Stanovení obsahu polyfenolů a celkové antioxidační kapacity v potravinách rostlinného původu. Z. Zloch, J. Čelakovský, A.

Transkript

1 Stanovení obsahu polyfenolů a celkové antioxidační kapacity v potravinách rostlinného původu Z. Zloch, J. Čelakovský, A. Aujezdská Ústav hygieny Lékařské fakulty UK, Plzeň Závěrečná zpráva o plnění výzkumného projektu podpořeného finančně Nadačním fondem Institutu Danone (v r. 2004) Plzeň, listopad 2004 Obsah: 1. Úvod s Metody studia antioxidační aktivity potravin s Metody zpracování vzorků potravin a stanovení obsahu některých antioxydantů a celkové antioxidační aktivity s Řešení výzkumného úkolu stanovení antioxidantů a celkové antioxidační aktivity potravin s Výsledky s Diskuse s Závěr s. 33

2 8. Literatura s Summary s Úvod Zdravotní význam potravin rostlinného původu je mnohostranný a převážně pozitivní. Opakovaně a jednoznačně jsou v epidemiologických studiích a v metaanalýzách jejich výsledků ověřovány statisticky významné asociace mezi velikostí příjmu těchto potravin a incidencí chronických chorob hromadného výskytu (zejména srdečně-cévních, nádorových, diabetu, obezity aj., 1), které svědčí o zdravotně protektivním účinku těchto potravin. Proto jsou v našich doporučeních, týkajících se spotřeby jednotlivých potravních druhů, ale také v Návodech pro předcházení civilizačním nemocem tyto komodity s důrazem uváděny jako stěžejní faktory prevence (2). Avšak v České republice je tradičně jejich spotřeba, hlavně ovoce, zeleniny, luštěnin a okopanin, relativně nízká. Mezi kvalitativní znaky potravin rostlinného původu, které determinují jejich pozitivní vztah ke zdravotnímu stavu populace, patří: zpravidla nízká energetická hodnota, většinou nízký obsah tuků a vysoký obsah monoenových a vícenenasycených mastných kyselin, výhodný obsahový podíl sodíku a draslíku, event. též hořčíku a vápníku, velký obsah různých forem vlákniny, nepřítomnost cholesterolu a obsah rostlinných sterolů, obsah vitaminů rozpustných ve vodě i v tucích, výskyt esenciálních stopových prvků a obsah chemoprotektivních látek s rozmanitými zdravotně ochrannými účinky na lidský organismus včetně antioxidační aktivity. Antioxidantům v potravě se v přítomné době věnuje velká pozornost, a to z hlediska jejich biologické účinnosti i z hlediska jejich výskytu v různých druzích potravin. Je tomu tak proto, že se považují za faktory eliminace nebo redukce oxidačních agens, látkových i enzymatických. Efektem této aktivity je ochrana struktur a funkcí mnohých biomolekul (polynenasycené mastné kyseliny v biomembránách, aminokyseliny v proteinech, sacharidy, různé typy nukleových kyselin aj.), udržování fysiologické rovnováhy mezi iniciátory oxidací (volné radikály, reaktivní formy kyslíku, dusíku aj.) a systémem antioxidační ochrany organismu a stimulace tvorby a aktivity endogenních antioxidantů (odborná literatura na téma rizik oxidačního poškození organismu a antioxidační ochrany je nesmírně bohatá a stále se rozšiřuje, např. 3-5). Úloha esenciálních a neesenciálních antioxidantů v ochraně zdraví a v prevenci vzniku a rozvoje nemocí je značně složitá, její mechanismus není dosud v uspokojující míře vysvětlený a zůstává zčásti hypotetický. Avšak výsledky velkého počtu experimentálních a klinických studií a epidemiologických šetření ukazují, že pravidelný a dostatečně velký příjem širokého spektra antioxidantů, esenciálních i neesenciálních (často nad doporučenou denní dávku) přímo koreluje s větší odolností organismu před chronickými chorobami hromadného výskytu, nebo jejich vznik a vývoj zpomalují. Potraviny jsou nositeli nejen klasických antioxidantů esenciální povahy (vitaminy C a E, karotenoidy, folát, selen a některé přechodné prvky), ale také několika tisíc druhů přírodních látek, které v modelových systémech a po aplikaci živým objektům vykazují srovnatelné, v mnoha případech dokonce intenzívnější antioxidační účinky. Tyto látky se mohou vyskytovat ve fysiologickém prostředí ve své redukované i oxidované formě a v závislosti na svém redukčním potenciálu a oxidoredukčních parametrech prostředí se mohou tyto formy - v interakci s jinými látkami - vzájemně přeměňovat. Oxidačně-redukční interakce mezi biomolekulami (lidskému organismu vlastními) nebo exogenními

3 oxidanty na jedné straně a těmito látkami na straně druhé mohou mít různý charakter, obvykle vzájemné výměny elektronů, vodíkových atomů nebo atomů resp. molekul kyslíku. Je dlouhou dobu známo, že analogické oxidačně-redukční reakce probíhají také v potravinách (žluknutí tuků a jeho blokování antioxidanty, enzymatické hnědnutí rostlinného materiálu) a také při jejich technologickém zpracování a skladování, ale rovněž v trávicím ústrojí savců. Potravní antioxidanty se aktivně projevují již v trávicí trubici, ale především po svém vstřebání (a po resorpci produktů svého trávení a štěpící činnosti bakteriemi tlustého střeva), a to v krevním oběhu i v cílových tkáních, zde v extra- i intracelulárním prostředí. Protože přírodní látky se po vstřebání často strukturně pozměňují po způsobu xenobiotik (biotransformacemi I. a II. typu), je studium jejich antioxidační aktivity nesnadné a metodicky není dosud plně zvládnuté (6). Z hlediska těchto poznatků je už po dobu několika let pozornost zaměřena na určení jednotlivých druhů přírodních látek a na separátní hodnocení jejich chemických vlastností a biologických účinků. Tato práce je velmi úporná, pomalá, nákladná a málo perspektivní, neboť počet dosud identifikovaných přírodních látek v rostlinném materiálu je vysoký (přes 6 tisíc) a většina z nich se vyskytuje v mnoha strukturně odlišných formách, často v závislosti na druhu a odrůdě rostliny, na vegetačních podmínkách jejich pěstování, na způsobu jejich zpracování apod. Podle nynějšího stavu poznání lze přírodní látky potravinářsky významných rostlin mající významnou oxidačně-redukční aktivitu roztřídit do několika skupin: Jednoduché fenoly a fenolové kyseliny (odvozené od hydroxyskořicové kyseliny) jednoduché a kondenzované nebo polymerisované polyfenoly stilbeny terpeny thioly a dithioly ad. (Také touto problematikou se dlouhodoběji a systematicky zabývá obsáhlá odborná literatura časopisecká i knižní, existují databáze dosud identifikovaných přírodních látek různého typu a jejich chemických a biologických vlastností, 7). 2. Metody studia a standardizace antioxidační aktivity přírodních látek a potravin V oblasti chemické analýzy a biologického hodnocení potravin byly v posledním desetiletí vypracovány početné metody, které umožňují stanovit tzv. celkovou antioxidační aktivitu vzorku (dále se bude často používat zkratka TAC tj. total antioxidant capacity). Jsou principiálně značně navzájem odlišné a postupně se vyvíjejí jejich modifikace. Jejich základním smyslem je charakterizovat v podmínkách blízkých fysiologickému prostředí jejich antioxidační popříp. redukční účinnost jako souhrnnou vlastnost potraviny. Celková antioxidační účinnost je analogicky a dnes už rutinně stanovována v klinicko-chemických laboratořích (ve vzorcích lidské krevní plazmy) a také v jiných typech biologického materiálu. Po řadu let se k tomuto účelu používá např. standardní radikálové metody s využitím setu fy Randox, Sev. Irsko. V následujícím stručném přehledu uvádíme - převážně jen jmenovitě - metody nejvýznamnější a dnes nejužívanější, jejich chemická charakterizace je předmětem našeho nedávného sdělení (12). Poněkud podrobnější popis principu a způsobu provedení uvedeme v kapitole o metodice naší výzkumné práce.

4 Metoda TEAC - (Trolox equivalent antioxidant capacity) využívá činidel, která iniciační akcí jiné látky přecházejí ve svou radikálovou formu, která je barevná a relativně stabilní. V přítomnosti antioxidačně aktivních složek extrahovaných ze vzorku potraviny se redukuje, a tím odbarvuje. Rychlost a míra odbarvení jsou úměrné antioxidační aktivitě vzorku. Aby vyjádření této kvality vzorku bylo standardní, stanovuje se shodným postupem TEAC v přítomnosti pouhého askorbátu, Troloxu, gallátu, epikatechinu nebo jiných klasických antioxidantů. Nejčastěji používaným prekursorem radikálu je tzv. ABTS, tj. 2,2 -azinobis.(3- ethylbenzothiazolin)-6-sulfonát, iniciátorem, který ji přeměňuje na modrozelený radikál ABTS+, je látka AAHP, tj. 2,2 -azobis(2-amidinopropan)dihydrochlorid, ale také peroxid vodíku, ferrokyanid, persíran nebo peroxidasa z křenu ve směsi s peroxidem vodíku aj. Metoda FRAP - (Ferric reduction ability of plasma) nebo FOX (Ferrous oxidation assay) je založena na redukci železitých komplexů jako je TPTZ (2,4,6- tripyridyl-s-triazin), ferrikyanid aj. které jsou téměř bezbarvé a po redukci a event. reakci s dalším činidlem vyváří barevné produkty, jakým může být např. berlínská modř. Metoda ORAC - (Oxygen radical absorbance kapacity) spočívá ve vytvoření peroxylového radikálu fykoeritrinu, a to jeho oxidací činidlem ABAP (2,2 - azobis-2-methyl- propionamidin). Radikál se určuje kvantitativně fluorimetricky a hodnotí se rychlost úbytku signálu po přidání testovaného vzorku. Lipidově peroxidační metody - provádějí se v pufrovaných modelových systémech obsahujících nenasycené mastné kyseliny a testovaný vzorek. Často se přidává homogenát živočišné tkáně, např. jater nebo mozku, a lipidová peroxidace se v ní iniciuje tetrachlormetanem nebo peroxidem. Je možné použít separovaných mikrosomů a iniciace lipoperoxidačních alterací směsí NADPH a železnaté soli nebo jinými systémy. S těmito typy testů jsme na našem pracovišti získali značné zkušenosti, a to v aplikacích na intoxikaci pokusných zvířat různými xenobiotiky a na kompenzace těchto nepříznivých změn esenciálními antioxidanty. Metody založené na detekci oxidačního poškození organismu - jsou nákladné a časově náročné, neboť se u pokusných zvířat vyvolává experimentální oxidační stres a současně nebo následně se v různých dávkách podává testovaný vzorek potraviny. Kritérii oxidačního poškození jsou např. 8-hydroxy-2 -deoxyguanosin v moči, karbonylované proteiny v krvi, tzv. TBARS (thiobarbituric acid reactive substances) v krvi, hydroperoxidy a konjugované dieny v krvi, F2-isoprostany a etan + pentan ve vydechovaném vzduchu. Novější speciální metody - Briggs-Rauscherova metoda využívající peroxylový radikál malonátu, jehož tvorba v umělém systému je moderována aplikovaným vzorkem. Kvantitativní hodnocení radikálu je oscilometrické, metoda je výjimečně citlivá. Jiná metoda spočívá ve vytvoření superoxidového anionu a jeho zhášení vzorkem, koncentrace tohoto radikálu se měří pomocí specifického biosenzoru. Osvědčují se rovněž metody neuvěřitelně jednoduché, např. směs měďnaté soli a činidla na sůl

5 měďnou (bathocuproin), určuje se množství redukované formy vytvořené potravními antioxidanty. Stanovení specifických antioxidantů ve vzorcích potravin - Velmi pravidelně se paralelně s určením TAC analyticky v témže vzorku zjišťuje obsah vitaminu C a E, celkový obsah karotenoidů nebo jednotlivě beta-karoten, lykopen aj. a celkový obsah fenolických látek, event. též separátně obsah flavonoidů. Celkové fenoly se zcela pravidelně určují kolorimetricky s použitím tzv. Folin-Ciocalteauova činidla (metoda je doporučena i v Meth.Enzymol.). V ambicioznějších a náročnějších studiích se do těchto analýz zařazují chromatografické separace, často na principu HPLC. Samostatným metodickým problémem stanovení TAC potravin je zpracování vzorku (především vlastní extrakce účinných látek, zahušťování popř. předčištění extraktů, jejich spolehlivé uchovávání) a použití standardů, pomocí nichž se TAC vzorků vyjadřuje. Úpravu vzorků před analýzou stručně pojednáme v kapitole o použitých pracovních postupech, o standardech byla zmínka v předchozích odstavcích. Souhrnně lze stanovení TAC potravin hodnotit jako snahu standardními postupy určit fysiologicky interpretovatelnou antioxidační účinnost vzorku, a to způsobem, který by byl metodicky, materiálově a instrumentálně dostupný a použitelný k početným sériovým analýzám. Jeho výsledky by měly korespondovat s biologicky se manifestující hodnotou téhož vzorku. 3. Metody zpracování vzorků potravin a stanovení obsahu některých antioxidantů a celkové antioxidační aktivity použité v této studii. Cílem této studie bylo stanovit u vybrané skupiny potravin rostlinného původu obsah vitaminu C, celkový obsah fenolických sloučenin, celkový obsah flavonoidů a celkovou antioxidační kapacitu (TAC). TAC byla stanovena paralelně čtyřmi rozdílnými chemickými metodami (jedna z nich - DPPH- se považuje spíše na orientační). Aplikované metody byly vybrány jako relativně nejvhodnější ze širší skupiny metodických postupů, jež byly testovány. Při tomto výběru se přihlíželo k praktické zvládnutelnosti metod, k jejich materiálové, instrumentální a časové náročnosti, ke spolehlivosti jejich výsledků a k jejich aktuálnosti z hlediska využívání na zahraničních pracovištích. (Nutno podotknout, že zkoušení a výběr metod narážel na různé nesnáze a překážky, mj. na výskyt věcných chyb v metodických návodech, a to i v renomovaných odborných časopisech.) Výběr a zpracování vzorků potravin

6 V plzeňských prodejnách (výjimečně na vlastních zahrádkách) bylo vybráno a zakoupeno několik desítek druhů čerstvého ovoce a zeleniny, čtyři druhy červeného a dva druhy bílého révového vína a dva druhy fermentovaného sypaného čaje. Podle možností se zaznamenala odrůda a země původu potraviny. Vzorky byly zpravidla zpracovány v den jejich nákupu, v případě potřeby byly uchovávány po minimální dobu v chladničce. Ovoce a zelenina byly mechanicky a v proudu vody očištěny (nerez náčiním) a pak extrahovány mixováním v moderním výkonném mixéru po dobu několika vteřin a při maximálních otáčkách nože. Bylo používáno extrakční směsi metanol - voda 1 : 1 a poměru 20 g potraviny a 80 ml. extrakční směsi. Hrubé homogenáty byly zfiltrovány přes papírový filtr nebo byly odstředěny (3 min., ot.) a supernatant případně ještě zfiltrován. Získaný extrakt byl ihned titiltrován na obsah vitaminu C a pak uložen v chladničce v uzavřené nádobě na dobu 1 max. 3 dnů. Byl zároveň použit ke stanovení celkových fenolů a flavonoidů a alikvotní podíl byl vakuově zahuštěn na méně než 1/3 původního objemu. Tento koncentrát byl v Eppendorfových zkumavkách uložen v mrazničce (cca -20 C) a v průběhu několika dnů až týdnů použit k laboratornímu stanovení TAC. Vzorky vín byly použity k analýzám bez předchozích úprav, čaje byly přelity vroucí destilovanou vodou, dekantovány a použity k analýzám bez zahušťování. Úprava potravinových vzorků před laboratorním stanovením jejich celkové antioxidační kapacity. Přikládáme kopie autentických manuálů používaných při těchto pracovních postupech. Čaje : 1 g suchého čaje ml vroucí vody, přelít, nechat 10 ml stát, při tom 2 3 krát zamíchat, pak slít a bez další úpravy zamrazit Révová vína : bez úpravy zmrazit Ovoce : očistit, evt. Oloupat (banány, citrusy apod.) Odvážit 20 g ovocné hmoty předem nakrájené na malé kousky, v mixéru přelít 80 ml extrakční směsi obsahující 40 ml metanolu a 40 ml vody, Mixovat při velkých obrátkách max. 10 vteř., Suspenzi zfiltrovat přes papírový filtr nebo odstředit při plných otáčkách a supernatant zfiltrovat přes papír (popříp. přes skleněnou fritu a při podtlaku).

7 Filtrát: 30 ml odpařit vakuově na přibl. 5 ml, doba odpařování by neměla překročit 1 hod. Odparek kvantitativně převést, tzn. S výplachem prázdné baňky do 10 ml odměrky, doplnit vodou po značku a promíchat. Tento zahuštěný extrakt rozlít do Eppendorfek a zamrazit. Zelenina listová, kořenová, cibule apod. : 20 g nakrájené zeleniny v mixéru zalít 80 ml 50 % směsi etanolu a vody, max. 10 vteř. mixovat, zfiltrovat nebo odstředit (podobně jako ovoce). Supernatant vakuově zahustit podobně jako u ovoce, odparek doplnit na objem 10 ml, promíchat a v Eppendorfkách zamrazit.! U každého vzorku zapsat do protokolu datum zpracování, druh potraviny a místo nákupu, navážku vzorku, objem extrakční směsi, podíl odebraný k zahuštění, a to i standardním provádění těchto operací! Chemické analýzy vzorků potravin Obsah vitaminu C byl stanoven ve většině čerstvých extraktů, a to klasickou Tillmansovou titrací s 2,6-dichlorfenolindofenolem (0.001 M). U barevných vzorků se bod ekvivalence indikoval s pomocí potenciometru. Jako standardu se použilo kyseliny L-askorbové p.a. kvality firmy Merck. Výsledky se vyjadřovaly v mg KA na 100 g původního vzorku. Stanovení obsahu vitaminu C v potravinách rostlinného původu Princip metody Kyselina askorbová je oxidována roztokem 2,6-dichlorfenolindofenolu, který tím přechází na bezbarvou leukobázi. Jeho nadbytek vytváří v kyselém prostředí červené zbarvení. Činidla

8 1. M roztok DFIF - přibl. 50 mg 2,6-dichlorfenolindofenolu nasypat do 250 ml vroucí vody a ještě horký roztok přefiltrovat přes papír do tmavé láhve. Uchovávat v chladničce, každý týden stanovit jeho faktor Faktorování činidla: Odvážit přesně 100 mg kys. askorbové, vsypat ji do 100 ml odměrky a rozpustit v přibl. 25 ml Vody, přidat přibl. 10 ml 5 % TCA a doplnit vodou po značku, dobře promíchat. Tento roztok je stabilní max. 3 hod. při pokoj. teplotě. Naplnit 5 10 ml byretu roztokem činidla Odpipetovat do malé Erlenm.baňky 1 ml zásob. roztoku KA, zředit napůl 5 % roztokem TCA a vodou a titrovat činidlem do vzniku výrazného červeného zbarvení přetrvávajícího Minim 10 vteř. Opakovat ještě dvakrát, odečíst spotřebudfif-činidla ( a ). Faktor DFIF č.: je-li a = počtu ml DFIF spotřebovaných při titraci KA, pak faktor f = 1000/a a odpovídá počtu umg KA vytitrovaných 1 militrem DFIF činidla. Každý týden korigovat! Analýza rostlinného materiálu 5 g analyzovaného vzorkukrátce rozmixovat s 25 ml 2 % TCA, u velmi měkkých potravin postačí vymačkat šťávu, směs zfiltrovat nebo krátce odstředit. 1ml filtrátu (je-li spotřeba činidla malá, pak 5 ml filtrátu i více) odpipetovat do baňky a titrovat DFIF činidlem do vzniku trvalejšího červeného zbarvení, tuto titraci provést 3krát (často se napoprvé přetitruje a tuto titraci je nutné pokládat jen za orientační). Výpočet koncentrace vitaminu C ve vzorku: Je-li n = navážka vzorku v g, b = objem extraktu vzorku odebraný k titraci v ml, a = spotřeba DFIF činidla při titraci v ml f = faktor činidla, pak mg vit. C ve 100 g vzorku = 3. a. f / n. b

9 Stanovení celkového obsahu fenolů se provádělo standardní, všeobecně doporučovanou a používanou fotometrickou metodou s Folin-Ciocaltauovým činidlem. Standardem byla kyselina gallová rozpuštěná v dest. vodě jako 0.6 M roztok. Stanovení celkového obsahu fenolických látek v potravinách rostlinného původu Činidla Folin-Ciocalteauovo činidlo: 10 ml činidla + 90 ml vody, v chladničce je údržné minim. 2 měs. Nasycený roztok uhličitanu sodného - přibl. 7.5 g sody + 95 ml vody, míchat, zbude-li nerozpuštěný zbytek, slít, uchovávat v láhvi s korkovou nebo gumovou zátkou Standardní roztok kys. gallové - 10 mg gallátu + 20 ml vody, v chladničce vydrží minim. 2 týdny Pracovní postup Použije se primární extrakt vzorku, není-li k dispozici, nebo dává-li slabou reakci, bere se 50 uml (mikrolitrů) zahuštěného extraktu Do zkumavek pipetovat: 1 ml zřed. Fol.-Ciocalt. Činidla 1 ml vody 50 uml vzorku

10 standard: totéž + 50 uml rozt. Gallátu slepý vz.: jen Fol.Ciocalt.č. + voda Promíchá se, ponechá se stát 5 min. a pak se ke všem zkumavkám přidá 1 ml nasyc. Roztoku uhlaičitanu sodného, Promíchá se a po 15 min. se fotometruje při 750 nm. Doporučuje se každý vzorek stanovit dvakrát. Stanovení celkového obsahu flavonoidů v extraktech se uskutečňovalo s pomocí orientační, málo specifické metody s hlinitou solí a dusitanem (8), standardem byl katechin. Přikládáme kopie původních pracovních návodů, podle kterých se analýzy prováděly. Stanovení obsahu flavonoidů v potravinách rostlinného původu Činidla 5 % roztok dusitanu sodného - 5 g Na NO ml vody, uchovávat v chladničce max. 14 dní 10 % rozt. chloridu hlinitého 10 g + 90 ml vody 1 M rozt. hydroxidu sodného 10 g NaOH a minim. množství vody (cca 5 ml), po rozpuštění doplnit na 250 ml, použít jen korkovou nebo gumovou zátku! 1 mm standardní roztok katechinu - 10 mg katechinu a 30 ml vody (nebo 30 mg ml), v chladničce vydrží minim.14 dní Pracovní postup Použít primární extrakt vzorku, není-li k dispozici nebo bude-li výsledné zbarvení slabé, použít zahuštěný extrakt Do zkumavek pipetovat:

11 0.5 ml vzorku 1.5 ml vody standard. vzorek: 0.5 ml stand.rozt. katechinu a 1.5 ml vody slepý vz.: jen 2 ml vody do všech zkumavek: přidat 0.2 ml roztoku dusitanu, promíchat, po 5 min. přidat 0.2 ml rozt. Chloridu hlinitého, promíchat a po dalších 5 min. přidat1.5 ml rozt. hydroxidu sodného a ihned 1 ml vody, promíchat, po 15 min. fotometrovat proti vodě při 510 nm. 4. Řešení vlastního výzkumného úkolu - stanovení TAC v potravinách rostlinného původu Tento úkol byl realizován rutinní aplikací čtyř různých laboratorních metod, kterými byly stanoveny hodnoty TAC v koncentrovaných vzorcích, (v případě vín v původním vzorku, v případě čajů v jejich extraktech). Hodnoty TAC jsou prezentovány - ve shodě s praxí jiných pracovišť (až na výjimky výhradně zahraničních) jako fyziologicky interpretovatelná vlastnost potravin, zjistitelná standardní laboratorní metodou na fyzikálně - chemickém základu, která naznačuje potenciální příznivý účinek na zdraví lidí a tento předpokládaný účinek lze kvantifikovat. Uvádíme stručně princip metod a pracovní návod na jejich provedení. Stanovení TAC v potravinách metodou FRAP Do pufrovaného prostředí se přidává kromě vzorku resp. standardu- roztok ferrikyanidu draselného a chloridu železitého. Látky s odpovídajícím redukčním potenciálem redukují železitou sůl na železnatou, která reaguje s ferrikyanidem za vzniku modrého zbarvení, které se měří spektrofotometricky (Spekol 210). Stanovení celkové antioxidační kapacity v potravnách metodou FRAP Přikládáme původní pracovní návod na použití této metody. Pracovní roztoky: 0.2 M fosfátový pufr ph 6.5 (Sörensen) 1 M roztok ferrikyanidu draselného

12 10 % rozt. kyseliny trichloroctové )TCA) 1. M roztok chloridu železitého Standard. roztok kys. gallové: 10 mg kys. gallové ml vody Pracovní postup: Do plastových zkumavek se dávkuje: 0.95 ml pufru + 50 uml tj. mikrolitrů vzorku ml rozt. ferrikyanidu, zahřívá se 20 min. při 50 st. C, přidá se 0.25 ml kys. trichloroctové a 0.5 ml vody 0.2 ml rozt. chloridu železitého promíchá se a po 15 min. se fotometruje při 700 nm. Stanovení se provádí vždy ve 3 paralelkách, souběžně se připravuje slepý vz., tj. stejná směs, ve které je místo vzorku 50 uml vody. Přikládáme původní manuál používaný v naší laboratoři při těchto analýzách. Jednotným standardem byl roztok kyseliny gallové, u každého vzorku se vždy prováděla 3 paralelní stanovení. Výsledky jsou vyjádřeny v ekvivalentním množství gallátu, které projevuje ve 100 g vzorku stejnou redukční aktivit, jednotně se používá aritmetického průměru ze tří stanovení a standardní odchylky od tohoto průměru. Stanovení TAC v potravinách metodou ovlivnění lipidové peroxidace v mozkovém homogenátu redukujícími faktory Z mnoha možných variant byl vybrán postup využívající čerstvě připraveného homogenátu mozku (přibl. 1 g tkáně dospělého potkana + 3 ml fysiologického roztoku, homogenizováno zabroušeným skleněným pístem ve skleněné zabroušené nádobě při ot./min. po celkovou dobu max. 20 vteřin). Mozek byl takto zpracován 2 dny a v některých případech 5 měsíců po usmrcení a po zmrazení tkáně při -20 st. C. Byl stanovován celkový obsah produktů lipidové peroxidace jejich reakcí s kyselinou 2-thiobarbiturovou (TBARS, thiobarbituric acid reactive substances) spektrofotometrickým způsobem. Toto stanovení se provádělo jednak v pouhém homogenátu a jednak v homogenátu s přidaným testovaným vzorkem. Zároveň se určovala intenzita zbarvení reakčního produktu thiobarbiturátu a malondialdehydu (standard TBARS) a míra ovlivnění lipidové peroxidace gallátem (standard redukujících faktorů potraviny). Výsledky byly vyjádřeny jako rozdíl v množství TBARS vzniklého v přítomnosti malondialdehydu a v přítomnosti testovaného vzorku a paralelně jako

13 rozdíl v množství TBARS ze vzorku a v přítomnosti známého množství gallátu. Antioxidační kapacita vzorku byla vyjádřena ekvivalentním množstvím gallátu (mg na 100 g vzorku), které snižuje lipoperoxidaci v mozkovém homogenátu ve stejné míře jako testovaný vzorek. Přikládáme pracovní postup při aplikaci této metody, který se v naší laboratoři používal. Stanovení TAC v potravinách metodou lipidové peroxidace v prostředí mozkového homogenátu Pracovní roztoky: 0.15 M roztok KCl g KCl ml vody Roztok kys. 2-thiobarbiturové (TBA) g NaOH ml vody, po rozpuštění přidat 1. g TBA, rozpustit a přidat 1 ml kys. o-fosforečné konc. a 25 ml vody 10 % rozt. kyseliny trichloroctové (TCA) - 10 g TCA rozpustit v 90 ml vody Standardní roztok malondialdehydu (MDA) - 0,47 g MDA rozpustit ve 100 ml vody (odp mmol/l) Stand. roztok kyseliny gallové - 10 mg na 100 ml vody Pracovní postup: Homogenizovat přibl. 1 g mozku s 3 ml rozt. KCl, podle potřeby další podíl tkáně k dosažení dostatečného celkového množství mozkového homogenátu, homogenáty spojit Do plast. zkumavek pipetovat: 0. ml rozt. KCl ml homogenátu ml vzorku potraviny + 1 ml rozt. TCA a 0.5 ml rozt. TBA promíchat a vlžit do lázně teplé 80 st. C na 45 min. Stand. roztoky: a/ stand. MDA - 1,6 ml KCl ml, tj. 10 uml stand.rozt. MDA + 1 ml rozt. TCA ml rozt. TBA b/ homogenát + TBA - 1,1 ml KCl ml homogenátu + 1 ml TCA ml TBA

14 zahřívat 45 min. při 80 st. C Všechny vzorky, standardy a slepý vz. (1.6 ml KCl + 1 ml TCA ml TBA) ochladit v proudu studené vody, krátce odstředit při 4000 ot. a fotometrovat proti vodě při 535 nm. Stanovení TAC v potravinách pomocí radikálu DMPD Sloučenina DMPD (dimethylfenylendiamin) se v roztoku převede na svou radikálovou formu, která je relativně stabilní a zároveň barevná, působením železité soli. Po přidání vzorku (zkoncentrovaného extraktu potraviny) se v přítomnosti redukčních faktorů radikál zháší, a tím odbarvuje. Tato změna se hodnotí spektrofotometricky. Standardem byla opět kyselina gallová, na jejíž ekvivalentní množství se antioxidační aktivita vzorku přepočítávala. Přikládáme pracovní návod na provedení stanovení TAC touto metodou, který se v naší laboratoři používal. Stanovení TAC v potravinách rostlinného původu pomocí volného radikálu DMPD Pracovní roztoky 1. M Na-acetátový pufr, ph 5.25 : 11 g octanu Na se rozpustí ve 400 ml vody 1.5 ml kys. octové konc. se přidá ke 100 ml vody, smíchá se 320 ml prvého + 80 ml druhého roztoku Roztok chloridu železitého : 20 mg FeCl-3. 6 H2O se rozpustí ve 100 ml vody Roztok DMPD (vždy zcela čerstvý!!!) -: 25 mg DMPD + 5 ml vody 10 mm roztok Troloxu : 25 mg Troloxu rozpustit v 10 ml lihu Před započetím práce se připraví čerstvý základní roztok radikálu DMPD (+.) :

15 30 ml pufru ml rozt. chloridu železitého ml rozt. DMPD Pracovní postup Do plastových zkumavek pipetovat: 2 ml základ. roztoku DMPD + 50 uml vzorku (někdy je nutné vzorek ředit, a to i 10 nás.) Stand. roztok: a/ - 2 ml zákl.rozt. DMPD a 50 uml rozt. Troloxu (paralelně gallát, epikatechin) 2b/ 2 ml zákl.rozt. DMPD a 50 uml vody Promíchat, po 10 min. fotometrovat proti vodě při 505 nm. Stanovení TAC v potravinách pomocí radikálu DPPH Princip stanovení TAC touto metodou je analogický metodě předchozí, využívá se sloučeniny dinitrofenylpikrylhydrazinu, která je v etanolovém roztoku v barevné radikálové formě. Její redukce se projevuje odbarvením roztoku, které se měří spektrofotometricky. Také v tomto případu se jako standard používal gallát a určovalo se jeho množství, které je ekvivalentní redukční účinnosti testovaného vzorku. Metoda byla přiřazena k testování vzorku dodatečně a považujeme ji za metodu orientační. Přikládáme pracovní postup předepsaný na našem pracovišti pro aplikaci této metody. Reakční roztoky: 0.2 mm-dpph v metanolu ( vždy čerstvý) Pracovní postup: 1.25ml roztoku DPPH + 50ul roztoku, zahřívat 30 min. při 37st.C, fotometrovat při 517 nm. Jako standard použít gallát. Stručný přehled metod, které byly vyzkoušeny k testování TAC a z různých důvodů, zejména pro pracovní obtíže, rušivé vlivy během pracovního postupu, nevyhovující reprodukovatelnost výsledků apod., byly jako nevyhovující opuštěny. Metoda FRAP modifikace s chloridem železitým a s TPTZ nereprodukovatelné výsledky.

16 Metoda s využitím lipidové peroxidace - použití jaterního homogenátu nedostatečně výrazné výsledky jak u vlastního homogenátu, tak po přidání vzorku, modifikace s kyselinou linolovou samotnou nebo s přidáním Tweenu 20 resp. 40 a modifikace s přidáním butylhydroxyanisolu - nesprávné výsledky ovlivněné neznámými faktory, modifikace s chloridem železnatým a thiokyanátem dtto, metoda s DPPH, modifikace s ferrozinem a s TPTZ - nesprávné výsledky při zhotovování kalibrační křivky. U metody 1., 2. a 3. byly vždy stejným pracovním postupem stanoveny aktivity odstupňovaných koncentrací standardních antioxidantů, tj. gallátu, epikatechinu a Troloxu (kalibrační křivky). Byl tak ověřován reálně stanovitelný koncentrační rozsah antioxidantů a linearita vztahu koncentrace x extinkce. 5. Výsledky stanovení přirozených antioxidantů a celkové antioxidační kapacity v potravinách Jsou přehledně uvedeny v tabulkách: 1 Obsah vitaminu C, fenolů a flavonoidů ve vzorcích ovoce a čaje 2 Obsah vitaminu C, fenolů a flavonoidů ve vzorcích zeleniny 3 Porovnání celkového obsahu fenolů v naší laboratoři a na zahraničních pracovištích 4 Hodnoty TAC zjištěné čtyřmi různými metodami v ovoci a čaji 5 Hodnoty TAC zjištěné čtyřmi různými metodami v zelenině 6 Porovnání hodnot TAC zjištěných u stejných druhů potravin v naší laboratoři a na zahraničních pracovištích 7a b Statistické zhodnocení významnosti korelace mezi výsledky FRAP a DMPD 8 Statistické zhodnocení významnosti korelace mezi výsledky DPPH a FRAP

17 9a b Statistické zhodnocení významnosti korelace mezi výsledky FRAP a LPX 10a b -Statistické zhodnocení významnosti korelace mezi výsledky vitaminu C a DMPD 11 Statistické zhodnocení významnosti korelace mezi výsledky vitaminu C a FRAP 12a b- Statistické zhodnocení významnosti korelace mezi výsledky polyfenolů a FRAP 13 Statistické zhodnocení významnosti korelace mezi výsledky polyfenolů a DMPD Tab. 1: Obsah některých přírodních antioxidantů v potravinách Potravina Vitamin C (mg/100g) Fenoly (mg KG/100 g) Flavonoidy (mg katechinu/100g) Avokádo 3,2 11,0 ± 0,7 Meloun vodní 3,6 22,5 ± 7,0 5,9 ± 0,6 Kiwi 99,0 101,0 ± 4,0 5,7 ± 0,1 Nektarinka 11,5 61,8 ± 4,6 15,4 ± 0,1 Švestka 5,4 122,0 ± 8,0 25,1 ± 0,1 Hruška 2,5 83,0 ± 6,8 11,1 ± 0,6 Jablko 10,5 155,5 ± 6,8 61,3 ± 0,3 Limetka 23,0 74,1 ± 3,6 24,6 ± 0,1 Mandarinka 46,8 20,7 ± 0,4 8,3 ± 1,0 Grapefruit 51,3 20,4 ± 0,6 10,7 ± 0,7 Citron 41,4 19,7 ± 0,5 7,4 ± 0,9 Pomeranč 56,0 113,2 ± 2,3 15,5 ± 1,0 Hrozen červený 0,34 259,0 ± 7,4 25,0 ± 2,0 Hrozen bílý 0,50 202,0 ± 3,8 48,0 ± 2,5 Víno červené 0,40 60,8 ± 3,8 45,7 ± 1,1 (Frankovka) Víno červ.(merlot) 2,6 72,0 ± 2,4 32,8 ± 0,9 Víno červ.(portugal) 0,54 63,1 ± 2,5 47,5 ± 1,6

18 Víno bílé (Ryzlink) 83,0 ± 10,4 2,7 ± 0,1 Víno bílé (Veltlín) 23,2 ± 0,8 6,8 ± 0,2 Čaj Earl grey 53,0 ± 5,2 (na 1 g) 19,5 ± 0,5 (na 1 g) Čaj indický 62,8 ± 1,9 (na 1 g) 18,4 ± 0,3 (na 1 g) Tab. 2: Obsah některých přírodních antioxidantů v potravinách Potravina Vitamin C (mg/100g) Fenoly (mg KG/100 g) Flavonoidy (mg katechinu/100g) Česnek 2,6 31,4 ± 1,7 5,6 ± 2,0 Cibule žlutá 8,4 42,7 ± 0,7 5,6 ± 0,7 Cibule červená 5,4 16,4 ± 0,7 8,9 ± 0,3 Mrkev 3,4 33,0 ± 3,0 11,5 ± 0,6 Paprika žlutá 109,6 93,4 ± 8,4 5,7 ± 1,0 Paprika červená 122,0 53,1 ± 6,3 5,8 ± 1,2 Kapusta 64,0 164,0 ± 4,7 6,9 ± 0,6 Okurka salátová 1,4 29,5 ± 1,1 5,1 ± 0,8 Zelí bílé 24,9 47,4 ± 1,3 3,2 ± 0,7 Zelí čínské 6,3 48,9 ± 3,4 9,5 ± 1,2 Brokolice 29,1 108,4 ± 4,6 13,9 ± 0,7 Pórek 10,1 92,1 ± 0,7 6,0 ± 1,6 Špenát 9,6 103,0 ± 1,3 61,0 ± 2,2 Salát hlávkový 3,5 48,6 ± 1,6 24,5 ± 1,9 Květák 34,0 51,7 ± 1,1 6,9 ± 2,0 Rajče 12,8 31,4 ± 1,7 8,4 ± 0,4 Cuketa 1,7 22,4 ± 4,3 4,5 ± 1,5

19 Brambor 3,4 64,3 ± 2,6 3,9 ± 0,3 Tab. 3: Porovnání celkového obsahu fenolických látek zjištěných v laboratoři autorů této práce a na pracovištích autorů zahraničních Vzorek potraviny Obsah fenolů (mg KG/100g) Literární pramen Naše Zahraniční pracoviště pracoviště Červené víno (Merlot) a Bílé víno (Ryzlink) a Grapefruit a Švestky a Mrkev a Zelí (kvašené) a Špenát a b Cibule bílá b Brambor b Salát hlávkový b Okurka salátová b a.a. Lugási, J. Horvási, 2003 (23) b.y.-f. Chu et al., 2002 (24) Tab. 4: Hodnoty TAC zjištěné různými metodami (mg KG/100g)

20 Potravina FRAP LPX DMPD DPPH Avokádo 51,0 ± 7,7 9,0 ± 0,3 66,6 ± 0,8 54,4 ± 2,7 Meloun vodní 65,6 ± 7,6 6,6 ± 0,9 61,3 ± 1,8 23,4 ± 0,4 Kiwi 57,0 ± 3,6 173,0 ± 81,6 65,4 ± 7,2 Nektarinka 105,5 ± 1,2 9,0 ± 1,5 103,5 ± 6,9 Švestka 3,9 ± 0,3 11,3 ± 0,7 2,6 ± 0,1 Hruška 86,0 ± 1,3 24,8 ± 1,1 8,5 ± 0,5 15,1 ± 0,6 Jablko 92,4 ± 7,2 7,3 ± 1,5 432,0 ± 4,1 59,1 ± 1,4 Limetka 187,0 ± 2,0 20,6 ± 0,7 Mandarinka 116,7 ± 3,7 10,7 ± 0,5 296,0 ± 10,6 24,5 ± 1,1 Grapefruit 187,3 ± 10,3 17,9 ± 7,3 297,5 ± 3,0 34,6 ± 0,6 Citron 48,3 ± 3,4 14,1 ± 2,6 287 ± 5,6 11,3 ± 0,4 Pomeranč 84,1 ± 3,1 7,1 ± 0,2 113,9 ± 2,2 Hrozen červený 379,0 ± 5,3 56,8 ± 1,8 28,3 ± 0,5 Hrozen bílý 456,0 ± 3,4 65,2 ± 9,8 19,5 ± 0,2 Víno červené 1323 ± ,2 ± 1,2 124,7 ± 4,9 (Frankovka) Víno červené 102,4 ± 2,5 (Merlot) Víno bílé (Veltlín) 56,6 ± 11,1 178,2 ± 47,5 80,4 ± 2,2 Čaj Earl grey 39,2 ± 0,4 20,0 ± 2,3 45,7 ± 2,7 (na 1 g) (na 1 g) (na 1 g) Čaj indický 39,6 ± 0,9 56,4 ± 0,9 15,1 ± 0,7 47,4 ± 3,3 (na 1 g) (na 1 g) (na 1 g) (na 1 g) KG kyselina gallová

21 FRAP ferric reduction ability of plasma LPX lipidová peroxidace DMPD N,N-dimethyl-1,4-fenylendiamin-dihydrazyl DPPH 2,2-difenyl-1-picryl-hydrazyl Aritmetické průměry ± S.D Tab. 5: Hodnoty TAC zjištěné různými metodami (mg KG/100g) Potravina FRAP LPX DMPD DPPH Česnek 5,4 ± 0,2 86,3 ± 2,0 290,2 ± 1,0 Cibule žlutá 178,0 ± 4,2 116,7 ± 5,4 186,1 ± 2,9 22,9 ± 0,1 Cibule červená 142,2 ± 3,0 103,0 ± 2,0 Mrkev 17,9 ± 0,2 12,6 ± 0,5 Paprika zelená 10,3 ± 1,8 11,0 ± 1, ± 72 56,6 ± 8,8 Paprika červená 67,2 ± 5,1 5,1 ± 0,8 665,0 ± 63,7 6,2 ± 0,3 Kapusta 98,3 ± 1,3 39,5 ± 1,1 102,9 ± 9,4 59,7 ± 5,8

22 Okurka salátová 26,5 ± 2,0 16,2 ± 0,7 3,4 ± 0,3 14,1 ± 0,1 Zelí bílé 97,1 ± 0,2 26,2 ± 0,9 32,6 ± 0,9 Zelí čínské 82,8 ± 2,1 25,5 ± 0,7 33,3 ± 0,7 10,3 ± 0,4 Brokolice 81,5 ± 3,9 19,9 ± 1,1 37,1 ± 0,5 20,4 ± 0,2 Pórek 14,7 ± 2,3 19,8 ± 0,4 20,7 ± 0,9 15,3 ± 4,7 Špenát 75,6 ± 1,1 33,3 ± 6,4 8,5 ± 0,1 21,1 ± 0,9 Salát hlávkový 59,8 ± 1,4 27,0 ± 3,1 7,8 ± 0,2 22,2 ± 1,2 Květák 96,2 ± 11,1 139,7 ± 1,2 31,8 ± 0,8 Rajče 66,6 ± 13,6 215,4 ± 8,5 343,0 ± 2,4 15,1 ± 0,3 Cuketa 13,4 ± 3,9 1,1 ± 0,2 Brambor 17,9 ± 0,5 4,7 ± 0,8 14,6 ± 0,2 KG kyselina gallová FRAP ferric reduction ability of plasma LPX lipidová peroxidace DMPD N,N-dimethyl-1,4-fenylendiamin-dihydrazyl DPPH 2,2-difenyl-1-picryl-hydrazyl Aritmetické průměry ± S.D

23 Tab. 6: Porovnání hodnot TAC zjištěných u podobných druhů potravin na řešitelském pracovišti a v zahraničních laboratořích

24 Vzorek potraviny FRAP (modifikace metody) Literární pramen Naše pracoviště (mg KG/100g) Zahraniční pracoviště Vyjádření výsledků metody Avokádo 51 5 Fe-TPTZ a Jablko 92 3,3 Fe-TPTZ a Grapefruit Fe-TPTZ a Kiwi 57 7 Fe-TPTZ a Meloun vodní 66 6 Fe-TPTZ a Pomeranč Fe-TPTZ a Zelí 97 6 Fe-TPTZ a Květák 96 4 Fe-TPTZ a Cibule bílá Fe-TPTZ a Čaj černý Fe-TPTZ a Brambor 18 1 Fe-TPTZ b Špenát 76 1 Fe-TPTZ b Cibule bílá Fe-TPTZ b Brokolice 82 0,4 Fe-TPTZ b Rajče 67 0,34 Fe-TPTZ b Rajče µmol Trolox/100g such.vz. Brokolice µmol Trolox/100g such.vz. Špenát µmol Trolox/100g such.vz. c c c a.n. Pellegrini et al., 2003 b.b. Halverson et al., 2002 c.b. Ou et al., 2002

25 Tab.7 a,b POROVNÁNÍ FRAP x DMPD Vstupní data FRAP 98,3 56,7 51,0 51,0 65,6 57,0 117,0 187,0 380,0 456,0 1323,0 DMPD 103,0 140,0 343,0 67,0 104,0 173,0 2960,0 298,0 231,0 275,0 1372,0 FRAP 56,6 48,3 84,1 39,2 39,6 66,6 56,7 67,2 10,3 17,9 95,0 DMPD 857,0 288,0 114,0 20,0 15,1 343,0 140,0 665,0 369,0 355,0 665,0 Analýza ANOVA Rozdíl SS MS F Významnost F Regrese , ,4 2, , Rezidua , ,38 Celkem ,953 Koeficienty Chyba stř. hodnoty t stat Hodnota P Dolní 95% Horní 95% Dolní 95,0% Horní 95,0% Hranice 95, , , , , , , ,31176 DMPD 0, , , , , , , ,

26 Graf Lineární trend a regrese + rovnice regresní křivky Korelační koeficient? 0, Z grafu je však patrné, že výsledek silně negativně ovlivňuje jedna odlehlá hodnota: FRAP 117,0 DMPD 2960,0 Po vyloučení této hodnoty dostaneme následující informace: Graf Lineární trend a regrese + rovnice regresní křivky

27 Korelační koeficient? 0, Závěr: Po vyloučení jediné odlehlé hodnoty se zvýšil korelační koeficient z 0, na 0, , což prokazuje vyšší závislost mezi oběma soubory dat. Tab.8 POROVNÁNÍ DPPH x FRAP Vstupní data DPPH 146,4 8,2 67,2 98,3 26,5 81,5 82,8 14,7 66,6 51,0 65,6 FRAP 22,9 56,6 6,2 59,7 14,1 20,4 10,3 15,3 15,1 15,1 23,4 DPPH 56,6 39,2 39,6 55,3 FRAP 80,4 45,7 47,4 59,1

28 Analýza ANOVA Rozdíl SS MS F Významnost F Regrese 1 290, ,1705 0, , Rezidua , ,734 Celkem ,71333 Koeficienty Chyba stř. hodnoty t stat Hodnota P Dolní 95% Horní 95% Dolní 95,0% Horní 95,0% Hranice 66, , , , , , , ,83027 FRAP -0, , , , , , ,09 0, Graf Lineární trend a regrese + rovnice regresní křivky Korelační koeficient? -0, Závěr: Vyhodnocení naměřených hodnot nepotvrdilo vysokou závislost mezi oběma soubory dat.

29 Tab. 9a,b POROVNÁNÍ FRAP x LPX Vstupní data FRAP 51,0 65,6 105,5 116,7 187,0 379,0 456,0 1323,0 48,3 86,0 55,3 187,0 LPX 9,0 6,6 9,0 10,7 17,9 105,0 65,2 22,2 14,1 24,8 3,7 20,6 FRAP 146,0 17,9 67,2 98,3 26,5 81,5 97,1 82,8 75,6 59,8 13,4 LPX 117,0 4,7 5,1 39,5 16,2 19,9 26,2 25,5 33,3 27,0 14,6 Analýza

30 ANOVA Rozdíl SS MS F Významnost F Regrese , ,95 1, , Rezidua , ,54 Celkem ,189 Koeficienty Chyba stř. hodnoty t stat Hodnota P Dolní 95% Horní 95% Dolní 95,0% Horní 95,0% Hranice 111, , , , , , , ,26646 LPX 1, , , , , , , , Graf Lineární trend a regrese + rovnice regresní křivky Korelační koeficient? 0,

31 Z grafu je však patrné, že výsledek silně negativně ovlivňuje jedna odlehlá hodnota: FRAP 1323,0 LPX 22,2 Po vyloučení této hodnoty dostaneme následující informace: Graf Lineární trend a regrese + rovnice regresní křivky

32 Korelační koeficient? 0, Závěr: Po vyloučení jediné odlehlé hodnoty se zvýšil korelační koeficient z 0, na 0, , což prokazuje vyšší závislost mezi oběma soubory dat. Tab.10 a,b POROVNÁNÍ Vit. C x DMPD Vstupní data

33 Vit. C 3,6 3,2 101,0 47,0 51,3 41,4 2,5 56,0 2,6 8,1 3,4 DMPD 104,0 104,0 173,0 2960,0 298,0 288,0 8,5 114,0 290,0 186,0 17,9 Vit. C 126,0 64,0 1,4 34,0 3,5 12,8 10,5 DMPD 1018,0 103,0 3,4 140,0 7,8 343,0 432,0 Analýza ANOVA Rozdíl SS MS F Významnost F Regrese , ,721 1, , Rezidua , ,166 Celkem ,36944 Koeficienty Chyba stř. hodnoty t stat Hodnota P Dolní 95% Horní 95% Dolní 95,0% Horní 95,0% Hranice 25, , , , , , , , DMPD 0, , , , , , , , Graf Lineární trend a regrese + rovnice regresní křivky

34 Korelační koeficient? 0, Z grafu je však patrné, že výsledek silně negativně ovlivňuje jedna odlehlá hodnota: Vit. C 47,0 DMPD 2960,0 Po vyloučení této hodnoty dostaneme následující informace: Graf Lineární trend a regrese + rovnice regresní křivky Korelační koeficient? 0,

35 Závěr: Po vyloučení jediné odlehlé hodnoty se zvýšil korelační koeficient z 0, na 0, , což prokazuje vyšší závislost mezi oběma soubory dat.

36 Tab.11 POROVNÁNÍ Vit. C x FRAP Vstupní data Vit. C 3,6 3,2 11,5 46,8 51,3 41,4 2,5 56,0 2,6 8,1 3,4 126,0 FRAP 65,6 51,0 105,5 118,0 187,0 48,3 86,0 84,1 2,4 146,0 17,9 67,2 Vit. C 5,4 64,0 1,4 29,1 24,9 10,1 9,6 3,5 34,0 12,8 10,5 FRAP 142,0 98,3 26,5 81,5 97,1 14,7 75,6 59,8 56,7 51,0 55,3 Analýza ANOVA Rozdíl SS MS F Významnost F Regrese , ,764 1, , Rezidua , ,834 Celkem ,27913 Koeficienty Chyba stř. hodnoty t stat Hodnota P Dolní 95% Horní 95% Dolní 95,0% Horní 95,0% Hranice 12, , , , , , , , FRAP 0, , , , , , , , Graf Lineární trend a regrese + rovnice regresní křivky

37 Korelační koeficient? 0, Závěr: Vyhodnocení naměřených hodnot nepotvrdilo vysokou závislost mezi oběma soubory dat. Tab. 12a,b POROVNÁNÍ Polyf. x FRAP Vstupní data Polyf. 38,2 101,0 62,0 20,7 20,4 259,0 202,0 145,0 2,5 56,0 42,7 FRAP 65,6 57,0 105,5 116,0 187,0 379,0 456,0 1323,0 86,0 84,1 178,0 Polyf. 64,0 53,1 5,4 1,4 29,1 47,4 48,6 51,7 31,4 201,0 259,0 FRAP 98,3 67,2 142,0 26,5 81,5 97,1 59,8 56,7 66,6 456,0 379,0 Analýza

38 ANOVA Rozdíl SS MS F Významnost F Regrese , ,69 9, , Rezidua , ,223 Celkem ,1509 Koeficienty Chyba stř. hodnoty t stat Hodnota P Dolní 95% Horní 95% Dolní 95,0% Horní 95,0% Hranice 45, , , , , , , , FRAP 0, , , , , , , , Graf Lineární trend a regrese + rovnice regresní křivky Korelační koeficient? 0, Z grafu je však patrné, že výsledek silně negativně ovlivňuje jedna odlehlá hodnota: Polyf. 145,0 FRAP 1323,0 Po vyloučení této hodnoty dostaneme následující informace:

39 Graf Lineární trend a regrese + rovnice regresní křivky Korelační koeficient? 0, Závěr: Po vyloučení jediné odlehlé hodnoty se zvýšil korelační koeficient z 0, na 0, , což prokazuje vysokou závislost mezi oběma soubory dat.

40 Tab.13 POROVNÁNÍ Polyf. x DMPD Vstupní data Polyf. 38,2 101,0 20,4 259,0 202,0 145,0 83,0 19,7 31,4 42,7 16,4 DMPD 61,3 173,0 298,0 230,0 275,0 1372,0 856,0 288,0 290,0 186,0 103,0 Polyf. 64,0 93,4 53,1 31,4 51,0 22,0 DMPD 355,0 1018,0 665,0 343,0 140,0 190,0 Analýza ANOVA Rozdíl SS MS F Významnost F Regrese , ,837 0, , Rezidua , ,46 Celkem ,73059 Koeficienty Chyba stř. hodnoty t stat Hodnota P Dolní 95% Horní 95% Dolní 95,0% Horní 95,0% Hranice 56, , , , , , , ,26133 DMPD 0, , , , , , , , Graf Lineární trend a regrese + rovnice regresní křivky

41 Korelační koeficient? 0, Závěr: Vyhodnocení naměřených hodnot nepotvrdilo vysokou závislost mezi oběma soubory dat. 6. Diskuse k výsledkům Obsah vitaminu C (tab. 1 a 2) stanovený v našich vzorcích ovoce a zeleniny odpovídá informacím o výskytu tohoto nutrientu v pramenech, jako jsou různé tabulky výživových hodnot potravin. Údaje byly použity ke stanovení statistické významnosti jejich korelace s hodnotami TAC (tab. 10 a 11). Koncentrace fenolů a flavonoidů (tab. 1 a 2) je nutné posuzovat s určitou opatrností a považovat je spíše za orientační, noboť stanovení obou skupin přírodních látek, zejména flavonoidů, fotometrickou metodou je málo specifické, převedení těchto látek do roztoku během extrakce není úplné, nerozlišuje se přítomnost volných a glykozidicky vázaných forem (v extraktech jsou v převaze glykozidy), nelze zcela eliminovat jejich enzymatickou oxidaci, kterou se snižuje počet hydroxylových skupin. Naprosto jednoznačně převažuje obsah fenolů nad obsahem flavonoidů, a to jak v ovoci, tak i v zelenině a v čajích. Přibližnou kalkulací celkové spotřeby ovoce a zeleniny u nás (dohromady do 200 kg na osobu a rok) a průměrném obsahu fenolů a flavonoidů v těchto potravinách (100 resp. 70 mg fenolů a 20 resp. 17 mg flavonoidů na 100 g ovoce resp. zeleniny, bez čaje a révových vín) získáme průměrný příjem fenolů ovocem a zeleninou cca 0.4 g na osobu a den a 0.1 g flavonoidů na osobu a den. Jestliže zvýšíme součet těchto hodnot o významné obsahy přírodních fenolických látek v čaji a vínu, přiblížíme se k hodnotě jejich celkového příjmu 1 g na osobu a den. Tím se potvrzuje předpoklad nizozemských aj. evropských nutričních odborníků, kteří upozorňují, že denní dávka rostlinných fenolů (včetně flavonoidů) významně překračuje příjem vitaminu C a E a karotenoidů dohromady (22).

42 Z individuálních hodnot je pozoruhodný vysoký obsah fenolů v jablkách, hroznech, čajích, kapustě, špenátu a brokolici. Naopak překvapuje dosti nízký obsah fenolů i flavonoidů v grapefruitech, citronech, mandarinkách, česneku, bramborách aj. V tab. 3 jsou uvedeny obsahy fenolů ve stejných druzích potravin stanovené v zahraničních laboratořích. Výběr těchto příkladů nebyl snadný, v zahraničí se věnuje převážná pozornost místním plodinám nebo technologicky upraveným potravinám. Také způsob vyjadřování koncentrací přírodních antioxidantů bývá odlišný. Hodnoty TAC stanovené čtyřmi různými metodami jsou v tab. 4 a 5. Je zřejmá velmi rozdílná velikost číselných hodnot v závislosti na způsobu stanovení TAC (nejmenší LPX, největší DMPD), i když jsou všechny výsledky jednotně vyjadřovány v mg gallátu (jako ekvivalentu) na 100 g vzorku. Tato skutečnost má příčinu v odlišnosti chemických principů jednotlivých metod. Na výsledné velikosti TAC vzorku se uplatňuje individuálně mnoho látek (řádově tisíce), které mohou reagovat s aplikovanými činidly a v daných podmínkách velmi rozdílně. Také mezi hodnotami TAC prezentovanými zahraničními autory se pravidelně vyskytuje značná variabilita v závislosti na uplatněné metodě. Tento nedostatek je možné částečně eliminovat jednak paralelním použitím několika různých metod a všestranným vzájemným porovnáváním výsledků, kterým je možno dospět ke správnějšímu zařazení každého vzorku do žebříčku hodnot TAC anebo důsledným používáním jediné, pečlivě vybrané metody. Její výběr a její případná modifikace by měly být vždy uváděny s výsledky stanovení. K zajímavým závěrům dospějeme posouzením rozdílnosti hodnot mezi různými druhy ovoce a zeleniny a povahy těchto vztahů vzájemným porovnáním čtyř paralelních výsledků (získaných čtyřmi různými metodami). Všeobecně nejvyšší hodnoty TAC byly dosti jednoznačně stanoveny u grapefruitů, hroznů červených i bílých, u červených vín, mandarinky a také u jablek (tato skutečnost je významná vzhledem k velké spotřebě tohoto ovoce). Ve skupině zeleniny jsou nejvyšší hodnoty TAC u cibule, kapusty, zelí, brokolice, květáku a zejména u rajčete. Naopak nižší hodnoty TAC byly zjištěny u citronu, švestky, melounu, u zelené papriky, pórku, cukety a u brambor. Porovnávání vzájemných vztahů mezi hodnotami TAC zjištěnými u téhož druhu potraviny různými metodami je obtížné a stěží uskutečnitelné tak, aby bylo uspokojivě přehledné. Provedli jsme proto (s pomocí doc. Ing. O.Tůmové, CSc., Ústav měření Elektrotechnické fakulty Západočeské univerzity v Plzni) takové porovnání regresní analýzou, a to mezi 7 různými páry souborů hodnot převážně výsledků TAC a částečně také obsahy přírodních antioxidantů. Příslušné korelační přímky a rovnice přímek s formulací povahy vztahu jsou uvedeny v grafech a tabulkách Statisticky významné korelace se vyskytovaly mezi výsledky TAC stanovenými metodami FRAP a DMPD (po vyloučení jediné hodnoty ze 22 hodnocených), mezi hodnotami FRAP a LPX (po vyloučení jedné hodnoty ze 23), mezi obsahem vitaminu C a hodnotou TAC zjištěnou metodou DMPD a mezi obsahem fenolů a hodnotou TAC stanovenou metodou FRAP (po vyloučení jedné z 22 dílčích hodnot). Ostatní hodnocené korelace DPPH x FRAP, vitamin C x FRAP, fenoly x DMPD naznačují, že vztahy mezi porovnávanými parametry jsou náhodné.

43 Lze učinit předběžný závěr, že nápadně často vstupuje do významných korelací s jinou metodou postup FRAP. Předpokládáme, že všechny shromážděné výsledky budeme v souvislosti s jejich zpracováváním k publikační realizaci- znovu a důkladněji statisticky přehodnocovat a že všechny dodatečně zjištěné skutečnosti zveřejníme. Nezávisle na charakteru vzájemných korelací je nutné zdůraznit, že nejpříznivější výsledky TAC se vyskytovaly společně s vyšším obsahem vitaminu C (většina citrusů) i polyfenolů (hrozny ovoce i nápoje, čaj) a u žlutozelené zeleniny (pravděpodobně účinkem karotenoidů). Naopak malé hodnoty TAC byly stanoveny u cukety, okurky, melounu, švestky aj. V tab. 6 uvádíme některé srovnatelné hodnoty TAC zjištěné a publikované zahraničními autory. Výběr takových dat je, i přes značnou rozsáhlost odborné literatury zabývající se touto problematikou, velmi obtížný, neboť v zahraničí se běžně používá mnoha různých modifikací základních metod a také zpracování vzorků před analýzou se mnohdy provádí speciálními způsoby. Laboratorní stanovení celkové antioxidační kapacity potravin má své opodstatnění jako jedna z možností poznávání a ověřování jedné důležité stránky biologické aktivity přírodních látek, které jsou v nich obsaženy. Jedná se o nepřímou metodu, jejíž výsledky nepostihují skutečný antioxidační potenciál potravin in vivo, tj. po jejich požití, ale jsou mu pouze úměrné. Protože je tato biologická vlastnost potravin významným faktorem podmiňujícím jejich příznivý vliv na zdraví, je zájem o standardní metody stanovení TAC, které by poskytovaly validní, navzájem srovnatelné a reprodukovatelné výsledky, oprávněný. Možnosti praktického využití výsledků systematického hodnocení TAC potravin rostlinného původu jsou několikeré, např.: mohou být používány jako alternativní kritérium biologické hodnoty potravin, mohou být používány jako srovnávací znak potravin v závislosti na různých podmínkách jejich získávání a úchovy (odrůdy, technologie, způsob skladování, klimatické a agrotechnické podmínky apod.), jsou podnětem pro přehodnocení účelnosti suplementací farmaceutickými antioxidanty namísto preference ovoce, zeleniny aj. potravin rostlinného původu, nabízejí v úvahu možnost přípravy koncentrovaných extraktů některých potravin (nikoli separace přírodních látek) a jejich aplikace při výrobě potravních doplňků nebo funkčních potravin, jejich prokázaný výskyt a biologický efekt v potravinách může stimulovat a usměrňovat pěstitelskou a šlechtitelskou činnost, mohou se stát jedním z kritérií tržního oceňování potravin. Naše výsledky naznačují, že koncepce TAC jako nového kritéria biologické hodnoty potravin příznivé pro zdraví je reálná. Aby se dosáhlo jejího dalšího rozvoje a předpokládaného efektu, je žádoucí zdokonalovat metodické postupy při určování TAC a podrobovat laboratornímu testování široký sortiment ovoce, zeleniny, luštěnin, obilovin, potravinářských surovin i finálních výrobků, a to opakovaně po dobu několika let. 7. Závěr