Výrobky Elucigene QST*R Návod k použití

Výrobky Elucigene QST*R Návod k použití Výrobek Velikost Katalogové číslo Elucigene QST*Rplusv2 50 testů AN0PLB2 Elucigene QST*R 50 testů AN003B2 Elucigene QST*R-XYv2 50 testů AN0XYB2 Elucigene QST*R-13 10 testů AN013BX Elucigene QST*R-18 10 testů AN018BX Elucigene QST*R-21 10 testů AN021BX Pro diagnostické použití in vitro Výrobce: Elucigene Diagnostics Greenheys House Pencroft Way Manchester Science Park Manchester M15 6JJ, Velká Británie Prodej, zákaznický servis a technická podpora: T: +44 (0) 161 669 8122 F: +44 (0) 161 669 8129 E: enquiries@elucigene.com E: techsupport@elucigene.com Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics (UK) Limited., a company registered in England and Wales, registration number 8696299. AN000BYCS Aug-2014 Strana 1 z/ze 37

Elucigene QST*R Výrobky řady Elucigene QST*R jsou multiplexní DNA analýzy pro rychlé prenatální zjištění aneuploidie u tří nejčastěji se vyskytujících případů vitální autosomální trisomie a pohlavních chromozomů X a Y. Soupravy Elucigene QST*R jsou k dispozici ve formátech uvedených níže. Další informace o soupravách řady QST*R můžete najít na adrese www.elucigene.com/products Určené použití QST*Rplusv2 Pro rutinní kvantitativní in vitro diagnózu tří nejobvyklejších forem vitální autosomální trisomie: trisomie 13 (Patauův syndrom), trisomie 18 (Edwardsův syndrom) a trisomie 21 (Downův syndrom). Souprava také obsahuje markery chromozomů X a Y a marker TAF9L pro zjištění pohlaví. Souprava Elucigene QST*Rplusv2 používá metodu QF-PCR (kvantitativní fluorescenční PCR). Soupravy jsou určeny k použití s DNA extrahovanou buď z amniotické tekutiny nebo vzorků choriových klků (chorionic villus samples, CVS) odebraných při amniocentéze. Zamýšlenou cílovou populací jsou těhotné ženy, u kterých je buď biochemicky nebo ultrazvukem zjištěno vysoké riziko postižení plodu, nebo kterým vzhledem k rodinné anamnéze nebo věku hrozí riziko postižení plodu. Prostředek je určen k použití společně s dalšími diagnostickými postupy k podpoře nebo odmítnutí navrhované klinické diagnózy. Prostředek je určen k profesionálnímu použití pouze v prostředí molekulární nebo cytogenetické laboratoře. QST*R Pro rutinní kvantitativní in vitro diagnózu tří nejobvyklejších forem vitální autosomální trisomie: trisomie 13 (Patauův syndrom), trisomie 18 (Edwardsův syndrom) a trisomie 21 (Downův syndrom). Soupravy Elucigene QST*R používají metodu QF-PCR (kvantitativní fluorescenční PCR). Soupravy jsou určeny k použití s DNA extrahovanou buď z amniotické tekutiny nebo vzorků choriových klků (chorionic villus samples, CVS) odebraných při amniocentéze. Zamýšlenou cílovou populací jsou těhotné ženy, u kterých je buď biochemicky nebo ultrazvukem zjištěno vysoké riziko postižení plodu, nebo kterým vzhledem k rodinné anamnéze nebo věku hrozí riziko postižení plodu. Prostředek je určen k použití společně s dalšími diagnostickými postupy k podpoře nebo odmítnutí navrhované klinické diagnózy. Prostředek je určen k profesionálnímu použití pouze v prostředí molekulární nebo cytogenetické laboratoře. QST*R-XYv2 Pro rutinní kvantitativní in vitro diagnózu stavu pohlavních chromozomů včetně obvyklých aneuploidií (Klinefelterův syndrom a Turnerův syndrom). Souprava Elucigene QST*R- XYv2 používá metodu QF-PCR (kvantitativní fluorescenční PCR). Soupravy jsou určeny k použití s DNA extrahovanou buď z amniotické tekutiny nebo vzorků choriových klků (chorionic villus samples, CVS) odebraných při amniocentéze. Zamýšlenou cílovou populací jsou těhotné ženy, u kterých je buď biochemicky nebo ultrazvukem zjištěno vysoké riziko postižení plodu, nebo kterým vzhledem k rodinné anamnéze nebo věku hrozí riziko postižení plodu. Prostředek je určen k použití společně s dalšími diagnostickými postupy k podpoře nebo odmítnutí navrhované klinické diagnózy. Prostředek je určen k profesionálnímu použití pouze v prostředí molekulární nebo cytogenetické laboratoře. AN000BYCS Aug-2014 Strana 2 z/ze 37

QST*R-13, QST*R-18, QST*R-21 Přídavné soupravy, které obsahují další autosomální markery, určené k použití společně se soupravami QST*R nebo QST*Rplusv2 pro rutinní kvantitativní in vitro diagnózu tří nejobvyklejších forem vitální autosomální trisomie: trisomie 13 (Patauův syndrom), trisomie 18 (Edwardsův syndrom) a trisomie 21 (Downův syndrom), v uvedeném pořadí. Tyto soupravy jsou dostupné pro rozšířené testování chromozomů, pokud je to nezbytné, nebo pro potvrzení pozitivních výsledků. Tyto soupravy používají metodu QF-PCR (kvantitativní fluorescenční PCR). Soupravy jsou určeny k použití s DNA extrahovanou buď z amniotické tekutiny nebo vzorků choriových klků (chorionic villus samples, CVS) odebraných při amniocentéze. Zamýšlenou cílovou populací jsou těhotné ženy, u kterých je buď biochemicky nebo ultrazvukem zjištěno vysoké riziko postižení plodu, nebo kterým vzhledem k rodinné anamnéze nebo věku hrozí riziko postižení plodu. Prostředek je určen k použití společně s dalšími diagnostickými postupy k podpoře nebo odmítnutí navrhované klinické diagnózy. Prostředek je určen k profesionálnímu použití pouze v prostředí molekulární nebo cytogenetické laboratoře. Souhrn a vysvětlení Downův syndrom, Edwardsův syndrom a Patauův syndrom jsou tři nejobvyklejší formy vitální autosomální trisomie. Výskyt narození živého plodu je přibližně 1 ze 700, resp. 1 ze 3 000 a 1 ze 21 700 (ve výše uvedeném pořadí syndromů). Turnerův syndrom u ženského pohlaví a Klinefelterův syndrom u mužského pohlaví představují nejobvyklejší aneuploidie pohlavních chromozomů. Nejčastější příčinou Turnerova syndromu je monosomie chromozomu X (karyotyp 45, X) a u Klinefelterova syndromu se jedná o další kopii chromozomu X (karyotyp 47, XXY). Výskyt narození živého plodu je přibližně 1 ze 2 000 až 1 ze 5 000 u ženského pohlaví v případě Turnerova syndromu a mezi 1 z 500 až 1 z 650 u mužského pohlaví v případě Klinefelterova syndromu. Riziko narození dítěte s Downovým syndromem se významně zvyšuje s věkem matky z přibližně 1:1 600 ve věku 20 až 24 let na 1:200 ve věku 35 let a na 1:19 ve věku 45 let a vyšším. Těhotným ženám je v prvním trimestru těhotenství rutinně nabízen screening na Downův syndrom. Standardní test se někdy nazývá OSCAR (One Stop Clinical Assessment of Risk) a provádí se v době mezi 10 a 13,5 týdny těhotenství. Testuje se kombinace dvou biochemických markerů, volného beta-hcg (humánního choriového gonadotropinu) a PAPP-A (plazmatického těhotenského proteinu A) s měřením tloušťky záhlaví plodu (nuchální translucence) (1). Kombinace výsledků těchto tří testů podává informaci o celkovém stupni rizika. Ženám, u kterých je zjištěno zvýšené riziko postižení plodu Downovým syndromem, se pak nabízí amniocentéza, jejíž pomocí se abnormalita přímo zjišťuje. Amniocentéza je invazivní metoda a znamená vpich jehly naváděné ultrazvukem do amniotického vaku obklopujícího plod. Odebírá se a testuje malé množství amniotické tekutiny (obvykle 10 až 20 ml), která obsahuje buňky plodu. Downův syndrom byl pojmenován v roce 1866 po Dr. Johnu Langdon Downovi, ačkoliv byl popsán již dříve. Je způsoben trisomií celého (nebo části) chromozomu 21 (2). Kromě různého stupně kognitivního postižení vykazují jedinci s Downovým syndromem několik společných rysů včetně hypotonie (sníženého napětí svalů), vyplazeného jazyka, očí mandlového tvaru způsobeného kožní řasou (epicanthem) a abnormálně zešikmených nahoru, jedné rýhy v dlani a kratších končetin. U těchto jedinců existuje zvýšené riziko vrozených srdečních vad a rozvoje Alzheimerovy choroby v pozdějším věku. AN000BYCS Aug-2014 Strana 3 z/ze 37

Edwardsův syndrom poprvé popsal Dr. John Edwards v roce 1960. Je způsoben trisomií celého (nebo části) chromozomu 18. Podobně jako u Downova syndromu, u matek vyššího věku existuje zvýšené riziko postižení plodu Edwardsovým syndromem. Typické klinické příznaky zahrnují nízkou porodní váhu, srdeční vady, gastrointestinální a urogenitální malformace, neurologické problémy a lebeční a obličejové abnormality. Průměrný čas přežití po porodu je přibližně 4 dne. Patauův syndrom je pojmenován po Dr. Klausovi Patauovi, který onemocnění popsal, včetně asociace s chromozomálním stavem. Je způsoben trisomií celého (nebo části) chromozomu 13. Děti s Patauovým syndromem trpí závažným postižením a mnoha abnormalitami. K typickým rysům patří zpomalení růstu plodu v děloze, nízká porodní váha, vrozené srdeční vady, mikrocefalie, holoprosencefalie s rozštěpem patra a mikrooftalmie, centrální apnoe, polydaktylie a závažná deformace nohou. Průměrný čas přežití po porodu je přibližně 2,5 dne. Turnerův syndrom u žen je způsoben chybějícím chromozomem X. U přibližně 98 % plodů s Turnerovým syndromem dojde k samovolnému potratu. Přežívající novorozenci mají několik společných rysů, včetně malé postavy, primární amenorrhoey, kožní řasy na krku (vyvinuté in utero z cysty obsahující tekutinu). Typicky také trpí vrozenými srdečními vadami a mohou mít ledviny deformované do tvaru podkovy. Klinefelterův syndrom u mužů je způsoben nadbytečným chromozomem X. Muži s Klinefelterovým syndromem jsou neplodní a mohou mít mírné kognitivní postižení. Obvykle mají nadprůměrný vzrůst, může se u nich vyvinout gynekomastie vyžadující chirurgickou redukci a existuje u nich zvýšené riziko osteoporózy vzhledem ke snížené hladině testosteronu. QST*Rplusv2 obsahuje markery pro všechny tři autosomie a chromozomy X i Y. Je určen k detekci chromozomálních aneuploidií těchto chromozomů, ale nedetekuje vyvážené strukturální poruchy ani nerozlišuje mezi aneuploidií způsobenou aberací spojení nebo nevyváženou poruchou. Principy metody Soupravy Elucigene QST*R používají metodu QF-PCR (kvantitativní fluorescenční PCR)(3-7). Při PCR amplifikaci se primery označené fuorescenčním barvivem navazují na vysoce polymorfní regiony DNA řetězce nazývané STR (podle angl. termínu short tandem repeat), umístěné na zkoumaných chromozomech. Jednotlivé hledané STR markery jsou specifické pro chromozomy, na kterých jsou umístěny, takže počet kopií STR markeru může diagnostikovat počet kopií chromozomu. Byly zvoleny informativní STR markery, které vykazují vysokou heterogenitu, takže počet kopií lze snadno určit. Normální diploidní vzorek má normální komplement párů všech somatických chromozomů, takže dvě alely chromozomálně specifického STR jsou metodou QF-PCR zjištěny jako dva píky v poměru 1:1. Zjištění další STR alely buď ve formě tří píků v poměru 1:1:1 nebo dvou píků v poměru 2:1 nebo 1:2 je diagnostické pro přítomnost další sekvence, která může znamenat další chromozom, jako v případě trisomie. Produkty amplifikované metodou QF-PCR se podrobují kvantitativní analýze kapilární elektroforézou v genetickém analyzátoru, aby se zjistil počet kopií analyzovaných STR markerů. AN000BYCS Aug-2014 Strana 4 z/ze 37

Varování a bezpečnostní opatření 1. Kontrolní vzorek normální DNA dodaný s touto soupravou byl nezávisle testován a shledán negativním na virus hepatitidy typu B (HBV), na virus hepatitidy typu C (HCV) a na viry lidské imunodeficience (HIV) 1 a 2. 2. Při manipulaci s materiály humánního původu je nutno postupovat opatrně. Všechny vzorky se musí považovat za potenciálně infekční. Žádná testovací metoda nemůže zaručit úplnou jistotu, že výrobek neobsahuje HBV, HCV nebo HIV nebo jiná infekční agens. 3. Při manipulaci se vzorky a komponentami testu a při jejich používání, skladování a likvidaci je nutno postupovat v souladu s postupy definovanými příslušnými státními normami nebo zákony pro nakládání s biologicky nebezpečnými materiály. 4. Podle současné správné laboratorní praxe musí laboratoře při každém testu zpracovat své vlastní vzorky pro interní kontrolu kvality se známým genotypem, aby bylo možné vyhodnotit validitu postupu. 5. Pokud je krabice soupravy poškozená, mohlo dojít k poškození obsahu. Soupravu nepoužívejte a kontaktujte zákaznický servis. AN000BYCS Aug-2014 Strana 5 z/ze 37

Symboly použité na označení Symboly použité na všech štítcích a na obalech odpovídají harmonizované normě ISO15223 Výrobce Počet testů Čtěte návod k použití X C Skladujte při teplotě nižší, než je zde uvedeno Datum exspirace Katalogové číslo Číslo šarže nebo dávky Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro AN000BYCS Aug-2014 Strana 6 z/ze 37

Dodávané materiály Uchovávejte všechny komponenty při teplotě nižší než -20 C. Každá souprava obsahuje: (TA): 2 x 250 µl (50 testů) nebo 1 x 100 µl (10 testů) reakční směsi QST*R obsahující primery pro amplifikaci několika STR (short tandem repeat) markerů. Podrobnosti o markerech jednotlivých souprav se uvádí v příloze 2. Reakční směs QST*R také obsahuje DNA polymerázu a deoxynukleotid-trifosfáty v pufru. Souprava 0,2 ml PCR lahvičky Číslo části Elucigene QST*Rplusv2 Průhledná 404454 Elucigene QST*R Oranžová 404442 Elucigene QST*R-XYv2 Růžová 404457 Elucigene QST*R-13 Zelená 404445 Elucigene QST*R-18 Fialová 404448 Elucigene QST*R-21 Žlutá 404451 (DC): 1 x 50 µl lahvička s kontrolním vzorkem DNA, diploidní pro markery detekované soupravou Elucigene QST*R: Souprava Číslo části Elucigene QST*Rplusv2 404485 Elucigene QST*R 404485 Elucigene QST*R-XYv2 404485 Elucigene QST*R-13 404485 Elucigene QST*R-18 404485 Elucigene QST*R-21 404485 50 (10) x 0,2ml PCR lahviček, barevně odlišených (viz výše). Příprava a uchovávání soupravy Po otevření soupravy se doporučuje rozdělit reakční směs do přiložených 0,2ml PCR lahviček (nebo ekvivalentních) v dávkách po 10 µl a zmrazit při -20 C. Před rozdělováním zajistěte, aby obsah lahviček byl dokonale rozmražen a promíchán. AN000BYCS Aug-2014 Strana 7 z/ze 37

Potřebný materiál, který se nedodává Obecný Laboratorní spotřební materiál rukavice, pipetové špičky. Vybavení laboratoře přesné pipety (2 sady: 1 pro manipulaci před amplifikací a 1 pro manipulaci po amplifikaci: pokud možno bezpečnostní pipety (positive displacement); ochranný oděv; vortexová třepačka; mikro centrifuga; 96jamková mikrotitrační destička do centrifugy. Extrakce DNA Příprava DNA InstaGene Matrix (Bio-Rad Laboratories, kat. č. 732-6030), sterilní deionizovaná voda. Amplifikace PCR Termální cyklovač kompatibilní s 96jamkovými mikrotitračními destičkami nebo 0,2ml lahvičkami s tepelnou přesností +/-1 C mezi 33 C a 100 C a rovnoměrností statické teploty +/-1 C. Kapilární elektroforéza Kapilární elektroforéza standard velikosti GeneScan 500 LIZ (ABI kat. číslo 4322682), GeneScan 600 LIZ (ABI kat. číslo 4366589) nebo GeneScan 600v2 LIZ (ABI kat. číslo 4408399), DS-33 (sada barviv G5), standardní matrice (ABI kat. číslo 4345833), polymer POP-7 (ABI kat. číslo 4352759), 10x Genetic Analyzer Buffer (pufr pro genetický analyzátor) (ABI kat. číslo 402824) a Hi-Di Formamid (ABI kat. číslo 4311320). Genetické analyzátory Applied Biosystems ABI 3130 a 3500 (se softwarem GeneMapper), 36cm nebo 50cm kapilární sestava pro genetický analyzátor 3500, 96jamkové optické destičky, 96jamková septa, 96jamkové kazety. Analýza dat Požaduje se jedna z následujících softwarových aplikací pro analýzu dat: GeneMapper 3.7 (Applied Biosystems Inc.) nebo vyšší nebo GeneMarker 1.65 (SoftGenetics LLC) nebo vyšší. Další dokumentace pro Elucigene QST*R Tento návod k použití obsahuje základní část pro interpretaci získaných výsledků. Další pokyny obsahují dokumenty Guide to Interpretation (Pokyny pro interpretaci) s příklady a glosářem, a Guide to Analysis (Průvodce analýzou), dostupné na webových stránkách Gen-ProbeElucigene Diagnostics: www.elucigene.com/products Odběr a uchovávání vzorku Musí se použít vzorky choriových klků (CV) nebo amniotické tekutiny (AF). Bylo hlášeno, že zařízení na odběr vzorků v určitých případech poškozují integritu určitých analytů a mohou rušit některé technologie metody. Všem uživatelům doporučujeme, aby zkontrolovali, zda se zvolená zařízení používají podle pokynů výrobce, a zda jsou pomůcky pro odběr vzorků a metody přípravy DNA kompatibilní s tímto testem. AN000BYCS Aug-2014 Strana 8 z/ze 37

Extrakce DNA Soupravy Elucigene QST*R jsou validovány s metodou extrakce DNA pomocí matrice InstaGene, lze je provádět v jedné zkumavce a vyhnout se přenosům mezi zkumavkami. Bylo prokázáno, že jiné metody extrakce poskytují stejně spolehlivé výsledky (např. soupravy Qiagen QIAamp). Metoda extrakce s použitím matrice InstaGene je popsána níže. Metoda extrakce InstaGene Amniotická tekutina (AF) Používá se přibližně 1-2 ml amniotické tekutiny. Choriový klk (CV) Vzorky CV je nutno pečlivě očistit a odstranit jakékoliv zbytky mateřské tkáně. Je důležité testovat buňky z více než jedné oblasti vzorku a zajistit, aby byly reprezentovány buňky jádra mezenchymu. Pro analýzu QST*R se doporučuje malá dávka buněčné suspenze, jako se připravuje pro konvenční kultivaci buněk. Tak se zajistí, že výsledek QST*R bude získán ze stejné populace buněk, jako byla použita pro analýzu karyotypu. 1. Připravte suspenzi matrice InstaGene na magnetické míchačce a míchejte za střední rychlosti po dobu nejméně 5 minut. 2. Centrifugujte vzorek (AF nebo CV) při 12 000 g po dobu 1 minuty, aby se vytvořil shluk buněk. 3. Vyjměte vzorky z centrifugy a zrakem zkontrolujte, zda shluk nemá stopy krve. Všimněte si stupně krevních skvrn, pokud je zpozorujete. 4. Opatrně odstraňte supernatant ze shluku buněk, shluk však nenarušte. Ponechte nad shlukem přibližně 10-20 µl supernatantu pro opětovné vytvoření suspenze. 5. Důkladně promíchejte vzorek ve vortexové třepačce. 6. Pokud zpozorujete více než 50% znečištění krví, přejděte ke kroku 7. Pokud zpozorujete méně než 50% znečištění krví, přejděte ke kroku 8. 7. Přidejte 200 µl sterilní deionizované vody ke shluku buněk. Důkladně promíchejte ve vortexové třepačce. Centrifugujte 1 minutu při 12 000 g, odstraňte supernatant a ponechte nad shlukem přibližně 10-20 µl supernatantu pro opětovné vytvoření suspenze. Poznámka: tento další promývací krok pomáhá rozpustit červené krvinky a odstranit krevní barvivo, které by mohlo inhibovat PCR. 8. Přidejte 200 µl matrice InstaGene z kroku 1 ke vzorkům pomocí pipetové špičky s velkým obsahem (např. 1 000 µl). Poznámka: pro optimalizaci extrakčního protokolu lze měnit objem přidávané matrice InstaGene (chelexová pryskyřice 100) a použít 100 µl matrice InstaGene pro malé shluky AF buněk (stěží viditelné), nebo 300 µl pro velké shluky (k pokrytí dna zkumavky), a vzorky CV a tkání. Zaznamenejte množství matrice InstaGene přidané ke každému vzorku. 9. Důkladně promíchejte vzorky ve vortexové třepačce a inkubujte při 100 C po dobu 8 minut v termálním bloku nebo vodní lázni. AN000BYCS Aug-2014 Strana 9 z/ze 37

10. Znovu důkladně promíchejte ve vortexové třepačce při vysoké rychlosti po dobu 10 sekund. 11. Centrifugujte vzorky při 12 000 g po dobu 3 minut. Supernatant obsahuje extrahovanou DNA. 12. Přikročte k přípravě PCR nebo uchovejte extrahovanou DNA při -20 C do doby, kdy jí bude třeba. Koncentrace DNA Jiné metody extrakce DNA a jiné typy vzorků, doporučujeme pečlivě vyhodnotit s testem Elucigene QST*R předtím, než se výsledky testů použijí k diagnostickým účelům. Za optimálních podmínek PCR a s použitím doporučeného nastavení nástřiku vzorků* zadaného v modulu pro analytický cyklus kapilární kolony (strana 12) se soustavně získávají přijatelné výsledky při vstupním množství DNA 1,25 ng až 10 ng. *Poznámka: nastavení nástřiku vzorku lze upravit tak, aby vyhovovalo množství amplikonu produkovaného během PCR reakce, které se může lišit podle přidaného množství vstupní genomické DNA. Menší množství amplikonu lze pro analýzu do kolony přidat zkrácením doby nástřiku. Naopak prodloužením doby nástřiku nebo napětí injekce lze pro analýzu do kolony přidat více amplikonu. Dříve amplifikované vzorky lze několikrát znovu nastříknout za účelem opakované analýzy. Protokol testu Postup amplifikace Pokud byly vzorky extrahovány metodou InstaGene, doporučuje se v PCR reakci používat přímo neředěný supernatant. Poznámka: Kvůli omezení rizika kontaminace se musí kroky 3-5 provádět v oblasti, kde se nenacházejí žádné stopy DNA. Je také nutné podniknout opatření k zamezení kontaminace produktem PCR. 1. Naprogramujte termální cyklovač na cyklus o jednom kroku pro aktivaci DNA polymerázy při 95 C po dobu 15 minut, s navazujícím programem amplifikačního cyklování se schématem 30 sekund při 95 C (denaturace), 1 minuta a 30 sekund při 59 C (anelace) a 1 minuta a 30 sekund při 72 C (extenze) na 26 cyklů. Na toto schéma se naváže 30minutový soubor s prodlevou při 72 C (extenze) ve finálním cyklu. Aktivace enzymů Cyklování Konečná extenze 95 C 95 C 15 min 30 s 72 C 72 C 1 minuta 30 s 30 min 59 C Pokojová teplota 1 minuta 30 s 26 cyklů AN000BYCS Aug-2014 Strana 10 z/ze 37

2. Součástí každého analytického cyklu PCR musí být negativní kontrola (voda). Lze považovat za vhodné použít další kontroly, např. normální pozitivní (dodávaná DNA kontrola) kontrola pozitivní na trisomii (DNA není dodávána). 3. Rozmrazte dříve připravené lahvičky reakční směsi QST*R v počtu dostatečném pro počet vzorků a zpracovávaných kontrol (viz poznámka v části Dodávané materiály) a centrifugujte lahvičky 10 sekund při 12 000 g. 4. Individuálními pipetovými špičkami přidejte 2,5 µl testované DNA to lahvičky na vzorek obsahující 10 µl reakční směsi QST*R a pipetováním promíchejte. Stejně postupujte se všemi vzorky k testování. Nepřidávejte vzorek DNA do PCR lahvičky s negativní kontrolou, přidejte však 2,5 µl sterilní destilované vody. Poznámka: musíte postupovat tak, aby nedošlo ke kontaminaci PCR reakce pryskyřicí InstaGene. 5. Krátce lahvičky centrifugujte, až bude veškerá kapalina na dně všech lahviček. 6. Lahvičky pevně uložte do bloku termálního cyklovače. Spusťte aktivační program při teplotě 95 C následovaný amplifikačním programem (viz krok 1). 7. Pro dokončení amplifikačního programu lze před provedením analýzy kapilární elektroforézou vzorky uskladnit při pokojové teplotě přes noc nebo při teplotě 2-8 C pro dobu až 7 dnů. Kapilární elektroforéza Všem uživatelům doporučujeme zkontrolovat, zda se zvolené vybavení používá podle pokynů výrobce a zda je kompatibilní s testem. Za klíčové prvky se v této souvislosti považují polymer a kapilární sestava. Optimálních výsledků lze na genetických analyzátorech ABI3130 nebo ABI3500 dosáhnout v následujících podmínkách kapilární elektroforézy: 1. Důkladně smíchejte 6,85 µl standardu velikosti s 250 μl Hi-Di Formamidu (dostatek směsi pro 16 jamek). Nakápněte 15 µl směsi do požadovaného počtu jamek 96jamkové optické destičky. 2. Přidejte 3 µl produktu PCR z testovaného vzorku do směsi standardu velikosti (z kroku 1), která je již nakápnutá v destičce a pipetou smíchejte. Těsně destičku uzavřete. 3. Produkt PCR nadávkovaný v optické destičce denaturujte v termálním cyklovači s následujícím nastavením parametrů: 94 C po dobu 3 minut a poté 4 C po dobu 30 sekund. 4. Centrifugujte destičku 10 sekund při 1 000 g, aby z jamek byly odstraněny veškeré bubliny a založte do genetického analyzátoru. AN000BYCS Aug-2014 Strana 11 z/ze 37

ABI3130 GENETIC ANALYZER (GENETICKÝ ANALYZÁTOR) Pomocí softwaru 3130 pro sběr dat vytvořte seznam vzorků s následujícím nastavením: Sample Name (Název vzorku): musí to být název nebo číslo specifické pro dotyčný vzorek. Run owner (Vlastník anal. cyklu): vyberte výchozího vlastníka pro laboratoř. Run Protocol (Protokol anal. cyklu): QST*R (obsahuje modul anal. cyklu QST*R 3130 viz níže)*. *Poznámka: je nutné vytvořit modul analytického cyklu s podrobnostmi o nastavení přístroje a pak jej přidělit k protokolu analytického cyklu, ve kterém byla vybrána položka Dye set G5 (Souprava barviva G5). Více informací o vytváření modulů analytického cyklu naleznete v návodu k použití přístroje. 3130 RUN MODULE (MODUL ANALYTICKÉHO CYKLU) PRO POLYMER POP7 36cm kapilární modul: QSTR # Parameter Name Value Range 1 Oven Temperature 60 int 18 65 Deg.C 2 Poly_fill_Vol. 6500 6500 38000 steps 3 Current Stability 5.0 int 0 2000 uamps 4 PreRun_Voltage 15.0 0 15 kvolts 5 Pre_Run_Time 180 1 1000 sec. 6 Injection_Voltage 3.0 1 15 kvolts 7 Injection_Time 15 1 600 sec. 8 Voltage_Number_of_Steps 20 1 100 nk 9 Voltage_Step_Interval 15 1 60 sec. 10 Data_Delay_Time 60 1 3600 sec. 11 Run_Voltage 15.0 0 15 kvolts 12 Run_Time 1200 300 14000 sec. AN000BYCS Aug-2014 Strana 12 z/ze 37

ABI3500 GENETIC ANALYZER (GENETICKÝ ANALYZÁTOR) Je nezbytné vytvořit protokol přístroje QSTR, který lze následně použít ve všech analytických cyklech QSTR. Protokol přístroje QSTR se vytváří pomocí knihovny protokolů přístroje 3500. Zkontrolujte, zda je vybráno následující nastavení: Run Module (Modul anal. cyklu): FragmentAnalysis50_POP7 Zadejte nastavení, které je podrobně popsáno na níže uvedeném obrázku: Chcete-li analyzovat vzorky, vytvořte destičku vzorku tak, že kliknete na příkaz Create Plate from Template (Vytvořit destičku ze šablony) na Dashboard (Přístrojové desce). Zkontrolujte, zda je přiřazen správný protokol přístroje pro QSTR (viz výše). AN000BYCS Aug-2014 Strana 13 z/ze 37

Analýza a interpretace výsledků Doporučuje se, aby si každá laboratoř vytvořila vlastní postupy a kritéria pro interpretaci a oznamování výsledků. Pokyny pro správnou praxi při QF-PCR byly dokumentovány ve Velké Británii Association for Clinical Genetic Scienceasociací Clinical Molecular Genetics Society and Association of Clinical Cytogeneticists a jsou dostupné na adrese: www.acgs.uk.com www.cmgs.org.uk PCR produkty jsou pozorovány v systému označení 5 barvivy s použitím sestavy filtrů G5. Sestava filtrů G5 detekuje na elektroforeogramu a v softwaru GeneMapper nebo GeneMarker fragmenty označené pomocí 6-FAM (modrá), VIC (zelená), NED (žlutá) a PET (červená) a marker standardu velikosti označený pomocí LIZ (oranžová). Průvodce pro analytický software GeneMarker a GeneMapper jsou k dispozici na internetových stránkách společnosti Gen-Probe: www.elucigene.com/products Průvodce analýzou GeneMapper uvádí podrobnosti nastavení softwaru a pokyny pro import analyzovaných dat do šablony zpráv v aplikaci Excel. Software GeneMarker poskytuje analytickou aplikaci pro trisomii, která je kompatibilní s Elucigene QST*R. Důležité upozornění: různé kombinace přístroje, polymery a standardu velikosti mohou způsobit mírné variace v určení velikosti. Při validaci soupravy musí uživatelé zkontrolovat, zda výchozí binární nastavení vedou ke správnému značení píků, a v případě potřeby je upravit. Pokud budete mít jakékoliv obtíže, požádejte o radu technickou podporu. Všeobecné pokyny pro analýzu pro všechny soupravy QST*R 1. Negativní kontrola nesmí vykazovat žádné ostré píky v analytickém rozmezí 100 až 510 bp. 2. Pozitivní kontrola musí podat očekávané výsledky a všechny píky musí splňovat níže uvedená kritéria. 3. Pro analýzu DNA vzorků musí pro každý testovaný marker být pozorován alespoň 1 pík. Přijatelný rozsah pro píky markerů při analýze na genetickém analyzátoru 3130 je mezi 50 a 6 000 relativními fluorescenčními jednotkami (rfu, relative fluorescent unit) a pro genetický analyzátor 3500 je tento rozsah mezi 175 a 32 000 rfu. Výšky píků mimo tento rozsah se nesmí analyzovat. 4. Elektroforeogramy špatné kvality vzhledem k prolínání barev mezi barvivy (angl. pullup) nebo elektroforetické špičky (ostré píky přítomné ve více než jednom barvivu) se nesmí interpretovat. Produkty PCR se musí nastříknout znovu a znovu analyzovat. 5. Analýza spočívá v hodnocení poměru píků (A1/A2), kde A1 je oblast píků kratšího fragmentu a A2 je oblast píku delšího fragmentu. Výsledný poměr je diagnostický pro počet kopií na lokusu. U nadbytečných chromozomů musí heterozygotní markery vykazovat dva píky podobné výšky. Kompletní analýza počtu kopií chromozomu se provádí porovnáním poměru plochy píků. AN000BYCS Aug-2014 Strana 14 z/ze 37

6. Heterozygotní markery se dvěma alelami musí spadat do rozsahu od 0,8 do 1,4. Pro dvě alely lišící se ve velikosti o více než 24 bp je však přijatelný poměr až do 1,5. Veškeré hodnoty v rámci tohoto rozsahu se považují za poměr 1:1. Pokud poměr spadá mimo tento rozsah, může to být způsobeno několika faktory: Trisomie celého chromozomu Částečná trisomie chromozomu (včetně duplikací sub-mikroskopické povahy) Mozaicismus Kontaminace dalším genotypem (např. matky, dvojčete, externím) Stutter efekt způsobující zkreslení Preferenční amplifikace jedné alely způsobující zkreslení Polymorfismus v místě primeru Somatické mikrosatelitní mutace Dokument Guide to Interpretation (Pokyny pro interpretaci) podává příklady typických profilů těchto případů. Homozygotní markery jsou neinformativní, neboť u nich nelze zjistit poměr. 7. K určení výsledku jako abnormálního (např. na přítomnost trisomie) se požadují alespoň dva informativní markery konzistentní s genotypem o třech alelách, a všechny ostatní markery musí být neinformativní. Nedoporučuje se interpretovat výsledek jako abnormální pouze na základě informací jednoho markeru. Pokud je to nutné, opakované testování se soupravami pro jediný chromozom (např. Elucigene QST*R-13, Elucigene QST*R-18 a Elucigene QST*R-21) může poskytnout dostatečné informace pro interpretaci. Trisomie je zjištěna podle následujících faktorů: 7.1. Dva píky rozdílné výšky, kdy jeden pík představuje dvě alely, které jsou společné s jedním nebo oběma rodiči. V tomto případě bude poměr mezi píky klasifikován jako 2:1 nebo 1:2, neboli A1/A2 podá výsledek v oblasti 1,8 až 2,4 když pík kratší alely má větší plochu než pík delší alely, nebo když A1/A2 podá výsledek v oblasti 0,45 až 0,65 kde pík kratší alely má menší plochu než pík delší alely. 7.2. Jsou přítomny tři píky podobné výšky. Poměr píků bude klasifikován jako 1:1:1 a jejich hodnoty budou spadat do normálního rozsahu 0,8 až 1,4 (pro alely separované více než 24 bp je přijatelný poměr alel až 1,5). Pokud k tomu nedojde, může to být způsobeno jedním z faktorů popsaných v kroku 6. 8. K určení výsledku jako normálního se požadují alespoň dva informativní markery konzistentní s genotypem o dvou alelách, a všechny ostatní markery musí být neinformativní. Normální výsledek oznamuje normální komplement dvou pro testované chromozomy. 9. Poměry ploch píků, které spadají mezi normální a abnormální rozsah se klasifikují jako nerozhodné. Nerozhodné výsledky lze objasnit s použitím souprav pro jednotlivé chromozomy. 10. Pokud jsou u jednoho chromozomu získány jak normální, tak abnormální vzorce alel, doporučuje se provést další testy a zjistit důvod rozporných výsledků dříve, než učiníte jakékoliv závěry. AN000BYCS Aug-2014 Strana 15 z/ze 37

11. Ve vzácných případech se rozsahy velikosti alel mohou překrývat. Pokud je podezření na tuto situaci, analýza se soupravami pro jediný chromozom může stav osvětlit. AN000BYCS Aug-2014 Strana 16 z/ze 37

Specifické pro QST*R-XYv2 a pohlavní markery chromosomu u QST*Rplusv2 1. Marker AMEL amplifikuje nepolymorfní sekvence na chromozomech X (104bp) a Y (110bp), lze jej použít ke zjištění přítomnosti nebo absence chromozomu Y a představuje sumu sekvence X ve vztahu k Y. Připomínáme, že ve vzácných případech bylo oznámeno selhání amplifikace z důvodu mutace sekvence AMEL-Y. 2. TAF9L je nevariantní paralogní marker se sekvencemi na chromozomech 3 a X. Pík specifický pro chromozom 3 (116 bp, reprezentující 2 kopie chromozomu 3) lze tedy použít jako referenční pík k asistenci při zjišťování počtu přítomných chromozomů X (pík 121 bp). Při analýze v kombinaci s amelogeninem a dalšími markery pohlavních chromozomů je obzvlášť užitečný pro diagnózu aneuploidie pohlavních chromozomů., například Turnerova syndromu. U normální ženy markery musí spadat do rozsahu od 0,8 do 1,4. U normálního muže nebo při monosomii X markery budou mít poměr 1,8. Další podrobnosti o interpretaci markeru TAF9L jsou uvedeny v pokynech pro interpretaci. 3. Polymorfní STR markery DXYS267 a DXYS218 jsou přítomny v chromozomech X i Y a reprezentují celkový počet pohlavních chromozomů. Pro informativní výsledek mužského pohlaví není možné zjistit, která alela reprezentuje chromozom X nebo Y. 4. Informativní markery specifické pro X, DXS981, DXS1187, XHPRT, DXS6807, DXS7423, DXS6803 a DXS6809 reprezentují počet chromozomů X. 5. Marker SRY specifický pro Y podá u normálních mužů jeden pík a nebude se amplifikovat u normálních žen. 6. Marker DYS448 specifický pro Y ve většině případů podá u normálních mužů jeden pík a nebude se amplifikovat u normálních žen. Bylo zjištěno, že tento marker ve vzácných případech může demonstrovat dědičný vzorec dvou alel (sub-mikroskopickou duplikaci následovanou replikačním klouzáním) nebo vykazovat nulovou alelu (nedojde k amplifikaci). 7. Výsledek s nepřítomností amplifikace markerů specifických pro Y a homozygotní pro všechny ostatní markery není nezbytně diagnostický pro Turnerův syndrom. Na základě publikovaných dat bude přibližně 1 ze 170 000 žen homozygotní na všech 7 polymorfních markerů specifických pro X. Podle Bayesovy metody to znamená pravděpodobnost přibližně 1:1 400, že profil homozygotní na všechny markery specifické pro X reprezentuje pravou monosomii genotypu X spíše než normální homozygotní ženu. AN000BYCS Aug-2014 Strana 17 z/ze 37

Funkční charakteristiky INTERNÍ VALIDACE QST*Rplusv2 Pomocí Elucigene QST*Rplusv2 bylo zaslepeným způsobem testováno 98 vzorků. Z těchto vzorků bylo 22 normálních/xy, 17 bylo normálních/xx, 12 mělo trisomii 21/XY, 7 mělo trisomii 21/XX, 9 mělo trisomii 18/XY, 8 mělo trisomii 18/XX, 2 měly trisomii 13/XY, 4 měly trisomii 13/XX, 8 bylo normálních/x0, 1 byl normální/xyy a 1 byl triploidní na všechny testované chromozomy. Jeden vzorek podal neinformativní výsledek. Šest vzorků nemělo analyzovatelné výsledky vzhledem ke špatné kvalitě vzorku. Všechny analyzovatelné výsledky vykazovaly 100% specificitu a citlivost vůči výsledkům získaným dříve pomocí alternativní zavedené metody. QST*R Pomocí Elucigene QST*R bylo zaslepeným způsobem testováno 312 vzorků. Z těchto vzorků bylo 286 normálních, 2 vykazovaly trisomii 13, 7 trisomii 18, 13 vzorků vykazovalo trisomii 21 a 2 byly triploidní pro všechny 3 testované chromozomy. Jeden vzorek byl kontaminován mateřskými buňkami, což znemožnilo analýzu, a jeden vzorek nepodal přes opakovanou amplifikaci interpretovatelný výsledek. Celkem 310 vzorků mělo analyzovatelné výsledky. Všechny analyzovatelné výsledky vykazovaly 100% specificitu a citlivost vůči výsledkům získaným dříve metodou zjišťování karyotypu. QST*R-XYv2 Pomocí Elucigene QST*R-XYv2 bylo zaslepeným způsobem testováno 321 vzorků. Z těchto vzorků bylo 160 normálních mužského pohlaví, 147 bylo normálních ženského pohlaví, 3 vykazovaly monosomii X, 2 vykazovaly XXY, 2 vykazovaly XYY a jeden XXX. Šest vzorků nemělo interpretovatelné výsledky přes opakovanou amplifikaci. Celkem 315 vzorků mělo analyzovatelné výsledky. Všechny analyzovatelné výsledky vykazovaly 100% specificitu a citlivost vůči výsledkům získaným dříve metodou zjišťování karyotypu. QST*R-13 Pomocí Elucigene QST*R-13 bylo zaslepeným způsobem testováno 152 vzorků. Z těchto vzorků bylo 144 normálních a 2 vykazovaly trisomii 13. Šest vzorků nemělo interpretovatelné výsledky přes opakovanou amplifikaci. Všechny analyzovatelné výsledky vykazovaly 100% specificitu a citlivost vůči výsledkům získaným dříve metodou zjišťování karyotypu. QST*R-18 Pomocí Elucigene QST*R-18 bylo zaslepeným způsobem testováno 152 vzorků. Z těchto vzorků bylo 143 normálních a 4 vykazovaly trisomii 18. Pět vzorků nemělo interpretovatelné výsledky přes opakovanou amplifikaci. Všechny analyzovatelné výsledky vykazovaly 100% specificitu a citlivost vůči výsledkům získaným dříve metodou zjišťování karyotypu. AN000BYCS Aug-2014 Strana 18 z/ze 37

QST*R-21 Pomocí Elucigene QST*R-21 bylo zaslepeným způsobem testováno 152 vzorků. Z těchto vzorků bylo 148 normálních a 2 vykazovaly trisomii 21. Dva vzorky neměly interpretovatelné výsledky přes opakovanou amplifikaci. Všechny analyzovatelné výsledky vykazovaly 100% specificitu a citlivost vůči výsledkům získaným dříve metodou zjišťování karyotypu. AN000BYCS Aug-2014 Strana 19 z/ze 37

PŘÍLOHA 1: PŘÍKLADY Elucigene QST*Rplusv2 Markery jsou značeny následovně: 6-FAM VIC NED PET DXS6803 DXS1187 AMEL D21S1409 D21S1435 D21S1446 TAF9L D13S252 D21S11 XHPRT D18S978 D21S1442 D21S1437 D18S386 SRY D18S819 D13S634 D13S305 D13S800 D18S535 D18S390 D13S628 Další podrobnosti o STR markerech včetně rozsahu velikostí vyhledejte v příloze 2. AN000BYCS Aug-2014 Strana 20 z/ze 37

Elucigene QST*Rplusv2 - GENEMAPPER Příklad profilu QST*Rplusv2 normálního muže ilustrující relativní polohu detekovaných markerů. AN000BYCS Aug-2014 Strana 21 z/ze 37

Elucigene QST*R Markery jsou značeny následovně: 6-FAM VIC NED PET D21S1435 D18S391 D18S978 D21S1409 D21S11 D18S325 D21S1411 D13S252 D21S1437 D18S386 D18S390 D18S819 D13S634 D13S305 D13S628 D18S535 Další podrobnosti o STR markerech včetně rozsahu velikostí vyhledejte v příloze 2. AN000BYCS Aug-2014 Strana 22 z/ze 37

Elucigene QST*R - GENEMAPPER Příklad normálního profilu QST*R ilustrující relativní polohu detekovaných markerů. AN000BYCS Aug-2014 Strana 23 z/ze 37

Elucigene QST*R-XYv2 Markery jsou značeny následovně: 6-FAM VIC NED PET DXS6803 DXS1187 AMEL DXYS267 DXS981 XHPRT SRY DYS448 DXS6807 DXS7423 DXS6809 DXYS218 Další podrobnosti o STR markerech včetně rozsahu velikostí vyhledejte v příloze 2. AN000BYCS Aug-2014 Strana 24 z/ze 37

Elucigene QST*R-XYv2 - GENEMAPPER Příklad profilu QST*R-XYv2 normálního muže ilustrující relativní polohu detekovaných markerů. AN000BYCS Aug-2014 Strana 25 z/ze 37

Elucigene QST*R-21 Markery jsou značeny následovně: 6-FAM VIC NED PET D21S1435 D21S1446 D21S1411 D21S1409 D21S11 D21S1442 D21S1437 Další podrobnosti o STR markerech včetně rozsahu velikostí vyhledejte v příloze 2. AN000BYCS Aug-2014 Strana 26 z/ze 37

Elucigene QST*R-21 - GENEMAPPER Příklad normálního profilu QST*R-21 ilustrující relativní polohu detekovaných markerů. AN000BYCS Aug-2014 Strana 27 z/ze 37

Elucigene QST*R-18 Markery jsou značeny následovně: 6-FAM VIC NED PET D18S847 D18S391 D18S978 D18S977 D18S1002 D18S386 D18S390 D18S819 D18S535 Další podrobnosti o STR markerech včetně rozsahu velikostí vyhledejte v příloze 2. AN000BYCS Aug-2014 Strana 28 z/ze 37

Elucigene QST*R-18 - GENEMAPPER Příklad normálního profilu QST*R-18 ilustrující relativní polohu detekovaných markerů. AN000BYCS Aug-2014 Strana 29 z/ze 37

Elucigene QST*R-13 Markery jsou značeny následovně: 6-FAM VIC NED PET D13S797 D13S325 D13S800 D13S252 D13S762 D13S305 D13S628 D13S634 Další podrobnosti o STR markerech včetně rozsahu velikostí vyhledejte v příloze 2. AN000BYCS Aug-2014 Strana 30 z/ze 37

Elucigene QST*R-13 - GENEMAPPER Příklad normálního profilu QST*R-13 ilustrující relativní polohu detekovaných markerů. AN000BYCS Aug-2014 Strana 31 z/ze 37

PŘÍLOHA 2: TABULKA POUŽITÝCH MARKERŮ Poznámka: barvivo NED použité v soupravách je spektrálně identifikováno jako žlutá barva. Pro přehlednost je obvykle zobrazováno černým písmem. Pozorovaná heterozygozita se zakládá na počtu alel pozorovaných pomocí validačního panelu Gen-ProbeElucigene Diagnostics. Tyto údaje se proto mohou lišit od publikovaných dat a mohou se také měnit v závislosti na testované populaci. Tabulka 1. Markery v Elucigene QST*Rplusv2 Marker Umístění Pozorovaná heterozygozita* Rozsah velikosti alely (bp) Barva markerového barviva D13S252 13q12.2 0,74 274-311 červená D13S305 13q13.3 0,79 424-466 zelená D13S634 13q21.33 0,84 380-428 modrá D13S800 13q22.1 0,72 284-320 žlutá D13S628 13q31.1 0,75 426-465 žlutá D18S819 18q11.2 0,73 400-425 červená D18S535 18q12.3 0,77 466-498 modrá D18S978 18q12.3 0,71 207-223 žlutá D18S386 18q22.1 0,92 332-405 zelená D18S390 18q22.3 0,69 356-394 žlutá D21S11 21q21.1 0,82 228-279 modrá D21S1437 21q21.1 0,76 307-347 modrá D21S1409 21q21.2 0,74 191-239 červená D21S1442 21q21.3 0,85 332-389 červená D21S1435 21q21.3 0,74 167-204 modrá D21S1446 21q22.3 0,76 205-235 zelená AMEL Xp22.22/Yp11.2 n/a 104/110 žlutá TAF9L 3p24.2/Xq21.1 n/a 116/121 žlutá DXS6803 Xq21.31 0,86 131-153 modrá XHPRT Xq26.2 0,72 266-298 zelená DXS1187 Xq26.2 0,73 123-165 zelená SRY Yp11.31 n/a 248 žlutá AN000BYCS Aug-2014 Strana 32 z/ze 37

Tabulka 2. Markery v Elucigene QST*R Marker Umístění Pozorovaná heterozygozita* Rozsah velikosti alely (bp) Barva markerového barviva D13S252 13q12.2 0,74 274-311 červená D13S305 13q13.3 0,79 424-466 zelená D13S325 13q14.11 0,80 272-309 zelená D13S634 13q21.33 0,84 380-428 modrá D13S628 13q31.1 0,75 426-465 žlutá D18S391 18p11.31 0,70 205-225 zelená D18S819 18q11.2 0,73 400-425 červená D18S535 18q12.3 0,77 466-498 modrá D18S978 18q12.3 0,71 207-223 žlutá D18S386 18q22.1 0,92 332-405 zelená D18S390 18q22.3 0,69 356-394 žlutá D21S11 21q21.1 0,82 228-279 modrá D21S1437 21q21.1 0,76 307-347 modrá D21S1409 21q21.2 0,74 191-239 červená D21S1435 21q21.3 0,74 167-204 modrá D21S1411 21q22.3 0,83 283-344 žlutá AN000BYCS Aug-2014 Strana 33 z/ze 37

Tabulka 3. Markery v Elucigene QST*R-XYv2 Marker Umístění Pozorovaná heterozygozita* Rozsah velikosti alely (bp) Barva markerového barviva DXYS218 Xp22.32/Yp11.3 0,74 376-392 modrá AMEL Xp22.22/Yp11.2 n/a 104-110 žlutá DXYS267 Xq21.31/Yp11.31 0,75 240-280 červená DXS6807 Xp22.3 0,66 326-351 modrá DXS981 Xq13.1 0,73 226-260 modrá DXS6803 Xq21.31 0,86 131-153 modrá DXS6809 Xq21.33 0,78 392-436 žlutá DXS1187 Xq26.2 0,73 123-165 zelená XHPRT Xq26.2 0,72 266-298 zelená DXS7423 Xq28 0,67 360-388 zelená SRY Yp11.31 n/a 248 žlutá DYS448 Yq11.223 n/a 349-372 červená Tabulka 4. Markery v Elucigene QST*R-21 Marker Umístění Pozorovaná heterozygozita* Rozsah velikosti alely (bp) Barva markerového barviva D21S11 21q21.1 0,82 228-279 modrá D21S1437 21q21.1 0,76 307-347 modrá D21S1409 21q21.2 0,74 191-239 červená D21S1442 21q21.3 0,85 290-349 zelená D21S1435 21q21.3 0,74 167-204 modrá D21S1411 21q22.3 0,83 283-344 žlutá D21S1446 21q22.3 0,76 205-235 zelená AN000BYCS Aug-2014 Strana 34 z/ze 37

Tabulka 5. Markery v Elucigene QST*R-18 Marker Umístění Pozorovaná heterozygozita* Rozsah velikosti alely (bp) Barva markerového barviva D18S391 18p11.31 0,70 205-225 zelená D18S1002 18q11.2 0,76 337-365 modrá D18S819 18q11.2 0,73 400-425 červená D18S847 18q12.1 0,71 204-232 modrá D18S535 18q12.3 0,77 466-498 modrá D18S978 18q12.3 0,71 207-223 žlutá D18S977 18q21.31 0,70 248-285 červená D18S386 18q22.1 0,92 332-405 zelená D18S390 18q22.3 0,69 356-394 žlutá Tabulka 6. Markery v Elucigene QST*R-13 Marker Umístění Pozorovaná heterozygozita* Rozsah velikosti alely (bp) Barva markerového barviva D13S252 13q12.2 0,74 274-311 červená D13S305 13q13.3 0,79 424-466 zelená D13S325 13q14.11 0,80 272-309 zelená D13S634 13q21.33 0,84 380-428 modrá D13S800 13q22.1 0,72 284-320 žlutá D13S628 13q31.1 0,75 426-465 žlutá D13S762 13q31.3 0,75 302-331 modrá D13S797 13q33.2 0,77 178-250 modrá AN000BYCS Aug-2014 Strana 35 z/ze 37

Omezení postupu Tento test je určen k detekci specifických trisomií chromozomů a aneuploidií pohlavního chromozomu, jak podrobně uvádí návod k použití. Test nemusí detekovat strukturální přesuny testovaných chromozomů a nedetekuje abnormality žádných jiných chromozomů. U testovaných chromosomů nemusí dojít k detekci mosaicismu. Výsledek QST*R je aplikovatelný pouze na testovanou tkáň a nemusí reprezentovat karyotyp plodu. Při kontaminaci mateřskými buňkami (MCC) a omezeném placentárním mosaicismu (CPM) může dojít k rozporům mezi výsledky QST*R a testu karyotypu. Poznámka: heterozygozita použitých markerů byla odvozena z náhodně zvolené skupiny vzorků dodaných k rutinní analýze z převážně bělošské severoevropské populace. Jakékoliv výpočty založené na těchto údajích o heterozygozitě jsou aplikovatelné výhradně na populaci, ze které pocházejí. Jako součást validačních studií lze provést malou studii s místními vzorky, aby se zjistil výskyt heterozygozity v testované populaci. Neočekává se, že variace v populaci významně ovlivní celkovou informační hodnotu analýzy. Prohlášení Výsledky tohoto diagnostického testu i jiných testů musí být interpretovány ve spojení s dalšími laboratorními a klinickými údaji, které jsou dostupné lékaři. Tyto reagencie Elucigene se dodávají pro diagnostické testy in vitro. Další podrobnosti o výrobcích Elucigene QST*R jsou dostupné na adrese: www.elucigene.com/products AN000BYCS Aug-2014 Strana 36 z/ze 37

Reference 1. CG Antenatal Care: full guidelines (Corrected June 2008) UK National Institute for Health and Clinical Excellence 2. O Connor, C. (2008) Trisomy 21 Causes Down syndrome. Nature Education 1(1). 3. Mansfield E S. Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative polymerase chain reaction and small tandem repeat polymorphisms. Human Molecular Genetics 1993 2(1): 43-50 4. Mann K, Fox SP, Abbs SJ, Yau SC, Scriven PN, Docherty Z, Mackie Ogilvie C. Development and implementation of a new rapid aneuploidy diagnostic service within the UK National Health Service and implications for the future of prenatal diagnosis. The Lancet 2001 358 (9287): 1057-1061 5. Mann K, Donaghue C, Fox SP, Docherty Z, Mackie Ogilvie C. Strategies for the rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy. European Journal of Human Genetics 2004 12: 907-915 6. Mackie Ogilvie C, Donaghue C, Fox SP, Docherty Z, Mann K. Rapid prenatal diagnosis of an aneuploidy using Quantitative Fluorescence-PCR (QF-PCR). Journal of Histochemistry and Cytochemistry 2005 53(3): 285-288 7. Deutsch S, Choudhury U, Merla G, Howald C, Sylvan A, Antonarakis SE. Detection of aneuploidies by paralogous sequence quantification. Journal of Medical Genetics 2004 41: 908-915 ELUCIGENE a QST*R jsou ochranné známky společnosti Delta Diagnostics Ltd. GENEMAPPER, GENESCAN, VIC, PET, NED, LIZ, 6-FAM, POP-7, a HI-DI jsou ochranné známky společnosti Life Technologies Corporation. GENEMARKER je ochranná známka společnosti SoftGenetics Corporation. QIAAMP je ochranná známka společnosti Qiagen GroupGmbh. INSTAGENE je ochranná známka společnosti Bio-Rad Laboratories Inc. Upozornění pro kupující: Limitovaná licence Polynukleotidy značené barvivy VIC, NED a PET (a jejich použití) mohou být chráněny jedním nebo několika patenty ve vlastnictví společnosti Applied Biosystems, LLC. Kupní cena tohoto výrobku zahrnuje omezená nepřenosná práva, vlastněná společností Applied Biosystems, LLC a poskytnutá na využití některých patentů, a to pouze v tomto rozsahu výrobku a výhradně pro aktivity kupujícího při detekci cíle v oboru diagnostiky v humánní medicíně. Žádná jiná práva se neposkytují. Potřebujete-li další informace o možnostech zakoupení licencí týkajících se výše uvedených barviv, kontaktujte outlicensing@lifetech.comvedoucího pracovníka oddělení licencí: Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California, 94404, USA. Copyright 2014 Delta Diagnostics (UK) Ltd. AN000BYCS Aug-2014 Strana 37 z/ze 37