informační magazín číslo 4-2006

informační magazín číslo 4-2006 CENA ARNOLDA BECKMANA - VYHLÁŠENÍ VÍTĚZŮ HEMATOLOGIE POD DROBNOHLEDEM BECKMAN COULTER NA GERLACHU O ČEM JEŠTĚ USLYŠÍTE: COMP

CENA ARNOLDA BECKMANA Vyhlašovaná Immunotech a.s., českou pobočkou společnosti Beckman Coulter Inc. a Českou společností pro biochemii a molekulární biologii 1. ročník ceny Arnolda Beckmana už má své vítěze ve všech třech vyhlašovaných kategoriích. Přihlášené publikace byly v každé kategorii zaslány k hodnocení dvěma nezávislým hodnotitelům z vysokých škol a z akademie věd. Hodnotitelé sestavili pořadí prací a zdůvodnili svůj návrh vítězné publikace. V případě vyrovnaného hodnocení měl o vítězi rozhodnout třetí hodnotitel předseda ČSBMB prof. RNDr. Václav Pačes,DrSc. Výsledky však byly tak jednoznačné, že jeho hlasu nebylo třeba. Vítězi ceny Arnolda Beckmana, ročníku 2004-2005, se stávají: Kategorie: Buněčná biologie a imunologie Vlada Filimoněnko, ÚEM AV ČR (dnes ÚMG AV ČR) Za práci: Nuclear actin and myosin I are required for RNA polymerase I transcription Nature Cell Biol 6, 1169-1172, 2004 Vlada V. Philimonenko 1,5, Jian Zhao 2,5, Sebastian Iben 2, Hana Dingová 1, Katarína Kyselá 1, Michal Kahle 1, Hanswalter Zentgraf 3, Wilma A. Hofmann 4, Primal de Lanerolle 4, Pavel Hozák 1 and Ingrid Grummt 2,6 1 Department of Cell Ultrastructure and Molecular Biology, Institute of Experimental Medicine, Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague 14220, Czech Republic. 2 Division of Molecular Biology of the Cell II, German Cancer Research Center, D-69118 Heidelberg, Germany. 3 Applied Tumorvirology, German Cancor Research Center, D-69118 Heidelberg, Germany. 4 Department of Physiology and Biophysics, University of Illinois at Chicago, Chicago IL 60612, USA. 5 These authors contributed equally to this work. Kategorie: Proteomika Petr Man, MBÚ AV ČR Za práci: Mass spectrometric analysis of the glycosphingolipidenriched microdomains of rat natural killer cells Proteomics 5, 113 122, 2005 Petr Man 1, 2, Petr Novák 1, 2, Marek Cebecauer 3, Ondrej Horváth 1, Anna Fišerová 1, Vladimír Havlíček 1 and Karel Bezouška 1, 2 1 Institute of Microbiology, Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague, Czech Republic, 2 Department of Biochemistry, Charles University, Prague, Czech Republic, 3 Ludwig Institute for Cancer Research, University of Lausanne, Epalinges, Switzerland Kategorie: Genomika, genetika a analýza nukleových kyselin Tomáš Vacík Za práci: Segmental trisomy of chromosome 17: A mouse model of human aneuploidy syndromes PNAS 102, 4500 4505, 2005 Tomáš Vacík 1, Michael Ort 2,3, Soň a Gregorová 1, Petr Strnad 1, Radek Blatný 1, Nathalie Conte 4, Allan Bradley 4, Jan Bureš 2, and Jiří Forejt 1 Institutes of 1 Molecular Genetics and 2 Physiology, Academy of Sciences of the Czech Republic, 14220 Prague, Czech Republic; 3 Department of Psychiatry, First School of Medicine, Charles University, 11636 Prague, Czech Republic; and 4 The Wellcome Trust Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SA, United Kingdom Blahopřejeme vítězům, děkujeme všem soutěžícím a těšíme na vaše příspěvky do soutěže o cenu Arnolda Beckmana v ročníku 2006-2007. JIŘÍ MOOS E-MAIL: JMOOS@BECKMAN.COM 2 informační magazín číslo 4-2006

Obsah Nové možnosti v přístrojové analýze subpopulací leukocytů (WBC) a erytrocytů (RBC) 4 Osvědčená a mnoha roky prověřená technologie Beckman Coulter VCS zásadním způsobem změnila pohled na buněčné subpopulace leukocytů. Kombinace průtokové cytometrie, vysokofrekvenční vodivosti a impedanční metody poprvé v historii přístrojové analýzy leukocytů nabízí možnost standardizace a kvantifikace vlastností jednotlivých typů leukocytů. Nová řada hematologických analyzátorů Beckman Coulter LH780 a LH785 6 XXX Pro stolní ultracentrifugy a vysokovýkonné centrifugy Beckman Coulter Průtoková cytometrie v hematologické laboratoři 7 Důležitou součástí laboratorní hematologie se v posledních desetiletích stala průtoková cytometrie. Časopis vydává a distribuuje IMMUNOTECH a.s., Radiová 1, 102 27 Praha 10 Časopis připravují Mgr. Jiří Moos, CSc. Mgr. Patrik Šaf RNDr. Helena Kurzweilová, RNDr. Běla Říčařová, CSc Ing. Petr Suchan Mgr. Markéta Krupařová Ing. Roman Šandrik, PhD Ing. Kateřina Ťukova Monika Lahodová Do časopisu přispěli Mgr. Jiří Moos, CSc. Ing. Petr Boudal Mgr. Pavel Kružík RNDR. Libor Kozák, CSc., FN Brno MUDr. Pavla Šigutová, FN Plzeň Ing. Roman Šandrik, PhD Pavol Skočdopole RNDr. Helena Kurzweilová RNDr. Vladimír Vilím, CSc., Revmatologický ústav, Praha Mgr. Markéta Krupařová MUDr. Pavla Šigutová titulní foto Grafická podoba Nina Nováková Tiskárna REPRO servis s. r. o. Starochuchelská 15/195, 159 00 Praha 5 Náklad čísla 1200 výtisků Detekce rozsáhlých delecí a duplikací v genech metodou MLPA 9 V současné době jsme svědky expanze DNA a RNA diagnostiky a rozsáhlých možností jejího využití v řadě medicínských oborů. Převratné diagnostické a terapeutické úspěchy z posledních let jsou výsledkem aplikace nových molekulárně biologických technik. Příklady hodnocení diferenciálních rozpočtů leukocytů na Coulter LH 750 10 Od listopadu 2005 pracujeme ve fakultní hematologické laboratoři s novým analyzátorem Coulter LH 755, od května 2005 máme Coulter LH 750 i v naší druhé laboratoři vzdálené 8 km. XIII. Slovensko česká konferencia o hemostáze a trombóze Martin 2006 15 V dňoch 4.- až 6. mája 2006 sa uskutočnila v Martine medzinárodná konferencia o Hemostáze a Trombóze. Beckman Coulter na špici 16 Výstup Beckman Coulter na Gerlachovský štít, august 2006. O čem ještě uslyšíte COMP 18 COMP je akronymum anglického označení cartilage oligomeric matrix protein. Jedná se o nekolagenní protein, který je podstatnou součástí tzv. extracelulární matrix chrupavky. Řadí se do rodiny extracelulárních proteinů thrombospondinů. Odtud pochází jeho další označení thrombospondin 5. Kde se můžeme setkat (září prosinec 2006) 20 Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech formou stánku informační magazín číslo 4-2006 3

Nové možnosti v přístrojové analýze subpopulací leukocytů (WBC) a erytrocytů (RBC) Osvědčená a mnoha roky prověřená technologie Beckman Coulter VCS zásadním způsobem změnila pohled na buněčné subpopulace leukocytů. Kombinace průtokové cytometrie, vysokofrekvenční vodivosti a impedanční metody poprvé v historii přístrojové analýzy leukocytů nabízí možnost standardizace a kvantifikace vlastností jednotlivých typů leukocytů. Zavedení měřítka pro velikost leukocytu, velikost jeho jádra, granularitu, poměr velikosti jádra k velikosti leukocytu, umožňuje použití matematických a statistických metod pro analýzu vlastností jednotlivých buněčných subpopulací leukocytů a zavedení statistického aparátu pro popis jejich patologií. Technologie Beckman Coulter VCS používá tři fyzikálně nezávislé metody analýzy vlastností buňky Historicky prvním pokusem jak statisticky popsat vlastnosti buněčné populace v hematologii bylo zavedení parametru RDW, variačního koeficientu populace erytrocytů. Tradiční mikroskopická hematologie používala a používá na popis velikostní různosti erytrocytů pojem anizocytóza a stupeň (kvantifikaci) tohoto jevu popisuje počtem křížků (+, ++, +++). Použití impedanční metody počítání erytrocytů za standardních fyzikálně-chemických podmínek umožnilo i standardizaci výsledků, kalibraci velikosti erytrocytů a zavedení měřítka v jejich distribuční křivce. Grafické zobrazení distribuce erytrocytů, charakteristické pro tuto populaci a známé jako Price-Jonesova křivka, dovoluje přímé vyčíslení vrcholu křivky = MCV a číselné vyjádření variačního koeficientu = RDW = míra anizocytózy erytrocytů. Tento parametr se stal nedílnou součástí krevního obrazu a každý z nás se s ním setkává mnohosetkrát denně. Hlavní výhodou číselného vyjádření (kvantifikace) této vlastnosti je možnost zavedení mezí pro normalitu a patologii, např. hodnota RDW mezi 12,5 a 15 je normální, vyšší hodnoty znamenají anizocytózu, jejíž stupeň je přesně charakterizován hodnotou RDW. Pro popis populace erytrocytů, jejich vlastností a případných patologií zavádí nová řada analyzátorů LH780 patentované parametry Red Cell Size Factor (RSF) a Microcytic Anemia Factor (MAF). Praktické klinické aplikace a použití těchto parametrů je dokladováno sérií právě dokončovaných a publikovaných studií. Podobně je možné zachytit i vlastnosti populace retikulocytů a popsat tak stav erytropoézy pacienta. Nová řada hematologických analyzátorů Beckman Coulter LH780 a LH785 přináší pro retikulocyty vedle stávajících parametrů IRF, MRV, další parametr RDW- -Retic-SD (RDWR-SD). Normal Mean Volume and SD For Neutrophil population Increased Neutrophil Mean Volume (cells other than mature neuts are present) and SD (increases the spread of the neut sizes) Patentovaná třírozměrná prostorová analýza diferenciálu leukocytů pomocí technologie VCS umožňuje, za použití výkonné počítačové techniky a softwaru, zavedení podobných parametrů i pro jednotlivé subpopulace leukocytů. Patentové řízení na ochranu autorství Beckman Coulter pro tyto parametry pro- 4 informační magazín číslo 4-2006

běhlo na přelomu roku 2005/2006 a v současné době se dokončuje jejich softwarová implementace do hematologických systémů Beckman Coulter. Budeme se tedy brzy setkávat s pojmy jako např.: střední objem neutrofilů, anizocytóza neutrofilů, mikro/makrocytóza neutrofilů, střední objem lymfocytů, anizocytóza lymfocytů, atd. Číselné vyjádření těchto hodnot je v současné době již používáno u posledních modelů analyzátorů řady LH750 ke generování varovných návěstí, případně pokynů k provedení automatického nátěru na sklíčko v lince LH755 a slouží k číselnému definování posunu doleva, to znamená výskytu mladších, nezralých forem granulocytů. Numerická charakteristika posunu doleva, vlevo je normální diff a postupně se vpravo progresivně zvětšuje počet a stupeň nezralých granulocytů Příklad typických hodnot VCS pro různé typy buněk Normal Reactive Lymph Ukazuje se, že znalost a kontrola středního objemu (Mean) a šířky (SD) jednotlivých subpopulací leukocytů je dnes tou správnou cestou jak zvýšit kvalitu a spolehlivost přístrojového diferenciálu v rutinním provozu. Plné využití analytického potenciálu nabídne nový model Beckman Coulter LH780, jehož vyhodnocovací software již zohlední výsledky mnoha nezávislých klinických studií, které již proběhly nebo jsou právě dokončovány. Do tříletého projektu se zapojila řada předních světových hematologických pracovišť Mayo Clinic USA, Hosp. Hammersmith London GB, které po celou dobu úzce spolupracovaly a konzultovaly výsledky s týmem Splenic Lymphoma Marginal Zone Typická poloha neutrofilních prekurzorových buněk v Beckman Coulter VCS Scatterplotu Hairy Cell Leukemia Lymph Mean Volume 85 87 100 126 Lymph Mean Conductivity 111.5 113 121 98 informační magazín číslo 4-2006 5 specialistů koncernu Beckman Coulter složeným ze softwarových a hematologických odborníků vedených Dr. Ramonem Lopez Simonem. Smyslem veškeré této práce není samoúčelné zavedení nových parametrů hematologigkého analyzátoru bez klinického významu, ale vytvoření validních hematologických pojmů s dokladovatelným klinickým významem a praktickou použitelností. Ukazuje se, že znalost a kontrola středního objemu (Mean) a šířky (SD) jednotlivých subpopulací leukocytů je dnes tou správnou cestou jak zvýšit kvalitu a spolehlivost přístrojového diferenciálu v rutinním provozu, jak do maximální míry ochránit laboratoř před falešně negativními výsledky a jak pomoci zachytit i takové fáze patologií, které jsou ještě klasickými manuálními metodami nedetekovatelné. Filozofie vyhodnocovacího software analyzátorů Beckman Coulter byla a je koncipována tak, aby ochránila pacienta rozhodnutí analyzátoru je vždy na straně bezpečnosti - nejasné výsledky jsou interpretovány jako pozitivní a laboratoř pozitivitu potvrdí nebo vyloučí v dalším analytickém kroku. Cílem rozhodně není konstrukce automatického analyzátoru, který by vyloučil člověka z analytického procesu a sám stanovoval diagnózu, ale přístroj, který co možná nejspolehlivějším způsobem zpracuje většinu běžného rutinního provozu, bezpečně zachytí a vytřídí možné nebo reálné patologie a maximem informací pomůže morfologovi při zkoumání nátěru. Právě toto je často opomíjená výhoda; představme si, že každý pětipopulační hematologický analyzátor Beckman Coulter počítá diferenciál z cca. 10 000 leukocytů a nalezne v nich např. 80 blastů. Jaká je asi pravděpodobnost, že je v našem nátěru a odečtu na 100 buněk uvidíme??? PETR BOUDAL E-MAIL:PBOUDAL@BECKMAN.COM

Nová řada hematologických analyzátorů Beckman Coulter LH780 a LH785 Preanalysis: Preanalytická fáze měření začíná u LH780 zadáním požadavků na krevní obraz do laboratorního informačního systému (LIS). Tyto informace jsou automaticky zaslány do řídicího počítače LH780 a u každého vzorku jsou selektivně analyzovány pouze opravdu požadované parametry (KO, Diff, Reti). Díky použití čárového kódu je vyloučeno riziko záměny vzorků, pacientský vzorek je jednoznačně identifikován včetně požadavků na měřené metody a odpadá další zadávání nebo vyplňování Worklistů. Toto uspořádání se označuje pojmem Full-Random-Access. Výrobci hematologických analyzátorů řeší tento problém v zásadě dvojím způsobem: Jedni zpracovávají krevní obraz vždy s maximálním počtem parametrů a zobrazují pouze vyžádané metody. Nevýhodou této koncepce je neustálá a zbytečná spotřeba všech reagencií. Ostatní výrobci zařazují krátký promývací cyklus vždy před přechodem z malého krevního obrazu (KO bez diff) na velký (KO+Diff+Reti). Přínosem je částečná úspora reagencií, nevýhodou je nutnost shromažďovat vzorky do sérií podle typu vyšetření. Přístroj LH780 je vybaven novými, bezúdržbovými keramickými ventily, které otvírají vždy pouze patřičné reagenční dráhy bez nutnosti proplachu. To šetří čas i peníze, a tak se podařilo dosáhnout skutečně selektivní analýzy bez dalších přidružených nákladů. Analysis: Vzorek krve je možno aspirovat manuálně statimový vstup nebo aspirace z atypických náběrovek, rutinní provoz používá kazetový podavač s kontinuálním předmícháváním vzorků. Bezprostředně při aspiraci vzorku je vestavěnou čtečkou čárových kódů načtena identifikace vzorku a je tak zcela vyloučena záměna vzorků. Nový typ kamerové čtečky čárových kódů toleruje jakoukoliv polohu štítku na náběrovce. Vlastní analyzátor je založen na osvědčeném Coulter-impedančním principu a neustále dále rozvíjené a prověřené VCS technologii. Vysoká hustota integrace polovodičových prvků spolu s použitím velmi rychlých procesorových jednotek a Hi- -Tech elektronických dílů umožnily vylepšení a zrychlení analytických algoritmů a především výrazné zlepšení odstupu signál šum. Tento parametr je vysoce kritický a rozhoduje, mimo jiné, o schopnosti analyzátoru registrovat a spolehlivě vyhodnocovat velmi malé a početně málo zastoupené částice (PLT - shluky, NRBCs, RETI, ). Nové, rychlejší analytické algoritmy kontrolují celou fázi průletu buňky měřicí aperturou tzv. Flight-Time a optimalizují následný čas potřebný pro ustálení systému tzv. Wait-Time. Výsledkem je znatelné zvětšení linearity, stability a rozsahu měření především u leukocytů a trombocytů. Horní hranice linearity měření leukocytů je 400 000 WBC/ml a u trombocytů 3 000 000 PLT/ml, horní hranice měřicího rozsahu je přitom cca 800 000 WBC/ml a 5 000 000 PLT/ml. Byly tak značně překonány hranice, jichž dříve dosahovaly pouze některé optické metody. Na opačném konci měřící škály leží hodnoty, se kterými se v každodenní rutinní praxi setkáváme možná častěji leukocytopenie a především trombocytopenie. Všechny dosud vyráběné hematologické systémy Coulter automaticky upozorňovaly u vzorků s počtem trombocytů menším než 20 000 PLT/ml na nutnost manuální kontroly. LH780 díky vysokému odstupu signál šum a vynikající stabilitě umožňuje přesné a lineární měření až do 5 000 PLT/ml. Celý měřící proces byl testován a validován podle referenční metody FDA a ISLH (International Society of Laboratory Hematology), kterou je průtoková cytometrie (CD41, CD61). Přesné a spolehlivé měření v této oblasti je rozhodující pro terapeutické podávání trombokoncentrátů a nabízí možnost zbavit se neoblíbených a značně subjektivních komůrkových metod. Vyspělá technologie VCS, s proměnným počítacím časem, je schopna validně diferencovat leukopenické vzorky již od 0,3 WBC. Dalším významným přínosem je automatická detekce přítomnosti normoblastů, jejich numerické vyhodnocení a automatická korekce počtu leukocytů u každého vzorku bez nutnosti použití dalších reagencií, do LIS je možné přenášet i nekorigovaný počet leukocytů UWBC. Pro stanovení počtu retikulocytů a jejich maturačního indexu je možno díky VCS technologii 6 informační magazín číslo 4-2006

použít průtokovou cytometrii, která je zároveň i referenční metodou. VCS technologie spolu s Intelli- -Kinetic metodou optimalizace pracovních podmínek analyzátoru a vylepšený způsob gatování nabízí stabilnější diferenciální rozpočet leukocytů především u starších a leukocytopenických vzorků. Veškeré subpopulace leukocytů jsou charakterizovány novými parametry Mean a SD jednotlivých populací a tyto hodnoty je možné i přenášet do sítě LIS k dalšímu využití. Postanalysis: Komplet hematologického analyzátoru Beckman Coulter LH780 je možné modulově doplnit o nátěrový a barvicí automat (model LH785), který podle výsledků vlastního měření a libovolných externích kriterií nebo jejich kombinací (druh patologie, diagnóza, oddělení, ošetřující lékař, ) připraví v reálném čase standardní nátěr obarvený klasickou metodou a popsaný číslem a jménem pacienta včetně čárového kódu. Rozsáhlý, několikavrstvý systém kontroly kvality výsledků, přesnosti a stability kalibrace běží neustále na pozadí analytického software a umožňuje nepřetržitou kontrolu celého analytického procesu. Rozsáhlé softwarové vybavení nabízí optimální využití kapacity analyzátoru a redukci času nutného pro obsluhu, vyhodnocování a validaci výsledků. LH780/ LH785 je nejnovějším produktem ve vývojové řadě hematologických analyzátorů koncernu Beckman Coulter a dalším významným posunem k vyšší kvalitě, bezpečnosti a ekonomii provozu našich laboratoří. PETR BOUDAL E-MAIL: PBOUDAL@BECKMAN.COM Průtoková cytometrie v hematologické laboratoři Důležitou součástí laboratorní hematologie se v posledních desetiletích stala průtoková cytometrie. outo metodou se provádí imunofenotypizace lymfomů a leukemií a stanovují se prognosticky významné znaky. Stanovení kmenových buněk se stalo nezbytnou součástí transplantací autologních a alogenních transplantací kostní dřeně nebo periferních progenitorových buněk. Průtokový cytometr FC500 je vybaven pěti detektory pro fluorescence a dvěma detektory pro měření optických vlastností buněk a částic. Optická lavice přístroje je osazena jedním nebo dvěma lasery (488 a 633 nm) a fotonásobiči citlivými v rozsahu 185 900 nm. Aspirace vzorků je zajištěna z podavače zkumavek s karuselem. Softwarové vybavení umožňuje analyzovat buňky periferní krve, kostní dřeně, uzlin a dalších biologických materiálů. Pro stanovení imunofenotypu lymfomů a leukemií je určena řada monoklonálních protilátek IOTest 3, které jsou konjugovány s fluorochromy FITC, PE a ECD. Tato kombinace umožňuje dále přidat monoklonální protilátky značené fluorochromy PC5 nebo APC a PC7. Tímto způsobem lze provádět pokročilé značení se čtyřmi nebo pěti monoklonálními protilátkami současně. Přístroj byl oceněn stříbrnou medailí za průmyslový design, sponzorovanou publikací Industry Business Outlook (IBO). Tato cena je udělována za výjimečný design analytických přístrojů a přístrojů pro biologické vědy. Druhým oceněním je cena udělená společností Frost&Sulivan, jednou z předních světových firem v oblasti poradenství. Důvodem k udělení ceny je výjimečná kvalita ve výrobě a užitné vlastnosti přístroje, který nabízí automatizaci, vedoucí ke komplexním výsledkům analýz. Kombinace monoklonálních protilátek pro imunofenotypizaci chronických lymfoproliferací z buněk B. obj. číslo Popis Formát počet testů A07706 KAPPA/LAMBDA/CD19 IOTest FITC/PE/ECD Liquid 25 testů A07707 CD5/CD10/CD19 IOTest FITC/PE/ECD Liquid 25 testů A07708 CD20/CD10/CD19 IOTest FITC/PE/ECD Liquid 25 testů A07709 FMC7/CD23/CD19 IOTest FITC/PE/ECD Liquid 25 testů A07710 CD5/CD23/CD19 IOTest FITC/PE/ECD Liquid 25 testů A07711 CD25/CD11c/CD19 IOTest FITC/PE/ECD Liquid 25 testů A07712 CD103/CD11c/CD19 IOTest FITC/PE/ECD Liquid 25 testů informační magazín číslo 4-2006 7

Kombinace monoklonálních protilátek pro imunofenotypizaci non- B lymfoproliferací. obj. číslo Popis Formát počet testů A07724 HLA-DR/CD7/CD45 IOTest FITC/PE/ECD Liquid 25 testů A07725 CD5/CD7/CD3 IOTest FITC/PE/ECD Liquid 25 testů A07726 CD8/CD4/CD3 IOTest FITC/PE/ECD Liquid 25 testů A07727 CD25/CD4/CD3 IOTest FITC/PE/ECD Liquid 25 testů A07728 CD16/CD56/CD3 IOTest FITC/PE/ECD Liquid 25 testů Velmi důležitou aplikací průtokové cytometrie je detekce minimální reziduální choroby po léčbě pacientů s lymfomy a leukemiemi. Toto stanovení je založeno na průkazu rozdílné exprese vybraného znaku (molekuly) nádorovými a zdravými buňkami. Specializovaný stemcxp software je určen ke stanovení procentuálního zastoupení a absolutních počtů kmenových buněk (CD34 pozitivních) v obvodové krvi, čerstvých nebo rozmražených aferézních produktech, čerstvé kostní dřeni a čerstvých nebo rozmražených vzorcích pupečníkové krve. Software je založen na požadavcích International Society for Cellular Therapy. Nové monoklonální protilátky pro průtokovou cytometrii Konjugované protilátky řady IOTest jsou univerzální reagencie pro průtokovou cytometrii určené pro všechny typy průtokových cytometrů. Tyto reagencie jsou určeny pro značení povrchových a intracelulárních antigenů. IOTest CD21-PE obj. číslo A32536, 100 testů, klon BL13 Monoklonální protilátka BL13 rozeznává antigen o molekulové hmotnosti 140 kda přítomný na lymfocytech B v sekundárním lymfoidním folikulu lymfatických uzlin a tonzil. Protilátka nereaguje s cirkulujícími lymfocyty B, lymfocyty T, monocyty a granulocyty. IOTest CD43-PE obj. číslo A32560, 100 testů, klon DFT1 Antigen CD43 je exprimován na krevních destičkách a na všech leukocytech, slabě na klidových lymfocytech B, po aktivaci se exprese zvyšuje. IOTest CD44-PE obj. číslo A32537, 100 testů, klon J.173 Molekula CD44 je přítomna na většině buněk a tkání, s výjimkou krevních destiček, hepatocytů, srdečního svalu atd. Byla popsána řada izoforem CD44. IOTest CD118 (LIFR) -PE obj. číslo A32346, klon 7G7 Antigen CD118 (LIFR, human leukemia inhibitor factor receptor) se nenachází na cirkulujících krevních buňkách, ale je exprimován na širokém spektru buněk včetně embryonálních kmenových buněk, hepatocytech, adipocytech, nervových a gliových buňkách, osteoblastech a myoblastech. IOTest CD123-PE obj. číslo A32535, 100 testů, klon SSDCLZ107D2 Antigen CD123, podjednotka receptoru pro IL-3, je přítomen na hematopoietických kmenových/progenitorových buňkách, většině buněk myeloidni řady a některých CD19+ buňkách. Chybí na CD3+ buňkách Jiným výrobkem, který obsahuje protilátku CD123, je kombinace CD(14+16)-FITC/ILT3-PE (CD85k)/ CD123-PC5, která slouží ke stanovení plazmacytoidní populace dendritických buněk. IOTest CD164-PE obj. číslo A32347, klon 67D2 Antigen CD164 je přítomen na CD34+ buňkách kostní dřeně a pupečníkové krve. Monoklonální protilátka 67D2 rozeznává epitop třídy IIIb. IOTest Anti-Rat CD3-FITC/ CD4-PC7/CD8-APC obj. číslo A32909, klony 1F4/ OX-38/OX-8, 50 testů IOTest Anti-Rat CD3-FITC/ CD45RA-PC7/CD161a-APC obj. číslo A32910, klony 1F4/OX-33/10/78, 50 testů Zcela nově se v naší nabídce objevují dva nové výrobky pro výzkumná pracoviště IOTest Anti-Rat CD3-FITC/CD4-PC7/CD8-APC (reagencie pro stanovení subpopulací lymfocytů T) a IOTest Anti- -Rat CD3-FITC/CD45RA-PC7/CD161a-APC (reagencie pro stanovení lymfocytů T, B a buněk NK). Obě kombinace konjugovaných monoklonálních protilátek jsou použitelné na průtokových cytometrech FC500 s dvěma lasery. Tato tříbarevná konfigurace (FITC/PC7/APC) výrazně usnadňuje analýzu na průtokovém cytometru bez potřeby nastavování kompenzací. Navíc je možné podle potřeby přidat další monoklonální protilátku značenou PE, např. pro stanovení aktivačních znaků. PAVEL KRUŽÍK E-MAIL: PKRUZIK@BECKMAN.COM 8 informační magazín číslo 4-2006

Detekce rozsáhlých delecí a duplikací v genech metodou MLPA V současné době jsme svědky expanze DNA a RNA diagnostiky a rozsáhlých možností jejího využití v řadě medicínských oborů. Převratné diagnostické a terapeutické úspěchy z posledních let jsou výsledkem aplikace nových molekulárně biologických technik. etody molekulární genetiky se zaměřují na vyhledávání mutací, tj. rozdílů v sekvencích DNA specifických genů. Mutace na DNA v konečném důsledku vedou k patologické aktivitě, stabilitě nebo expresi kódovaných proteinů. Rozeznáváme několik typů mutací. V případě, kdy je zaměněn jeden nukleotid na DNA za jiný, hovoříme o bodových mutacích. Někdy pozorujeme při analýze DNA ztrátu nebo naopak nadbytek několika nukleotidů. Takovéto mutace nazýváme krátké delece nebo inzerce. Mohou však nastat i případy, kdy chybí nebo je přítomno navíc několik tisíc bazí zahrnující jeden nebo více exonů daného genu. Toto jsou případy rozsáhlých delecí nebo duplikací uvnitř genů. Nejčastěji vznikají homologní rekombinací (nerovnoměrným crossing- -overem) mezi repetitivními Alu sekvencemi ležícími uvnitř genů v intronových oblastech. Běžná analýza mutací v genech je založená na amplifikaci jednotlivých exonů pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) a následném sekvenování. Avšak tato tzv. exon by exon screeningová metoda může selhat v případě detekce mutantních alel typu rozsáhlých delecí, neboť primery použité v PCR reakci se nemohou do příslušných oblastí DNA navázat. K chybným interpretacím výsledků při DNA diagnostice může docházet například u složených heterozygotů pro jednu mutantní alelu s bodovou mutací a druhou mutantní alelou s rozsáhlou delecí. Tito pacienti se mohou buď jevit jako falešní homozygoti pro bodovou mutaci nebo u nich druhou mutaci nelze běžnými metodami nalézt. Detekce velkých genových přestaveb obvykle vyžaduje alternativní techniky. Nejprve se pro tyto účely používala metoda Southern blottingu. Jedná se však o časově velice náročnou a pracnou techniku, která navíc vyžaduje velké množství DNA. Později používaná metoda, long-range PCR, která umožňuje amplifikaci fragmentů až do velikosti 20 kb, se zdála být ve srovnání se Southern blottingem k detekci velkých delecí nebo duplikací výhodnější. Avšak studujeme-li geny větší než 20 kb, je zapotřebí analyzovat několik vzájemně se překrývajících amplikonů. Pokud jsou delece nebo duplikace rozsáhlejší, je tato metoda neúčinná. Proto byla nedávno pro detekci velkých genových přestaveb popsána nová metoda nazvaná multiplexová ligačně podmíněná amplifikace (MLPA) (1). MLPA je metoda umožňující v jedné reakci identifikovat v genech rozsáhlé delece nebo duplikace v řádech několika desítek až stovek kilobazí, které nejsou běžnými PCR technikami zjistitelné. Metoda se skládá z několika kroků. V první fázi dochází k denaturaci genomové DNA a hybridizaci jednovláknových DNA molekul se specifickými oligonukleotidovými sondami vážícími se do exonových oblastí studovaného genu. Sondy jsou navrženy tak, že se do příslušné exonové oblasti váží vždy dvě sondy, které k sobě těsně přiléhají. V dalším kroku dochází působením ligázy ke spojení hybridizovaných sond v jeden DNA fragment, který je v následném kroku amplifikován univerzálními primery, z nichž jeden primer je fluorescenčně značený. Sondy jsou navrženy tak, aby každý exon vytvářel během PCR různě dlouhý produkt. Směs PCR produktů ze všech exonů vyšetřovaného genu je v konečné fázi podrobena fragmentační analýze. Když jeden nebo několik exonů vlivem rozsáhlé delece na jedné z alel chybí, nedochází k navázání sondy do příslušné oblasti a při fragmentační analýze je detekována poloviční velikost píku odpovídající danému exonu (viz. obr. 1). Při duplikaci na jedné alele je pík naopak zvýšen. Pro bezchybnou analýzu se do reakce přidávají i kontrolní sondy, vážící se do jiných oblastí na genomu, a musí tudíž dávat u všech jedinců vždy identický signál. Více o MLPA na http://www.mlpa.com. MLPA metodu jsme s úspěchem použili pro detekci rozsáhlých delecí v genu pro fenylalaninhydroxylasu (PAH) u pacientů s fenylketonurií (PKU) s jednou zatím neurčenou mutantní alelou (2). U celkem 31 pacientů byla pomocí MLPA detekována delece buď třetího nebo pátého exonu PAH genu příklad viz. obr. 1. V současné době pátráme pomocí MLPA po rozsáhlých delecích či duplikacích v genu pro LDL receptor u velkého množství vzorků pacientů s familiární hypercholesterolemií (FH). Fragmentační analýzu provádíme na 8-kapilárním automatickém sekvenátoru Beckman-Coulter CEQ 8000. Tento přístroj je schopen během krátké doby kvalitně analyzovat velké množství vzorků. Výhodou CEQ 8000 je snadná obsluha, velká výkonnost a vhodně řešený software pro zpracování a tisk dat. informační magazín číslo 4-2006 9

Obr. 1: Příklad MLPA analýzy genu pro fenylalaninhydroxylasu (PAH). Čísla nad píky označují jednotlivé exony PAH genu, A a C: normální MLPA profil. B: Profil PKU pacienta s delecí 3. exonu na jedné alale. D: Profil PKU pacienta s delecí 5. exonu na jedné alele. Příklady hodnocení diferenciálních rozpočtů leukocytů na Coulter LH 750 Od listopadu 2005 pracujeme ve fakultní hematologické laboratoři s novým analyzátorem Coulter LH 755, od května 2005 máme Coulter LH 750 i v naší druhé laboratoři vzdálené 8 km. Závěrem lze konstatovat, že MLPA je vhodná rychlá a spolehlivá metoda k detekci delecí a duplikací uvnitř genů. Je vhodná také k detekci větších chromozómových přestaveb a numerických chromozómových aberací jako např. Downův nebo Turnerův syndrom. MLPA jistě brzy najde široké uplatnění v DNA diagnostice řady dalších závažných genetických onemocnění. Literatura 1) J. P. Schouten, C. J. McElgunn, R. Waaijer, D. Zwijnenburg, F. Diepvens, G. Pals. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res. 30 (2002):e57. 2) L. Kozák, E. Hrabincová, J. Kintr, O. Horký, P. Zapletalová, I. Blaháková, P. Mejstřík, D. Procházková. Identification and characterization of large deletions in the phenylalanine hydroxylase (PAH) gene by MLPA: evidence for both homologous and non-homologous mechanisms of rearrangement. Mol. Genet. Metab. In press. RNDR. LIBOR KOZÁK, CSC., CENTRUM MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE A GENOVÉ TERAPIE, FAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO ČERNOPOLNÍ 9, 625 00 BRNO, E-MAIL: LKOZAK@FNBRNO.CZ laboratoři klademe velký důraz na rychlost a přesnost stanovení kompletního krevního obrazu pro ambulantní i lůžková oddělení a kliniky fakultní nemocnice i pro mimonemocniční klienty. Diferenciální rozpočet leukocytů pokročilou technologií analýzy krevních částic ve 3D prostoru pomocí tří nezávislých fyzikálních veličin umožnil významně omezit počty vyšetření rozpočtu leukocytů v mikroskopu, k čemuž přispívá i nově zavedená mikroskopická validace automaticky zhotovených rozpočtů. Způsob nastavení nátěrového a barvicího automatu dovolí laborantkám neměnit osvědčené pracovní postupy při zlepšení kvality nátěrů a úspoře manuální práce (zůstává stejný typ nátěrů, fixace, barvení). Denně zpracováváme krevní obrazy nevybočující z fyziologických mezí, krevní obrazy s reaktivními změnami i množství vysoce patologických nálezů u dětských i dospělých pacientů s hematoonkologickými a onkologickými diagnózami. Předkládáme několik příkladů hodnocení patologických krevních obrazů. Závěr: Mikroskopické hodnocení nátěru periferní krve zůstává i nadále základem dobré práce v hematologické laboratoři. Kvalitní analyzátor krevního obrazu tuto práci významně ulehčí, a tak je možné plně vyhovět různorodým požadavkům kladeným na moderní laboratoř. MUDR. PAVLA ŠIGUTOVÁ, ÚSTAV KLINICKÉ BIOCHEMIE A HEMATOLOGIE, FAKULTNÍ NEMOCNICE PLZEŇ, ALEJ SVOBODY 80, 304 60 PLZEŇ, E-MAIL: SIGUTOVA@FNPLZEN.CZ 10 informační magazín číslo 4-2006

Anémie z poruchy tvorby erytrocytů z poruchy syntézy hemu Příklad 1: 13letý chlapec je 5 měsíců po laparoskopické splenektomii pro thalasémii major, navíc s přítomnou hemoglobinopatií E. Těžká hypochromní mikrocytární anémie, trombocytémie, extrémní přítomnost normoblastů v periferní krvi. Retikulocyty v tomto případě nestanoveny. histogram erytrocytů (Price Jonesova křivka) scatterplot numerické hodnoty krevního obrazu a flagging detekce abnormálních vzorků krevní obraz vydaný laboratoří Anémie ze zvýšené ztráty erytrocytů Příklad 2: 47letý muž s dědičnou sférocytózou, nyní vyšetřován pro sideropenickou anémií nejspíše při skluzné hiátové hernii. parametry retikulocytů Akutní myeloidní leukémie Příklad 3: 62letý muž odeslaný do hematologické ambulance z okresní nemocnice s podezřením na CLL (hodnoceno pravděpodobně pouze podle numerických hodnot vydaných analyzátorem). Nejedná se o lymfocyty v periferní krvi (viz scatterplot a flagging ), je nutné mikroskopické hodnocení s nálezem blastů, dalším vyšetřením zjištěna akutní myeloidní leukémie M1-2 dle FAB klasifikace. histogram leukocytů scatterplot retikulocytů numerické hodnoty leukocytů krevní obraz vydaný laboratoří scatterplot a flagging myeloblast v periferní krvi krevní obraz vydaný laboratoří informační magazín číslo 4-2006 11

Akutní myeloidní leukémie Příklad 4: 47letá žena s prvozáchytem akutní myeloidní leukémie subtypu M2 dle FAB klasifikace, na scatterplotu je podezření na monocyty, jedná se však o blasty. V kostní dřeni 25% infiltrace lehce POX pozitivními blasty. scatterplot numerické hodnoty krevního obrazu a flagging krevní obraz vydaný laboratoří Akutní lymfatická leukémie Příklad 5: 37letá žena s prvozáchytem akutní lymfoblastické leukémie, pro-b-all dle EGIL klasifikace, v periferní krvi převaha lymfoblastů. Myeloproliferativní nemoci - chronická myeloidní leukémie Příklad 6: 47letá žena s prvozáchytem chronické myeloidní leukémie. Jasný patologický obraz dobře zhodnocený analyzátorem. scatterplot leukocytů lymfoblasty v periferní krvi histogram leukocytů scatterplot a flagging krevní obraz vydaný laboratoří nátěr periferní krve krevní obraz vydaný laboratoří numerické hodnoty krevního obrazu numerické hodnoty krevního obrazu a flagging 12 informační magazín číslo 4-2006

Myeloproliferativní nemoci primární myelofibróza Příklad 7: 83letá pacientka léčena mnoho let pro myelofibrózu, před měsícem ukončena léčba hydroxyureou. nátěr periferní krve numerické hodnoty leukocytů scatterplot leukocytů krevní obraz vydaný laboratoří Myeloproliferativní nemoci primární eosinofilní syndrom Příklad 8: 13letá dívka s primárním eosinofilním syndromem před zahájením léčby kortikoidy. Automatický i mikroskopický rozpočet leukocytů souhlasí. histogram leukocytů krevní obraz vydaný laboratoří Maligní lymfoproliferativní nemoci nehodgkinovský lymfom (NHL) scatterplot leukocytů Příklad 9: 80letý muž s původní diagnózou NHL typu mantle cell lymfomu, po cytostatické léčbě byl v remisi. Nyní progrese onemocnění s nálezem prolymfocytů v periferní krvi. numerické hodnoty leukocytů numerické hodnoty leukocytů scatterplot leukocytů prolymfocyt v periferní krvi I prolymfocyt v periferní krvi II krevní obraz vydaný laboratoří informační magazín číslo 4-2006 13

Chronická lymfatická leukémie (CCL) Příklad 10: 73letý muž s diagnózou B-CLL 0 st dle Raie stanovenou před 2 lety, před měsícem se objevila těžká trombocytopenie nikoliv jako IV. st. nemoci, ale jak bylo ověřeno dalším vyšetřením, jednalo se o kombinaci základního onemocnění CLL a idiopatické trombocytopenické purpury (ITP). histogram trombocytů numerické hodnoty leukocytů scatterplot leukocytů krevní obraz vydaný laboratoří Benigní lymfoproliferativní choroby infekční mononukleóza Příklad 11: 17letá dívka s infekční mononukleózou, při prvozáchytu krevní analyzátor hodnotí jako podezření na přítomnost nezralých buněk granulopoezy. aktivní lymfocyt v periferní krvi scatterplot leukocytů a flagging numerické hodnoty leukocytů krevní obraz vydaný laboratoří 14 informační magazín číslo 4-2006

V dňoch 4.- až 6. mája 2006 sa uskutočnila v Martine medzinárodná konferencia o Hemostáze a Trombóze. Bol to už XIII. zjazd, ktorý organizovala hematologická a Transfuciologická spoločnosť SLS Hremalofogické společnost ČSL J. E. Purkyně, Jesseniova Lekárska fakulta Univerzity Komenského v Martine, Martinská fakultná nemocnica a 4 ďalšie odborné subjekty spoločnosti. Garantom konferencie bolo predsedníctvo v zložení prof. MUDr. P. Kubisz, DrSc. a prof. MUDr. J. Malý, PhD. Podujatie bolo tiež významne podporované EHA (Európskou Hematologickou Asociáciou). Cieľom konferencie bolo vymeniť si odborné skúsenosti v oblasti hemostázy a trombózy. Zúčastnili sa na ňom odborníci zo Slovenska, Českej republiky ako i zo zahraničia. Vedecký program bol venovaný nasledovným témam: Hemofília a trombofília Antitrombotická terapia Bypasová terapia Laboratórna diagnostika porúch hemostázy Nádorové ochorenia a hemostáza Aktuálne otázky manifestácie porúch hemostázy v chirurgických odboroch Konferencia bola hodnotená 12.3 CME Creditmi a zúčastnilo sa na nej 340 špecialistov bolo na nej prednesených 57 odborných príspevkov bolo zverejnených 29 posterov prezentovalo sa 12 firiem Počas zjazdu sa uskutočnil krst novej učebnice od prof. P. Kubusza Hematológia a transfusiológia, ktorú vydáva v tomto roku vydavateľstvo GRADA. XIII. Slovensko česká konferencia o hemostáze a trombóze Martin 2006 Ako sa prezentoval na podujatí Beckman Coulter a Instrumentation Laboratory? Spoločnosť Beckman Coulter a Instrumentation Laboratory potvrdili globálne partnerstvo v oblasti hemostázy i na tomto podujatí, kde sme spoločne prezentovali obidve spoločnosti. Instrumentaion Laboratory je na Slovensku zastupovaná spoločnosťou Immunotech a v Českej republike spoločnosťou COMESA. Na tomto podujatí sme mali spoločný stánok. Prezentáciu sme sústredili na analyzátory ACL 7000, 9000 a 10000 CL1 HmX a LH 750 D-Dimery novinky testov HemosIL Faktor XIII Antigen Účastníkom konferencie boli k dipozícii naši predstavitelia a produktoví špecialisti. Z Instrumentation Laboratory (Milano) pricestoval pán Alberto Strada, z Comesy Česká republika boli prítomní pan Š. Lukeš, M. Hejduková a V. Blažková. Z Immunotechu R. Šandrik, Ľ. Horenitzká, T. Torda Hlavným príspevkom spol. Instrumentation Laboratory k odbornému programu konferencie bola prednáška prof. Paolo Simioniho z Univerzity Padova (Taliansko). Názov prednášky bol Trombophilia: Klinické a laboratórne aspekty. Prof. Simioni sa venoval histórii venóznej trombo-ebolií, jej riziku vo veku nižšom ako 45 rokov, periodickej a opakujúcej sa venóznej trombo-ebolií. Prednáška prof. P. Simioniho zaujala veľa odborníkov a jej odozvou bola zaujímavá diskusia. Ak máte o prednášku záujem je možné si ju vyžiadať na adrese rsandrik@beckman.com. Informácie o konferencii je možné nájsť na www stránkach www.jfmed.uniba.sk, alebo www.hematology.cz ROMAN ŠANDRIK E-MAIL:RSANDRIK@BECKMAN.COM informační magazín číslo 4-2006 15

Beckman Coulter na špici VÝSTUP BECKMAN COULTER NA GERLACHOVSKÝ ŠTÍT AUGUST 2006 ňa 1. 8. 2006 ráno o 5.00 vyrazila skupina vysokohorských nadšencov zdolať najvyšší vrchol Vysokých Tatier Gerlachovský štít 2655 m n.m. 5 účastníkov pod vedením 2 horských vodcov Mirom a Marekom sa rozhodli vyniesť zástavu s logom Beckman Coulter na vrchol. Predpoveď počasia nebola práve najlepšia, na nálade nám nepridala ani informácia, že ostatní horskí vodcovia zrušili na tento deň plánované túry. Trasa začína na Sliezkom dome. Turistická značka vedie popri Velickom plese cez skalný prah Večný dážď, čo sme si mali možnosť vyskúšať na vlastnej koži. Značka ide pod previs, kde stále kvapká voda. Nad skalným prahom sa odbočuje do Velickej próby, kde začína lezenie. Niektorí si prvýkrát vyskúšali horolezecké náradie. Po výstupe Velickou próbou sme sa ocitli na hrebeni, odkiaľ sa nám naskytol nádherný výhľad na okolité doliny a vrcholy. Pri postupe po hrebeni sme videli, ako prichádza dážď. Keď sme dorazili na vrchol Gerlachovského štítu (okolo 9,30) bola už hmla dážď a vietor. Po pol hodinovej prestávke na občerstvenie som začal ľutovať, že nemám rukavice. Studené skaly, reťaze a kramle boli ako balzam na naše skrehnuté ruky. Zostup Batizovskou próbou v daždi po šmykľavých skalách bol na niektorých exponovaných miestach skutočný adrenalín. V ústí žľabu do Batizovskej doliny sme absolvovali ešte čerešničku na torte asi 30 m dlhé snehové pole, kde pri prudkom sklone sa nebolo možné udržať na nohách. Zostup dolinou k Batizovskému plesu, kde sme sa pripojili na turistickú značku bola už pohoda. Ja som podcenil kondičnú prípravu a skončil som so svalovicou asi na polovici tela. Po celkovom zhodnotení mi nedá nepovedať, že naša expedícia dopadla úspešne. Trasu zvládli všetci po vlastných nohách v čase 9 hodín, prevýšenie cca. 1000 metrov, napriek počasiu, ktoré nebolo práve najlepšie. Najväčší optimisti (ja a Ľudo) chceli ešte pridať vrchol zadného Gerlachu, ale boli sme prehlasovaní ostatnými a nakoniec sa ukázalo, že 3 hodiny navyše by nebolo práve to najlepšie pre naše nohy. Teším sa na ďalšie stretnutie vo Vysokých Tatrách. Športu zdar a horolezectvu zvlášť! PAVOL SKOČDOPOLE E-MAIL: PSKOCDOPOLE@BECKMAN.COM 16 informační magazín číslo 4-2006

Jak se daří vašim buňkám? Přesvědčte se na vlastní oči Vi-Cell TM XR Cell Viability Analyzer Mějte buňky pod dohledem! Vi-Cell TM Cell Viability Analyzer vám umožní monitorovat počet buněk v kultuře, jejich životnost, velikost i distribuci velikosti a tvar buněk. Vi-Cell TM umožňuje: Obrazovou analýzu buněk v rozmezí koncentrací 5x10 4-10 7 Obrazovou analýzu buněk v rozmezí velikostí 2-70 µm Pomocí distribuce velikostí rozeznat subpopulace buněk v kultuře S využitím trypan blue rozeznat a vyhodnotit podíl živých a mrtvých buněk Plně automatickou analýzu trvající 2,5 minuty Přístroj je vybaven autosamplerem na 12 pozic. Na jednu analýzu potřebujete pouze 0,5 ml vzorku. Pokročilá zobrazovací technologie je vybavena automatickým zaostřováním, CCD kamerou o rozlišení 1394 x 1040 a dodatečným zoomem k rozlišení detailů jednotlivých buněk a jejich shluků. Systém je vybaven uživatelsky příjemným software, který umožňuje kvantitativní zpracování dat, statistické vyhodnocení, 3D grafy či sledování trendů. Data mohou být exportována jako Excelový soubor. Software vyhovuje požadavkům 21 CFR Part 11. e-mail pro odborné dotazy BMRIOT@beckman.com a telefon pro odborné dotazy +420 267 008 513 informační magazín číslo 4-2006 17

O čem ještě uslyšíte COMP COMP je akronymum anglického označení cartilage oligomeric matrix protein. Jedná se o nekolagenní protein, který je podstatnou součástí tzv. extracelulární matrix chrupavky. Řadí se do rodiny extracelulárních proteinů thrombospondinů. Odtud pochází jeho další označení thrombospondin 5. COMP byl poprvé izolován z hovězí chrupavky (1). Struktura lidské varianty této molekuly byla charakterizována o dva roky později (2). COMP je glykoprotein s velkou molekulovou hmotností (524 kda), který ve své struktuře váže vápenaté ionty (3). Jeho molekula je složena z pěti identických podjednotek s molekulovou hmotností 86 650 kda (4). Podjednotky jsou navzájem spojeny v oligomerizující doméně nacházející se na N- -konci a struktura je stabilizována disilfidickými můstky. Nativní molekula proteinu se za přítomnosti zinečnatých iontů váže ke kolagenu I, II, IX (5). Předpokládá se, že COMP se podílí na vzniku zesíťované fibrilární struktury kolagenu, která propůjčuje příslušným tkáním značnou odolnost vůči tahu a torzi. Důkazem významu COMP pro normální funkci zdravé chrupavky jsou dvě dědičná onemocnění skeletu - pseudoachondroplasie a mnohočetné epifyzeální dysplasie (6). U obou onemocnění byla zjištěna přítomnost mutace genu COMP. Charakteristickým rysem obou chorob je nápadně malý vzrůst postižené osoby, tzv. zakrslost, a čas- 18 informační magazín číslo 4-2006

to je pozorován brzký nástup osteoartrózy. Mechanizmus, jakým mutace proteinu brzdí růst, je ale v současnosti stále předmětem výzkumu. Osteoartróza je velmi rozšířené onemocnění, které přináší bolest a sníženou hybnost kloubů. V České republice je postiženo asi 10 % populace. Četnost výskytu narůstá významně s věkem. Odhaduje se, že u osob nad 60 let je postiženo až 50 %. Osteoartróza se vyznačuje postupnou destrukcí kloubní chrupavky doprovázenou změnami subchondrální kosti. Krajním řešením problému jsou kloubní náhrady. Diagnóza osteoartrózy, založená tradičně na rentgenu a bolestivosti, je již obvykle prováděna v době pokročilého poškození tkáně. Proto bylo mnoho pozornosti zaměřeno na vývoj diagnostiky založené na biochemických markerech, zejména na stanovení makromolekul nebo jejich částí vyskytujících se v chrupavce. Zvýšené uvolňování těchto molekul z kloubů do krevního oběhu může být odrazem narušeného obratu kloubní tkáně. Vyvstala zejména potřeba najít takový marker, který by citlivě predikoval iniciaci a progresi onemocnění osteoartrózou. Úvodní studie, využívající monoklonální protilátky proti COMP, naznačují, že tímto užitečným prognostickým markerem progrese osteoartrózy může být právě tento protein (7, 8, 9, 10, 11). Další chorobou, u níž dochází k poškození chrupavky, je revmatoidní artritida. Jedná se o chronické progresivní onemocnění postihující zánětlivou reakcí periferní klouby. Důsledkem progresivní destrukce těchto kloubů je snížená fyzická výkonnost, bolestivost kloubů a také zkrácení délky života. Závažnost onemocnění podtrhuje i jeho vysoká prevalence. Uvádí se, že je jím postiženo 0,5 až 1 % populace. Agresivita, s jakou destrukce kloubů postupuje, se liší pacient od pacienta. Proto jsou hledány sérové markery, které by pomohly předpovědět míru agresivity onemocnění a umožnily tak stanovit včas odpovídající léčbu. Jedním z možných kandidátů je i COMP. Klinické studie postupně prokazují, že stanovení COMP může být užitečným nástrojem pro určení prognózy vývoje u pacientů s diagnostikovanou revmatoidní artritidou (12, 13). Další možnosti jeho využití spočívají při hodnocení efektu léčby revmatoidní artritidy (14, 15). Glykoprotein COMP má nepopiratelně velmi důležitý význam pro vytvoření plně funkční struktury chrupavky, šlach a kostí. Možnosti využití stanovení jeho sérových hladin pro diagnostické účely jsou široké a jsou dále ověřovány v rámci mnoha klinických studií. Již nyní lze říci, že COMP je považován za marker degradace chrupavky. Jeho sérové hodnoty tak mohou být využity k monitorování procesu její destrukce (16,17). Literatura (1) Hedbom et al. J Biol Chem. 267(9): 6132-6 (1992) (2) Newton et al. Genomics. 24(3): 435-9 (1994) (3) Chen et al. J Biol Chem. 275(34): 26538-44 (2000) (4) Zaia et al. J Biol Chem. 272(22): 14120-6 (1997) (5) Rosenberg et al. J Biol Chem. 273(32): 20397-403 (1998) (6) Briggs et al. Nat Genet. 10: 330 336 (1995) (7) Sharif et al. Br. J. Rheumatol. 34: 306 310 (1995) (8) Petersson et al. Br.J.Rheumatol. 37: 46 50 (1998) (9) Conrozier et al. Ann. Rheum. Dis. 57: 527-532 (1998) (10) Vilím et al. Osteoarthritis Cartilage 9: 612-618 (2001) (11) Vilím et al. Osteoarthritis Cartilage 10: 707-713 (2002) (12) Skoumal et al. Scand.J.Rheumatol. 32: 156-161 (2003) (13) Forsblad d Elia et al. Arthritis Res Ther. 6(5): 457-68 (2004) (14) den Broeder et al. Ann Rheum Dis. (4): 311-8 (2002) (15) Weitoft et al. Ann Rheum Dis. 64(12): 1750-3 (2005). (16) Otterness et al. Osteoarthritis Cartilage 8: 180-185 (2000) (17) Larsson et al. Rheumatology 41: 996-1000 (2002) RNDR. VLADIMÍR VILÍM, CSC. REVMATOLOGICKÝ ÚSTAV, PRAHA Omluva redakce: šotek opět zasahuje V předcházejícím čísle časopisu opět řádil redakční šotek. Tentokrát se mu zalíbil článek Aktiviny a inhibiny v klinickém výzkumu i praxi. Hned ve druhém odstavci si pohrával s řeckými písmenky, která označují podjednotky inhibinu B. Správné složení inhibinu B je tedy α-β B, nikoliv β - β B. Omlouváme se všem, kterým šotek zamotal hlavu. VAŠE REDAKCE Soutěž Pomozte nám chytit šotka Šotek tentokrát řádil v naší redakci už podruhé. Zlobí nás, že ho nemůžeme polapit. Proto jsme se rozhodli požádat vás o pomoc. A jelikož by každé úsilí mělo být odměněno, ti z vás, kteří budou v lovu šotka úspěšní, obdrží hrnek s naším logem. Čtěte tedy toto číslo obzvlášť pečlivě a hledejte překlep jako stopu po šotkově řádění. Může to být např. zkomolené slovo, přehozená písmenka nebo zaměněný index ve vzorci. Své úlovky posílejte nejpozději do 31.10. 2006 na e-mailovou adresu hkurzweilova@beckman.com. Jako předmět zprávy uveďte, prosím, slovo ŠOTEK. ŠOTKU, TĚŠ SE! informační magazín číslo 4-2006 19

Kde se můžeme setkat (září prosinec 2006) Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech formou stánku 26. - 27. 9. 2006 Seminář Výzvy a otázky proteomiky Liběchov 1. - 4. 10. 2006 4. metodické dny Železná Ruda 4. 6.10.2006 IX.Medzinárodný zjazd vojenských internistov, pneumológov, laboratórnych pracovníkov Nová Polanka, Vysoké Tatry 5. - 7. 10. 2006 5th Meeting of the European Mucosal Immunology Group Praha 25. - 28. 10. 2006 XXIII. Sjezd alergologů a klinických imunologů a XI. Kongres imunologů Hradec Králové 26. 27. 10.2006 II. Bratislavské hematologické a transfuzilogické dni s medzinárodnou účasťou Bratislava 26. 10. 2006 Seminář klinická genetika Brno 8. 11. 2006 Pracovní dny Automatizace Olomouc 23. 24. 11. 2006 VII. Česko-slovenské dny laboratorní hematologie s mezinárodní účastí Hradec Králové 6. 7. 12. 2006 Pracovní dny Sekce biochemických laborantů ČSKB Karlova Studánka 7. 8. 12. 2006 10. Celostátní konference o DNA diagnostice Brno MARKÉTA KRUPAŘOVÁ, MKRUPAROVA@BECKMAN.COM