LIPIDY. IZOLACE CELKOVÝCH LIPIDŮ pro stanovení celkového množství lipidů pro další detailní rozbory charakteru lipidů

Transkript

1 LIPIDY IZOLACE CELKOVÝCH LIPIDŮ pro stanovení celkového množství lipidů pro další detailní rozbory charakteru lipidů Obecné požadavky na izolaci selektivita (absence nelipidických složek) zachování nativní struktury - nutnost desaktivace lipolytických a oxidativních enzymů (ochrana polynenasycených mastných kyselin) - minimalizace autooxidace Zajištění kvantitativních výsledků nutnost užití směsi mísitelných rozpouštědel: nepolárn rní (nejčast astěji uhlovodík) rozrušení hydrofobních a van der Waalsových interakcí s matricí polárn rní (alkohol) přerušení vodíkových a iontových vazeb na lipidy a polysacharidy 1

2 Přehled metod izolace a stanovení celkových lipidů Postup podle Štěpení Rozpouštědla vodíkových vazeb Soxhleta ne pentan, hexan, petrolether, chloroform, diethylether Grossfelda ano (HCl) diethylether Použitelnost vzorky s nízkým obsahem vody, hlavně neutrální lipidy vzorky s vysokým obsahem sacharidů (pečivo) Postup podle FOLCHE Štěpení vodíkových vazeb ano Rozpouštědla chloroformmethanol (2:1) Použitelnost vzorky s vyšším obsahem vody a polárních lipidů jako fosfolipidy a komplexní lipidy (maso a masné výrobky) Postup podle ROSEHO, GOTTLIEBA (přesn esná rozhodčí metoda!) Štěpení vodíkových vazeb ano (NH 4 OH) Rozpouštědla ethanol, diethylether, petrolether Použitelnost vzorky s vyšším obsahem vody a lipoproteinů, bílkovin a sacharidů (mléko a některé mléčné výrobky) 2

3 Postup podle Štěpení vodíkových vazeb Rozpouštědla Použitelnost Schmida, Bondzynskiho- Ratzlaffa ano (HCl) ethanol, diethylether, petrolether vzorky s vyšším obsahem vody a bílkovin (sýry, maso a masné výrobky) GRAVIMETRICKÁ KONCOVKA odpařen ení rozpouštědla, zvážen ení rezidua BĚŽNÉ TYPY EXTRAKTORŮ: aparatura dle SOXHLETA STANOVENÍ CELKOVÝCH LIPIDŮ RYCHLÝMI FYZIKÁLN LNÍMI METODAMI Metoda butyrometrická (Gerberova) - vzorek resp. tukové kuličky ky se hydrolyzují H 2 SO 4 - uvolněný ný tuk se po přídavku p 1-pentanolu1 (amylalkoholu)) odstřed edí - objem tuku se odečte na stupnici butyrometru (% hm.) - vhodné pro mléko, smetanu, sýry 3

4 Butyrometr na mléko A kalibrovaná stupnice,b tělo butyrometru C hrdlo butyrometru, D - zátka Metoda denzimetrická - extrakce 1,2-dichlorbenzenem - stanovení hustoty extraktu - odečet % tuku z kalibračního grafu (olejniny) modifikace: - stanovení dielektrické konst., - indexu lomu apod. Metoda nízkorozlišovací NMR spektrometrie Měření signálu pohyblivějších protonů kapalného podílu vzorku signál příslušející vodě se eliminuje kalibrací, vysušením, převedením do tuhé fáze... Použití: obsah oleje v semenech, extrakčních šrotech podíl tekutého podílu lipidů v emulzích, margarínech 4

5 A obalový pás vodíků tuhé fáze B ostrý pás vodíků kapalné fáze C plocha odpovídající podílu kapalné fáze M - frekvence Nízkorozlišovací NMR-spektrum jedlého tuku STANOVENÍ FUNKČNÍCH SKUPIN LIPIDŮ Klasické postupy charakterizace lipidů Tukové číslo kyselosti zmýdelnění Míra obsahu volných mastných kyselin veškerých mastných kyselin Vyjádření obsahu mg KOH na 1 g tuku nebo ml KOH (c = 1 mol.l -1 ) na 100 g tuku = stupeň kyselosti mg KOH na 1 g esterové esterově vázaných mastných kyselin mg KOH na 1 g Tukové číslo hydroxylové Míra obsahu hydroxylových skupin (parciálních esterů glycerolu) Vyjádření obsahu mg KOH na 1 g acetylovaného tuku jodové rhodanové dvojných vazeb polyenových mastných kyselin % halogenu (jako jod) vázaného lipidy % rhodanu (jako jod) vázaného lipidy 5

6 dienové Tukové číslo Reichertovo Weiselovo Polenského Míra obsahu konjugovaných mastných kyselin těkavých mastných kyselin (ve vodě rozpustných dtto ve vodě nerozpustných) Vyjádření obsahu % maleinanhydridu (jako jod) vázaného lipidy mg KOH na 1 g tuku Číslo jodové Na dvojné vazby lipidů se váže (aduje) halogen, jeho nespotřebované množství (vyjádřené jako jod) se stanoví titrací thiosíranem CH=CH + BrI CH CH Br I BrI + KI I 2 + KBr I Na 2 S 2 O 3 2 NaI + Na 2 S 4 O 6 Hanušova metoda: BrI Wijsova metoda: ICl existuje řada modifikací vždy je třeba specifikovat použitý postup metoda je nevhodná pro oxidované a polymerované lipidy Příklad hodnot jodového čísla: slunečnicový olej ~ 125 kokosový olej ~ 8 6

7 Číslo zmýdelnění zmýdelnění přebytkem KOH neutralizace HCl s použitím fenolftaleinu jako indikátoru stanovení K iontů vázaných v mýdlech pomocí titrace HCl na bromfenolovou modř Číslo kyselosti lipidy rozpuštěné v polárním rozpouštědle se titrují alkoholickým roztokem KOH (fenolftalein nebo thymolftalein) - posouzení rozsahu hydrolytického ho žluknutí (lipázy, technologické operace jako smažen ení...) Číslo hydroxylové rozpuštěné lipidy resp. volné hydroxylové skupiny se acetylují acetanhydridem (v prostředí pyridinu) stanoví se přírůstek obsahu esterových vazeb titrační metoda: CH2 -O-CO-R CH-O-CO-R CH2OH CH2 -O-CO-R + (CH3CO)2O CH-O-CO-R + CH3COOH CH2 -O-CO-CH3 Rozložení přebytku acetanhydridu, titrace uvolněné octové kyseliny: (CH 3 CO) 2 O + H 2 O 2 CH 3 COOH 2 CH 3 COOH + 2 NaOH 2 CH 3 COONa 7

8 spektrofotometrická metoda: -výpočet z rozdílu esterových vazeb před a po acetylaci (po rozložení přebytku acetanhydridu se tuk izoluje do rozpouštědla nemísitelného s vodou) a) vznik hydroxamových kyselin: CH2 -O-CO-R NOH NOH CH-O-CO-R + 2 NH2OH R -C + R -C + CH2OH OH OH CH2OH CHOH CH2OH b) vznik barevného produktu s železitými solemi: nebo R - C NOH N-O- 3 R - C + Fe3+ R - C Fe OH OH 3 NH-O- O 3 Fe CH2 -O-CO-R NOH NOH CH-O-CO-R + 3 NH2OH R - C + R - C + CH2 -O-CO-CH3 OH OH NOH CH3 - C + OH CH2OH CHOH CH2OH - charakterizace emulgátorů (parciálních esterů glycerolu); přítomnost ricinolejové kyseliny STANOVENÍ FRAKCÍ LIPIDŮ METODY SEPARACE podle uspořádání chromatografie v plošném uspořádání (TLC) sloupcová chromatografie HPLC (GLC) podle principu adsorpční chromatogarfie rozdělovací chromatografie ionexová chromatografie 8

9 Sorbenty používan vané pro LC frakcionaci lipidů deaktivovaný Florisil magnesium silikát (7 % vody) silikagel (5 10 % vody) oxid hlinitý (5 %) TLC Příklad 1. separace lipidů na silikagelu (Merck) vyvíjecí soustava: hexan Et 2 O k. octová (70 : 30 : 1) detekce: 2,7 - dichlorfluorescein / UV Sloupcová LC Příklad 2. Separace lipidů na koloně Florisilu (35 x 170 mm, 30 g, nm), eluce podle vzrůstající polarity ml elučního činidla hexan diethylether methanol skupina eluovaných lipidů uhlovodíky estery cholesterolu triacylglyceroly + volné mastné kyseliny volný cholesterol diacylglyceroly monoacylglyceroly 9

10 SEPARACE NEUTRÁLN LNÍCH LIPIDŮ - STRUKTURNÍ ANALÝZA TRIACYLGLYCEROLŮ Dělení TGA podle zastoupení mastných kyselin chromatografické metody (GC, HPLC) GC Požadavky na instrumentaci: možnost programování teploty až do o C injektor on-column FID nebo light scattering detektor Příklad 1: Dělení triacylglycerolů kokosového oleje na náplňové koloně s 1% JXR na Gas-ChromQ, teplota o C, 3 o C/min, nosný plyn: dusík 50 ml/min Příklad 2: separace máselného tuku na křemenné kapilární koloně (25 m x 0.25 mm) s relativcně polární stacionární fází TAP (0.1 μm), teplota o C, 3 o C/min, FID, vodík 2 ml/min 10

11 STANOVENÍ NEZMÝDELNITELNÝCH LÁTEKL které látky patří do této t to skupiny? extrahovatelné organickými rozpouštědly spolu s lipidy nerozkládají se za podmínek zmýdelnění ( = účinkem hydroxidů alkalických kovů) pigmenty (např. karotenoidy) uhlovodíky vyšší alifatické alkoholy steroly (volné, esterifikované, glykosidy) tokoferoly (minerální či silikonové oleje) STANOVENÍ CELKOVÉHO OBSAHU NEZMÝDELNITELNÝCH LÁTEK lipidy se zmýdelní (1 M KOH v ethanolu; 1 hod., 95 o C) nezmýdelnitelné látky se extrahují petroletherem nebo diethyletherem rozpouštědlo se odpařía odparek se zváží (gravimetrie) 11

12 STANOVENÍ FRAKCÍ NEZMÝDELNITELNÝCH LÁTEK Předběžná separace pomocí TLC, přednostně ale HPLC Příklad: HPLC separace nezmýdelnitelného podílu slunečnicového oleje (LiChrosorb Si-60, 250 x 4.6 mm; hexan isopropanol, 99 : 1), RID I neidentifikovaná frakce, II 4-monomethylsteroly, III Δ5-steroly, IV Δ7-steroly, V vnitřní standard (betulin) STANOVENÍ STEROLŮ Stanovení celkového obsahu sterolů lipidy se zmýdelní volné steroly se srazí digitoninem a stanoví vážkově RO CH 3 CH 3 CH 3 H O O OH CH 3 Digitonin R,R : 2 D-glukosa 2 D-galaktosa 1 L-xylosa R O Stanovení jednotlivých sterolů metodou GC lipidy se zmýdelní nezmýdelnitelný podíl se izoluje a rozdělí chromatografií na tenké vrstvěči pomocí HPLC vyšetřenípomocímetody GC (často po derivatizaci na trimethylsilylethery) Detekce: - běžně pomocí FID - identifikace podle retenčních časů - selektivněji pomocí hmotnostně spektrpometrického detektoru (MSD) zohlednění struktury 12

13 Příklad: Separace sterolů slunečnicového oleje pomocí kapilární GC/FID; kolona CP Sil 19 CB (25m x 0.32 mm); isotermně 265 o C 1 cholesterol, 2 campeterol, 3 campestanol, 4- stigmasterol, 5 Δ7 campesterol, 6 cholesterol, 7 β-sitosterol, 8 stigmastanol, 9 Δ5-avenasterol, 10 Δ5-24-stigmastadienol, 11 7Δ-stigmasterol, 12 7Δ-avenasterol Enzymová metoda stanovení cholesterolu Komerční kity pro volný cholesterol, vázaný je třeba uvolnit cholesterol + O2 cholesteroloxidasa 5-cholesten-3-on + H 2O2 H2O2 + CH3OH katalasa H-CH=O + 2 H2O H-CH=O + CH3-C-CH2-C-CH3 + NH3 O O acetylaceton H3CCO COCH3 + 3 H2O H3C N CH3 3,5-biacetyl-1,4-dihydrolutidin STANOVENÍ FOSFOLIPIDŮ Izolace tuhé vzorky extrakce směsí chloroform methanol, hexan isopropanol, dichlormethan methanol potřeba rozrušení lipid-proteinových komplexů oddělení od triacylglycerolů z roztoků v nepolárních rozpouštědel precipitace acetonem tekuté vodné vzorky směs methanolu a chloroformu vysolení fosfolipidy v organické vrstvě 13

14 STANOVENÍ CELKOVÉHO OBSAHU FOSFOLIPIDŮ Konverze organického fosforu na anorganický - lipidy se mineralizují na mokré cestě - fosfor se stanoví spektrofotometricky jako molybdenová modř (viz stanovení fosforu) STANOVENÍ SLOŽEN ENÍ FOSFOLIPIDŮ - FRAKCIONACE TLC na silikagelu chromogenní činidla: směs octanu měďnatého, kyseliny fosforečné a sírové (barva závisí na stupni nenasycenosti) molybdenové činidlo (reaguje s fosforem) Dragendorffovo činidlo (pro deriváty cholinu) ninhydrin (pro deriváty obsahující aminoskupinu) Extrakce na tuhou fázi (solid phase extraction, SPE) Oddělení fosfolipidů od neutrálních lipidů Princip SPE 14

15 Stacionární fáze Sep-Pak silica Sep-Pak silica Sep-Pak silica 10 ml chloroform 10 ml petrolether/diethyl ether (7:93) 30 ml methanol 40 ml hexan/diethylether (1:1) 20 ml methanol 20 ml CHCl 3 /CH 3 OH/H 2 O (3:5:2) 20 ml chloroform 30 ml methanol Mobilní fáze Frakce NL PL NL PL NPL PL Stacionární fáze Sep-Pak silica Bond-Elut aminopropyl Sep-Pak silica Bond-Elut silica chloroform aceton/methanol (9:1) chloroform/methanol (1:1) chloroform/2-propanol (2:1) k. octová/diethylether (2:98) methanol 10 ml petrolether/diethylether (95:5) 20 ml diethylether 10 ml methanol 30 ml hexan/diethylether (20:80) 30 ml methanol Mobilní fáze Frakce NL PL NL FFA PL TG PL NPL PL HPLC metody Příklad: Separace fosfolipidů kravského mléka kolona: Sperisorb (100 x 4.6 mm), hexan-2-propanol, detektor: evaporative light scattering 15

16 Stanovení trans mastných kyselin Trans- 9-octadecenoic acid (Elaidic acid) Cis- 9-octadecenoic acid (Oleic acid) ANTINUTRIČNÍ VLASTNOSTI STANOVENÍ MASTNÝCH KYSELIN Stanovení trans mastných kyselin INFRAČERVEN ERVENÁ SPEKTROMETRIE Absorbce při 967 cm -1, (10.34 µm) - deformace přilehlých C-H vazeb Příklad: Vyhodnocení infračerveného spektra při stanovení trans-vazeb; A absorbance, P,Q - korigovaná hodnota Stanovení konjugovaných mastných kyselin Mastné kyseliny a jejich estery s konjugovanými dvojnými vazbami (na rozdíl od polyenových kyselin) absorbují při: nm (konjugované dieny: -CH=CH-CH=CH nm (konjugované trieny: -CH=CH-CH=CH- CH=CH-) Stanovení SPEKTROFOTOMETRICKÉ 16

17 Stanovení esenciáln lních mastných kyselin ENZYMOVÉ Esenciáln lní mastné kyseliny a jejich estery se oxidují lipoxygenasou (linoleát:: O 2 oxidoreduktasa, EC ) na příslup slušné hydroperoxidy V rámci r fináln lního kroku se stanoví: úbytek O 2 manometricky absorbance při i 232 nm (absorbance konjugovaných hydroperoxidů) - spektrofotometrie Fe 3+ vzniklé oxidací Fe 2+ - spekrofotometrie Fe 2+ + R-O-O-H R Fe 3+ + RO + OH - Stanovení jednotlivých mastných kyselin STANOVENÍ POMOCÍ GC nižší mastné kyseliny se stanoví jako volné nebo po převedenp evedení na butylestery analýza mléčných výrobků Obecny postup: mastné kyseliny se převedou p před p GC analýzou na METHYLESTERY v rámci r následujn sledujících ch kroků (i) Zmýdelnění jsou-li mastné kyseliny vázány v v triacylglycerolech, fosfolipidech,, voscích ch apod., musí se uvolnit zmýdelněním var s cca 1M metanolickým KOH v inertní atmosféře) a následně extrakce do organického rozpouštědla (ii) Příprava methylesterů Esterifikace methanolem v přítomnosti p kyselého katalyzátoru toru BF 3 (Lewisova kyselina) Kyselá katalýza (HCl( HCl,, H 2 SO 4 ) basicky katalyzovaná reakce např. transesterifikace methoxidem sodným: R-COOH + CH 3 ONa RCOOCH 3 + R-OnR 17

18 Příklad: GC separace methyl esterů mastných kyselin máselného oleje, BPX kapilára (25 m x 0.32 mm), FID (1) 4:0, (2) 6:0, (3) 8:0, (4) 10:0, (5) 10:1, (6) 12:0, (7) 14:0, (8) 14:1 n-5, (9) iso 15:0, (10) anteiso 15:0, (11) iso 16:0, (13) 16:1 n-7, (14) 17:1, (15) 18:0, (16) 18:1 n-9 + n-7, (17) 18:2 n-6, (18) 18:3 n-3, (19) conj, 18:2, (20) 20:0 STANOVENÍ METODAMI HPLC volné mastné kyseliny malá detekční citlivost RID derivatizace - absorbce v UV (např. fenacylestery) Příklad: HPLC v reverzní fázi, kolona - µbondapak C- 18), mobilní fáze - acetonitril - voda (gradient) STANOVENÍ STUPNĚ ŽLUKLOSTI 18

19 STANOVENÍ STUPNĚ ŽLUKLOSTI Stanovení peroxidového čísla - indikace rozsahu žluklosti v úvodních fázích Hydroperoxidy mastných kyselin se stanoví JODOMETRICKY: ROOH + 2 I H + ROH + I 2 + H 2 O I Na 2 S 2 O 3 2 NaI + Na 2 S 4 O 6 Výsledky se vyjadřují jako peroxidové číslo (P.Č.) v mg aktivního kyslíku na 1 g tuku Stanovení p-anisidinového čísla - indikace fáze rozkladu hydroperoxidů (vznik off-flavour) p-anisidin reaguje s 2-alkenaly2 a jinými aldehydy za vzniku barevného produktu (Schiffovy( base), které se stanoví SPEKTROFOTOMETRICKY H 3C O NH 2 + O=CH-CH=CH-R H 3C O N=CH- CH CH R + H2O Výsledky se vyjadřují jako anisidinové číslo (absorbance při 400 nebo 430 nm, 1% roztoku tuku v 1 cm kyvetě) Stanovení thiobarbiturového čísla - indikace fáze rozkladu hydroperoxidů (vznik off-flavour) 2-thiobarbiturová kyselina reaguje s malondialdehydem a 2,4-alkadienaly za vzniku barevného produktu, stanovení SPEKTROFOTOMETRICKY SH N OH 2 + O=CH-CH2-CH=O N OH S N N OH HO CH-CH= CH OH HO N N SH Výsledky se vyjadřují jako thiobarbiturové číslo (absorbance při 530 nm, 1% roztok tuku v 1 cm kyvetě, nebo v mg malondialdehydu na 1 g tuku) 19

20 Stanovení obsahu polymerů - indikace tepelného namáhání (smažení) Vzorek se frakcionuje pomocí VYLUČOVAC OVACÍ (GELOVÉ PERMEAČNÍ) CROMATOGRAFIE Příklad: sójový olej po smažení - 1, 2 polymery, 2 TGA, 3 volné mastné k. SCE kolona (300 x 7.8 mm; PL-GelTM (póry = 100 Å) tetrahydrofuran, RI detektor STANOVENÍ STABILITY TUKŮ - různé typy testů podle využit ití daného tuku Schaalův test Lipidy se skladují při i zvýšen ené teplotě za přístupu vzduchu a stanoví se ve vhodných intervalech stupeň oxidace a určí se indukční perioda sledované změny: peroxidové číslo, přírůstek p hmotnosti, anisidinové číslo, těkavt kavé sloučeniny jednoduchý test, vyžaduje však v velké množstv ství vzorků,, zdlouhavý (4 aža 8 dní) Metoda aktivního kyslíku ku (AOM) Vzorek oleje se provzdušňuje při teplotě 100 o C oficielní metoda (AOAC) Metoda kyslíkové bomby pro stabilní tuky a oleje (např. fritovací, šorteningy, apod.) vzorek udržován při 135 o C, výchozí tlak kyslíku 110 psig, sleduje se pokles tlaku 2 10 x rychlejší než AOM 20

21 Expozice světlu pro různé typy výrobků jako bramborové lupínky, mléko apod. vzorek se ozařuje florescenčním světlem o intenzitě 7535 lux, teplota 30 o C sleduje se změna senzorické jakosti, příp. vznik těkavých sloučenin 21