Elucigene TRP Návod k použití

Elucigene TRP Návod k použití Katalogové číslo: TH003B2 50 testů Pro diagnostické použití in vitro Manufactured by: Elucigene Diagnostics Greenheys House Pencroft Way Manchester Science Park Manchester M15 6JJ For Sales, Customer Service and Technical Support:- T: +44 (0) 161 669 8122 F: +44 (0) 161 669 8129 E: enquiries@elucigene.com E: techsupport@elucigene.com Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics (UK) Limited., a company registered in England and Wales, registration number 8696299 TH003BYCS 001 Jul-2014 Strana 1 z 12

Elucigene TRP (panel pro riziko trombózy) Určené použití Traditional HGVS Nomenclature cdna name Protein name Factor V Leiden R506Q F2 NM_000130.3:c.1601G>A Protein name p.arg534gln Factor II 20210G>A F2 AF478696.1:g21538G>A (c.-97g>a) MTHFR 677C>T MTHFR NM_005957.3:c.665C>T p.ala222val Pro simultánní in vitro kvalitativní detekci mutací faktoru V Leiden (R506Q), protrombinu (faktor II 20210A) a methylen-tetrahydrofolátreduktázy (MTHFR C677T) v DNA extrahované z plné krve (konzervované pomocí EDTA) neboze vzorků suchých kapek krve. Souhrn a vysvětlení Žilní trombóza způsobuje v USA přibližně 50 000 úmrtí za rok a frekvence výskytu je 1 z 1 000 osob za rok 1. Ke vzniku trombózy přispívá mnoho známých rizikových faktorů, např. chirurgické operace, těhotenství, perorální antikoncepce a delší čas bez pohybu ( syndrom turistické třídy ) 2. Citlivou rovnováhu procesu koagulace krve také ovlivňuje genetický element. Biochemická koagulační kaskáda je složitá a obsahuje mnoho faktorů, které proces posilují nebo inhibují, a výsledkem jejich působení je buď nedostatečná srážlivost (hemofilie) nebo nadměrná srážlivost (trombofilie). Z těchto faktorů byly tři identifikovány jako klíčové pro vznik většiny případů dědičné trombofilie 3,4,5. Genové mutace těchto faktorů jsou užitečnými indikátory zvýšeného rizika žilní trombózy. Jedná se o faktor V Leiden (R506Q), faktor II (protrombin 20210A) a MTHFR (677C>T). MTHFR (methylen-tetrahydrofolátreduktáza) je nezbytná pro udržování hladiny homocysteinu, což má vliv na proces srážení krve. Faktor V Leiden je nejobvyklejší dědičná forma trombofilie. V USA a v Evropě jsou 3 až 8 % obecné populace heterozygotní na faktor V Leiden 6. Četnost výskytu homozygotů mutace faktoru V Leiden je přibližně 1 z 5 000, avšak podstatně se liší u různých populací. Riziko žilní tromboembolické příhody závisí jak na genetických, tak na získaných faktorech. Důležitým faktorem je věk, a u jedinců s mutací faktoru V Leiden se riziko zvyšuje rychleji. Jedinec heterozygotní na mutaci faktoru V Leiden má 7krát vyšší pravděpodobnost, že se u něj vyvine žilní trombóza, a u jedince homozygotního na faktor V Leiden je toto riziko 80ti násobně zvýšené 7. Ke zvýšenému riziku přispívají další rizikové genetické faktory (protrombin 20210A a MTHFR 677C) heterozygot faktoru V Leiden má 20krát vyšší riziko, pokud je zároveň heterozygot na 20210A 8. U žen, které užívají perorální antikoncepci, se riziko žilní trombózy zvyšuje 30ti násobně, pokud je žena heterozygotní na faktor V Leiden, a riziko je několiksetkrát vyšší, pokud je žena homozygotní na faktor V 9. Testování se obecně zaměřuje na pacienty mladší 50 let s anamnézou žilní trombózy a na pacienty nebo příbuzné s rodinnou anamnézou zvýšené srážlivosti krve. Testování je kromě toho vhodné u příbuzných jedinců s potvrzeným faktorem V Leiden a u žen, které několikrát samovolně potratily, prodělaly závažnou preeklampsii nebo porodily mrtvé dítě. Znalost statusu faktoru V Leiden může ovlivnit zvládání těhotenství a mít dopad na rozhodnutí o užívání perorální antikoncepce 10. Jakmile byl identifikován faktor V Leiden, je velmi informativní provést testy na další rizikové faktory trombózy jako je protrombin (faktor II) a TH003BYCS 001 Jul-2014 Strana 2 z 12

MTHFR. Přínosem identifikace mutace faktoru V Leiden u pacientů se žilní trombózou je skutečnost, že asymptomatičtí členové rodiny se mohou rozhodnout zjistit, zda u nich rovněž existuje zvýšené riziko žilní trombózy. Toto zjištění jim může pomoci při vedení antitrombolytické léčby v obdobích největšího rizika, jako jsou chirurgické operace, těhotenství, orální antikoncepce a delší období nehybnosti při dálkových letech 11. Principy metody Metoda používaná v testu Elucigene TRP je založena na systému diferenciální amplifikace mutací (Amplification Refractory Mutation System, ARMS), což je technologie alelověspecifické PCR amplifikace, která je schopna detekovat bodové mutace nebo malé delece deoxyribonukleové kyseliny (DNA) 12. Test obsahuje dvě reakční směsi, které se vzájemně doplňují. První reakční směs specificky amplifikuje všechny TRP alely, které nejsou zasaženy mutacemi faktoru V Leiden (R506Q), faktoru II (protrombin 20210A) a MTHFR (677C>T), tj. divoký typ. Druhá reakční směs naopak obsahuje primery, které specificky amplifikují pouze alely s mutacemi R506Q, 20210A a 677C>T. Obě reakční směsi také zahrnují primery, které amplifikují DNA sekvence bez faktoru V Leiden, protrombinu a MTHFR, jako vnitřní amplifikační kontrolu testu, která označuje úspěšnou amplifikaci. Amplifikované produkty (amplikony) těchto dvou reakcí jsou separovány elektroforézou v agarózovém gelu a přítomnost proužků v gelu indukuje status alel profaktor V Leiden (R506Q), faktor II (protrombin 20210A) a MTHFR (677C>T). Varování a bezpečnostní opatření 1. Kontrolní vzorek DNA dodaný s touto soupravou je humánního původu a byl nezávisle testován pomocí rozboru na bázi PCR a shledán negativním na virus hepatitidy typu B (HBV), na virus hepatitidy typu C (HCV) na virus lidské imunodeficience 1 (HIV1). 2. Při manipulaci s materiály humánního původu je nutno postupovat opatrně. Všechny vzorky se musí považovat za potenciálně infekční. Žádná testovací metoda nemůže zaručit úplnou jistotu, že produkt neobsahuje HBV, HCV nebo HIV 1 nebo jiná infekční agens. 3. Při manipulaci se vzorky a komponentami testu a při jejich používání, skladování a likvidaci je nutno postupovat v souladu s postupy definovanými příslušnými státními normami nebo zákony pro nakládání s biologicky nebezpečnými materiály. 4. Podle současné správné laboratorní praxe musí laboratoře při každém testu zpracovat své vlastní vzorky pro kontrolu kvality se známým genotypem, aby bylo možné vyhodnotit validitu postupu. 5. Pokud je krabice soupravy poškozená, mohlo dojít k poškození obsahu. Soupravu nepoužívejte a kontaktujte zákaznický servis. TH003BYCS 001 Jul-2014 Strana 3 z 12

Symboly použité na označení Symboly použité na všech štítcích a na obalech odpovídají harmonizované normě ISO 15223 Výrobce Počet testů Přečtěte si návod k použití X C Skladujte při teplotě nižší, než je zde uvedeno Datum exspirace Katalogové číslo Číslo šarže nebo dávky Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro TH003BYCS 001 Jul-2014 Strana 4 z 12

Dodávané materiály Reagencie se musí skladovat v oblasti, kde nehrozí riziko kontaminace produktů DNA nebo PCR. Všechny reagencie jsou dodávány připravené k použití Neotevřené a otevřené reagencie skladujte při teplotě -20 C. Otevřené reagencie lze skladovat až 3 měsíce. Součástí dodávky jsou materiály dostačující na 50 testů: 1. 2 lahvičky x 450 µl, Primer směs A (TA), obsahující primery specifické pro amplifikaci alel nezasažených mutacemi faktoru V, faktoru II a MTHFR, kontrolní primery a deoxynukleotid-trifosfáty v pufru (404502). 2. 2 lahvičky x 450 µl, Primer směs B (TB), obsahující primery specifické pro amplifikaci alel zasažených mutacemi faktoru V, faktoru II a MTHFR, kontrolní primery a deoxynukleotid-trifosfáty v pufru (404503). 3. 2 lahvička x 600 µl, vkládací barvivo (LD). (404481) 4. 1 lahvička x 200 µl, ředicí pufr (DB). (404482) 5. 1 lahvička x 50 µl, DNA kontrola (DC), normální výsledek na mutace faktorův Leiden R506Q a protrombin 20210A, a homozygotní na alelovou mutaci MTHFR 677C. (404487) Potřebný materiál, který se nedodává Laboratorní potřeby: rukavice, zkumavky pro mikrocentrifugy se šroubovacím uzávěrem, pipetovací špičky, tenkostěnné 0,2 ml nebo 0,5 ml lahvičky pro PCR (použití lahviček dvou různých barev usnadní identifikaci směsi primeru). Preparace DNA: sterilní deionizovaná voda dobré kvality, chlorid sodný (NaCl), EDTA (kyselina etylendiamintetraoctová), granule hydroxidu sodného (NaOH), krystalizovaný 2- amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (Tris-báze), 36 % kyselina chlorovodíková (HCl, specifická hmotnost 1,18), chlorid amonný (NH 4Cl). PCR amplifikace: lehký bílý minerální olej Sigma*, sterilní destilovaná voda dobré kvality, AmpliTaq Gold (Applied Biosystems). Elektroforéza: materiály pro gelovou elektroforézu, včetně NuSieve 3:1 agarózy (Lonza), žebříček s 50 páry bází, ethidium bromid. * Pro amplifikaci prováděnou v 0,5 ml PCR lahvičkách nebo v termálních cyklovačích bez vyhřívaného víka. Požadované vybavení Vybavení laboratoře: přesné pipety (2 sady, 1 pro manipulaci před amplifikací a 1 pro manipulaci po amplifikaci, doporučujeme pipety bez vzduchového polštáře), laboratorní sklo, ochranný oděv, vortexová třepačka, mikro centrifuga, vyvažování, stojany na vzorky. Preparace DNA: vyhřívací blok (zahřívání do 100 C). Amplifikace: termální cyklovač kompatibilní s 0,5 ml nebo 0,2 ml lahvičkami (s tepelnou přesností +/-1 C mezi 33 C a 100 C a rovnoměrností statické teploty +/-1 C), vyhřívané víko je volitelné. Elektroforéza: horizontální gelová nádoba typ Submarine, napájení, mikrovlnné zařízení, vodní lázeň pro chlazení agarózy, UV prosvětlovač, fotografický systém. TH003BYCS 001 Jul-2014 Strana 5 z 12

Odběr a uchovávání vzorku Musí se používat vzorky plné krve (EDTA) nebo suché kapky krve. Bylo hlášeno, že zařízení na odběr vzorků v určitých případech poškozují integritu určitých analytů a mohou rušit některé technologie metody 13. Všem uživatelům doporučujeme, aby zkontrolovali, zda se zvolené zařízení používá podle pokynů výrobce a zda jsou zařízení na odběr vzorků a alternativní metody preparace DNA kompatibilní s tímto testem. Před preparací DNA se vzorky krve musí uchovávat při teplotě -20 C. Zabraňte opakovanému zmrazování a rozmrazování. Preparace DNA ze vzorků plné krve (EDTA) 1. Napipetujte 80 µl každého vzorku krve do mikrocentrifugové zkumavky se šroubovacím uzávěrem. 2. Napipetujte do každé zkumavky 320 µl roztoku 170 mm (9,09 g/l) NH 4Cl. 3. Míchejte 20 minut jemným kroužením a převracením. Vyhněte se silnému třepání, aby se nevytvořila pěna. 4. Centrifugujte všechny zkumavky 2 minuty při 12 000 g, až se vytvoří shluk buněk. 5. Pipetou odstraňte supernatant a zlikvidujte jej. 6. Napipetujte do každé zkumavky 300 µl roztoku 10 mm (0,58 g/l) NaCl / 10 mm (3,72 g/l) EDTA a ve vortexové třepačce znovu vytvořte suspenzi buněk. 7. Centrifugujte všechny zkumavky 1 minutu při 12 000 g, až se vytvoří shluk buněk. 8. Opakujte kroky 5 až 7 ještě nejméně dvakrát, až bude ze supernatantu zcela odstraněno viditelné červené zbarvení. 9. Pipetou odstraňte supernatant a zlikvidujte jej. 10. Napipetujte do každé zkumavky 200 µl roztoku 50 mm (2 g/l) NaOH a ve vortexové třepačce znovu vytvořte suspenzi buněk. 11. Inkubujte ve vyhřívacím bloku při teplotě 100 C po dobu 10 minut. 12. Napipetujte do každé zkumavky 40 µl roztoku 1 M (121,1 g/l) Tris-báze/HCl (ph 7,5) a promíchejte ve vortexové třepačce. 13. Přidejte do každé mikrocentrifugové zkumavky 1 ml sterilní deionizované vody, aby měl vzorek DNA celkový objem 1,24 ml. 14. Centrifugujte všechny zkumavky 1 minutu při 12 000 g, až se vytvoří shluk buněčného odpadu. DNA je obsažena v supernatantu. Preparace DNA ze suchých kapek krve 1. Vyrazte ze vzorkové karty do 1,5ml zkumavky se šroubovacím uzávěrem 2 disky o průměru 3 mm (b). Disky se musí vyrazit z části karty, která je zcela saturována krví. Před každým dalším vzorkem vyrazte do odpadu několik disků z čistých karet, aby nedocházelo k přenosu vzorků. TH003BYCS 001 Jul-2014 Strana 6 z 12

2. Přidejte 1 ml roztoku 10 mm (0,58 g/l) NaCl / 10 mm (3,72 g/l) EDTA a v rotační míchačce míchejte po dobu 15 až 20 minut. Pokud není k dispozici rotační míchačka, promývání může být nutno prodloužit až na 30 minut. 3. Odstraňte a zlikvidujte promývací roztok. 4. Opakujte kroky 2 a 3 ještě jednou. 5. V tomto okamžiku by měla být většina krevního pigmentu z disku vyplavena. V této fázi však obvykle disky s krevními vzorky ještě mohou mít lehké červenohnědé zabarvení. 6. Krátce zpracujte v mikrocentrifuze (3 vteřiny), aby se zbývající promývací roztok shromáždil na dně zkumavky. Pipetou odstraňte co největší množství promývacího roztoku, které lze odstranit bez narušení disků s krevními vzorky. 7. Toto krátké zpracování v mikrocentrifuze obvykle odstraní z disků s krevními vzorky další krevní pigment. 8. Přidejte do každé zkumavky 150 µl roztoku 50 mm (2 g/l) NaOH. Opatrně poklepejte prstem, aby se obsah promíchal. 9. Vařte ve vyhřívacím bloku po dobu 10 minut. Vyhřívací blok se musí vyvážit na 100 C. 10. Krátce zpracujte v mikrocentrifuze, aby se supernatant shromáždil na dně zkumavky. 11. Přidejte do každé zkumavky 30 µl roztoku 1 M (121,1 g/l) Tris-báze/HCl (ph 7,5) za účelem neutralizace, a opatrně promíchejte. 12. Přidejte ke každému DNA vzorku 420 µl sterilní vody Sigma, aby měl vzorek celkový objem 600 µl. 13. Dobře vzorky promíchejte a před odběrem zpracujte v mikrocentrifuze. 14. Přeneste supernatant do nové, označené zkumavky se šroubovacím uzávěrem. Uchovávejte extrahovanou DNA při teplotě -20 C. (b) Celková plocha použitého krevního vzorku by měla být přinejmenším ekvivalentní dvěma 3mm kruhovým diskům s krevním vzorkem. Lze například použít jeden 6mm disk z karty, pokud je to vhodné. Pro preparaci DNA z plné tekuté krve byla také použita souprava na odběr krve QIAamp DNA Blood Kit (Qiagen) a potvrdilo se, že poskytuje reprodukovatelné výsledky, které lze interpretovat. Společnost Elucigene Diagnostics doporučuje metody preparace DNA popsané výše, o kterých je prokázáno, že podávají konzistentní a spolehlivé výsledky. DNA připravená jinými metodami nebo z jiných typů vzorků nemusí být pro test Elucigene TRP optimální a může podávat suboptimální výsledky. Klíčová kritéria pro alternativní metody preparace DNA jsou koncentrace DNA a absence inhibitorů PCR. Před použitím výsledků testu pro diagnostické účely se doporučuje test Elucigene TRP důkladně vyhodnotit s alternativními metodami a různými typy vzorků. Nedoporučuje se testovat vzorky DNA o koncentraci <10 ng / 5 µl. Za podmínek optimálních pro PCR jsou výsledky pravidelně získávány za koncentrací DNA 10 až 100 ng / 5 μl. Poznámka: Vzhledem k proměnlivosti kvality a výtěžku DNA může být někdy nutné konečný roztok DNA až 5ti násobně zředit, aby se zajistila účinná amplifikace. TH003BYCS 001 Jul-2014 Strana 7 z 12

Testovací protokol Postup amplifikace Množství uvedená v tabulkách 1 a 2 lze zvýšit v poměru k počtu testů (pokud se liší od počtů uvedených v tabulkách). Vzhledem k malým objemům, které se používají, společnost Elucigene Diagnostics nedoporučuje provádět v jednom běhu méně než 5 testů. 1. Naprogramujte termální cyklovač souborem s prodlevou tak, aby se AmpliTaq Gold aktivoval při 94 C na dobu 20 minut, s navazujícím programem amplifikačního cyklování se schématem 30 vteřin při 94 C (denaturace), 2 minuty při 58 C (anelace) a 1 minuta při 72 C (extenze) po 35 cyklů. Na toto schéma je třeba navázat souborem s prodlevou 20 minut při 72 C (extenze) ve finálním cyklu. Poznámka: Pro PCR reakci v 0,5ml lahvičkách zvolte na termálním cyklovači metodu Block. 2. Rozmrazte a centrifugujte lahvičky se směsí primeru A (TA), směsí primeru B (TB), AmpliTaq Gold (nedodává se), vkládacím barvivem (LD) a ředicím pufrem (DB) po dobu 10 vteřin při 12 000 g, jemně promíchejte ve vortexové třepačce a pak opět lahvičky 10 vteřin centrifugujte. Poznámka: Kroky 3 6 se musí provádět v oblasti, kde se nevyskytuje DNA. 3. Podle tabulky 1 připravte dostatečné množství roztoku AmpliTaq Gold s ředicím pufrem, s dodaným vkládacím barvivem a sterilní destilovanou vodou, které bude postačovat pro plánovaný počet testovaných vzorků a kontrol. Důkladně promíchejte jemným nabíráním a vytlačováním pipetou. Tabulka 1. Ředění přípravku AmpliTaq Gold Počet požadovaných testů 5 10 20 50 Objem sterilní destilované vody (µl) 21 42 84 210 Objem vkládacího barviva (µl) 30 60 120 300 Objem ředicího pufru (µl) 6 12 24 60 Objem přípravku AmpliTaq Gold (µl) 3 6 12 30 Objem celkem (µl) 60 120 240 600 4. Podle tabulky 2 připravte reakční směsi A a B. Do označené mikrocentrifugové zkumavky vložte alikvot směsi primeru A. Do druhé označené mikrocentrifugové zkumavky vložte alikvot směsi primeru B. Novými pipetovacími špičkami přidejte do každé zkumavky příslušný objem naředěného roztoku AmpliTaq Gold (z kroku 3). Jemně zkumavky promíchejte ve vortexové třepačce a 10 vteřin je centrifugujte při 12 000 g. TH003BYCS 001 Jul-2014 Strana 8 z 12

Tabulka 2. Příprava reakčních směsí A a B Počet požadovaných testů 5 10 20 50 A B A B A B A B Objem směsi primeru A (µl) 82,5 165 330 825 Objem směsi primeru B (µl) 82,5 165 330 825 Objem naředěného enzymu (µl) 27,5 27,5 55 55 110 110 275 275 Objem celkem (µl) 110 110 220 220 440 440 1100 1100 5. Pro každý vzorek označte jednu lahvičku písmenem A a druhou písmenem B nebo pro každou směs primeru použijte lahvičku jiné barvy (pokud jsou k dispozici). 6. Napipetujte 20 µl připravené reakční směsi A na dno všech PCR lahviček označených písmenem A. Postup opakujte s příslušným počtem PCR lahviček označených písmenem B a přidejte do nich reakční směs B. 7. Vždy novou pipetovací špičkou přidejte do všech párů lahviček A a B 5 µl testovaného DNA vzorku. Přidejte jednu kapku lehkého bílého minerálního oleje Sigma na pokrytí vodné fáze *. Pevně znovu uzavřete. 8. Pro negativní kontrolu do jednoho páru lahviček A a B nepřidávejte žádnou DNA. Přidejte 1 kapku lehkého bílého minerálního oleje Sigma na pokrytí vodné fáze *. Pevně znovu uzavřete. 9. Centrifugujte lahvičky A a B po 10 vteřin při 12 000 g. 10.Lahvičky pevně uložte do bloku termálního cyklovače. Zahajte cyklus s prodlevou při teplotě 94 C následovaný programem amplifikačního cyklování. 11.Zlikvidujte všechny nepoužité zbytky naředěného přípravku AmpliTaq Gold a reakčních směsí A a B. 12.Po dokončení programu amplifikačního cyklování lze před provedením analýzy gelovou elektroforézou vzorky uchovávat při pokojové teplotě přes noc nebo při teplotě 2 až 8 C pro dobu až 7 dnů. * Pro amplifikaci prováděnou v 0,5 ml PCR lahvičkách nebo v termálních cyklovačích bez vyhřívaného víka. Gelová elektroforéza Všem uživatelům doporučujeme zkontrolovat, zda se zvolené vybavení používá podle pokynů výrobce a zda je kompatibilní s tímto testem. V tomto kontextu jsou klíčovými parametry rozměry gelové mřížky a hřebínku (pomůcky k vytváření jamek). Výsledky byly získány za následujících podmínek elektroforézy: 1. Produkt PCR byl zpracován elektroforézou v 3 % agarózovém gelu NuSieve 3:1 za použití tris-boritanu s ethidium bromidem (TBE/EtBr) jako reakčního pufru. TBE/EtBr byl připraven jako pufr s 134 mm (16,2 g/l) Tris-báze, 74,9 mm (4,63 g/l) kyseliny borité, 2,55 mm (0,95 g/l) EDTA s přídavkem 0,1 µg/ml ethidium bromidu. 2. 3 g přípravku NuSieve 3:1 byly rozpuštěny ve 100 ml TBE/EtBr a nality do 15 x 12 cm horizontálního gelového podnosu s hřebínkem na tvorbu jamek 1,5 mm x 5 mm zavěšeným 1 mm nad základnou. 3. 15 µl produktu PCR z každé PCR lahvičky bylo vloženo do sousedících jamek na připraveném agarózovém gelu. TH003BYCS 001 Jul-2014 Strana 9 z 12

4. Žebříček o 50 párech bází byl zpracován vedle vzorků jako měřítko molekulární váhy. 5. Elektroforéza byla prováděna za napětí 5 až 6 V/cm mezi elektrodami, až se přední hrana barvy přesunula 4 cm od zakládacích jamek k anodě (1 až 1,5 hodiny). 6. Po elektroforéze byly gely umístěny do UV prosvětlovače o vlnové délce 260 nm, zobrazeny a vyfotografovány. Interpretace výsledků 1. Negativní kontrola nesmí mít proužky v oblasti definované horními a spodními kontrolními proužky (viz obr. 1). 2. Horní i spodní kontrolní proužky musí být u všech vzorků jasně viditelné (viz obr. 1). 3. Poloha horních i spodních kontrolních proužků musí indikovat správnou velikost molekul (viz obr. 1). Pokud není kterýkoliv z výše uvedených bodů dodržen, výsledky se nesmí interpretovat a test je nutno opakovat. Obrázek 1 zobrazuje ve formě diagramu velikost, páry báze a relativní umístění PCR produktu v gelu, které se očekává u heterozygotního genotypu trombózy (přenášejícího mutace faktoru V, faktoru II nebo MTHFR) při použití reagencie testu zjišťujícího riziko trombózy. Obrázek 1 600 bp 500 bp ŽEBŘÍČEK PCR VELIKOST MUTACE Normální Mutantní 526 bp Horní kontrola 400 bp 350 bp 423 bp Horní kontrola 300 bp 250 bp 260 bp Faktor II 200 bp 200 bp Faktor V 150 bp 100 bp 140 bp 97 bp MTHFR Spodní kontrola 50 bp TH003BYCS 001 Jul-2014 Strana 10 z 12

Funkční charakteristiky Ve studii prováděné v laboratořích společnosti bylo s použitím doporučeného protokolu testováno testem Elucigene TRP (TH003B2) třicet vzorků dříve genotypovaných pomocí restrikční enzymové analýzy. Dvacet devět vzorků DNA bylo úspěšněamplifikováno pomocí soupravy Elucigene TRP. U jednoho vzorku DNA se amplifikace nezdařila, ale při opakovaném testování byl výsledek přijatelný. U dvaceti šesti vzorků podala souprava Elucigene TRP pozitivní výsledek na mutace, a u čtyř vzorků nebyly zjištěny žádné mutace. Z 30 testovaných vzorků bylo 7 pozitivních na mutace faktoru V (R506Q), 10 bylo pozitivních na mutace faktoru II (protrombin 20210A) a 16 bylo pozitivních na mutace MTHFR (677C>T). Všechny výsledky získané pomocí soupravy Elucigene TRP potvrdily původní výsledky genotypizace. Ve studii prováděné v laboratořích společnosti bylo s použitím doporučeného protokolu testováno testem Elucigene TRP (TH003B2) třicet spárovaných vzorků plné krve a suchých kapek krve od třiceti jedinců. Osmnáct z těchto spárovaných vzorků podalo pozitivní výsledek na mutace detekované soupravou Elucigene TRP. Výsledky testu vzorků plné krve byly v souhlasu s výsledky testu suchých kapek krve od stejného jedince. Omezení postupu 1. Výsledky tohoto diagnostického testu i jiných testů musí být interpretovány ve spojení s jinými laboratorními a klinickými údaji, které jsou dostupné lékaři. 2. Nepřítomnost mutací detekovaných touto soupravou nezaručuje, že nejsou přítomny jiné mutace genů faktoru V Leiden, faktoru II a MTHFR. Mohou existovat jiné mutace, které tato souprava nedetekuje. 3. U vzorků odebraných po nedávné transfuzi krve mohou být zjištěny chybné výsledky, stejně jako u jiných genetických testů. Uživatel těchto testů musí tyto skutečnosti zdůraznit při hlášení výsledků klinickému lékaři, který stanovuje diagnózu, nebo lékaři z genetické poradny. Reference TH003BYCS 001 Jul-2014 Strana 11 z 12

1. Heit JA, Silverstein MD, Mohr DN, Petterson TM, Lohse CM, O'Fallon WM, Melton LJ 3rd. The epidemiology of venous thromboembolism in the community. Thromb Haemost 2001;86:452-463. 2. Rosendaal FR. Risk factors for venous thrombotic disease. Thromb Haemost 1999;82:610-619. 3. Bertina RM, Rosendaal FR. Venous thrombosis the interaction of genes and environment. N Engl J Med 1998;338:1840-1841. 4. Poort SR, Rosendaal FR, Reitsma PH, Bertina RM. A common genetic variation in the 3'- untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis. Blood 1996 Nov 15;88:3698-3703. 5. Press RD, Bauer KA, Kujovich JL, Heit JA. Clinical utility of factor V Leiden (R506Q) testing for the diagnosis and management of thromboembolic disorders. Arch Pathol Lab Med 2002;126:1304-1318. 6. Zöller B. Hillarp A, Berntorp E, Dählback B. Activated protein C resistance due to a common factor V gene mutation is a major risk factor for venous thrombosis. Ann Rev Med 1997;48:45-58. 7. Makris M, Preston FE, Beauchamp NJ, Cooper PC, Daly ME, Hampton KK, Bayliss P, Peake IR, Miller GJ. Co-inheritance of the 20210A allele of the prothrombin gene increases the risk of thrombosis in subjects with familial thrombophilia. Thromb Haemost 1997;78:1426-1429. 8. Endler G, Mannhalter C. Polymorphisms in coagulation factor genes and their impact on arterial and venous thrombosis. Clin Chim Acta 2003;330:31-55. 9. Hirsch DR, Mikkola KM, Marks PW, Fox EA, Dorfman DM, Ewenstein BM, Goldhaber SZ. Pulmonary embolism and deep venous thrombosis during pregnancy or oral contraceptive use: prevalence of factor V Leiden. Am Heart J 1996;131:1145-1148. 10. Bokarewa MI, Bremme K, Blomback M. Arg506-Gln mutation in factor V and risk of thrombosis during pregnancy. Br J Haematol 1996;92:473-478. 11. Spector EB, Grody WW, Matteson CJ, Palomaki GE, Bellissimo DB, Wolff DJ, et al. Technical standards and guidelines: venous thromboembolism (factor V Leiden and prothrombin 20210G>A testing): a disease-specific supplement to the standards and guidelines for clinical genetics laboratories. Genet Med. 2005 Jul-Aug;7(6):444-53 12. Newton CR et al. Analysis of any point mutation in DNA. The Amplification Refractory Mutation System (ARMS). Nucleic Acid Res 17: 2503-2516 (1989). 13. Satsangi J et al. Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet 343:1509-1510 (1994). ELUCIGENE is a trademark of Delta Diagnostics (UK) Ltd. ARMS is a trademark of AstraZeneca UK Ltd. QIA AMP is a trademark of the Qiagen Group. NUSIEVE is a trademark of Lonza. AMPLITAQ GOLD is a trademark of Roche Molecular Systems Inc. Copyright 2014 Delta Diagnostics (UK) Ltd. TH003BYCS 001 Jul-2014 Strana 12 z 12