udílen el. náboj. Tyto jsou pak v el. poli vychylovány a odseparovány. udělení náboje a separace gateovaných bb
Imunofenotypizace - CD znaky Stanovení povrchových a intracelulárních markerů exprimovaných jednotlivými hodnocenými buňkami vznik CD klasifikace v r. 1982, využívá k identifikaci buněk tzv. CD markerů - Cluster of Differenciation, def. cca 300 znaků (antigenů Ag) a není uzavřeno historicky označeny nejprve leukocytární markery, později zahrnutí dalších znaků (megakaryocyty, trombocyty, erytrocyty ) různá fce - buněčné enzymy, receptory mikrobiálních Ag, transportní proteiny, prezentace Ag, Fc receptory, komplementové receptory, regulační signalizační receptory a jejich ligandy, adhezivní proteiny
Hematopoeza
Identifikace subpopulací pomocí MoAb proti znakům přítomným na povrchu nebo v cytoplazmě buňky na základě exprese CD markerů rozlišení subpopulací buněk, jejich stádia vývoje a zralosti, patologie T lymfocyty B lymfocyty NK buňky kmenové buňky trombocyty erytrocyty leukocyty monocyty dendritické bb CD1a - CD3, CD4, CD5 - CD8... CD19, CD20 - CD24, CD79 - CD84... CD16, CD55, CD56, CD57, CD244... CD34, CD117... CD36, CD41, CD42a, CD42b, CD61... Gly-A (CD235a)... CD45... CD14... CD83, HLA-DR, ILT3...
Princip IFT monoklonální protilátka (MoAb) konjugovaná s fluorochromem (fluorescenční molekulou) suspenze buněk s určitými povrchovými či intracelulárními antigeny (Ag) vizualizace specifické vazby MoAb-Ag možnost kombinace několika MoAb vizualizace mnoha znaků najednou
Vazba MoAb - Ag plná krev kostní dřeň bb suspenze + vybrané protilátky konjugované s fluorescenční barvou = označení buněk vazbou protilátek na odpovídající Ag B T + = T B Anti CD3-FITC Anti CD19-PE
Zpracování a analýza vzorku Imunofenotypizace typ vzorku - buněčná suspenze - nesrážlivá periferní krev či kostní dřeň (EDTA, Heparin), BAL, kultivované buňky, desintegrovaná lymfatická uzlina Inkubace - se specifickou monoklonální protilátkou proti požadovaným znakům (T, B, NK buňky ) lyzace erytrocytů - pokud jsou obsaženy v suspenzi osmoticky, enzymaticky či chemicky fixace - 0,5% paraformaldehydem proplach - vymytí nadbytečné protilátky pomocí PBS analýza - získání listmode a vyhodnocení histogramů
Klinické využití FC Rutinní vyšetření a výzkumné analýzy imunologie hemato-onkologie transplantologie transfuziologie hematologie
Imunologie Analýza imunokompetentních buněk (IFT) subpopulace T, B, NK buněk dif. dg. imunodeficiencí apod. Analýza autoprotilátek proti leukocytům, erytrocytům či trombocytům Analýza funkce neutrofilů oxidativní vzplanutí fagocytóza
Základní populace lymfocytů CD8-FITC/CD4-PE/CD45-PC5/CD3-PC7 T lymfocyty - cytotoxické: CD3 + CD8 + - pomocné: CD3 + CD4 + CD45 + lymfocyty CD45 + lymfocyty B lymfocyty - B2: CD19 + CD20 + - B1: CD5 + CD19 + CD20 dim+ CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PC5/CD19-PC7 CD45 + lymfocyty CD45 + lymfocyty NK buňky - CD3 - CD16 + CD56 + - NK-T: CD3 + CD56 +
Absolutní počty buněk Využití firemního roztoku s přesně definovaným počtem částic na ml a fluorescencí ve všech kanálech zadáván jako kalibrátor shodný objem vzorku a kalibrátoru HIV + pacienti - stanovení abs. počtu CD4 + helper T lymfocytů CD45 + lymfocyty CD45 + lymfocyty CD45 + lymfocyty 1135 bb/ul 558 bb/ul 11 bb/ul
Transplantologie Zjištění zastoupení hematopoetických kmenových buněk CD34 + leukocyty (hematopoietic stem cell, HSC) v rámci transplantace kmenových buněk monitorování PK po stimulaci G-CSF, v transplantátu analýza pupečníkové krve Vymezení leukocytů Označení mrtvých bb Vymezení CD45 + leukocytů Označení CD34 + HSC
Hemato-(onkologie) Analýza povrchových a intracelulárních markerů - imunofenotypizace dif. dg. leukémií, lymfomů apod. analýza stavu onemocnění (remise, relaps ) stanovení minimální reziduální nemoci DNA analýza ploidita a proliferace buněk Analýza apoptózy a nekrózy
Diferenciální diagnostika hematologických malignit Vychází ze znalostí exprese povrchových a intracelulárních molekul v průběhu diferenciace krevních bb přítomnost patologických buněk s odlišným fenotypem liniová příslušnost (lymfoidní, myeloidní, monocytární aj.) diferenciační stupeň hematologických malignit analýza smíšeného fenotypu u leukémií detekce aberantně exprimovaných markerů
Kdy provádět IFT? cytopenie (zejména bicytopenie a pancytopenie) leukocytózy (lymfocytózy, monocytózy a eozinofilie) nález atypických buněk či blastů v PK, KD či jiných TT zvýšený počet plazmocytů, monoklonální gamapatie organomegalie či nález tkáňové masy neutrofilie ze zralých buněk polyklonální hypergamaglobulinémie polycytémie, trombózy a bazofílie
Akutní myeloidní leukémie Klonální neoplastická proliferace myeloidních blastů Antigeny prekurzorových buněk: CD34, CD38, CD117, HLA-DR, TdT Myeloidní antigeny: CD13, CD15, CD33, CD65, MPO Antigeny monocytární diferenciace: CD14, CD4, CD64, CD36, CD11b, CD11c leukocyty leukocyty
Lymfoproliferace - B-CLL Patologické B1 (CD5 + CD19 + ) lymfocyty přítomny v PK - vesměs charakteristický fenotyp CD20 dim+ CD23 + - bez exprese povrchových kappa/lambda lehkých řetězců Ig CD5 + CD19 + CD20dim + CD23dim + sk - /sl -
Malignity z PC plazmocyty (PC) fyziologicky přítomny v nízkém zastoupení - produkce vlastních MoAb zvratem v diferenciaci vznikají maligní PC - prekanceróza - MGUS (nízký počet maligních PC) - kumulace maligních PC v KD - mnohočetný myelom charakteristický fenotyp rozlišení fyziologických CD19 + a patologických CD56 + PC myeloma stem cells - CD138 - CD34 - CD27 + vysoký stupeň proliferace schopné diferenciace do maligních CD138+bb
Analýza PC u MG normální CD19 + CD56 - PC CD38 + CD138 + PC abnormální CD19 - CD56 + PC
Nejčastější aplikace u PLT I. Diagnostika dědičných či získaných defektů Glanzmanova trombocytopenie (GPIIb/IIIa - CD41/CD61) Syndrom Bernard Soulier (GPIb/IX - CD42b/CD42a) Syndrom šedých destiček (P-selektin - CD62P). Aktivace PLT in vivo analýza na aktivaci závislých Ag (CD62P) analýza PLT-PLT agregátů, případně agregátů s Leu (CD62P iniciuje interakci s PSGL-1 na leukocytech) destičkové mikropartikule
Defekty PLT GP Glanzmanova trombastenie CD61 CD41 Krvácivý stav CD36
Nejčastější aplikace u PLT II. Transfuziologie monitorování koncentrátů PLT (zbytkové WBC, aktivace PLT - CD62P, CD42b) detekce s PLT asociovaných Ig (potransfuzní reakce, ITP) Analýza PLT obratu detekce retikulovaných PLT (kvantifikace nezralých destiček - stupeň trombopoezy) počty PLT
Hereditární sférocytóza nejčastější vrozená hemolytická anémie molekulární defekty membránových proteinů erytrocytů (spectrin, band 3 ) narušený bikonkávní tvar destrukce ve slezině diagnostické testy sférocyty, osmotická rezistence, autohemolýza kryohemolýza průtoková cytometrie vazba kyseliny eosin maleimidové (EMA) na erytrocyty - analýza snížení fluorescence oproti kontrole
Hereditární sférocytóza K - kontrolní vzorek P - pacient s HS K - kontrolní vzorek P - pacient s HS po transfuzi ERY EMA ratio = 33,6/46,8 = 0,72 EMA ratio = 43,3/42,4 = 1,02 zbytkové patologické erytrocyty na pozadí transfundovaných MFI - medián intenzity fluorescence EMA = poloha peaku na ose X MFI P/MFI K= EMA ratio ~ 1 u pacientů bez HS a <0,9 u HS
PNH - Paroxysmální noční hemoglobinurie Chybění glykofosfatidyl-inositol proteinové kotvy Analýza CD235a + erytrocytů dle zastoupení CD55 - /CD59 - buněk různé typy PNH I-III Analýza monocytů a neutrofilů - CD45 + a CD14 + /CD33 + přítomnost proaerolyzinu FLAER - protilátka proti GPI Ery CD235a + Ery CD59 - Ery CD55 - Ery
Hmotnostní Cytometrie Nový přístup využívající stabilní izotopy kovů jako značky spolu s jejich detekcí pomocí atomové hmostnostní spektrometrie značky jsou spojeny s MoAb kompatibilními s povrchovými i či intracelulárními znaky buňky jsou vaporizovány, atomizovány a ionizovány, poté je měřena základní kompozice simultánní detekce až 30 parametrů jedné buňky bez nutnosti kompenzace SPADE
Zobrazovací cytometrie Flow cytometr se zobrazovacími a funkčními vlastnostmi mikroskopu přímé zobrazení buněk s 60 násobným rozlišením simultánní fenotypové a funkční analýzy s využitím 5 laserů a 12 zobrazení na buňku
Výhody a nevýhody FC FC analýza povrchových i intracelulárních markerů je citlivá a kvalitativní metoda (lze i kvantitativně) simultánní analýza několika markerů na vysokém počtu buněk paralela k morfologickému vyšetření - upřesnění dg. chybí informace morfologická občas nejednoduchá interpretace flowcytometr a fluorescenčně značené protilátky jsou poměrně drahé