SLEDOVÁNÍ INTERAKCE PROTINÁDOROVÉHO LÉČIVA DOXORUBICINU S AMINOKYSELINAMI. Ondřej Zítka

Transkript

1 1 SLEDVÁNÍ INTERAKCE PRTINÁDRVÉ LÉČIVA DXRUBICINU S AMINKYSELINAMI ndřej Zítka

2 Liga proti rakovině (LPR) 2 Nezisková organizace založena 199, Zakladatel prof. Zdeněk Dientstbier 212 lavním cílem je snížení úmrtnosti na zhoubné nádory v ČR. K dosažení tohoto cíle jsou tři hlavní dlouhodobé programy: prevenci nádorových onemocnění a výchovu ke zdravému způsobu života Den proti rakovině (letos vybráno 14, Kč) Protikuřácké výchovné programy Každoroční putovní výstavy Sympozium ke Světovému dni proti rakovině zlepšení kvality života onkologických pacientů Přístup k informacím o vlastní nemoci a poradenství (nádorová telefonní linka) Rekondiční pobyty, finanční podpora onkologickým organizacím podporu onkologického výzkumu a přístrojového vybavení onkologických pracovišť

3 istorie našich projektů LPR Studium hladiny metalothioneinu u pacientů se zhoubnými nádory a zdravých dobrovolníků (René Kizek) 28 - Bioanalytické možnosti monitorování oxidačního stresu u pacientů se zhoubnými nádory (René Kizek) 21 - Sarkosin, α-metylacyl-coa racemáza, prostatický specifický antigen a metalothionein jako nádorové markery u karcinomu prostaty, studie na nádorových buněčných liniích (Vojtěch Adam) Moderní nástroje zobrazování cíleného transportu protinádorových léčiv (Markéta Vaculovičová) Sledování interakce protinádorového léčiva doxorubicinu s aminokyselinami (ndřej Zítka) Dedikováno celkem 18 článků, cenění LPR za publikace z r. 28 (Vojtěch Adam)

4 Concentration of AA (µmol.ml -1 ) Téma výzkumu LPR Antracyklinové antibiotikum doxorubicin je velmi využívaný pro léčbu rakoviny Díky jeho kardiotoxicitě lze u pacientů často pozorovat srdeční selhání v důsledku nasazení chemoterapie Protože kardiotoxický efekt DX není dosud scela objasněn na molekulární úrovni rozhodli jsme se primárně studovat jeho interakce přímo s nejvíce se vyskytujícími AMK v myokardu (viz obrázek analýza obsahu AMK v srdci kuřete) Ser Lys Thr Ile Ala Val Gly Leu Asp Arg Glu Tau Pro Amino acid Amino acids Ser Lys Thr Ile Ala Val Gly Leu Asp Arg Glu Taur Pro Average (µmol.ml -1 )

5 Výzkumné cíle projektu LPR Cíle řešení červenec 213 květen 214: a) sledování interakcí doxorubicinu s aminokyselinami, tvořících myokard, pomocí multiinstrumentálních metod b) chemická příprava několika typů molekul pro cílený transport doxorubicinu liposomů a uhlíkových nanočástic c) sledování vlastností takto připravených nanotransportérů, zkoumání jejich potenciálu cíleně uvolňovat léčivo vlivem vnějších podmínek a in vivo uvolňování za využití multiinstrumentálních metod

6 a) sledování interakcí DX s AMK 6 C 3 DX C 3 C C 2 Complex formation C 3 DX/AA complex C C 2 + AA N N C C R Physiological conditions N C C R C 3 N Amide bond Schema možné interakce DX s AMK

7 Absorbance (AU) a) sledování interakcí DX s AMK 7 Pro sledování interakcí byla primárně použita metody UV-VIS spektrometrie DX poskytoval maximální absorbanci při λ = 48 nm Bya sledována Interakce aminokyseliny (1; 2; 3; 6; 12.; 25; 5; 1 µmol.ml -1 ) s doxorubicinem (1 µmol.ml -1 ) Při zvyšovaní koncentrace AMK byl pozorován výrazný pokles absorbance u Arg, Lys, Ala, Val, což značí na interakci. Naopak menší nebo žádný pokles byl zaznamenán u všech ostatních aminokyselin. 1,,9,8,7,6,5,4 Absorbance (AU) Arginine,3,2,1, Wavelength (nm)

8 RT: RT: RT: 94.9 Relative AUC a) sledování interakcí DX s AMK 8 Abychom získaly detailnější přehled použili jsme ke studiu interakcí iontově výměnnou kapalinovou chromatografii (IELC) Podobně jako u předchozího studia jsme pozorovali interakci u Ser, Lys, Ala, Val, ale navíc byla také pozorovna inteakce u Pro, Gly, Tau, Thr, Asp, Glu, Ile, aleu 12% 1% 8% 6% 4% 2% % Arginine Concentration of DX (µg.ml -1 ) Retention time (min.) ( Expression of retention time changes (min); x real curve of a sample and calculated overlay expressing amino acids breaking points.)

9 Concentration of DX (µg.ml -1 ) Concentration of AA (µmol.ml -1 ) a) sledování interakcí DX s AMK Nejnižší koncentrace DX pro interakci (IELC) AMK (1 µmol.ml -1 ) Nejnižší koncentrace AMK pro interakci (UV-VIS) DX (1 µmol.ml -1 ) Ser Val Ala Arg Lys Asp Thr Leu Pro Tau Ile Gly Glu Ser Val Ala Arg Lys Asp Thr Leu Pro Tau Ile Gly Glu Amino acid Amino acid Stanovení zlomového bodu interakce DX s AMK matematická analýza

10 Concentration of AA (µmol.ml -1 ) Ser Lys Thr Ile Ala Val Gly Leu Asp Arg Glu Taur Pro Concentration differences (%) a) sledování interakcí DX s AMK 1 Porovnání kuřecího srdce před (A) a po (B) aplikaci 1 μg.ml -1 doxorubicinu rozpuštěného ve fyziologickém roztoku. Fluorescence byla detekována pomocí Carestream In-Vivo Xtreme Imaging System. Koncentrace AMK byla stanovena pomocí IELC (C). A C Before DX application After DX application B 8 Amino acid 4 Ser Lys Thr Ile Ala Val Gly Leu Asp Arg Glu Taur Pro Amino acid

11 b) příprava molekul pro cílený transport Výsledky pro projekt LPR 213 jsou dosud jen částečně zpracovány 11 C B 3 2 b Concenctration of doxorubicin [μg.ml-1] Liposome Liposome Lipo 1 +SDS Lipo 1 Lipo 9 +SDS 12.5 Lipo 9 E a liposome 1 Tisíce liposome 9 Lipo 8 +SDS 4 liposome 8 Cholesterol Concentration doxorubicine [µg.ml-1] 5 Phospholipid bilayer Fluorescence intensity [13a.u.] D Average concentration of cholesterol [mmol.l-1] Doxorubicin Lipo 8 A Liposome 1 With SDS 12, , Concenctration of doxorubicin [μg.ml-1]

12 Current [µa] Concentration doxorubicine(µg.m L -1 ) Lip 8 Lip 9 Lip 1 Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] b) příprava molekul pro cílený transport 12 Výsledky pro projekt LPR 213 jsou dosud jen částečně zpracovány A x Liposome 1 with doxorubicin (1 µg.ml -1 ) + DB Liposome 1 + DB Liposome 9 with doxorubicin (1 µg.ml -1 ) + DB Liposome 9 + DB Liposome 8 with doxorubicin (1 µg.ml -1 ) + DB Liposome 8 + DB Doxorubicin (1 µg.ml -1 ) + DB DB matrix x [doxorubicin+] m/z 2 1 B m/z C 1 5 (nd) Liposome 1 [85 µg.ml -1 ] Liposome 9 [86 µg.ml -1 ] Liposome 8 [8 µg.ml -1 ] a b c d 3 2 DX 5 µg.ml -1 1 µm 1 µm 1 µm 1 µm e f g h Time [min] 1 µm 1 µm 1 µm 1 µm

13 Relative growth Relative growth Relative growth IC 5 [µm] c) In Vivo studium nanotransportu DX 13 výsledky pro projekt LPR 213 dosud nejsou zcela zpracovány A 3% 2% 1% % Time [h] B 3% 2% 1% % Time [h] C 3% 2% 1% % Time [h] D liposome 8 liposome 9 liposome Time [h] br.3: Růstové křivky vyhodnocení antimikrobiálního účinku doxorubicinu uzavřeného v liposomech. Účinek látky se testoval na bakteriální kultuře Staphylococcus aureus (S.a.) pomocí přístroje Multiskan EX. Měření probíhalo po půlhodinových intervalech při teplotě 37 C a při vlnové délce 62 nm. Všechny grafy obsahují růstové křivky pro samostatný doxorubicin (1μg.mL -1 ) a S.a. ( ) (A) růstové křivky doxorubicinu uzavřeného v liposomu 8. (B) růstové křivky doxorubicinu v liposomu 9. (C) růstové křivky doxorubicinu v liposomu 1. (D) hodnoty IC 5 (µm) pro doxorubicin v liposomech. Koncentrace doxorubicinu ve vzorcích byla ( ), 12.5 ( ), 25 ( ) a 5 ( ) μg.ml -1. () rozdíly v hodnotách jsou statisticky významné (na hladině významnosti α =.5). (ns) rozdíly v hodnotách nejsou statisticky významné (α =.5).

14 Poděkování 14 grantové agentuře Liga proti rakovině Praha za poskytnutí finančního daru 26 tis Kč. podpůrným spoluřešitelům Michal Masařík, Petr Babula, Marie Stiborová, Tomáš Eckschlager, spolupracovníkům laboratoře Metalomiky a Nanotechnologií vedoucí René Kizek

15 Děkuji Vám za Vaši pozornost 15

16 Determination of breaking points of amino acids 16 For the function calculating the breaking points of amino acids, following variables were defined: a for absorbance (y-axis), l for lowest point on y-axis, u for uppermost point on y-axis, k for slope of curve, i for log breakpoint position and c for concentration of doxorubicin. Using these variables, the relation of doxorubicin concentration and absorbance can be expressed as it follows: a = l u l 1+1k i c To fit the curve, variables l, u, k and i were calculated using the least squares method. Consequently, breakpoint (b) was subsequently calculated according to: b = 1 i Macro in Microsoft Excel using a solver tool was used to create the fit of the curve and to calculate the breaking points of individual amino acids

17 C B 3 2 b Concenctration of doxorubicin [μg.ml-1] Liposome Liposome Lipo 1 +SDS Lipo 1 Lipo 9 +SDS 12.5 Lipo 9 E a liposome 1 Tisíce liposome 9 Lipo 8 +SDS 4 liposome 8 Cholesterol Concentration doxorubicine [µg.ml-1] 5 Phospholipid bilayer Fluorescence intensity [13a.u.] D Average concentration of cholesterol [mmol.l-1] Doxorubicin Lipo 8 A Liposome 1 With SDS 12, , Concenctration of doxorubicin [μg.ml-1] Schéma jednotlivých liposomů, stanovení cholesterolu v liposomech na přístroji BS-4 a změření fluorescence doxorubicinu v liposomech pomocí přístroje In-vivo Xtreme. Absorbance cholesterolu byla měřena 6 min při 55 nm. Pro výpočet koncentrace cholesterolu bylo použito hodnoty absorbance reagencie R1 a hodnoty absorbance roztoku po 6 min inkubace se vzorkem. (A) liposom 8; obsahuje 1 mg cholesterolu. (B) liposom 9; obsahuje 5 mg cholesterolu. (C) liposom 1 neobsahuje cholesterol. (D) koncentrace cholesterolu naměřené v liposomech 8, 9 a 1 při různých koncentracích uzavřeného doxorubicinu. (E) fluorescence vzorků liposomů s koncentrací doxorubicinu postupně, 25, 5 a 1 µg.ml-1. Na mikrotitrační destičku Nunc bylo vždy pipetováno 2 µl vzorku a vody (nebo SDS 3 mm) v poměru 1:1. Vlnová délka excitačního záření byla 6 nm. () rozdíly v naměřených hodnotách jsou statisticky významné (na hladině významnosti α =.5). (ns) not significant rozdíly v naměřených hodnotách nejsou statisticky významné (na hladině významnosti α =.5).

18 Current [µa] Concentration doxorubicine(µg.ml -1 ) Lip 8 Lip 9 Lip 1 Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] A x Liposome 1 with doxorubicin (1 µg.ml -1 ) + DB Liposome 1 + DB Liposome 9 with doxorubicin (1 µg.ml -1 ) + DB Liposome 9 + DB Liposome 8 with doxorubicin (1 µg.ml -1 ) + DB Liposome 8 + DB Doxorubicin (1 µg.ml -1 ) + DB DB matrix x [doxorubicin+] m/z 2 1 B m/z C 1 5 (nd) Liposome 1 [85 µg.ml -1 ] Liposome 9 [86 µg.ml -1 ] Liposome 8 [8 µg.ml -1 ] a b c d 3 2 DX 5 µg.ml -1 1 µm 1 µm 1 µm 1 µm e f g h Time [min] 1 µm 1 µm 1 µm 1 µm Ve všech zde uvedených analýzách byly hodnoceny liposomy s nejvyšší vloženou koncentrací doxorubicinu (1 µg.ml -1 ) (A) Na obrázku jsou znázorněny hmotnostní spektra (získána pomocí MALDI-TF) jednotlivých liposomů jak samotných tak s enkapsulovaným doxorubicinem, dále také samotný liposom a matrice použitá k analýze. Na vloženém obrázku je detail spekter pro molekulovou hmotnost doxorubicinu. (B) Celkový obsah enkapsulovaného doxorubicinu byl stanoven pomocí PLC-ED. Zde jsou zobrazeny chromatogramy z této analýzy a na vloženém grafu je uvedeno porovnání stanoveného obsahu doxorubicinu. (C) Mikroskopické snímky bakterie Staphylococcus aureus po inkubaci doxorubicinu v liposomech (lympus IX71, Tokyo, Japan): a, b, c, d: ambient light; e, f, g, h: fluorescenční snímky (excitace: nm; emise: 58 nm); a, e: Liposome 8; b, f: Liposome 9; c, g: Liposome 1; d, h: Staphylococcus aureus bez lipozomu