CHARAKTERIZACE A MECHANISMY

Transkript

1 MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE CHARAKTERIZACE A MECHANISMY VZNIKU NEURÁLNÍCH PREKURZORŮ IN VITRO STUDIE Diplomová práce Veronika Pánská Vedoucí práce: RNDr. Josef Večeřa, Ph.D. Brno 2014

2 Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Bc. Veronika Pánská Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Charakterizace a mechanismy vzniku neurálních prekurzorů in vitro studie Experimentální biologie Speciální biologie RNDr. Josef Večeřa, Ph.D. Akademický rok: 2013/2014 Počet stran: 78+1 Klíčová slova: Kmenové buňky; neurální kmenové buňky; neurogeneze; neurosféry; HIF-1α; imunochemické metody

3 Bibliographic Entry Author Title of Thesis: Bc. Veronika Pánská Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Characterization and mechanism of formation of neural progenitors in vitro study Degree programme: Field of Study: Supervisor: Experimental Biology Special Biology RNDr. Josef Večeřa, Ph.D. Academic Year: 2013/2014 Number of Pages: 78+1 Keywords: Stem cells; neural stem cells; neurogenesis; neurospheres; HIF-1α; immunochemical methods

4 Abstrakt V této diplomové práci jsme se věnovali kultivaci a analýze neurosfér, které v in vitro podmínkách vznikají z neurálních kmenových a progenitorových buněk (NSPC), v našem případě odvozených z pluripotentních embryonálních kmenových buněk. Neurosféry slouží jako ideální model pro studium raného vývoje nervové soustavy. V této práci jsme využili několika různých mtodických pro charakterizaci vzniku a udržení neurálních vlastností NSPC. Zkoumali jsme také vliv transkripčního faktoru HIF-1α na tyto buňky, jelikož jeho fyziologická funkce je mimojiné spojována právě s kmenovostí NSPC, ale není příliš probádána. Abstract In this thesis we studied cultivation and analysis of neurospheres, which in vitro arise from neural stem and progenitor cells (NSPC) derived from mouse pluripotent embryonic stem cells (ESC). Neurospheres serve as convenient model for early neural development studies. We used several methodological approaches for characterization of origin and preservation of neural atributes of NSPC. We also studied the importance of transcription factor HIF-1α for these cells as physiological role of HIF-1α is associated with fate of NSPC. However, this regulation is not well described yet.

5

6

7 Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat vedoucímu práce RNDr. Josefu Večeřovi, Ph.D. za cenné rady, časté konzultace, vstřícnost a především trpělivost během vypracování diplomové práce. Ráda bych také poděkovala mému konzultantovi Mgr. Jiřímu Pacherníkovi, Ph.D. za jeho přínosné rady a pomoc. Dále bych chtěla poděkovat kolegům Mgr. Janu Kučerovi a Bc. Julii Musilové za úvod do metody western blot a Mgr. Haně Kolářové, Ph.D. za umožnění přístupu ke konfokálnímu mikroskopu BFÚ. V neposlední řadě velký dík patří všem kolegům z Ústavu fyziologie a imunologie živočichů za vytvoření přátelské atmosféry. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 16. května 2014

8 Obsah Úvod Teoretická část Neurogeneze in vivo Kmenové buňky Niche Niche a koncentrace kyslíku Signální dráha Notch Embryonální kmenové buňky Neurální kmenové buňky Molekulární charakterizace NSC Neurální kmenové buňky a HIF-1α Význam dráhy Notch u neurálních kmenových buněk Vybrané molekulární vlastnosti ESC a NSC BLBP LewisX Mash Nanog Nestin Pax Sox geny podskupiny B Cíle práce Metody Použité buněčné linie a jejich kultivace Použité buněčné linie Kultivace ESC Kultivace neurosfér Média, pufry a doplňové složky Imunochemické metody Příprava primárních protilátek z hybridomů Použité primární protilátky a pufry Imunocytochemická analýza pomocí průtokové cytometrie Imunocytochemická analýza pomocí fluorescenčního mikroskopu

9 Použité pufry a gely Analýza obrazu s ImageJ Statistika Výsledky Analýza obrazu hodnocení velikostí a počtu neurosfér Distribuce počtu neurosfér podle jejich velikosti Vliv absence HIF-1α na počet neurosfér Vliv absence HIF-1α na proliferaci a distribuci NSPC Imunocytochemická analýza povrchových a vnitrobuněčných znaků pomocí fluorescenční mikroskopie Imunocytochemická analýza vybraných povrchových a vnitrobuněčných znaků průtokovou cytometrií Imunocytochemická analýza vybraných povrchových a vnitrobuněčných znaků metodou Western blot Diskuze Závěr Seznam použitých zkratek Citace Přílohy

10 Úvod Neurální kmenové buňky jsou nediferencované buňky se schopností dát vznik širokému spektru buněk nervového systému. Během neurogeneze jsou tyto neurální kmenové buňky poprvé přítomny v neurální ploténce, dále ve vývoji i v nervové trubici a embryonálním mozku. V rámci embryonálního vývoje tyto kmenové buňky maturují a tvoří další podtypy neurálních kmenových, progenitorových a diferencovaných buněk. V in vitro podmínkách lze z neurálních kmenových a progenitorových buněk (ať už izolovaných z embryonálních mozků či derivované z embryonálních kmenových buněk) kultivovat charakteristické sféroidní útvary - neurosféry. V podmínkách odrážejících embryonální vývoj lze z embryí derivovat vývojově odlišné primitivní a definitivní neurální kmenové/progenitorové buňky. Tyto buňky se liší expresí charakteristických proteinů, které odrážejí jejich proliferační schopnosti a neurální charakter. Na základě těchto informací jsme se snažili zhodnotit vznik primitivních a definitivních neurosfér a popsat jejich proliferační a neurální vlastnosti. Zajímal nás především vliv transkripčního faktoru HIF-1α na vlastnosti neurálních kmenových/progenitorových buněk a z nich vzniklých neurosfér. K hodnocení morfologických a dynamických vlastností neurosfér byla použita metoda analýzy obrazu. K hodnocení vývojových stádií NSPC na základě specifických proteinových markerů byly použity imunochemické metody s analýzou - na průtokovém cytometru, fluorescenčním mikroskopu a pomocí metody western blot. 10

11 1. Teoretická část 1.1. Neurogeneze in vivo Počátkem vývoje nervového systému je proces tzv. neurální indukce a tvorba neurální ploténky. Názory na tento mechanizmus nejsou jednotné. Historicky prvním názorem na počátek neurální indukce je inhibice kostního morfogenetického proteinu 4 (BMP4 bone morphogenetic protein 4) pomocí proteinů jako Noggin (Fürthauer et al., 1999; Zimmerman et al., 1996), Follistatin (Fainsod et al., 1997) nebo Chordin (Piccolo et al., 1996; Sasai et al., 1994) exprimovaných organizérem, který během vývoje vzniká jako součást primitivního proužku (Beddington, 1994). Mnoho autorů se přiklání k možnosti, že inhibice BMP4 není dostatečným impulzem pro vznik neurální indukce. Mezi další možné vlivy se zařadil pozitivní účinek FGF signalizace (FGF fibroblast growth factor, fibroblastový růstový faktor) (Streit et al., 2000), inhibice signalizace Wnt (Wingless/Int-1) nebo i propojení těchto dvou signálních drah (shrnuto, Wilson a Edlund, 2001), čímž by mohlo docházet ke snížení exprese Bmp (Bainter et al., 2001). Není však doposud znám jasný scénář této časné vývojové etapy nervového systému. První definovanou strukturou nervového systému je nervová trubice vznikající procesem neurulace. Před neurulací se rozdělí buňky ektodermu na základě signálu neurální indukce (viz výše). Rozdělí se na budoucí epidermis, buňky neurální lišty a buňky neurální ploténky. Z buněk s neurálním charakterem vzniká neurální ploténka, která se vlivem prodlužování buněk zvětší oproti zbylým ektodermálním strukturám. Dojde k zesílení okrajů ploténky, jejich zvednutí a fúzi (Obr. 1). Vzniká dutá trubice, která v hlavové části embrya mohutní. Zde se začínají tvořit tři primární mozkové váčky prosencephalon, mesencephalon a rhombencephalon (Gilbert, 2000; Stiles a Jernigan, 2010). K rozčlenění nervové trubice v rámci celého embrya dochází ve směru anteriorně-posteriorním v oblasti mozku pod vlivem faktorů rodiny Pax (Paired box; Thompson a Ziman, 2011), dále anteriorně od zadního mozku až po ocasní část vlivem Hox genů (Hox - homeoboxový), kyseliny retinové a signalizace Wnt. Dorzo-ventrální rozdělení trubice je způsobeno protichůdným gradientem faktorů rodiny 11

12 transformujících růstových faktorů β (TGF-β transforming growth factor beta) (příp. také signalizace Wnt), Pax a Shh (Sonic hedgehog) (Borgeset al., 2001; Noback, 2005; Petros et al., 2011). Obr.1: Tvorba nervové trubice u myši mezi 7, dnem embryonálního vývoje (E7.5 E10.5). (A) Rozdělení neurální ploténky, (B) zvedání valů neurální ploténky, (C) ohýbání a přibližování valů, (D) fúze valů a zanoření nově vzniklé nervové trubice. MHP a DLHP představují panty ohybu neurální ploténky (upraveno podle URL1) Samotná nervová trubice se během vývoje morfologicky proměňuje od své vnitřní části (lumen) až po bazální membránu. Na počátku působí vícevrstevně, tvoří ji však jedna vrstva neuroepiteliálních buněk, u nichž dochází k typické jaderné migraci dělících se buněk (Götz a Huttner, 2005; Rao, 2006). Později se dělí na vrstvu 12

13 ventrikulární (VZ ventricular zone) obklopující lumen, subventrikulární (SVZ subventricular zone), intermediální a marginální (pod bazální membránou). Aktivně se dělící buňky se nachází ve ventrikulární vrstvě (Noback, 2005). Mezi neurální kmenové buňky (NSC neural stem cells) řadíme neuroepiteliální buňky neurální ploténky (Haubensak et al., 2004), z nich vznikající radiální gliové buňky ventrikulární vrstvy (RGC radial glial cell) (Anthony et al., 2004) a astrocytům podobné kmenové buňky přítomné v dospělém mozku (vznikající z RGC) (Merkle et al., 2004). V CNS (centrální nervové soustavě) se jak v rámci embryogeneze, tak v dospělosti objevují v subventrikulární vrstvě tzv. intermediální progenitory, které navyšují svým symetrickým dělením počet buněk v mozku a předpokládá se, že mají oproti NSC omezený potenciál sebeobnovy (Miyata et al., 2004) (Obr.2). Symetrické a asymetrické dělení kmenových buněk je popsáno v kapitole 1.2. Obr.2: Změna podoby neurálních kmenových buněk během vývoje. Modře jsou znázorněny NSC, zeleně pak intermediální progenitory. (A) Na počátku vývoje tvoří 13

14 neuroepiteliální buňky svým symetrickým dělením jednovrstevné epitelium a již od tohoto momentu vznikají rané neurony. (B) Neuroepiteliální buňky se mění v embryonální radiální gliové buňky spojující svými dlouhými výběžky ventrikulární a piální povrch. RGC pak přímo tvoří neurony a oligodendrocyty nebo případně nepřímo skrze intermediální progenitory uložené v SVZ. (C) RGC zůstávají i v neonatálním mozku, kde tvoří oligodendrocyty, interneurony, ependymové buňky a astrocyty. (D) V dospělém mozku přebírají funci NSC právě astrocytům podobné buňky, které vznikly z RGC. Často mají stejně jako RGC dlouhé buněčné výběžky, které spojují ventrikulární povrch a bazální laminu cév. Stri striatum, SVZ subventrikulární vrstva, VZ ventrikulární vrstva (upraveno podle Merkle a Alvarez-Buylla, 2006) Kmenové buňky Výzkum kmenových buněk a jejich terapeutického potenciálu našel největší uplatnění po uvedení izolace lidských embryonálních kmenových buněk z vnitřní buněčné masy blastocysty (Thompson et al., 1998). Studium kmenových buněk brzy zaujalo jednu z předních příček výzkumu za účelem využití při léčbě neurodegenerativních, kardiovaskulárních onemocnění, rakovině, cukrovce atd. Charakteristickou vlastností kmenových buněk je jejich schopnost sebeobnovy a schopnost diferenciace. Existují ve většině tkání těla, tvoří však ale jen mizivé procento celkového složení buněk (okolo 1-2%). Kmenové buňky lze dělit podle jejich potenciálu. Největší potenciál mají totipotentní buňky, které jsou součástí zygoty a mohou vytvořit embryo i s trofoblastem. Zástupcem pluripotentních buněk jsou embryonální kmenové buňky (ESC - embryonic stem cells) se schopností utvořit všechny buňky tří zárodečných vrstev ektodermu, mezodermu a endodermu. Multipotentní buňky mají již omezený diferenciační potenciál a mohou vytvořit omezenou škálu buněk (např. neurální kmenové buňky). Unipotentní buňky mohou tvořit pouze jediný typ buněk (např. epidermální buňky) (shrnuto, Alison et al., 2002; Preston et al., 2003). Pro kmenové buňky je typické asymetrické dělení, díky němuž mohou vznikat dvě rozdílné buňky. Jednou je buňka diferencovaná a druhá buňka kmenová se stejnými vlastnostmi jako měla buňka mateřská (shrnuto, Watt a Hogan, 2000; Preston et al., 2003). K symetrickému dělení často dochází v souvislosti se zvětšením počtu 14

15 kmenových buněk, protože během něj dochází k tvorbě dvou stejných dceřiných buněk (Obr.3) (Conti et al., 2005). K dělení kmenových buněk dochází ve specializovaných oblastech mnoha tkání, tzv. niche (Dingli et al., 2007). Obr.3: Symetrické vs. asymetrické dělení kmenových buněk. Z mateřské kmenové buňky vzniká asymetrickým dělením jedna buňka kmenová a druhá a diferencovaná. Kmenová buňka se také může dělit symetricky, čímž vzniknou dvě stejné dceřiné kmenové buňky identické s mateřskou. Symetrické diferenciační dělení dává vznik dvěma stejným dceřinným buňkám, které už se však odlišují od buňky mateřské (upraveno podle URL2) Niche Niche je místem typickým pro kmenové buňky a jedná se o mikroprostředí s kombinací buněk a extracelulárních komponent vhodných pro kmenovou buňku dané tkáně. Ta je zde ovlivňována jak sekretovanými faktory (např. TGF-β, Wnt), tak interakcí s okolními buňkami (velkou roli zde hraje např. Notch signalizace) a extracelulární matrix (shrnuto, Alison et al., 2002; Preston et al., 2003). Toto prostředí ovlivňuje všechy důležité komponenty života kmenové buňky jako je proliferace, diferenciace nebo maturace (shrnuto, Watt a Hogan, 2000). 15

16 Niche a koncentrace kyslíku Niche může obsahovat různé množství kyslíku. Existují buněčné typy vyžadující nízkou hladinu kyslíku hypoxii, stejně tak existují typy obývající dobře okysličené niche (Obr. 5) (Simon a Keith, 2008). Konkrétně neurální kmenové buňky mají ve svém niche mezi 1-8% O 2 (Dings et al., 1998). Obr. 5: Různé populace kmenových buněk osidlují niche s různou koncentrací kyslíku. (A) Grafické znázornění kmenových buněk vyžadujících hypoxii a (B) kmenových buněk, které naopak vyžadují kyslík ve vyšší koncentraci (upraveno podle Simon a Keith, 2008). Pro regulaci buněčné odpovědi na hypoxii buňky exprimují tzv. hypoxií indukované faktory (HIF). HIF patří do rodiny transkripčních faktorů s podobou bhlh- PAS (basic helix-loop-helix-per-arnt-sim), obsahující členy HIF-1, HIF-2 a HIF-3 (Wang a Semenza, 1995; Hogenesch et al., 1997; Gu et al., 2000). Během hypoxie dochází ke stabilizaci HIF-α podjednotky, dimerizaci s HIF-1β a přesunu do jádra, kde je spuštěna exprese cílových genů ovlivňujících angiogenezi, proliferaci a přežití nebo glukózový metabolismus (Obr.6). Během normoxie dochází k proteozomální degradaci faktoru HIF-1α a signální dráha je zablokována (Semenza, 1999; Lu a Kang, 2010). 16

17 Obr.6: V normoxii dochází vlivem prolylhydroxylázy (PHD) k hydroxylaci prolinových zbytků HIF-1α. Hydroxylovaný HIF-1α interaguje s von Hippel Lindau proteinem (VHL), je označen ubiquitinem (Ub) a je proteazomálně degradován. Za hypoxických podmínek však k této degradaci nedochází a stabilizovaný HIF-1α v jádře dimerizuje s HIF-1β, kde po navázání na HRE (hypoxia-responsive) spouští transkripci cílových genů, jejichž shrnutí se nachází v pravé části ilustrace (upraveno podle Lu a Kang, 2010). Dostupnost kyslíku ovlivňuje v buňce také další procesy jako je regulace aktivity Notch a Wnt signálních drah nebo exprese Oct4. Během hypoxie dochází k vazbě HIF-2α na promotor Oct4 a spuštění jeho exprese, čímž je pozitivně ovlivněna pluripotence (Hu et al., 2003; Covello et al., 2006) Signální dráha Notch Notch signalizace je evolučně konzervovaný mechanismus pro buněčnou interakci (shrnuto, Artavanis-Tsakonas et al., 1999) a hraje důležitou úlohu v regulaci osudu buněk. Po navázání ligandu Delta (pro neurogenezi nejdůležitější konkrétně Delta1) exprimovaného na buněčné membráně na Notch receptor sousedící buňky dojde k rozštěpení tohoto receptoru a uvolnění jeho intracelulární domény (NICD Notch intracellular domain) do cytoplazmy. NICD se přesouvá do jádra, kde se váže na RBP- Jk (označovaný také jako CBF-1/CSL) a spouští se exprese cílových genů, mezi které 17

18 patří Hes (hairy and enhancer of split) a Hey (Hairy Ears, Y-Linked) geny (shrnuto, Andersson et al., 2011). Tyto geny blokují expresi transkripčních efektorů jako Neurogenin2 (Ngn2) (Cornell a Eisen, 2002), Mash1 (myší ASCL1) (de la Pompa el al., 1997) a MyoD (Myogenic differentiation; Kopan et al., 1994), čímž brání diferenciaci buněk. Ligand Delta-like1 (Dll1) je exprimován po indukci proneurálními geny Mash1 a Ngn2 (Obr.4). Vlivem exprese Dll1 v jedné buňce a spuštění signalizace Notch v buňce sousedící dochází k rozdílné expresi cílových genů a tedy rozdílnému charakteru buněk (Castro et al., 2006). Tento jev se nazývá laterální inhibice (Artavanis-Tsakonas et al., 1999). Obr.4: Schéma signalizace Notch. Po navázání ligandu Delta1 na receptor Notch dochází k uvolnění NICD z membrány a jejímu vcestování do jádra, kde tvoří komplex s proteinem Rbpj a transkripčním koaktivátorem Maml (Mastermind-Like). Tento finální komplex aktivuje expresi transkripčních represorů, např. Hes1 a Hes5. Ty poté potlačují expresi proneurálních genů (Mash1, Ngn2) a Dll1. Exprese Dll1 je indukována proneurálními geny buňkou, která nemá aktivovaný Notch receptor. Numb funguje jako inhibor dráhy Notch (upraveno podle Shimojo et al., 2011) Embryonální kmenové buňky Objev embryonálních kmenových buněk se datuje do roku 1981, kdy vědci Martin Evans a Matthew Kaufman zaměřili svoji pozornost na buňky myšího 18

19 preimplantačního embrya, které jsou díky svojí pluripotenci schopné tvořit chiméry a teratokarcinomy (Obr. 7) (Evans a Kaufman, 1981). Ke stejným výsledků přišel i Gail R. Martin, který tyto ESC izolované z blastocysty kultivoval v médiu kondiciovaném teratokarcinomálními buňkami (Martin, 1981). Obr.7: Izolace kmenových buněk z myší blastocysty, která vznikla z oplozeného vajíčka přes osmi buněčné totipotentní stádium. Izoluje se vnitřní buněčná masa (ICM inner cell mass) blastocysty a tyto buňky lze jako pluripotentní ESC kultivovat (upraveno podle URL3). Jak již bylo zmíněno dříve, lidské pluripotentní embryonální buňky si musely na svůj objev Thomsonem a kolektivem počkat až do roku Na základě tohoto objevu bylo možné srovnat mesc (murine ESC myší ESC) a hesc (human ESC lidské ESC). Jedná se například o rozdílnou expresi SSEA-1, SSEA-3 a SSEA-4 (SSEA - stage specific embryonic antigen antigen specifický pro stádium). mesc exprimují pouze SSEA-1, lidské naopak pouze SSEA-3 a SSEA-4. Pro kultivaci hesc je nutná přítomnost FGF2, pro myší ESC je nutná přítomnosti faktoru inhibujícího leukemii (LIF leukemia inhibitory factor) (Thomson et al., 1998; Ginis et al., 2004). Podmínky kultivace myších ESC se během let měnily a přes nejrůzněji kondiciovaná média byl objeven pro ESC důležitý cytokin výše zmíněný LIF (Smith 19

20 et al., 1988), který se váže na receptor gp130 a LIF receptor (Yoshida et al., 1994). Navázáním dojde ke spuštění dráhy skrze JAK (Janusova kináza) a aktivaci STAT3 (signální transduktor a aktivátor transkripce) společně s kaskádou MAPK (proteinová kináza aktivovaná mitogenem) a dochází k udržení programu sebeobnovy (Takahashi- Tezuka et al., 1998). Aktivace STAT3 vlivem LIF a sérové podmínky v médiu byly stanoveny jako ideální pro sebeobnovu ESC (Niwa et al., 1998; Matsuda et al., 1999). Pluripotence ESC je závislá na třech důležitých faktorech Oct4, Sox2 (SRY (Sex Determining Region Y)-Box) a Nanog (Niwa et al., 2000, Avilion et al., 2002; Mitsui et al., 2003). Vlivem Oct4, Sox2 a dalších dvou faktorů se roku 2006 podařilo reprogramovat diferencované buňky na tzv. indukované pluripotentní kmenové buňky (Takahashi a Yamanaka, 2006). Shinya Yamanaka byl v roce 2012 za tento objev společně se Sirem Johnem Gordonem oceněn Nobelovou cenou v oblasti Fyziologie a medicíny Neurální kmenové buňky Vznik neurálních kmenových buněk v in vivo podmínkách je popsán v kapitole 1.1. Jako model pro studium vlastností a vývoje NSC se používá in vitro technika pro tvorbu plovoucích neurosfér derivovaných z ESC nebo z NSC izolovaných z neurogenních zón CNS (Pacey et al., 2006). Tvorba velkých sféroidů je podpořena i migrací buněk, která je umožněna specializovanými podii (Mori et al., 2007). Tento pohyb napomáhá spojování neurosfér ve velké agregáty, které se vyznačují velmi vysokou heterogenitou (Wang et al., 2006b). Heterogenita neurosfér je také způsobena buňkami v rozdílném diferenciačním stádiu, které ji tvoří. Neurosféra je tak tvořena neurálními kmenovými buňkami, neurálními a gliálními progenitory (Suslov et al., 2002). Navíc je zřejmé, že s rostoucí velikostí neurosféry vzniká uprostřed specifické mikroprostředí se sníženou hladinou kyslíku, což může být důležité z hlediska zachování subpopulace NSC ve sferoidu. V in vitro podmínkách byla neurální indukce popsána jako důsledek kultivace ESC v bez sérových podmínkách a při nízké koncentraci buněk. Zároveň tato tvorba plovoucích sféroidních kolonií z tzv. primitivních neurálních kmenových buněk (pnsc) byla podpořena účinkem LIF (Obr. 8) (Tropepe et al., 2001). Označení pnsc je použito pro buňky, které kromě neurálních vlastností mají po krátkou dobu ještě i 20

21 pluripotentní charakter (Morrison et al., 1997). V in vivo podmínkách by se k těmto pnsc daly přirovnat buňky okolo E7.5, které exprimují neurální geny jako Nestin a Sox1 a 2 (Wood a Episkopou, 1990; Kawaguchi et al., 2001). Z těchto pnsc se vlivem růstových faktorů FGF2 a EGF mohou kultivovat definitivní neurální kmenové buňky (dnsc) a z nich vznikající neurosféry (Obr. 8). Tyto dnsc představují in vitro ekvivalentem kmenových buněk vyskytujících se v embryonálním (od E8.5) a dospělém mozku (Reynolds et al., 1992; Hitoshi et al., 2004). Obr. 8: Proces neurální diferenciace ESC v in vitro podmínkách. ESC jsou kultivovány při minimálních podmínkách (nízká koncentrace buněk, bezsérové podmínky) a za vlivu LIF se tvoří primitivní neurosféry (vyobrazena i na fotce ze světelného mikroskopu). Po rozdělení neurosféry na jednotlivé buňky se z pnsc ve stejných podmínkach avšak pod vlivem FGF2 tvoří dnsc a definitivní neurosféry. Vlivem séra (1% FBS fetální bovinní sérum) lze tyto neurosféry po přisednutí na vhodný substrát diferencovat na neurony, astrocyty a oligodendrocyty (upraveno podle Wislet-Gendebien, 2013) Molekulární charakterizace NSC Tak jako každá linie buněk, i neurální kmenové buňky a z nich vznikající jednotlivé podtypy buněk, mají své charakteristické znaky. Jejich shrnutí v širokém spektru buněk nervového systému se nachází na Obr. 9 na straně

22 NSC jsou heterogenní a jejich profil exprese je rozdílný na základě proliferace, přežití a apoptózy (Bez et al., 2003). Radiální gliové buňky sdílejí mnoho vlastností s astrocyty, jako je exprese GFAP (gliálně-fibrilární acidický protein; Levitt a Rakic, 1980), GLAST (glutamátový transportér; Shibata et al., 1997) a BLBP (brain lipid binding protein) (Feng et al., 1994), ale také sdílí znaky s neuroepiteliálními buňkami jako je nestin (Hartfuss et al., 2001), RC1 a RC2 (radial cell 1 a 2; Misson et al., 1988; Mori et al., 2005) a vimentin (Pixley a De Vellis, 1984). Pro zjednodušení jsou tyto markery shrnuty do Tab.1. Transkripčním faktorem charakterizujícím radiální gliové buňky a některé progenitorové buňky je pak navíc Pax6 (Heins et al., 2002; Haubst et al., 2004). Popis vybraných znaků se nachází v kapitole 1.5. Tab. 1: Charakteristické znaky neuroepiteliálních buněk, radiálních gliových buněk a astrocytů. Tabulka znázorňuje sdílené znaky mezi jednotlivými typy buněk (upraveno podle Malatesta et al., 2003) Neurální kmenové buňky a HIF-1α K zajímavému fenoménu dochází u NSC a neurálních prekurzorů ve vztahu k transkripčnímu faktoru HIF-1α. Ten je u ostatních buněk za normoxie hydroxylován, ubiquitinován a degradován, jak již bylo popsáno výše. U NSC a neurálních prekurzorů je však stabilizován ve specializovaných vezikulech, tzv. vezikulech nesoucích HIF-1α (HBV HIF-1α bearing vesicles), takže nedochází k jeho degradaci. HIF-1α tak může regulovat Notch a Wnt signalizaci, které u těchto buněk modulují sebeobnovu a diferenciaci (Roitbak et al., 2011). 22

23 Dráha Notch je při nízké koncentraci kyslíku ovlivněna stabilní vazbou HIF-1α s NICD a zároveň dochází ke zvýšené expresi γ-sekretázy, která způsobuje proteolytické štěpení NICD v cytoplazmatické membráně a její translokaci dovnitř buňky. Tyto dva mechanismy vedou ke zvýšené koncentraci NICD uvnitř hypoxických buněk, její translokaci do jádra, vazbě na transkripční komplex a k expresi cílových genů, které jsou zodpovědné za udržení nediferencovaného stavu NSC inhibicí neurálních efektorů jako je Mash1 a Neurogenin (Gustafsson et al., 2005; Wang et al., 2006a) Význam dráhy Notch u neurálních kmenových buněk Významnou roli v přechodu pnsc v dnsc hraje signalizace Notch a její cílové geny Hes (Hitoshi et al., 2004). Přechod ESC v pnsc není pod vlivem Notch, což dokazují i experimenty na RBP-J -/- buňkách (deficientních pro jaderný faktor RBP-J), u kterých tento přechod nebyl omezen (Hitoshi et al., 2002). Podle některých prací je však Notch signalizace nezbytná, aby ESC získaly neurální charakter během kultivace bez séra a bez růstových faktorů (Lowel 2006). V in vivo podmínkách není vztah mezi Notch a přechodem ESC v pnsc přesně popsán. Poprvé ve vývoji se ve větší míře objevují Hes geny, konkrétně Hes5, na úrovni neuroepitelia mezi E , kdy vznikají první dnsc závislé na FGF2. K expresi Hes5 však dochází i u pnsc, jeho exprese je ale malá až téměř nulová. Na základě těchto informací byl formulován předpoklad, že během přechodu pnsc v dnsc dochází k aktivaci Notch signalizace. Tento závěr byl potvrzen na Notch1-/- (deficitní pro receptor Notch1) embryích, u kterých se tvořily pnsc a ponechávaly si neurální charakter, zatímco dnsc se tvořily jen ve velmi omezeném množství (Hitoshi et al., 2004). V in vivo podmínkách jsou Hes1 a Hes5 (a tedy i Notch signalizace) zásadní pro udržení sebeobnovy (Nakamura et al., 2000; Hitoshi et al., 2002). 23

24 Obr.9: Markery neurální linie buněk. Toto schéma shrnuje známé markery neurálních buněk a zároveň znázorňuje jejich diferenciaci a rozdělení (upraveno podle R&D Systems, URL4). 24

25 1.5. Vybrané molekulární vlastnosti ESC a NSC Tato kapitola obsahuje podrobnější popis vybraných molekul, ovlivňujících osud ESC i NSC v in vivo i in vitro podmínkách. Podkapitoly jsou seřazeny abecedně BLBP Lipidy vázající protein (brain lipid-binding protein) Blbp nebo také Fabp7 je člen rodiny hydrofobních ligand-vázajících proteinů (FABP) popsaný v CNS. Tyto molekuly modulují transkripci interakcí s jadernými receptory a hrají roli v metabolismu (Kurtz et al., 1994; Haunerland a Spener, 2004). BLBP je v in vivo podmínkách součástí jak cytoplazmy, tak i jádra. Tato skutečnost naznačuje úlohu BLBP v přenosu ligandu k jadernému receptoru. BLBP je zásadní pro morfologické změny radiálních glií jako je tvorba sítě vláken z buněčných výběžků, po kterých migrují neurony (Feng et al., 1994; Feng a Heintz, 1995). Exprese BLBP v radiálních gliových buňkách vyžaduje signalizaci Notch. U mutantů pro Notch1 a Notch3 docházelo ke značnému snížení hladiny BLBP v telencefalonu E14.5 (Anthony et al., 2005) LewisX Forse1 je monoklonální protilátka rozeznávající karbohydrátový epitop Lewis- X. V CNS tato protilátka rozpoznává chondroitin sulfát proteoglykan pojmenovaný phosphocan, který má vysokou molekulární hmotnost a jeho exprese je nejvyšší v časném postnatálním myším mozku (Allendoerfer et al., 1995; Tole et al., 1995). Epitop LewisX je součástí SSEA-1(Gooi et al., 1981), který je často využíván k identifikaci nediferencovaných ESC (Muramatsu a Muramatsu, 2004). Novější studie však tento antigen zařazují i jako marker jiných buněk, např. NSC (Kim a Morshead, 2003; Yanagisawa et al., 2005). Je exprimován především časnými neurálními kmenovými progenitorovými buňkami, neuroblasty, glioblasty a jeho exprese mizí u více diferencovaných buněk (Capela a Temple, 2006). 25

26 LewisX je exprimován společně s neurálními regulačními geny a mohl by být zahrnut i v rozčleňování neurální trubice (Allendoerfer et al., 1999). Forse1 je tedy brán jako vhodný kandidát pro oblastně a časově specifické značení časných stádií neurálního vývoje (Tole et al., 1995) Mash1 Mash1/ASCL1 je bhlh transkripční faktor s proneurálním vlivem (Ball et al., 1993). Mash1 je savčí homolog achate-scute complex u octomilky regulující diferenciaci v různých oblastech nervového systému, např. u čichových, očních a telencefalických neuronů (Tomita et al., 1996; Cau et al., 1997; Casarosa et al., 1999). Je cílovým genem Hes1, který je aktivním represorem Notch signalizace (de la Pompa et al., 1997), při které se transkripční represor Hes1 váže na promotor Mash1 a brání tak jeho expresi (Ishibashi et al., 1995; Chen et al., 1997). Mash1 je spojován také s aktivací exprese Delta-like 1 (Dll-1), který je Notch ligandem a jehož exprese vyvolává u cílových buněk diferencovaný fenotyp, čili opačný než je tomu u buněk s aktivovaným Notch receptorem (Bettenhausen et al., 1995). V rámci CNS je Mash1 exprimován v neurálních prekurzorech. Jeho exprese začíná mezi E8.5 a E10.5 v neuroepiteliu středního mozku, ventrální části předního mozku a míše. V další vlně exprese mezi E10.5 a E12.5 se vyskytuje ve ventrikulární vrstvě mozku v různé koncentraci. Od E12.5 je již exprimován u buněk mimo ventrikulární vrstvu (Guillemot a Joyner, 1993). V mozku je Mash1 nezbytný pro specifikaci neurálních prekurzorů v GE (ganglionic eminence dočasná embryonální mozková struktura v telencefalonu) (Casarosa et al., 1999). Pokud dojde k přerušení regulace tohoto faktoru (např. při nedostatku Hes1), dochází k předčasné neurogenezi a vážným defektům neurální trubice (Ishibashi et al., 1995) Nanog Nanog je nedávno objevený, homeoboxový transkripční, který se jako efektor pro regulaci pluripotentních genů zapojuje do signalizačních drah Wnt a BMP (Hart et 26

27 al., 2004; Pan a Thomson, 2007). Jeho vliv je zásadní pro udržení sebeobnovy a pluripotence nediferencovaných ESC (Chambers et al., 2003), a následně během diferenciace těchto buněk dochází k jeho rapidnímu úbytku. Embrya, která nemají Nanog, ztrácí schopnost tvorby vyšších struktur a ve stádiu blastocysty zanikají (Mitsui et al., 2003). Chambers a kolektiv (2003) zavedli experiment s ESC, které tento faktor v nadměrné míře exprimovaly. Během tohoto pokusu bylo zjištěno, že Nanog podporuje sebeobnovu nezávisle na dráze LIF/STAT3. Pro udržení pluripotence Nanog sice kooperuje se Stat3, ale zároveň potlačuje diferenciační aktivitu NF-κB (Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells; Torres a Watt, 2008). Jednou z nejzajímavětších vlastností Nanogu je jeho pomalé a náhodné kolísání u ESC, které má za následek vznik heterogenní buněčné populace. Existují tak dva stavy buněk stabilní s vysokou expresí Nanogu a nestabilní s nízkou expresí. Buňky exprimující Nanog v malé míře jsou tak s největší pravděpodobností kandidáty pro diferenciaci (Kalmar et al., 2009). Regulace Nanogu spočívá v jeho autorepresi, avšak přesný molekulární mechanismus není doposud znám (Fidalgo et al., 2012; Navarro et al., 2012) Nestin Nestin (zkrácený název pro protein neuroepiteliálních kmenových buněk neuroepithelial stem cell protein) je protein z rodiny intermediálních filament přítomný ve vývíjející a regenerující se tkáni CNS. Je exprimován především v aktivně se dělících progenitorových buňkách CNS a využívá se tak jako určující znak těchto buněk (Lendahl et al., 1990; Cattaneo a McKay, 1990; Dahlstrand et al., 1995). Nestin není schopen tvořit filamenta sám, je tedy kolokalizován s jinými intermediálními filamenty, např. vimentinem (Eliasson et al., 1999). Liu et al. (2013) ve svých experimentech zaznamenali expresi nestinu především v buněčných výběžcích a formulovali tak teorii, že se nestin (ve spolupráaci s β-iii-tubilinem) podílí na formaci těchto výběžků během diferenciace lidských neurálních progenitorů. V dospělých neuronech se nestin již nenachází a je plně zastoupen dalším intermediálním filementem - β-iii-tubilinem, v případě astrocytů je nahrazen GFAP (Messam et al., 2000; Erceg et al., 2008). 27

28 Gen Nes (kódující nestin) je cílovým genem komplexu Sox (přesněji skupiny B1) a POU transkripčních faktorů (Tanaka et al., 2004). Závislost na POU proteinech (např. Brn2) se odráží i na kolísání exprimovaného množství nestinu během buněčného cyklu. Množství nestinu během G2-M fáze významně poklesá (Sunabori et al., 2008). Nedostatek tohoto proteinu vede ke smrti embrya, protože v neurální trubici nevzniká dostatek NSC (Park et al., 2010) Pax6 Pax patří do rodiny transkripčních faktorů s DNA vázající doménou buď v podobě párové domény samotné nebo i s homeodoménou (Bopp et al., 1986; Jun a Desplan, 1996). První myší Pax gen (Pax1) byl objeven roku 1988 (Deutsch et al., 1988) a od tédy bylo identifikováno celkem devět členů Pax rodiny u myši a člověka, které se podílí na vývoji mnoha embryonálních struktur, např. CNS, očí, neurální lišty, endokrinních žláz atd. (shrnuto, Lang et al., 2007). Pro neurogenezi významný Pax6 je pleiotropní, jaderný protein a poprvé je u myši exprimován během E8 (embryonální den 8), kdy je neurální ploténka tvořena neuroepiteliálními buňkami. Následně během E10 dochází k expresi Pax6 v předním mozku, zadním mozku a páteřní míše (Walther a Gruss, 1991; Inoue et al., 2000). Různé hladiny Pax6 určují, zda bude u NSC probíhat sebeobnova (toto optimum není jasně stanoveno) nebo bude probíhat diferenciace a tvorba bazálních progenitorů (odpovídající zvýšené či snížené expresi Pax6) (Sansom et al., 2009). Pax6 je tak klíčovým faktorem po většinu neurogeneze, a to především v mozkové kůře (Hack et al., 2004). Neurální kmenové (neuroepiteliální buňky a radiální gliové buňky) a progenitorové buňky nacházející se ve ventrikulární vrstvě silně exprimují tento faktor (Hirata et al., 2002; Hevner et al., 2006). Pax6 u těchto buněk ovlivňuje např. buněčný cyklus, regulaci adhezivních molekul, mezibuněčnou signalizaci a je jedním z hlavních faktorů ovlivňujících osud buněk během rozdělování (patterningu) CNS (shrnuto, Simpson a Price, 2002). 28

29 Regulace buněčné cyklu zajišťuje udržení počtu progenitorových buněk v mozkové kůře, jak bylo potvrzeno na Pax6 deficientních buňkách, u nichž dochází ve velké míře k opouštění buněčného cyklu a maturaci (Quinn et al., 2007). Významnou roli hraje Pax6 i při stimulaci mezibuněčných interakcí neuronneuron nebo neuron-glie během vývoje CNS (Meech et al., 1999). Za tuto adhezi je zodpovědná molekula L1, která je společně s NCAM (neural cell adhesion molecule adhezivní molekula neurálních buněk), regulována pomocí Pax6, jež se váže v regulační oblasti genů pro tyto proteiny a spouští jejich expresi (Holst, et al., 1997). Mezi transkripční geny regulované pomocí Pax6 patří především Ngn2 (Neurogenin2) (Scardigli et al., 2003), BLBP/FABP7 (Arai et al., 2005) nebo také pro proliferaci NSC významný faktor LewisX (Shimoda et al., 2002). Mezi mnohé kooperace Pax6 s jinými transkripčními geny se řadí i spolupráce se Sox2. Párová doména (paired-box) Pax6 umožňuje vazbu s HMG doménou Sox2, čímž dochází k zesílení transkripce cílových genů. Společně například iniciují expresi δ-crystallinu, čímž se nastartuje tvorba oční čočky (Kondoh et al., 2004). Mutace genu Pax6 u myší vyvolává fenotyp malých očí (Small eye - Sey) a zároveň dochází ke vzniku vážných mozkových abnormalit (Hill et al., 1991;Georgala et al., 2011). U člověka se tato mutace fenotypově projevuje jako onemocnění zvané aniridie, které negativně ovlivňuje oči a oční nervy (Ton et al., 1992). Pax6 je zásadním faktorem pro přežití a toto tvrzení potvrzují Pax6 deficientní myši umírající ihned po narození se závažnými defekty očí a silnou deformací cerebrálního kortexu (Pratt et al., 2000) Sox geny podskupiny B1 Sox jsou transkripční faktory patřící do HMG (high-mobility group) doménové rodiny proteinů, které jsou klíčovými v regulaci embryonálního vývoje a determinaci buněčného osudu (shrnuto, Kamachi et al., 2000). Označení Sox přestavuje zkratku z Sry-related HMG box, kde Sry (sex-determining region on chromosome Y) je oblast chromozomu Y určující pohlaví (Gubbay et al., 1990). 29

30 Sox rodina je rozdělena na podskupiny A-G na základě podobnosti jednotlivých Sox proteinů v jejich HMG doméně. Důležitou podskupinu B1 tvoří Sox1, Sox2 a Sox3 (Thiel, 2013). Tyto geny bývají také označovány jako panneurální a jsou silně exprimovány ve vývíjející se CNS (Collignon et al., 1996; Lafebvre et al., 2007). Sox2 a Sox3 jsou poprvé exprimovány v časném embryu okolo 6.5 dpc (day post coitum den po početí), Sox1 o den později (Wood a Episkopou, 1999). Pokud dojde k inhibici SoxB1 genů, dochází k předčasné diferenciaci neurálních prekurzorů a naopak při nadměrné expresi se zastavuje neurogeneze (Avilion et al., 2003; Bylund et al., 2003). Tato skupina genů je exprimována i během dospělosti a stejně jako v embryonálním vývoji má za úkol zachovávat vlastnosti NSC. Geny SoxB1 podskupiny se mohou během časného vývoje funkčně nahrazovat, ale v pozdějším vývoji embrya již toto zastoupení není možné a dochází ke vzniku závažných defektů. Ztráta Sox1 způsobuje u myši epilepsii a malé oči (Malas et al., 2003), Sox2 deficientní myši nepřežijí stádium implantace embrya (Episkopou, 2005) a Sox3 deficientní myší trpí paralýzou vlivem poruchy migrace buněk neurální lišty (Rizzoti et al., 2004) Sox1 Sox1 se poprvé v myším embryu objevuje během neurální indukce během 7.5 dpc (days post coitum dny po početí). Dále je exprimován neuroepiteliálními buňkami po celé anteriorně-posteriorní ose ( dpc) a také po fúzi a vzniku neurální trubice ( dpc). S postupným vývojem a především diferenciací neuroepiteliálních buněk dochází ke snižování exprese Sox1. Sox1 je tedy časným znakem neuroepiteliálních buněk (Pevny et al., 1998) Sox2 Sox2 byl jako první identifikován v rámci hledání genů příbuzných genu určujícímu pohlaví Sry (Gubbay et al., 1990). Sox2 je nejčastěji zmiňován pro svůj podíl na udržení pluripotence ESC a buněk trofoblastu a jeho exprese ovlivňuje množství vývojově důležitých genů jako např. nestin, FGF4 a Oct4 (Kamachi et al., 2000; Avilion et al., 2003; Dailey et al., 1994). Sox2 je během neurogeneze exprimován jak multipotentními neurálními kmenovými buňkami, tak proliferujícími progenitory CNS a jeho exprese se výrazně 30

31 snižuje společně s diferenciací těchto buněk. Na základě inhibice Sox2 bylo dokázáno, že tento faktor udržuje vlastnosti neurálních progenitorů (např. exprese Pax6) (Graham et al., 2003) a overexprese tohoto faktoru vede k jejich významnému nárůstu (Yamamizu, 2013). Ztráta Sox2 u dospělé myši vede k neurodegradačním projevům jako je tomu u Huntingtonovy nebo Alzheimerovy nemoci (Ferri et al., 2004). 31

32 2. Cíle práce Tvorba neurosfér je základní charakteristikou neurálního vývoje buněk v in vitro podmínkách. Na základě vlivu exogenních faktorů dochází k vytváření dvou různých vývojových stádií neurosfér (primitivní a definitivní) a existuje několik markerů, které mohou popisovat tato odlišná stádia. Práce bude tedy zaměřena na studium rozdílu mezi jednotlivými vývojovými stádii neurosfér a také na rozdíl mezi buňkami bez genu pro HIF-1α a buňkami přirozeně exprimujícími HIF-1α. Přesně se jedná o tyto cíle: popsat neurosféry vytvořené z HIF-1α deficientních a HIF-1α exprimujících ESC na základě analýzi obrazu zdokumentovat adaptaci neurálního charakteru ESC a z nich vzniklých neurosfér na základě specifických neurálních markerů zmapování rozdílů v expresi neurálních markerů vlivem absence HIF- 1α u ESC i neurosfér záskané výsledky vzájemně porovnat a odiskutovat. 32

33 3. Metody 3.1. Použité buněčné linie a jejich kultivace Použité buněčné linie V experimentech byly použity myší ESC linie R1, které jsou odvozeny z vnitřní buněčné masy blastocysty staré 3,5 dpc (Nagy et al., 1993) v experimentech označovány jako wt. Buňky deficientní pro HIF-1α (v experimentech označovanány jako HIF-/-) nám byly laskavě poskytnuty laboratoří P. Carmelieta (Center for Transgene Technology and Gene Therapy, Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology, KU Leuven, Belgium). Gen pro HIF-1α byl u ES buněk R1 linie inaktivován inzertem vloženým homologní rekombinací, buňky s inzertem vyselektovány (resistence na geneticin, G418) a nepřítomnost funkčního HIF-1α byla ověřena jak na úrovni RNA, tak proteinu (Carmeliet et al., 1998) Kultivace ESC Kolonie ESC se kultivovaly v LIF médiu (oddíl Média) na miskách potažených 0,1% roztokem želatiny (Sigma-Aldrich). LIF médium bylo použito pro udržení nediferencovaného stavu a podpory proliferace ESC buněk. Oplach buněk byl prováděn pomocí pufrovaného fyziologického roztoku PBS (Phosphate buffered saline, ph 7,4). Buňky byly pasážovány (=disociace na jednotlivé buňky a vysetí do čerstvého média) každé 2 dny v koncentraci přibližně buněk/ 1 cm 3 média. K enzymatické disociaci buněk štěpením mezibuněčných spojů byl použit trypsin-edta (PAA). Kultivovány byly v termostatu při 95% vlhkosti, 5% CO 2 a 37 C Kultivace neurosfér Neurosféry byly kultivovány za standardních podmínek (95% vlhkost, 5% CO 2 a 37 C) v bezsérovém médiu s přídavkem inzulinu, transferrinu a selenu (ITS), médium bylo též obohaceno o doplňky B27, N2 a NAC. Misky nebyly poželatinovány, aby vyseté buňky neadherovaly a docházelo k tvorbě plovoucích neurosfér. Pro kultivaci primitivních neurosfér byl přidán LIF pro definitivní neurosféry byly přidány růstové faktory FGF2 a EGF. Primitivní neurální kmenové progenitorové buňky byly označeny jako pnspc (primitive neural stem/progenitor cells) a definitivní jako dnspc (neural stem/progenitor cells). 33

34 Prvním krokem pro kultivaci neurosfér bylo převedení ztrypsinizovaných ESC do ITS média pro pnsc v koncentraci buněk/1 ml. Po třech dnech byly narostlé neurosféry použity ke zpracování a analýze. Část primitivních neurosfér byla ztrypsinizována a buňky byly vysety na dnsc v koncentraci buněk/1 ml. I přes to, že literatura zmiňuje kultivaci neurosfér po dobu 6-7 dní, my jsme v našich experimentech zvolili 3 denní kultivaci. Při delší kultivaci jak 3 dny docházelo ke slučování velkých neurosfér do souvislých útvarů, což zhoršovalo možnosti analýzy obrazu Média, pufry a doplňové složky PBS s ph 7,4: - 8,0 g NaCl - 0,2 g KCl - 2,9 g Na 2 HPO 4 *12H 2 O - 0,2 g KH 2 PO 4 - doplněno do 1000 ml H 2 O ES médium Dulbecco s Modified Eagle Medium, high Glucose, Invitrogen (obsah glukózy 4,5 g/l a NaHCO 3 3,7 g/l) s přídavkem do 500 ml média: -NEAA (neesenciální aminokyseliny 1x 100x konc.; Invitrogen -L-glutamin (finální koncentrace 200 mm); PAA -FBS (fetální bovinní sérum, fin. koncentrace 15%); PAN -P/S (antibiotika Penicilinn-100 i.u./ml, Streptomycin - 0,1 mg/ml); PAN - β-merkaptoethanol (fin.konc. 0,05 mm); Sigma-Aldrich LIF médium ES médium (viz výš) s přídavkem LIF (5 ng/ml; Chemicon) ITS médium bezsérové médium DMEM/F-12 (Invitrogen) s přídavkem inzulínu, transferrinu a selenu (1x 100xkonc.; Gibco); a s přídavkem P/S (viz ES médium; PAN) Médium pro primitivní neurosféry (pn) ITS médium obohacené o N2 (100x koncentrovaný; Gibco), B27 (50x koncentrovaný; Gibco), NAC (N-acetyl-Lcystein, 1mM; Sigma), LIF (2,5 ng/ml; Chemicon) 34

35 Médium pro definitivní neurosféry (dn) ITS médium obohacené o N2 (100xkonc.; Gibco), B27 (50xkonc.; Gibco), NAC (1mM; Sigma), EGF (50ng/ml; PeproTech), FGF2 (10 ng/ml; PeproTech) 3.2. Imunochemické metody Příprava primárních protilátek z hybridomů Hybridomy pro tvorbu protilátek anti-pax6 a anti-lexisx (tzv. ForseI) byly pořízeny z Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, University of Iowa). Vialka se zamraženou buněčnou kulturou hybridomů byla rychle rozmražena v teplé vodě a její obsah byl převeden do 10 ml ES média. Doba kultivace se odvíjela od rychlosti růstu hybridomů a pohybovala se v rozmezí 4-6 dní. Po kultivaci bylo z misky odebráno médium, které se po filtraci používalo jako primární protilátka proti cílovým buněčným proteinům Použité primární protilátky a pufry V následujících dvou typech imunocytochemie byly použity primární protilátky vytvořené z hybridomů a komerčně dodávané primární protilátky (Tab. 2). Pro následující metody se připravují 4 typy promývacích pufrů: WB1 sterilní PBS WB2 sterilní PBS, 0,01% Tween WB3 sterilní PBS, 1% BSA (bovinní sérový albumin), 0,01% Tween WB4 sterilní PBS, 0,1% Triton,1% BSA Primární protilátka Firma Sekundární protilátka Fluorofor Anti-LewisX DSHB goat anti-mouse IgM FITC Anti-Pax6 DSHB donkey anti-mouse IgG Alexa 488 Anti-Nestin Abcam donkey anti-mouse IgG Alexa 488 Anti-BLBP Abcam goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Anti-Sox2 SantaCruz donkey anti-goat IgG Alexa 488 Anti-Sox2 SantaCruz donkey anti-goat IgG Alexa Fluor 594 Tab.2: Použité primární protilátky a jejich odpovídající sekundární protilátky včetně fluoroforů. Barevné odlišení v tabulce znázorňuje rozdílné barvy emitovaného světla. 35

36 Imunocytochemická analýza pomocí průtokové cytometrie ES buňky byly dvakrát promyty v PBS, odděleny od misky pomocí trypsinu v objemu od 0,5 1 ml v závislosti na počtu buněk. Trypsinizace probíhala 5 min při teplotě 37 C. Reakce byla poté ukončena přidáním ES média, které způsobilo neutralizaci trypsinu. Buňky byly spočítány pomocí Bürkerovy komůrky a byla připravena suspenze přibližně buněk v 1 ml PBS do každé předchystané zkumavky. Pro každý vzorek byla připravena negativní kontrola. V případě použití neurosfér je třeba nejdříve odebrat co nejvíce kultivačního média od buněk, trypsinizovat, neutralizovat a teprve poté promývat pomocí PBS. Pokud protilátka značí vnitrobuněčné komponenty buňky, je potřebná fixace a permeabilizace buněk. K permeabilizaci byl použit pufr z PBS s 0,1% Tritonu a 0,1% NP-40. Nastavení centrifugy bylo po celou dobu experimentu 4 min, 4 C a 400 rcf. V případě fixace bylo potřeba odsát PBS a napipetovat 500 µl 4% PFA, nechat inkubovat po dobu 20 min při 4 C. Centrifugaci a odsátí následovalo trojité promytí buněk v 1 ml WB2. Blokační krok probíhal při pokojové teplotě (RT - room temperature), 60 min v 500 µl WB4. Po blokaci se vzorky promyly 1 ml WB3. Po odsátí přidáme 100 μl naředěných protilátek (v poměru 1:200 v WB3), které jsou komerčně dodávány, případně 100 μl neředěných protilátek připravených z hybridomů. Do zkumavek se vzorky, které budou sloužit jako negativní kontrola, je pipetováno pouze 100 μl WB3. Primární protilátky se kultivují se vzorkem 30 min, RT. Po kultivaci jsou vzorky 3x promyty v WB4. Sekundární protilátky jsou ředěny v WB4 v poměru 1:200 a do každé zkumavky je napipetováno 100 μl, kultivace na 30 min, RT, na temném místě. Sekundární protilátky jsou ze vzorků dvakrát vymyty pomocí WB4. Finální oplach probíhá v 1 ml WB1. Vzorky jsou poté přelity µl WB1 a velmi jemně propipetovány. Měření probíhá na přístroji Accuri C6 od firmy BD. Pro fluorofory FITC a Alexa Fluor 488 byl pro detekci zvolen FL-1 detektor. V této metodě se výhradně používaly zelené flurofory Imunocytochemická analýza pomocí fluorescenčního mikroskopu Tato technika se liší od předchozí především přípravou buněk, které se kultivovaly na kulatých krycích sklíčkách, ke kterým pomocí želatiny adherovaly. Krycí 36

37 sklíčka byly namočeny do ethanolu, ožehnuty, vloženy do 24 jamkové desky, dvakrát promyty v PBS a poželatinovány. Do každé jamky bylo odkápnuto menší množství média s buňkami (okolo 300 µl). Neurosféry se nechaly přibližně hodin adherovat v termostatu při 37 C. Práce se sklíčky probíhala po celou dobu v destičce. V prvním kroku byly sklíčka opatrně opláchnuty PBS a převrstveny 500 µl 4% PFA po dobu 30 min při RT. Pokud necháváme destičku kultivovat při RT, je třeba ji přikrýt víčkem, aby nedocházelo k nadměrnému odpařování. Po tomto fixačním kroku následoval dvojitý oplach 500µl PBS na 10 min. Blokační krok trval 1 hod pří RT, byl použit pufr ze sterilního PBS, 1% BSA a 0,1% Tritonu (WB4). Primární protilátky byly použity naředěné (komerčně dodávané) i nenaředěné (hybridomové). Ředění je 1:200 v WB4, primární protilátky jsme nechali kultivovat ideálně přes noc v objemu 200 µl při 4 C. Po kultivaci následovalo promytí od primární protilátky 3x 10 minut v PBS, RT. Sekundární protilátky byly ředěny 1:500 v WB4. Přidali jsme 200 µl sekundárních protilátek na 60 min, při RT. Pokud chceme značit jádra, připipetujeme 5 min před ukončením inkubace 1000x ředěné DAPI (1mg/ml, Sigma). Finální oplach byl provedem pětkrát na 5-10 min v PBS při RT. Pomocí jehly a pinzety byla sklíčka vytažena z desky a umístěna na podložní skla, kde jsme nakápli malé množství Vectashieldu. Je potřebné orientovat adherované buňky do Vectashieldu. Takto připravené vzorky byly skladovány při 4 C. Mikroskopování probíhalo na konfokálním mikroskopu Leica CM TCS SPS X (Biofyzikální Ústav, Královopolská 135, Brno) a na konfokálním mikroskopu Olympus (Univerzitní Kampus, budova A1, Kamenice 5, Brno) Western Blot Příprava lyzátů a stanovení koncentrace proteinů Připravené buňky v Ependorfových zkumavkách byly opláchnuty PBS a byl k nim přidán SDS-lyzační pufr. Pomocí ultrazvukové sondy Brandson byly vzorky sonikovány. Koncentrace proteinů se stanovala pomocí soupravy DC Protein Assay Kit od firmy Bio-Rad. Kalibrační křivka se stanovovala na základě množství proteinů v koncentrační řadě BSA (v rozmezí od 0,1 mg/ml po 2 mg/ml). Na základě zjištěné koncentrace byly vzorky ředěny na výslednou koncentraci 0,5 mg/ml. Do každého 37

38 vzorku byla přidána bromfenolová modř (0,01%) a merkaptoethanol (1%) a byly povařeny při 100 C Proteinová elektroforéza a Western blot Gelová elektroforéza SDS-PAGE byla prováděna na 10% a 12% akrylamidovém gelu při napětí 130V v running pufru. Různě husté gely byly použity kvůli velkému rozpětí velikostí cílových proteinů. Pro malé proteiny byl použit 12% akrylamidový gel (viz Tab. 3). Pro určení molekulových hmotností byl vedle vzorků napipetován proteinový standard SDH-6 (Sigma-Aldrich). Membrány z polyvinylidenfluoridu byly aktivovány v methanolu a společně s gely se blotovaly při napětí 100 V po dobu 75 minut v transferovém pufru. Po přenosu proteinů z gelu na membránu byly membrány přesunuty do 5% roztoku sušeného mléka kvůli blokování nespecifických reakcí. Membrány byly přes noc inkubovány v požadovaných primárních protilátkách při teplotě 4 C (Tab. 3). Poté se po dobu 10 minut 5x promývaly v omývacím pufru. Inkubace se sekundární protilátkou trvala 1 hod na RT (Tab. 3). Následovalo 5x 10 min oplachu a poté se proteiny nechaly reagovat s chemiluminiscenčním substrátem (Millipore, USA) a byly vyvolány na fotografický papír (GE). Prim.Ab Firma Sek. protilátka Ředění prim.ab Velikost (kda) Anti-bActin SantaCruz anti-mouse IgG 1:10000 ~ 40 Anti-BLBP Abcam anti-rabbit IgG 1: Anti-Sox2 SantaCruz anti-goat IgG 1: Anti-LewisX DSHB anti-mouse IgM 1:2 200 Anti-Nanog Abcam anti-rabbit IgG 1:4000 ~ 45 Anti-Nestin Abcam anti-mouse IgG 1: Anti-Pax6 DSHB anti-mouse IgG 1:2 50 Hustota gelu 12% 10% Tab. 3: Použité primární a jim odpovídající sekundární protilátky, včetně velikosti cílových proteinů. Barevné rozdělení značí rozdělení proteinů pro dva různě husté gely Použité pufry a gely SDS lyzační pufr 1% SDS 0,1% glycerol 100 mm Tris, ph 7,4 38

39 Separační gel (10ml, 10%) destilovaná H 2 O 4 ml 40% akrylamid 3,3 ml 1,5 M Tris HCl (ph 8,8) 2,5 ml 10% amonium persulfát (APS) 0,1 ml N,N,N,N -tetramethylenethylene-diamin (TEMED) 0,004 ml Separační gel (10ml, 12%) destilovaná H 2 O 3,6 ml 40% akrylamid 2,75 ml 1,5 M Tris HCl (ph 8,8) 2,5 ml 10% APS 0,1 ml TEMED 0,004 ml Zaostřovací gel (3 ml) destilovaná H 2 O 2,1 ml 40% akrylamid 0,5 ml 1 M Tris HCl (ph 6,8) 0,38 ml 10% APS 0,03 ml TEMED 0,003 ml Transferový pufr 1x, 1 l Tris baze glycin methanol destilovaná H 2 O 14,42 g 3,03 g 200 ml doplnit do 1 l Promývací pufr 2 M Tris Hcel (ph 7,4-7,6) 10 ml Tween 20 1 ml NaCl 13 g destilovaná H 2 O doplnit do 2 l 39

40 3.3. Analýza obrazu s ImageJ ImageJ je freeware program vyvinutý v National Institutes of Health pro analýzu obrazu. V programu lze měřit jak manuálně, tak automatizovaně. Pro naše potřeby bylo zvoleno měření plochy neurosfér (Obr. 11). Měření plochy jsme zvolili kvůli neurosférám s nepravidelným tvarem, u kterých by mohlo být měření např. průměru zavádějící. ImageJ měří v relativních jednotkách, bylo tedy nutné optimalizovat měřítko, čehož jsme dosáhli vyfocením Bürkerovy komůrky, jejíž mřížka má jasně definované rozměry. Obr. 11: Vzhled a příklad měření programu ImageJ 40

41 3.4. Statistika Pokud bylo provedeno opakování měření, jsou hodnoty uvedeny ve formě průměru a směrodatné odchylky. Významnost rozdílu byla stanovena pomocí T-testu na hladině p<0,01 (označení **) a p<0,001 (označení ***). Pro vyhodnocení byl použit software Statistica. 41

42 4. Výsledky 4.1. Analýza obrazu hodnocení velikostí a počtu neurosfér Jako první krok byla zvolena analýza kultivovaných neurosfér na základě jejich velikosti (plochy v μm 2 ). Velikost, tvar i barva rostoucích neurosfér odráží vitalitu těchto sféroidů a zároveň společně s počtem neurosfér slouží jako podpůrný důkaz o proliferaci a potenci neurálních kmenových a progenitorových buněk (NSPC neural stem/progenitor cell) HIF-/- (deficientní pro HIF-1α) a wt (buněčná linie přirozeně exprimující HIF-1α) v normoxických podmínkách (Obr.12). Primitivní neurosféry (pn) vznikají z pnspc (primitivní neurální kmenové/progenitorové buňky) a definitivní neurosféry (dn) vznikají z dnspc (definitivní neurální kmenové/progenitorové buňky). Primitivní neurosféry tvoří kulaté, velké sféroidy ve velkém počtu, definitivní neurosféry jsou nepravidelného tvaru a zdají se menší. Obr.12: Fotografie neurosfér tvořených během druhého dne kultivace. Podle měřítka lze srovnat rozdílnou velikost primitivních a definitivních neurosfér. 42

43 Distribuce počtu neurosfér podle jejich velikosti Počítání neurosfér a jejich rozřazení podle velikosti bylo zvoleno za účelem sledování zastoupení v rámci zvolených kategorií ( μm 2, μm 2 atd.) a určení optimální velikosti těchto sféroidů, které dosáhnou kultivací po určený časový úsek, kdy jsou podrobeny další analýze (Graf 1). Po dvou až třech dnech kultivace byla nejvíce zastoupena skupina neurosfér okolo 100 µm 2, jak u HIF-/-, tak i u wt. Graf 1: Graf znázorňuje závislost počtu primitivních neurosfér (wt a HIF-/-) na velikosti neurosféry (vyjádřených v μm 2 plochy focené neurosféry). Tento graf poukazuje na optimální velikost neurosfér, které dosáhnou po 3 dnech kultivace Vliv absence HIF-1α na počet neurosfér Vyhodnocení počtu neurosfér sloužilo k určení potence NSPC na základě frekvence tvorby neurosfér. Vycházíme z předpokladu, že jedna neurosféra je derivátem právě jedné NSPC a tudíž počet vzniklých neurosfér je přímo úměrný počtu NSPC v buněčné suspenzi na počátku kultivace. Celkový počet neurosfér je uveden v Grafu 2. V případě definitivních neurosfér bylo statisticky prokázáno (p<0,001), že jejich počet 43

44 Počet NSPC/1000 buněk Počet neurosfér/ 1 ml Počet neurosfér/ 1 ml je nižší u HIF-/-. V případě primitivních neurosfér je tento trend zachován, není však statisticky významný. Početní zastoupení NSPC v definovaném počtu vysetých buněk je uveden v Grafu 3. Tento graf shrnuje informace z Grafu 2 a ukazuje na sníženou schopnost dnsc tvořit neurosféry oproti pnsc. Toto snížení NSPC je navíc umocněno absencí HIF-1α Celkový počet primitivních neurosfér wt HIF -/ Celkový počet definitivních neurosfér *** wt HIF -/ Buněčná linie Buněčná linie Graf 2: Celkový průměrný počet primitivních a definitivních neurosfér s ohledem na jejich buněčnou linii. Hodnoty jsou průměrem 4-5 nezávislých experimentů jsou hodnoceny t-testem. Signifikantní rozdíl je značen *** (p<0,001) Zastoupení NSPC v celkovém počtu buněk 30 23, ,4 wt pnspc HIF -/- pnspc wt dnspc ,9 2,5 HIF -/- dnspc 0 Buněčná linie a stádium vývoje Graf 3: Celkový počet NSPC připadajících na 1000 vysetých buněk. 44

45 Počet neurosfér/1 ml Vliv absence HIF-1α na proliferaci a distribuci NSPC Hodnocení proliferace bylo provedeno na základě sledování velikosti neurosfér, které dosáhly během kultivace po 3 dnech. Vycházíme z předpokladu, že velikost, které dosáhne neurosféra za daný čas, závisí na rychlosti proliferace NSPC, které neurosféru tvoří. Jinými slovy, čím intenzivněji buňky tvořící neurosféru proliferují, tím větší velikosti neurosféra v daném čase dosáhne. Grafy 4 a 5 ukazují, že jak wt tak HIF-/- neurosféry dosahovaly v daném čase zhruba stejných velikostí, nebyl nalezen významný rozdíl pro většinu z uvedených velikostních kategorií. Jediný statisticky významný rozdíl v počtu neurosfér byl zaznamenán pro kategorii μm 2 u definitivních neurosfér (Graf 5), což je zároveň nejpočetněji zastoupená kategorie. Primitivní neurosféry odhalují podobný trend poklesu počtu u HIF-/-, ale nebyl vyhodnocen jako statisticky významný pro žádnou z kategorií (Graf 4) Distribuce primitivních neurosfér podle velikosti wt HIF-/ Velikost neurosféry (µm 2 ) Graf 4: Distribuce počtu primitivních neurosfér podle velikosti. U primitivních neurosfér nebyl prokázán signifikantní rozdíl v žádné kategorii. 45

46 Počet neurosfér/ 1 ml Distribuce definitivních neurosfér podle velikosti wt HIF-/ Velikost neurosféry (µm 2 ) Graf 5: Distribuce počtu definitivních neurosfér podle velikosti. V případě kategorie µm 2 byl prokázán signifikantní rozdíl. Statistika (T-test) byla provedena na 5 nezávislých měřeních, statisticky významný rozdíl je označen ** (p<0,01) Imunocytochemická analýza povrchových a vnitrobuněčných znaků pomocí fluorescenční mikroskopie Po vizuálním hodnocení neurosfér ve světelném mikroskopu následovalo hodnocení vybraných neurálních markerů pomocí imunocytochemie s následnou analýzou na fluorescenčním mikroskopu. V tomto kroku se náš zájem obrátil na skutečnost, zda se doopravdy jedná o neurosféry, tedy zda jsou exprimovány charakteristické neurální proteiny, případně i transkripční faktory účastnící se udržení pluripotence. Jednalo se o proteiny Sox2, Nestin a LewisX (popsány v kapitole 1.5.). Jako první ověření, zda naše neurosféry mají neurální charakter, jsme nechali primitivní neurosféry adherovat a diferencovat po dobu 48 hodin bez přítomnosti séra a růstových faktorů. Obr.13 zachycuje populaci NSPC exprimujících neurální protein Nestin a také občasnou přítomnost raných neuronů exprimujících intermediální protein β-iii-tubulin. 46

47 Obr.13: Primitivní neurosféry adherované po dobu 48 hodin a značené neurálními markery (Nestin a β-iii-tubulin). Sledovali jsme expresi tří různých znaků NSPC exprimovaných v různých oblastech buňky - Nestinu tvořícího filamenta v cytoplazmě, Sox2, což je jaderný transkripční faktor, a proteinu LewisX exprimovanému na povrchu buněčné membrány. Pro sledování byly použity wt i HIF-/- ve třech stádiích vývoje ESC, primitivní neurosféry a definitivní neurosféry (pro všechna stádia 2-3 nezávislá pozorování). HIF-/- i wt ESC exprimují nízkou hladinu Nestinu a naopak jsou silně pozitivní na přítomnost Sox2 v porovnání s pn a dn. U LewisX se zdá, že absence HIF-1α vede v ESC k jeho zvýšené expresi oproti pn a dn (Obr. 14, 21). Jak primitivní, tak definitivní neurosféry byly pozitivní na přítomnost Nestinu (Obr.15, 16). Obr. 18 srhnuje všechny snímky pro Nestin z hlediska vývojových stadií i přítomnosti/absence HIF-1α. ESC i primitivní neurosféry byly pozitivní na přítomnost Sox2, přičemž u definitivních neurosfér se exprese tohoto transkripčního faktoru jeví snížená (Obr. 15, 16). Obr. 17 shrnuje všechny snímky pro Sox2 z hlediska vývojových stádií i přítomnosti/absence HIF-1α. U primitivních neurosfér byl LewisX exprimován jak u wt, tak i HIF-/- (Obr. 20). U definitivních neurosfér bohužel nebylo možné pořídit snímky z neurosfér bez HIF-1α (malý počet a špatná schopnost adheze), jsou tedy uvedeny snímky pouze z wt, u nichž taktéž dochází k expresi LewisX (Obr. 21). 47

48 Obr. 14: Exprese Sox2 a Nestinu u nediferencovaných ESC (wt). Obr. 15: Exprese Sox2 a Nestinu u primitivních neurosfér (wt x HIF -/-). 48

49 Obr. 16: Exprese Sox2 a Nestinu u definitivních neurosfér (wt x HIF-/-). Obr. 17: Shrnutí exprese Sox2 pro všechna stádia (ESC, pn a dn) wt i HIF-/-. 49

50 Obr. 18: Shrnutí exprese Nestinu pro všechna stádia (ESC, pn a dn), wt i HIF-/-. Obr. 19: Značené ESC pro povrchový protein LewisX. 50

51 Obr. 20: Exprese povrchového proteinu LewisX pro primitivní neurosféry. Obr. 21: Snímky pro definitivní neurosféru wt, u níž dochází k expresi proteinu LewisX. 51

52 4.3. Imunocytochemická analýza vybraných povrchových a vnitrobuněčných znaků průtokovou cytometrií Z vyhodnocení proteinových markerů v celých neurosférách byla pozornost přesunuta na suspenzi wt a HIF-/- buněk připravených trypsinizací ESC, primitivních neurosfér (pn) a definitivních neurosfér (dn). Důraz byl kladen na dva znaky NSPC transkripční faktor Pax6 a povrchový znak LewisX, které byly měřeny ve všech vývojových stádiích. Doplňující měření bylo provedeno také pro další markery BLBP, Nestin a Sox2, které mělo posílit věrohodnost výsledků z dalších dvou metod. Byla snaha provádět všechna měření pro buněk, bohužel se to vždy nepodařilo (např. případě wt definitivních neurosfér pro Pax6, Graf 6). Pro suspenzi našich ESC, pn a dn byl jako první sledován jaderný transkripční faktor Pax6. Z Grafu 6 se zdá, že vyšší počet buněk exprimujících Pax6 mají ESC HIF- /- a u primitivních neurosfér je tento trend otočen (větší počet wt buněk exprimuje Pax6). Zajímavá skutečnost byla zaznamenána u definitivních neurosfér, u kterých vznikly dvě populace buněk pozitivních pro Pax6 jedna populace exprimovala tento faktor silně a druhá slabě (Graf 6, dole). 52

53 Graf 6: Exprese Pax6 u ESC, primitivních a definitivních neurosfér. Osy zobrazují závislost fluorescence na počtu buněk. Šedě jsou označeny negativní kontroly, zeleně pak buněčné populace pozitivní pro daný znak. Jako druhý byl sledován již výše zmiňovaný protein LewisX. Tento povrchový protein se zdá být silněji exprimován a ve větším počtu buněk u ESC HIF-/- oproti wt (Graf 7). 53

54 Graf 7: Exprese LewisX u ESC, primitivních a definitivních neurosfér. Osy zobrazují závislost fluorescence na počtu buněk. Šedě jsou označeny negativní kontroly, zeleně pak buněčné populace pozitivní pro daný znak. Pro primitivní neurosféry (wt i HIF-/-) jsme se rozhodli provést doplňující měření na průtokovém cytometru pro proteiny BLBP, Nestin a Sox2, abychom mohli rozhodnout o případném rozdílu v jejich expresi. V případě nestinu se zdá, že je silněji exprimován u wt oproti HIF-/-, v případě Sox2 se u wt se objevuje náznak subpopulace se silnější expresí tohoto markeru, která není patrná u HIF-/- (Graf 8). 54

55 wt HIF-/- wt HIF-/- wt HIF-/- Graf 8: Doplňující analýza BLBP, nestinu a Sox2 na průtokovém cytometru. Grafy znázorňují závislost fluorescence a počtu buněk. Šedě jsou vyvedeny negativní kontroly, barevně pak buněčné populace pozitivní pro daný znak Imunocytochemická analýza vybraných povrchových a vnitrobuněčných znaků metodou Western blot Toto kvalitativní až semi-kvantitativní hodnocení bylo pro zvoleno ověření či potvrzení již zjištěných hodnot předchozími metodami. Konkrétně byly analyzovány proteiny Sox2, Nestin, LewisX a Pax6, navíc byly zařazeny tři další proteiny β-actin jako kontrolní protein, dále pak s pluripotencí spojovaný protein Nanog a protein BLBP, jehož exprese je spojována s fenotypem radiálních glií a astrocytů. Měření opět 55

56 probíhalo pro vývojová stádia ESC, primitivní a definitivní neurosféry s cílem odhalit, zda se exprese těchto markerů liší v závislosti na přítomnosti HIF-1α a na vývojovém stádiu NSPC. Kompletní shrnutí exprese proteinů je v Obr.22. Pluripotentní marker Nanog byl v nižším zastoupení u definitivních neurosfér, z toho u HIF-1α deficientních byl velmi málo exprimován. Panneurální Sox2 byl zvýšen u pn oproti ESC a u definitivních neurosfér došlo opět k poklesu až vymizení. Obecně docházelo u markerů Sox2, Pax6, LewisX, BLBP a Nestinu ke zvýšené expresi u primitivních neurosfér. Pro Sox2, Pax6, BLBP a LewisX se navíc zdálo, že byly ve zvýšené míře přítomny u HIF- 1α deficientních ESC. U BLBP došlo prakticky k vymizení u HIF-1α decifientních dn. Obr.22: Western blot pro proteiny Nanog, Sox2, Pax6, LewisX, BLBP a Nestin. β-actin je kontrolní protein pro vzorky. 56

57 5. Diskuze Z literatury je známo, že v in vitro podmínkách je možná kultivace sféroidních útvarů známých jako neurosféry, které vznikají na základě přítomnosti neurálních kmenových či progenitorových buněk (Pacey et al., 2006). Studium těchto neurosfér bylo použito v předkládané diplomové práci jako model pro charakterizaci časného neurálního vývoje. Na základě dostupné literatury byla zvolena kultivace primitivních neurosfér vlivem exogenního LIF (Tropepe et al., 2001) a definitivních neurosfér vlivem FGF2 a EGF (Hitoshi et al., 2004). Jako ideální doba kultivace byly zvoleny tři dny, pokud trvala kultivace déle, docházelo ke srůstům neurosfér, čímž se rapidně zhoršily možnosti hodnocení. Zároveň je tato doba dostatečně dlouhá na to, aby se vyvinuly neurální znaky (Obr. 15, 16) a neurosféry dosáhly optimální velikosti, což dokazují naše výsledky i výsledky jiných laboratoří (Tropepe et al., 2001). Během kultivace byly patrné rozdíly mezi primitivními a definitivní neurosférami především v počtu. Tento fakt může záviset: 1) na přítomnosti LIF u primitivních neurosfér a 2) na kultivaci neurosfér za normoxických podmínek. Pozorovali jsme, že kultivací NSPC v kombinaci LIF+FGF2+EGF nedochází k přechodu na definitivní neurosféry, LIF přebíjí účinky FGF2 i EGF a udržuje charakter primitivních neurosfér. Nezveřejněné výsledky naší laboratoře svědčí o pozitivním vlivu 5% hypoxie na tvorbu definitivních neurosfér oproti normoxickým podmínkám. Vliv nízké koncentrace kyslíku na tvorbu neurosfér byl popsán i vědkyní Clarke z laboratoře profesora van der Kooye (2009). Jako podpůrný důkaz této teorie jsou i výsledky z porovnání velikostní distribuce neurosfér (Grafy 4 a 5, str. 45, 46). Roli zde tedy může hrát přítomnost exprimovaného HIF-1α, který je u NSPC stabilizován ve vezikulech a může ovlivňovat jejich osud (Roitbak et al., 2011). Důležitost exprese HIF-1α je nejvíce patrná v Grafu 2 a Grafu 3 (str. 44), kdy porovnáním wt a HIF-/- lze říci, že z buněk deficientních pro HIF-1α se tvoří jen velmi malé procento NSPC, což má vliv na již výše zmíněný pokles vzniku definitivních neurosfér. Stádiový přechod primitivních neurosfér v definitivní byl již popsán Hitoshim a kolektivem (2004). Dále je pro NSC známo, že v normoxii dochází stabilizací HIF-1α ve specifických vezikulech cytoplazmy k inhibici signální dráhy Notch (Roitbak et al., 2011). Je také dobře popsán vliv HIF-1α na stabilizaci a zvýšení Notch signalizace u 57

58 NSPC ze 14-ti denního embryonálního mozku (Gustafsson 2005). V našem případě lze tedy spekulovat o možnosti, že ztráta HIF-1α vede k omezení Notch signalizace u NSPC a tím pádem vzniká i malé množství definitivních neurosfér (Graf 2, str. 44). Na výsledcích (viz Příloha 1) z qpcr byl zaznamenán u HIF-/- dnspc nárůst v expresi proneurálního Mash1 oproti wt (Mash1 je negativně regulován signalizací Notch; de la Pompa et al., 1997). Tato změna tedy popisuje sníženou Notch signalizaci vlivem ztráty HIF-1α. Tuto teorii podporuje i snížená exprese BLBP, jehož exprese je závislá na aktivní Notch signalizaci u NSC (Anthony et al., 2005). V případě našich definitivních neurosfér došlo ke znatelnému úbytku BLBP u HIF-/-, což potvrzuje vymizení Notch signalizace u buněk deficientních pro HIF-1α. Zajímavé bylo také zjištění, že u HIF-/- byl rapidně snížen počet definitivních neurosfér o velikosti μm 2 (Graf 5, str. 46), což poukazuje na skutečnost, že HIF-1α je důležitý pro udržení specifické populace NSPC s jasně nastavenou dobou/intenzitou proliferace. Dalším hlavním výstupem tohoto výzkumu byla analýza různých proteinových markerů, které jsou exprimovány v jednotlivých vývojových stadiích NSPC. Největší důraz byl kladen na rané neurální/astrogliální znaky (Nestin, Sox2, Pax6, BLBP a LewisX) u HIF-1α deficientních ESC a z nich odvozených neurosfér. U metody Western blot jsme sledovali navíc expresi proteinu Nanog, jehož funkce je zásadní pro udržení pluripotence ESC (Chambers et al., 2003). Na Obr. 22 (str. 56) lze vidět expresi Nanogu i u primitivních neurosfér s poměrně vysokým obsahem pluripotentních buněk. Další pluripotentní a zároveň i panneurální transkripční faktor Sox2 (Avilion et al., 2003; Li et al., 1998) byl exprimován u všech vývojových stádii, což slouží jako podpůrný důkaz pro jeho pluripotentně-neurální funkci (Obr. 17, str. 49). Pokles exprese Sox2 společně s Nanogem u definitivních neurosfér svědčí o jejich maturaci a poklesu populace pluripotentních buněk (Obr. 17, str. 49 a Obr. 22, str. 56). Tento pokles je v případě Nanogu zesílen nepřítomností HIF-1α, což opět naznačuje možnou závislost na Notch signalizaci a její roli v inhibici diferenciace umocněn v přítomnosti HIF-1α. Protein intermediálních filament Nestin je nejvíce exprimován u NSPC a v případě ESC by měl být exprimován v minimu (Cattaneo a McKay, 1990), což dokazují i naše výsledky (Obr. 18, str. 50). Obecně je exprese Nestinu nejvyšší u 58

59 primitivních neurosfér, což je nejlépe vidět na Western blotu (Obr. 22, str. 56). Vyšší exprese dosahují neurosféry wt, u neurosfér deficientních pro HIF-1α lze pozorovat pokles jak pod mikroskopem, tak průtokovým cytometrem (Obr. 18, str. 50 a Graf 8, str. 55). Z těchto informací lze vyvodit snižující se neurální charakter neurosfér vlivem ztráty HIF-1α. Transkripční faktor Pax6 je podle literatury velmi hojně popisovaný protein významný především u NSPC (Hirata et al., 2002). Zvyšující se exprese u ESC HIF-/- (Obr. 22, str. 56) opět naznačuje, že ztráta HIF-1α má vliv na spontánní adaptaci neurálního charakteru ESC. Snižující se exprese Pax6 byla zaznamenána u HIF-1α deficientních primitivních neurosfér, což vypovídá o ústupu neurálních vlastností oproti wt (Graf 6, str. 53 a Obr. 22, str. 56). Rozdílná exprese Pax6 byla pozorována především mezi primitivními a definitivními neurosférami, kdy primitivní mají vyšší expresi tohoto transkripčního faktoru (Obr. 22, str. 56). Zajímavou informaci představuje Graf 6 (str. 53) pro definitivní neurosféry, kdy analýza na průtokovém cytometru odhalila dvě populace buněk exprimujících Pax6 v odlišné míře. Přítomnost těchto populací podává důkaz o heterogenitě vzniklých definitivních neurosfér a naznačuje existenci přechodné populace progenitorů u definitivních neurosfér. Podporou pro přítomnost více a méně Pax6-pozitivních buněk u definitivních neurosfér jsou pozorování naší laboratoří, kdy neurosféry izolované ze 14-ti denních embryonálních mozků (in vivo ekvivalent definitivních neurosfér kultivovaných z ESC) vykazují jasně oddělenou populaci silně Pax6 pozitivních buněk, jejichž exprese je navíc v rámci neurosféry zřetelně prostorově oddělená. Zároveň definitivní neurosféry deficientní pro HIF-1α jsou z velké části tvořeny buňkami s nízkou expresí Pax6. Toto pozorování nasvědčuje ztrátě neurálního charakteru vlivem nepřítomnosti HIF-1α u definitivních neurosfér. Povrchový epitop LewisX je součástí SSEA1 (Gooi et al., 1981) a je nejvíce exprimován u buněk s neurálním charakterem, objevuje se i u buněk pluripotentních (Allendoerfer et al., 1995; Capela a Temple, 2002). Je tedy pozorovatelný u primitivních i definitivních neurosfér (Obr. 20 a Obr. 21, str. 51). Významné změny exprese nebyly v rámci neurosfér pozorovány ani při analýze průtokovou cytometrií (Graf 7, str. 54). Rozdíl exprese LewisX na základě Western blotu je pouze při porovnání primitivních a definitivních neurosfér, kdy u definitivních exprese lehce poklesá (Obr. 22, str. 56). Rozdíl v expresi LewisX byl pozorován u ESC, kdy 59

60 deficience HIF-1α pravděpodobně způsobuje nárůst neurálních vlastností (Obr. 19, str. 50; Graf 7, str. 54; Obr. 22, str. 56). Podporu pro již několikrát zmiňovaný trend vzniku a udržení charakteru NSPC představuje detekce proteinu BLBP, který je in vivo transientně exprimován populací radiálních glií a specifické vyblokování tohoto proteinu má později ve vývoji za následek inhibici gliální a neuronální diferenciace (Feng et al., 1994). Exprese BLBP byla u primitivních neurosfér zvýšena oproti ESC, navíc se zdá, že za nepřítomnosti HIF-1α dochází ke zvýšení BLBP u ESC, přičemž podobný trend byl pozorován i pro Pax6 a Sox2 (Obr. 22, str. 56). Nezdá se však, že by exprese HIF-1α ovlivňovala rozdíl v hladině BLBP u primitivních neurosfér (Obr. 22, str. 56, Graf 8, str. 55). Jak LewisX, tak BLBP jsou považovány za specifické (byť transientně exprimované) znaky populace radiálních gliových buněk (viz výše). Jejich přítomnost v primitivních neurosférách, která byla zjištěna v našich pokusech společně s expresí neurálních znaků Sox2, Pax6, LewisX a Nestin, doplňuje představu o heterogenní populaci buněk, které se v neurosférách nachází v různém stupni neurální vyzrálosti, od pluripotentních přes více vyzrálé NSPC (Bez et al., 2003). Vyvstává otázka, zda snížená schopnost proliferace/růstu u HIF-1α deficientních neurosfér nějak koreluje s nárůstem neurálních znaků u ESC a následným poklesem těchto znaků, především u definitivních neurosfér. Nabízí se vysvětlení, že absence HIF-1α nějakým způsobem i za normoxie zablokuje BMP4 signalizaci, což by vysvětlovalo nárůst neurálních znaků u HIF-1α -/- na úkor snížené rychlosti proliferace NSPC u primitivních neurosfér. BMP4 je známý jako hlavni blokátor neurálního osudu buněk (Levine a Brivanlou, 2007). Mechanismus tohoto působení ale není jasný, mohl by být zprostředkovaný Notch signální dráhou, ale byl by potřebný další výzkum a ověření za využití HIF-1α knock-out buněk a inhibitorů Notch signální dráhy. Notch signalizace by mohla však vysvětlit rychlý nárůst neurálních markerů primitivních neurosfér wt, což je ve shodě s literaturou (Lowel et al., 2006). Snížená Notch signalizace následkem HIF-1α deficience by potom vysvětlovala sníženou schopnost proliferace u primitivních neurosfér, protože Notch ovlivňuje proliferaci raných NSC pšes cyklin-d1 (Das et al., 2010). Definitivní neurosféry a jejich snížená schopnost růstu/proliferace a pokles neurálních markerů je pravděpodobně závislý na Notch signální dráze a je probrán výše v této kapitole. Dalším výzkumem by tedy bylo potřeba 60

61 zjistit, zda námi pozorovaná změna schopnosti proliferace, sebeobnovy a exprese neurálních markerů u HIF-1α deficientních neurosfér (obzvláště u primitivních) je spojena s BMP4 signální dráhou a zda je alespoň v některém stádiu závislá na Notch signalizaci. 61

62 6. Závěr V rámci terapeutických možností dnešní doby se do popředí dostává především využití kmenových buněk. Studium neurálních kmenových buněk je důležité pro případné terapeutické využití při léčbě nádorových onemocnění či poranění nervové soustavy. Neurální kmenové buňky představují základní kámen vysoce komplikované hierarchie nejrůznějších podtypů buněk nervového systému. Pouze důkladným studiem těchto buněk můžeme zajistit jejich bezpečné a efektivní použití v buněčné terapii. Tato diplomová práce se zaměřovala především na popis vzniku in vitro útvarů vytvořených neurálními kmenovými a progenitorovými buňkami neurosférami. Tyto neurosféry byly studovány a porovnány na základě jejich vývojového stádia a zároveň porovnávány v závislosti na expresi HIF-1α, který se dostává do popředí z hlediska jeho důležitosti pro udržení vlastností NSPC. Na základě analýzi obrazu a imunochemických metod (průtokový cytometr, western blot a fluorescenční mikroskopie) jsme se pokusili zhodnotit vliv HIF-1α na neurální charakter NSPC v normoxických podmínkách, čili podmínkách běžné laboratorní kultivace. Tato práce přinesla několik zajímavých skutečností. Ztráta HIF-1α vede ať už přímo či nepřímo ke spontánní adaptaci neurálního charakteru ESC a především k omezené formaci definitivních neurosfér se značně heterogenními vlastnostmi. Spontánní adaptace neurálního charakteru buněk deficientních pro HIF-1α byla prokázána zvýšenou expresí Sox2, LewisX, Pax6 a BLBP oproti wt buňkám s přirozeně exprimujícím HIF-1α. Pokles neurálního charakteru primitivních neurosfér vlivem ztráty HIF-1α odráží nízká exprese Pax6 a Nestinu. Už primitivní neurosféry vykazují značnou heterogenitu v expresi různých neurálních/astrogliálních markerů, což vypovídá o přítomnosti různých buněčných subpopulací s rozdílným diferenciačním potenciálem. Na heterogenní vlastnosti definitivních neurosfér poukazuje především exprese transkripčního faktoru Pax6, který na základě nízké a vyšší exprese rozděluje populaci buněk na dvě podskupiny nezávisle na přítomnosti HIF-1α.. Dále jsou heterogenní vlastnosti podpořeny rozdílnou expresí proteinu BLBP a Nanogu, kdy oba proteiny jsou v poklesu u HIF-1α deficientních buněk. 62

63 Na základě výsledků jsme zformulovali tyto závěry: Ztráta HIF-1α vede u ESC ke zvýšenému neurogennímu potenciálu Primitivní NSPC a z nich vznikající primitivní neurosféry vykazují jasný neurální charakter bez ohledu na expresi HIF-1α. Již ve stádiu primitivních neurosfér se objevují buňky vykazující vlastnosti radiálních gliových buněk i neurálních progenitorů s různým diferenciačním potenciálem. Definitivní neurosféry se tvoří v menším počtu a ztrácí neurální znaky během kultivace v normoxických podmínkách oproti primitivním neurosférám, což je navíc umocněno absencí HIF-1α. 63

64 7. Seznam použitých zkratek ASCL1 -Achaete-Scute Complex Homolog 1 bhlh basic helix-loop-helix bhlh-pas - basic helix-loop-helix-per-arnt-sim BLBP brain lipid binding protein, protein vázající mozkový lipid BMP bone morphogenetic protein, kostní morfogenetický protein BSA bovine serum albumin, bovinní sérový albumin CNS central nervous system, centrální nervová soustava Dll1 Delta-like 1 dn definitivní neurosféra dnsc definitive neural stem cell, definitivní neurální kmenová buňka dpc days post coitum, dny po početí ESC embryonic stem cell, embryonální kmenová buňka FABP fatty acid binding protein, hydrofobní ligand-vázající protein FBS fetal bovine serum, fetální bovinní sérum FGF fibroblast growth factor, fibroblastový růstový faktor GE ganglionic eminence GFAP glial fibrilary acidic protein, gliálně-fibrilární acidický protein GLAST glutamate aspartate transporter, glutamátový transportér HBV - HIF-1α bearing vesicles, vezikuly nesoucí HIF-1α Hes - hairy and enhancer of split hesc human embryonic stem cell, lidská embryonální kmenová buňka Hey - Hairy Ears, Y-Linked HIF hypoxia inducible factor, faktor indukovaný hypoxií Hox gen- homeoboxový gen HRE hypoxia-responsive element ICM inner cell mass, vnitřní buněčná masa JAK Janus kinase, Janusova kináza LIF leukemia inhibitory factor, faktor inhibující leukémii Maml - Mastermind-Like MAPK mitogen-activated protein kinase, proteinová kináza aktivovaná mitogenem Mash1 mouse ASCL1, myší ASCL1 64

65 mesc mouse embryonic stem cell, myší embryonální kmenová buňka MyoD - myogenic differentiation NCAM neural cell adhesion molecule, adhezivní molekula neurálních buněk Nestin neuroepithelial stem cell protein, protein neuroepiteliálních kmenových buněk NF-κB - nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NICD Notch intracellular domain, intracelulární doména Notch Ngn - Neurogenin NSC neural stem cell, neurální kmenová buňka NSPC neural stem/progenitor cell, neurální kmenová/progenitorová buňka Oct4 octamer binding transkription factor 4, oktamer vázající transkripční faktor 4 Pax gen Paired box gen POU5F1 - POU Class 5 Homeobox 1 pn primitivní neurosféra pnsc primitive neural stem cell, primitivní neurální kmenová buňka RBP-Jk - recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region RC radial cell RGC radial glial cell, radiální gliová buňka SSEA stage specific embryonic antigen, antigen specifický pro stádium STAT - signal transducer and activator of transcription, signální transduktor a aktivátor transkripce Shh Sonic hedgehog Sox - SRY (Sex Determining Region Y)-Box SVZ subventricular zone TGF transforming growth factor, transformující růstový faktor Ub ubiquitin VHL von Hippel Lindau protein VZ ventricular zone, ventrikulární vrstva Wnt Wingless/Int-1 65

66 8. Citace Alison M.R., Poulsom R., Forbes S., Wright N.A An introduction to stem cells. J Pathol : Allendoerfer K.L., Durairaj A., Matthews G.A., Patterson P.H Morphological domains of Lewis-X/FORSE-1 immunolabeling in the embryonic neural tube are due to developmental regulation of cell surface carbohydrate expression. Dev Biol. 211: Allendoerfer K.L., Magnani J.L., Patterson P.H FORSE-1, an antibody that labels regionally restricted subpopulations of progenitor cells in the embryonic central nervous system, recognizes the Le(x) carbohydrate on a proteoglycan and two glycolipid antigens. Mol Cell Neurosci. 6: Andersson E.R., Sandberg R., Lendahl U Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138: Anthony T.E., Klein C., Fishell G., Heintz N Radial glia serve as neuronal progenitors in all regions of the central nervous system. Neuron. 41: Anthony T.E., Mason H.A., Gridley T., Fishell G., Heintz N Brain lipid-binding protein is a direct target of Notch signaling in radial glial cells. Genes Dev. 19: Arai Y., Funatsu N., Numayama-Tsuruta K., Nomura T., Nakamura S., Osumi N Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex. J Neurosci. 25: Artavanis-Tsakonas S., Rand M.D., Lake R.J Notch signaling: cell fate control and signal integration in development. Science. 284: Avilion A.A., Nicolis S.K., Pevny L.H., Perez L., Vivian N., Lovell-Badge R Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function. Genes Dev. 17: Bainter J. J., Boos A., Kroll K. L Neural induction takes a transcriptional twist. Dev. Dyn. 222(3): Ball D.W., Azzoli C.G., Baylin S.B., Chi D., Dou S., Donis-Keller H., Cumaraswamy A., Borges M., Nelkin B.D Identification of a human achaete-scute homolog highly expressed in neuroendocrine tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 90: Beddington R.S Induction of a second neural axis by the mouse node. Development. 120: Bettenhausen B., Hrabé de Angelis M., Simon D., Guénet J.L., Gossler A Transient and restricted expression during mouse embryogenesis of Dll1, a murine gene closely related to Drosophila Delta. Development. 121: Bez A., Corsini E., Curti D., Biggiogera M., Colombo A., Nicosia R.F., Pagano S.F., Parati E.A Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res. 993: Bopp D., Jamet E., Baumgartner S., Burri M., Noll M Isolation of two tissue specific Drosophila paired box genes, Pox meso and Pox neuro. EMBO J. 8:

67 Borges A.C., Marques S., Belo J.A The BMP antagonists cerberus-like and noggin do not interact during mouse forebrain development. Int J Dev Biol. 45: Botquin V., Hess H., Fuhrmann G., Anastassiadis C., Gross M.K., Vriend G., Scholer H.R New POU dimer configuration mediates antagonistic control of an osteopontin preimplantation enhancer by Oct-4 and Sox-2. Genes Dev. 12: Boyer L.A., Lee T.I., Cole M.F., Johnstone S.E., Levine S.S., Zucker J.P., Guenther M.G., Kumar R.M., Murray H.L., Jenner R.G., Gifford D.K., Melton D.A., Jaenisch R., Young R.A Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122: Bylund M., Andersson E., Novitch B.G., Muhr J Vertebrate neurogenesis is counteracted by Sox1-3 activity. Nat Neurosci. 6: Capela A., Temple S LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev Biol. 291: Carmeliet P., Dor Y., Herbert J.M., Fukumura D., Brusselmans K., Dewerchin M., Neeman M., Bono F., Abramovitch R., Maxwell P., Koch C.J., Ratcliffe P., Moons L., Jain R.K., Collen D., Keshert E Role of HIF-1alpha in hypoxia-mediated apoptosis, cell proliferation and tumour angiogenesis. Nature. 394: Casarosa S., Fode C., Guillemot F Mash1 regulates neurogenesis in the ventral telencephalon. Development.126: Castro D.S., Skowronska-Krawczyk D., Armant O., Donaldson I.J., Parras C., Hunt C., Critchley J.A., Nguyen L.,Gossler A., Göttgens B., Matter J.M., Guillemot F Proneural bhlh and Brn proteins coregulate a neurogenic program through cooperative binding to a conserved DNA motif. Dev Cell. 11: Cattaneo E., McKay R Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor. Nature. 347: Cau E., Gradwohl G., Fode C., Guillemot F Mash1 activates a cascade of bhlh regulators in olfactory neuron progenitors. Development. 124: Clarke L., van der Kooy D Low oxygen enhances primitive and definitive neural stem cell colony formation by inhibiting distinct cell death pathways. Stem Cells. 27: Collignon J., Sockanathan S., Hacker A., Cohen-Tannoudji M., Norris D., Rastan S., Stevanovic M.,Goodfellow P.N., Lovell-Badge R A comparison of the properties of Sox-3 with Sry and two related genes, Sox-1 and Sox-2. Development. 122: Conti L., Pollard S.M., Gorba T., Reitano E., Toselli M., Biella G., Sun Y., Sanzone S., Ying Q.L., Cattaneo E., Smith A Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3(9):e283. Cornell R.A., Eisen J.S Delta/Notch signaling promotes formation of zebrafish neural crest by repressing Neurogenin1 function. Development. 129: Covello K.L., Kehler J., Yu H., Gordan J.D., Arsham A.M., Hu C.J., Labosky P.A., Simon M.C., Keith B HIF-2α regulates Oct 4: effects of hypoxia on stem cell function, embryonic development, and tumor growth. Genes Dev. 20:

68 Dahlstrand J., Lardelli M., Lendahl U Nestin mrna expression correlates with the central nervous system progenitor cell state in many, but not all, regions of developing central nervous system. Brain Res Dev Brain Res. 84: Dailey L, Basilico C Coevolution of HMG domains and homeodomains and the generation of transcriptional regulation by Sox/POU complexes. J Cell Physiol. 186: Dailey L., Yuan H., Basilico C Interaction between a novel F9-specific factor and octamer-binding proteins is required for cell-type-restricted activity of the fibroblast growth factor 4 enhancer. Mol Cell Biol. 14: Das D., Lanner F., Main H., Andersson E.R., Bergmann O., Sahlgren C., Heldring N., Hermanson O., Hansson E.M., Lendahl U Notch induces cyclin-d1-dependent proliferation during a specific temporal window of neural differentiation in ES cells. Dev Biol. 348: de la Pompa J.L., Wakeham A., Correia K.M., Samper E., Brown S., Aguilera R.J., Nakano T., Honjo T., Mak T.W., Rossant J., Conlon R.A Conservation of the Notch signalling pathway in mammalian neurogenesis. Development. 124: Deutsch U., Dressler G.R., Gruss P Pax 1. A member of a paired Box homologous murine gene family is expressed in segmented structures during development. Cell. 53: Dingli D., Traulsen A., Michor F (A)Symmetric Stem Cell Replication and Cancer. PLoS Comput Biol. 3(3):e53. Dings J., Meixensberger J., Jager A., Roosen K Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43: Eliasson C., Sahlgren C., Berthold C.-H., Stakeberg J., Celis J.E., Betsholtz C., Eriksson J.E., Pekny M Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274: Episkopou V SOX2 functions in adult neural stem cells. Trends Neurosci. 28: Erceg S., Laínez S., Ronaghi M., Stojkovic P., Pérez-Aragó M.A., Moreno-Manzano V., Moreno-Palanques R., Planells-Cases R., Stojkovic M Differentiation of human embryonic stem cells to regional specific neural precursors in chemically defined medium conditions. PLoS One. 3:e2122. Evans M.J., Kaufman M.H Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292: Fainsod A., Deißler K., Yelin R., Marom K., Epstein M., Pillemer G., Steinbeisser H., Blum M The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4. Mech Dev. 63: Feng L., Hatten M.E., Heintz N Brain lipid-binding protein (BLBP): A novel signaling system in the developing mammalian CNS. Neuron. 12: Feng l., Heintz N Differentiating neurons activate transcription of the brain lipid-binding protein gene on radial glia through a novel regulatory element. Development. 121: Ferri A.L., Cavallaro M., Braida D., Di Cristofano A., Canta A., Vezzani A., Ottolenghi S., Pandolfi P.P., Sala M.,DeBiasi S., Nicolis S.K Sox2 deficiency causes neurodegeneration and impaired neurogenesis in the adult mouse brain. Development. 131:

69 Fidalgo M., Faiola F., Pereira C.F., Ding J., Saunders A., Gingold J., Schaniel C., Lemischka I.R., Silva J.C., Wang J Zfp281 mediates Nanog autorepression through recruitment of the NuRD complex and inhibits somatic cell reprogramming. Proc Natl Acad Sci U S A. 109: Fürthauer M., Thisse B., Thisse C Three different noggin genes antagonize the activity of bone morphogenetic proteins in the zebrafish embryo. Dev. Biol. 214(1): Georgala P.A., Carr C.B., Price D.J The role of Pax6 in forebrain development. Dev Neurobiol. 71: Gilbert S.F. Developmental Biology, 6th edition. Sunderland (MA): Sinauer Associates, p. ISBN: Ginis I., Luo Y., Miura T., Thies S., Brandenberger R., Gerecht-Nir S., Amit M., Hoke A., Carpenter M.K., Itskovitz-Eldor J., Rao M.S Differences between human and mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 269: Gooi, H. C., Feizi, T., Kapadia, A., Knowles, B. B., Solter, D., Evans, M. J Stagespecific embryonic antigen involves a 1-3 fucosylated type 2 blood group chains. Nature 292: Götz M., Huttner W.B The cell biology of neurogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6: Graham V., Khudyakov J., Ellis P., Pevny L SOX2 Functions to Maintain Neural Progenitor Identity. Neuron. 39: Gu Y.Z., Hogenesch J.B., Bradfield C.A The PAS superfamily: sensors of environmental and developmental signals. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 40: Gubbay J., Collignon J., Koopman P., Capel B., Economou A., Münsterberg A., Vivian N., Goodfellow P.,Lovell-Badge R A gene mapping to the sex-determining region of the mouse Y chromosome is a member of a novel family of embryonically expressed genes. Nature. 346: Guillemot F., Joyner A.L Dynamic expression of the murine Achaete-Scute homologue Mash-1 in the developing nervous system. Mech Dev. 42: Gustafsson M.V., Zheng X., Pereira T., Gradin K., Jin S., Lundkvist J., Ruas J.L., Poellinger L., Lendahl U., Bondesson M Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9: Hack M.A., Sugimori M., Lundberg C., Nakafuku M., Götz M Regionalization and fate specification in neurospheres: the role of Olig2 and Pax6. Mol Cell Neurosci. 25: Hart A.H., Hartley L., Ibrahim M., Robb L Identification, cloning and expression analysis of the pluripotency promoting Nanog genes in mouse and human. Dev Dyn. 230: Hartfuss E., Galli R., Heins N., Götz M Characterization of CNS precursor subtypes and radial glia. Dev Biol. 229: Haubensak W., Attardo A., Denk W., Huttner W.B Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101: Haubst N., Berger J., Radjendirane V., Graw J., Favor J., Saunders G.F., Stoykova A., Götz M Molecular dissection of Pax6 function: the specific roles of the paired domain and homeodomain in brain development. Development. 131:

70 Haunerland N.H., Spener F Fatty acid-binding proteins insights from genetic manipulations. Prog Lipid Res. 43: Heins N., Malatesta P., Cecconi F., Nakafuku M., Tucker K.L., Hack M.A., Chapouton P., Barde Y.A., Götz M Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci. 5: Hevner R.F., Hodge R.D., Daza R.A., Englund C Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: Conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus. Neurosci Res. 55: Hill R.E., Favor J., Hogan B.L., Ton C.C., Saunders G.F., Hanson I.M., Prosser J., Jordan T., Hastie N.D., van Heyningen V Mouse small eye results from mutations in a paired-like homeobox-containing gene. Nature. 354: Hirata T., Nomura T., Takagi Y., Sato Y., Tomioka N., Fujisawa H., Osumi N Mosaic development of the olfactory cortex with Pax6-dependent and -independent components. Brain Res Dev Brain Res. 136: Hitoshi S., Alexson T., Tropepe V., Donoviel D., Elia A.J., Nye J.S., Conlon R.A., Mak T.W., Bernstein A., and van der Kooy D Notch pathway molecules are essential for the maintenance, but not the generation, of mammalian neural stem cells. Genes &Dev.16: Hitoshi S., Seaberg R.M., Koscik C., Alexson T., Kusunoki S., Kanazawa I., Tsuji S., van der Kooy D Primitive neural stem cells from the mammalian epiblast differentiate to definitive neural stem cells under the control of Notch signaling. Genes Dev. 18: Hogenesch J.B., Chan W.K., Jackiw V.H., Brown R.C., Gu Y.Z., Pray-Grant M., Perdew G.H., Bradfield C.A Characterization of a subset of the basic-helix-loop-helix-pas superfamily that interacts with components of the dioxin signaling pathway. J Biol Chem. 272: Holst B.D., Wang Y., Jones F.S., Edelman G.M A binding site for Pax proteins regulates expression of the gene for the neural cell adhesion molecule in the embryonic spinal cord. Proc Natl Acad Sci U S A. 94: Hu C.J., Wang L.Y., Chodosh L.A., Keith B., Simon M.C Differential roles of hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) and HIF-2α in hypoxic gene regulation. Mol. Biol. Cell 23: Chambers I, Colby D, Robertson M, Nichols J, Lee S, Tweedie S, Smith A Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113: Chen H., Thiagalingam A., Chopra H., Borges M.W., Feder J.N., Nelkin B.D., Baylin S.B., Ball D.W Conservation of the Drosophila lateral inhibition pathway in human lung cancer: a hairy-related protein (HES-1) directly represses achaete-scute homolog-1 expression. Proc Natl Acad Sci U S A.94: Chew J.L., Loh Y.H., Zhang W., Chen X., Tam W.L., Yeap L.S., Li P., Ang Y.S., Lim B., Robson P., Ng H.H Reciprocal transcriptional regulation of Pou5f1 and Sox2 via the Oct4/Sox2 complex in embryonic stem cells. Mol Cell Biol. 25: Inoue T., Nakamura S., Osumi N Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate. Dev Biol. 219:

71 Ishibashi M., Ang S.-L., Shiota K., Nakanishi S., Kageyama R., Guillemot F Targeted disruption of mammalian hairy and Enhancer of split homolog-1 (HES-1) leads to up-regulation of neural helix loop helix factors, premature neurogenesis and severe neural tube defects. Genes Dev. 9: Jun S., Desplan C Cooperative interactions between paired domain and homeodomain. Development. 122: Kalmar T., Lim C., Hayward P., Muñoz-Descalzo S., Nichols J., Garcia-Ojalvo J., Martinez Arias A Regulated fluctuations in nanog expression mediate cell fate decisions in embryonic stem cells. PLoS Biol. 7:e Kamachi Y., Uchikawa M., Kondoh H Pairing SOX off with partners in the regulation of embryonic development. Trends Genet. 16: Kawaguchi A., Miyata T., Sawamoto K., Takashita N., Murayama A., Akamatsu W., Ogawa M., Okabe M., Tano Y., Goldman S.A., Okano H Nestin EGFP transgenic mice: Visualization of the self-renewal and multipotency of CNS stem cells. Mol. Cell. Neurosci. 17: Kim M., Morshead C.M Distinct populations of forebrain neural stem and progenitor cells can be isolated using side-population analysis. J Neurosci. 23: Kondoh H., Uchikawa M., Kamachi Y Interplay of Pax6 and SOX2 in lens development as a paradigm of genetic switch mechanisms for cell differentiation. Int J Dev Biol. 48: Kopan R., Nye J.S., Weintraub H The intracellular domain of mouse Notch: a constitutively activated repressor of myogenesis directed at the basic helix-loop-helix region of MyoD. Development.120: Kurtz A., Zimmer A., Schnütgen F., Brüning G., Spener F., Müller T The expression pattern of a novel gene encoding brain-fatty acid binding protein correlates with neuronal and glial cell development. Development. 120: Lang D., Powell S.K., Plummer R.S., Young K.P., Ruggeri B.A PAX genes: Roles in development, pathophysiology, and cancer. Biochem Pharmacol. 73:1 14. Lefebvre V., Dumitriu B., Penzo-Méndez A., Han Y., Pallavi B Control of cell fate and differentiation by Sry-related high-mobility-group box (Sox) transcription factors. Int J Biochem Cell Biol. 39: Lendahl U., Zimmerman L.B., McKay R.D CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. Cell. 60: Levine A.J., Brivanlou A.H Proposal of a model of mammalian neural induction. Dev Biol. 308: Levitt P., Rakic P Immunoperoxidase localization of glial fibrillary acidic protein in radial glial cells and astrocytes of the developing rhesus monkey brain. J Comp Neurol. 193: Li M., Pevny L., Lovell-Badge R., Smith, A Generation of purified neural precursors from embryonic stem cells by lineage selection. Curr. Biol. 8:

72 Liu C., Zhong Y., Apostolou A., Fang S Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochem Biophys Res Commun. 439: Lowell S., Benchoua A., Heavey B., Smith A.G Notch promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells. PLoS Biol. 4:e121. Lu X., Kang Y Hypoxia and Hypoxia-Inducible Factors Master Regulators of Metastasis. Clin Cancer Res. 16: Malas S., Postlethwaite M., Ekonomou A., Whalley B., Nishiguchi S., Wood H., Meldrum B., Constanti A., Episkopou V Sox1-deficient mice suffer from epilepsy associated with abnormal ventral forebrain development and olfactory cortex hyperexcitability. Neuroscience. 119: Malatesta P., Hack M.A., Hartfuss E., Kettenmann H., Klinkert W., Kirchhoff F., Götz M Neuronal or Glial Progeny: Regional Differences in Radial Glia Fate. Neuron. 37: Martin G Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci. 78: Matsuda T., Nakamura T., Nakao K., Arai T., Katsuki M., Heike T., Yokota, T STAT3 activation is sufficient to maintain an undifferentiated state of mouse embryonic stem cells. EMBO J. 18: Matsunaga E., Araki I., Nakamura H Pax6 defines the di-mesencephalic boundary by repressing En1 and Pax2. Development. 127: Meech R., Kallunki P., Edelman G.M., Jones F.S A binding site for homeodomain and Pax proteins is necessary for L1 cell adhesion molecule gene expression by Pax-6 and bone morphogenetic proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 96: Merkle F.T., Alvarez-Buylla A Neural stem cells in mammalian development. Curr Opin Cell Biol. 18: Merkle F.T., Tramontin A.D., García-Verdugo J.M., Alvarez-Buylla A Radial glia give rise to adult neural stem cells in the subventricular zone. Proc Natl Acad Sci U S A. 101: Messam C.A., Hou J., Major E.O Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody. Exp Neurol. 161: Misson J.P., Edwards M.A., Yamamoto M., Caviness V.S.J Identification of radial glial cells within the developing murine central nervous system: Studies based upon a new immunohistochemical marker. Dev Brain Res. 44: Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H., Segawa K., Murakami M., Takahashi K., Maruyama M., Maeda M., Yamanaka S The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell. 113: Miyata T., Kawaguchi A., Saito K., Kawano M., Muto T., Ogawa M Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131:

73 Mori H., Fujitani T., Kanemura Y., Kino-Oka M., Taya M Observational examination of aggregation and migration during early phase of neurosphere culture of mouse neural stem cells. J Biosci Bioeng.104: Mori T., Buffo A., Götz M The novel roles of glial cells revisited: the contribution of radial glia and astrocytes to neurogenesis. Curr Top Dev Biol. 69: Morrison S.J., Shah N.M., Anderson D. J Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88: Muramatsu T., Muramatsu H Carbohydrateantigensexpressed on stem cells and and early embryonic cells. Glycoconj J. 21: Nagy A., Rossant J., Nagy R., Abramow-Newerly W., Roder J.C Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90: Nakamura Y., Sakakibara S., Miyata T., Ogawa M., Shimazaki T., Weiss S., Kageyama R., Okano H The bhlh Gene Hes1 as a Repressor of the Neuronal Commitment of CNS Stem Cells. J Neurosci. 20: Navarro P., Festuccia N., Colby D., Gagliardi A., Mullin N.P., Zhang W., Karwacki-Neisius V., Osorno R., Kelly D., Robertson M., Chambers I OCT4/SOX2-independent Nanog autorepression modulates heterogeneous Nanog gene expression in mouse ES cells. EMBO J. 31: Nichols J., Zevnik B., Anastassiadis K., Niwa H, Klewe-Nebenius D., Chambers I., Scholer H., Smith A Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell. 95: Niwa H., Burdon T., Chambers I., Smith A Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12: Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat Genet. 24: Noback Ch.R., Strominger N.L., Demarest R.J., Ruggiero D.A. The Human Nervous System: Structure and Function, 6th edition. Totowa, New Jersey: Humana Press, p. ISBN: Pacey L., Stead S., Gleave J., Tomczyk K., Doering L Neural stem cell culture: neurosphere generation, microscopical analysis and cryopreservation. Nat Prot. doi: /nprot Palmieri S.L., Peter W., Hess H., Schöler H.R Oct-4 transcription factor is differentially expressed in the mouse embryo during establishment of the first two extraembryonic cell lineages involved in implantation. Dev Biol. 166: Pan G.J., Chang Z.Y., Scholer H.R., Pei D Stem cell pluripotency and transcription factor Oct4. Cell Res.12: Park D., Xiang A.P., Mao F.F., Zhang L., Di C.G., Liu X.M., Shao Y., Ma B.F., Lee J.H., Ha K.S., Walton N., Lahn B.T Nestin is required for the proper self-renewal of neural stem cells. Stem cells. 28:

74 Pesce M., Schöler H.R Oct-4: control of totipotency and germline determination. Mol Reprod Dev.55: Pesce M., Schöler H.R Oct-4: gatekeeper in the beginnings of mammalian development. Stem Cells. 19: Petros T.J., Tyson J.A., Anderson S.A Pluripotent stem cells for the study of CNS development. Front Mol Neurosci. 4:30. Pevny L.H., Sockanathan S., Placzek M., Lovell-Badge R A role for SOX1 in neural determination. Development. 125: Piccolo S., Sasai Y., Lu B., de Robertis E. M Dorsoventral Patterning in Xenopus: Inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86(4): Pixley S.K.R., De Vellis J Transition between immature radial glia and mature astrocytes studied with a monoclonal antibody to vimentin. Dev Brain Res. 15: Pratt T., Vitalis T., Warren N., Edgar J.M., Mason J.O., Price D.J A role for Pax6 in the normal development of dorsal thalamus and its cortical connections. Development. 127: Preston S.L., Alison M.R., Forbes S.J., Direkze N.C., Poulsom R., Wright N.A The new stem cell biology: something for everyone. Mol Pathol : Quinn J.C., Molinek M., Martynoga B.S., Zaki P.A., Faedo A., Bulfone A., Hevner R.F., West J.D., Price D.J Pax6 controls cerebral cortical cell number by regulating exit from the cell cycle and specifies cortical cell identity by a cell autonomous mechanism. Dev Biol. 302: Rao M.S. Neural Development and Stem Cells, 2nd edition. Totowa, New Jersey: Humana Press, p. ISBN: Reynolds B.A., Tetzlaff W.,Weiss S A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes. J. Neurosci. 12: Rizzoti K., Brunelli S., Carmignac D., Thomas P.Q., Robinson I.C., Lovell-Badge R SOX3 is required during the formation of the hypothalamo-pituitary axis. Nat Genet. 36: Roitbak T., Surviladze Z., Cunningham L.A Continuous Expression of HIF-1α in Neural Stem/Progenitor Cells. Cell Mol Neurobiol. 31: Sansom S.N., Griffiths D.S., Faedo A., Kleinjan D.J., Ruan Y., Smith J., van Heyningen V., Rubenstein J.L., Livesey F.J The Level of the Transcription Factor Pax6 Is Essential for Controlling the Balance between Neural Stem Cell Self-Renewal and Neurogenesis. PLoS Genet. 5:e Sasai Y., Lu B., Steinbeisser H., Geissert D., Gont L. K., de Robertis E. M Xenopus chordin: A novel dorsalizing factor activated by organizer-specific homeobox genes. Cell. 79: Scardigli R., Baumer N., Gruss P., Guillemot F., Le Roux I Direct and concentrationdependent regulation of the proneural gene Neurogenin2 by Pax6. Development. 130: Semenza G.L Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxiainducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol. 15: Shibata T., Yamada K., Watanabe M., Ikenaka K., Wada K., Tanaka K., Inoue Y Glutamate transporter GLAST is expressed in the radial glia-astrocyte lineage of developing mouse spinal cord. J Neurosci. 17:

75 Shimoda Y., Tajima Y., Osanai T., Katsume A., Kohara M., Kudo T., Narimatsu H., Takashima N., Ishii Y., Nakamura S., Osumi N., Sanai Y Pax6 controls the expression of Lewis x epitope in the embryonic forebrain by regulating α 1,3-fucosyltransferase IX expression. J Biol Chem. 277: Shimojo H., Ohtsuka T., Kageyama R Dynamic expression of Notch signaling genes in neural stem/ progenitor cells. Front Neurosci. 5:78. Shimozaki K., Nakashima K., Niwa H., Taga T Involvement of Oct3/4 in the enhancement of neuronal differentiation of ES cells in neurogenesis-inducing cultures. Development. 130: Schöler H.R., Ruppert S., Suzuki N., Chowdhury K., Gruss P New type of POU domain in germ linespecific protein Oct-4. Nature. 344: Simon M.C., Keith B The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nat Rev Mol Cell Biol. 9: Simpson T.I., Price D.J Pax6; a pleiotropic player in development. Bioessays. 24: Smith A.G., Heath J.K., Donaldson D.D., Wong G.G., Moreau J., Stahl M., Rogers D Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature 336: Stiles J., Jernigan T.L The Basics of Brain Development. Neuropsychol Rev. 20: Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D Initiation of neural induction by FGF signalling before gastrulation. Nature. 406: Sunabori T., Tokunaga A., Nagai T., Sawamoto K., Okabe M., Miyawaki A., Matsuzaki Y., Miyata T., Okano H Cell-cycle-specific nestin expression coordinates with morphological changes in embryonic cortical neural progenitors. J Cell Sci. 121: Suslov O.N., Kukekov V.G., Ignatova T.N., Steindler D.A Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc Natl Acad Sci U S A. 99: Takahashi K., Yamanaka S Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126: Takahashi-Tezuka M., Yoshida Y., Fukada T., Ohtani T., Yamanaka Y., Nishida K., Nakajima K., Hibi M., Hirano T Gab1 acts as an adapter molecule linking the cytokine receptor gp130 to ERK mitogen-activated protein kinase. Mol. Cell. Biol. 18: Tanaka S., Kamachi Y., Tanouchi A., Hamada H., Jing N., Kondoh H Interplay of SOX and POU factors in regulation of the Nestin gene in neural primordial cells. Mol. Cell. Biol. 24: Thiel G How Sox2 maintains neural stem cell identity. Biochem J. 450:e1-2. Thompson J.A., Ziman M Pax genes during neural development and their potential role in neuroregeneration. Prog Neurobiol. 95:

76 Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshall V.S., Jones J.M Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282:5391. Tole, S., Kaprielian, Z., Ou, S. K., Patterson, P. H FORSE-1: A positionally-regulated epitope in the developing rat central nervous system. J. Neurosci. 15: Tomita K., Nakanishi S., Guillemot F., Kageyama R Mash1 promotes neuronal differentiation in the retina. Genes Cells. 1: Ton C.C.T., Miwa H., Saunders G.F Small eye (Sey): Cloning and characterization of the murine homolog of the human aniridia gene. Genomics. 13: Torres J., Watt F.M Nanog maintains pluripotency of mouse embryonic stem cells by inhibiting NFkappaB and cooperating with Stat3. Nat Cell Biol. 10: Tropepe V., Hitoshi S., Sirard C., Mak T.W., Rossant J., van der Kooy D Direct Neural Fate Specification from Embryonic Stem Cells: A Primitive Mammalian Neural Stem Cell Stage Acquired through a Default mechanism. Neuron. 30: Walther C., Gruss P Pax-6, a murine paired box gene, is expressed in the developing CNS. Development.113: Walther C., Gruss P Pax-6, a murine paired box gene, is expressed in the developing CNS. Development. 113: Wang G.L., Semenza G.L Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 270: Wang R., Zhang Y.W., Zhang X., Liu R., Zhang X., Hong S., Xia K., Xia J., Zhang Z., Xu H. 2006a. Transcriptional regulation of APH-1A and increased γ-secretase cleavage of APP and Notch by HIF 1 and hypoxia. FASEB J. 20: Wang T.Y., Sen A., Behie L.A., Kallos M.S. 2006b. Dynamic behavior of cells within neurospheres in expanding populations of neural precursors. Brain Res. 1107: Watt F.M., Hogan B.L Out of Eden: stem cells and their niches. Science : Wilson S. I., Edlund T Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat Neurosci. 4 Suppl: Wislet-Gendebien S. Trends in Cell Signaling Pathways in Neuronal Fate Decision. InTech, p. ISBM: Wood H.B., Episkopou V Comparative expression of the mouse Sox1, Sox2 and Sox3 genes from pre-gastrulation to early somite stages. Mech. Dev. 86: Yamamizu K., Piao Y., Sharov A.A., Zsiros V., Yu H., Nakazawa K., Schlessinger D., Ko M.S.H Identification of Transcription Factors for Lineage-Specific ESC Differentiation. Stem Cell Reports.1: Yanagisawa M., Tega T., Nakamura K., Ariga T., Yu R.K Characterization of glycoconjugate antigens in mouse embryonic neural precursor cells. J Neurochem. 95: Yoshida K., Chambers I., Nichols J., Smith A., Saito M., Yasukawa K., Shoyab M., Taga T., Kishimoto T Maintenance of the pluripotential phenotype of embryonic stem cells through direct activation of gp130 signalling pathways. Mech. Dev. 45:

77 Zimmerman L. B., de Jesus-Escobar J. M., Harland R. M The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4. Cell.86: Internetové zdroje: URL1: URL2: book /ch01s02.html URL3: URL4: 77

78 9. Přílohy 1. Plakátové sdělení Role of HIF-1α in selfrenew and differentiation of neurospheres derived from embryonic stem cells na konferenci International Conference Analytical Cytometry VII Mikulov

79 Příloha č