Mikrobiologické diagnostické metody MUDr. Pavel Čermák, CSc.
Princip identifikace soubor ZNAKŮ s rozdílnou separační hodnotou S HODNOTA S: S 1 S 2 S 3
Základní problémy Minimum morfologických znaků Podobná antigenní struktura Extragenomový materiál - plasmidy, transposomy Systémově nejasné postavení mikroorganismů
Rozdělení metod Detekce patogena - přímý průkaz (kultivace, antigeny, genetická detekce atd.) Detekce patofys. odpovědi - protilátky, enzymy (markery)
Detekce patogena Morfologie - barvení Antigenní struktura Chemická struktura, produkty metabolismu Genetická informace Biochemické vlastnosti - klasická mikrobiologická diagnostika
MIKROSKOPIE GRAM, ZIEHL-NEELSEN,GIEMSA VÝHODY NEVÝHODY - rychlost - jednoduchost - zkušenosti - interpretace - dostupnost - cena
Elektronový mikroskop Přímá elektronoptická metoda 50 000x prohlížení 100 000x foto Imunoelektronoptická metoda 100x citlivější
Poxviridae 200 x 300 nm
Herpesviridae 150 nm
KLASICKÁ IDENTIFIKACE 1. MIKROSKOPIE 2. OBECNÁ půda - krevní agar, MC agar 3. SELEKTIVNÍ půdy - DC, Endův agar 4. BIOCHEMICKÉ testy zkvaš. cukrů, metab. bílkovin atd.= barevné reakce MATEMATICKÉ vyhodnocování - identifikační seznamy - počítačové programy komerční diagnostické sety: LACHEMA API
Disková difusní metoda Petriho miska s MH agarem a testovaným mikrobem Citlivý k ATB Rezistentní k ATB ATB disk Zóna inhibice růstu
Diluční bujonová metoda MIC ATB1 ATB2 128 32 64 16 Plastová destička 8 x 12 jamek 32 16 8 4 2 1 8 4 2 1 0,5 0,2 MH bujon s dvojkovým ředěním ATB a testovaným kmenem Koncentrace ATB
E - test Pertiho miska s testovaným kmenem 128 32 Zóna inhibice růstu 2 Proužek vytvářející koncetrační gradient
Izolace na tkáňové kultuře TKÁŇOVÁ KULTURA lidské, opičí buňky Cytopatický efekt = destrukce kultury namnožení viru - v praxi jediná možnost vajíčka (embrya) se téměř nepoužívají
Antigenní struktura Aglutinace Vstřícná elektroforéza Imunofluorescence Latexová aglutinace, koaglutinace EIA metody
Vstřícná imunoelektroforéza pohyb detekovaného materiálu v agrovém gelu + Ig Ag - Různé modifikace - Western blot
Imunofluorescence (IF) 1. PŘÍMÁ - detekce antigenu Hledaný objekt 2. NEPŘÍMÁ - detekce protilátek + - rychlost - jednoduchost - cena - - subjektivní hodnocení - nespecifické reakce
Latexová aglutinace /koagl./ - vyšší citlivost - jednoduchost - cena - různé modifikace (barva atd) Ag Diag + identifikační sety: bakt. meningitis streptokoky, rotaviry
Imunoassay Labeled homogenní x heterogenní kompetitivní x nekompetitivní Nonlabeled turbidimetrie nefelometrie RIA EIA ELISA = enzyme linked imunosorbrnt assay - princip sendviče - vazba x promývání - různé modifikace (IgG,IgM capture, one step atd.)
ELISA Detekce protilátek peroxidázový sys. avidin-biotinový sys. antigen hledaná protilátka enzym protil. proti lidské protilátce substrát
Detekce antigenu ELISA vázaná protilátka proti antigenu hledaný antigen značená protilátka proti antigenu enzym substrát
ELISA Provedení: - ručně - poloautomat - automat
KFR Inaktivované vyšetřované sérum Ag Morčecí komplement Hemolytický systém
Genetické metody Hybridizační - sondy DNA, RNA (nejčastější v dtekci bakterií - bakteriální buňka obsahuje mnohonásobně více RNA než DNA) specifita citlivost Mykobakterie Neis. gonorh. Chlamydie Amplifikační - PCR, LCR + další (základní princip - syntéza části detekované NK, prodloužením primerů DNA, RNApolymerázou a basemi, geometrickou řadou do množství prokazatelného běžnými metodami) citlivost riziko kontaminace TBC, GO, Chlamydie hepatitida B + další
1. rozvláknění NK Hybridizace 2. vazba známé sekvence DNA, RNA 3. detekce - enzymaticky - fluorescenčně - elektroforeticky
Amplifikace - PCR Polymerase Chain Reaction 1. rozvláknění NK 2. vazba primerů primer 1 primer 2 3. syntéza pomocí polymerázy a bazí 4. Rozvláknění, vazba primerů, polymerace 40x 5. detekce NK 10 5
Další modifikace genetických metod Nested PCR - v principu dvojitá PCR reakce AMTD - průkaz rrna M.tuberculosis (nejvyšší citlivost) RFLP - analýza restrikčních fragmentů DNA (poddruhové určení - epidemiologie) Real time PCR - ukončení amplifikace v okamžiku dostatečného množství amplifikovaného produktu KVANTIFIKACE!!!
DNA - STRIP technologie 1. izolace DNA 2. Amplifikace DNA 3. Hybridizace na komplementární probě identifikace několika druhů v jednom kroku
Chemické identifikační metody Plynová chromatografie mastných kyselin Chomatografie metabolitů (anaeroby) Elektroforéza celotělových proteinů + rychlost automatizace otevřený systém - cena, náročnost Pyrolýzová hmotová spektrometrie - tepelná degradace bakt. bb. - spektrometrická analýza RYCHLOST
Vývojový trend - automatizace Základ - klasické biochemické metody - ELISA - hybridizace, amplifikace 1. Počítač + fotometr - velké množství firemních systémů pro serologii - vysoká citlivost fotometru = rychlost - nutnost manuální obsluhy
2. Automaty a poloautomaty Serologie - zpracování komerčních diag. setů pro ELISA stanovení antigenů a protilátek Abbot IMX Abbot AXSYM - princip individuálního sekvenčního zpracování materiálu Murex TECAN - dávkové zpracování destička Bakteriologie 1. Přístroje pro kultivaci hemokultur a mykobakterií. 2. Systémy pro identifikaci a stanovení ATB citlivosti
Poloautomaty - hemokultury Stanovení CO 2 Becton Dickinson - Bactec - Bactec TB 480 Organon Teknika - Bact/Alert - MB/Bact Luminiscence bio Mérieux VITAL vývoj zastaven
Automaty pro identifikace a ATB citlivosti bio Mérieux - mini API - ATB expression - VITEK Roche - COBAS micro BAG - Merlin micronaut MAST - Mastascan colour (princip digitalizace obrazu Petriho misky - ATB citlivosti)
Výhled do budoucnosti Amplifikační genetické metody ČIP V každém poli jiný primer = najednou se provede velké množství reakcí - pokryje většinu běžně diagnostikovaných bakterií. 10 x 10 cm Možnost stanovení ATB citlivosti - má rovněž genetický základ!