UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI. Přírodovědecká fakulta

Transkript

1 UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie & Centrum regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum Vývoj nových chromatografických metod pro stanovení antiepileptik v biologickém materiálu DIPLOMOVÁ PRÁCE Autor: Bc. Zuzana Radzyniaková Studijní program: B1406 Biochemie Studijní obor: Biochemie Forma studia: Prezenční Vedoucí práce: RNDr. Tomáš Gucký, Ph.D. Konzultant práce: Mgr. Barbora Sokolová, Ph.D. Rok: 2014

2 Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně s vyznačením všech použitých pramenů a spoluautorství. Souhlasím se zveřejněním diplomové práce podle zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách, ve znění pozdějších předpisů. Byla jsem seznámena s tím, že se na moji práci vztahují práva a povinnosti vyplývající ze zákona č. 121/2000 Sb., autorský zákon, ve znění pozdějších předpisů. V Olomouci dne Bc. Zuzana Radzyniaková

3 Chtěla bych velmi poděkovat mému vedoucímu práce RNDr. Tomáši Guckému, Ph.D. a Mgr. Barboře Sokolové, Ph.D. za odborné vedení, cenné rady, připomínky a předané zkušenosti při studiu daného tématu, provádění experimentální části a vypracování této diplomové práce. Dále bych chtěla poděkovat Ing. Michalu Birkáši za pomoc při zpracování grafických podkladů. Poděkování také patří všem pracovníkům Úseku instrumentálních metod Laboratoří AGEL a.s. v Novém Jičíně.

4 Bibliografická identifikace Jméno a příjmení autora Bc. Zuzana Radzyniaková Název práce Vývoj nových chromatografických metod pro stanovení antiepileptik v biologickém materiálu Typ práce Diplomová Pracoviště Vedoucí práce Laboratoře AGEL a.s., Nový Jičín RNDr. Tomáš Gucký, Ph.D. Konzultant práce Rok obhajoby práce Abstrakt Mgr. Barbora Sokolová, Ph.D Epilepsie je neurologické onemocnění, které se projevuje řadou poruch nervové činnosti, z nichž nejmarkantnější jsou epileptické záchvaty. První volbou léčby epilepsie je farmakoterapie antiepileptiky. Snahou je výrazně snížit nebo zcela vyloučit výskyt epileptických záchvatů. Nezbytným předpokladem úspěšné farmakoterapie je terapeutické monitorování těchto léčiv. Terapeutické monitorování antiepileptik je důležité z mnoha důvodu, a to hlavně při zahájení léčby, při periodické kontrole, při podezření na pokles účinnosti farmakoterapie, na toxicitu, na nedostatečné dávkování nebo na non-compliance a při změně dávkování či antiepileptika. Cílem je optimalizace dávkování léčiva s ohledem na individualizaci léčby a minimalizaci nežádoucích projevů. Předložená diplomová práce se zabývá vývojem, optimalizací a validací HPLC-ESI-MS-MS metod pro identifikaci a kvantifikaci sedmi antiepileptik (topiramátu, levetiracetamu, gabapentinu, vigabatrinu, clobazamu, clonazepamu a diazepamu) a třech aktivních metabolitů diazepamu (nordiazepamu, oxazepamu a temazepamu) v lidském séru. Tyto metody jsou velmi jednoduché, ekonomické a časově nenáročné na přípravu vzorku, analýzy jsou dostatečně rychlé. Dále byla ověřena linearita studovaných metod a prokázána jejich vysoká selektivita a specifičnost. Preciznost, přesnost a citlivost metod plně dostačuje potřebám klinické laboratoře. Tyto zavedené metody jsou součástí rutinní praxe na Úseku instrumentálních metod Laboratoří AGEL a.s. v Novém Jičíně. Klíčová slova Antiepileptika, terapeutické monitorování léčiv, LC-MS-MS, validace metody. Počet stran 111 Počet příloh 1 Jazyk Český

5 Bibliographical identification Autor s first name and surname Title Type of thesis Department Supervisor Consultant The year of presentation Abstract Bc. Zuzana Radzyniaková The development of some new chromatography methods for the determination of antiepileptic drugs in biological matrice. Diploma AGEL Laboratories, Nový Jičín RNDr. Tomáš Gucký, Ph.D. Mgr. Barbora Sokolová, Ph.D The epilepsy is a neurological disease that manifests in a variety of disorders of the nervous activities which are noticeable seizures. The first choice of treatment is the pharmacotherapy with antiepileptic drugs. The effort of pharmacotherapy is to significantly reduce or fully eliminate seizures. The therapeutic drug monitoring is required for a successful phramacotherapy. Therapeutic monitoring of antiepileptic drugs is important for many reasons, especially when starting treatment, in periodical examination, for suspected decrease of drug efficacy, toxicity, insufficient dosage or non-compliance and when changing dosage or antiepileptic drug. The aim is to optimize the dosage of the drug with consideration on an individual approach and minimizing adverse events. This present thesis deals with the development, optimization and validation of HPLC-ESI-MS-MS methods for the identification and quantitation of seven antiepileptic drugs (topiramate, levetiracetam, gabapentin, vigabatrin, clobazam, clonazepam and diazepam) and three active metabolites of diazepam (nordiazepam, oxazepam and temazepam) in human serum. These methods are rapid and simple, economical and time saving for sample pretreatment. Furthermore, a linearity of methods were verified and their high selectivity and specificity were demonstrated. Precision, accuracy and sensitivity of developed methods are fully sufficient in accordance with clinical laboratory practice. These established methods are currently in clinical practice use at the Department of Instrumental Methods, AGEL Laboratories in Nový Jičín. Keywords Number of pages 111 Number of appendices 1 Language Antiepileptic drugs, therapeutic drug monitoring, LC-MS-MS, validation of method Czech

6 OBSAH 1 Cíle práce Úvod Současný stav řešené problematiky Epilepsie Typy epileptických záchvatů Parciální epileptické záchvaty Generalizované epileptické záchvaty Terapeutické možnosti při léčbě epilepsie Farmakoterapie Terapeutické monitorování antiepileptik Mechanismus působení antiepileptik Modulace napěťově řízených iontových kanálů Modulace excitační a inhibiční neurotransmise Rozdělení antiepileptik Antiepileptika I. generace Antiepileptika II. generace Antiepileptika III. generace Analytické metody pro stanovení antiepileptik v biologickém materiálu Experimentální část Materiály a chemikálie Biologický materiál Chemikálie Ostatní materiál Přístrojové vybavení Příprava zásobních roztoků standardů Použitá instrumentace Optimalizace parametrů MS Optimalizace podmínek LC Příprava vzorku Precipitace proteinů Extrakce kapalina/kapalina... 55

7 4.6 Kvantifikace Validace metody Příprava pracovních roztoků standardů a pracovních vzorků Selektivita Specifičnost Linearita Preciznost a přesnost Limit detekce a limit kvantifikace Výtěžnost Posouzení vybraných farmakokinetických parametrů antiepileptik levetiracetamu a topiramátu Výsledky Optimalizace parametrů MS Optimalizace podmínek LC Validace metod pro stanovení antiepileptik v séru Selektivita Specifičnost Linearita Preciznost a přesnost Limit detekce a limit kvantifikace Výtěžnost Posouzení vybraných farmakokinetických parametrů antiepileptik levetiracetamu a topiramátu Diskuse Závěr Literatura Seznam použitých symbolů a zkratek Příloha

8 1 CÍLE PRÁCE Vypracování literární rešerše na téma: Terapeutické monitorování antiepileptik, jejich charakteristické vlastnosti a přehled analytických metod pro jejich stanovení v biologických materiálech se zaměřením na HPLC/UPLC-MS metody. Vývoj a optimalizace chromatografických metod stanovení antiepileptik v biologickém materiálu. Validace vyvinutých metod. Aplikace metod na reálné vzorky pacientů. 1

9 2 ÚVOD Antiepileptika, též antikonvulziva patří do skupiny léčiv, která se využívají jako základní farmakoterapeutický přístup v léčbě epilepsie. Antiepileptika zahrnují strukturně různorodé sloučeniny s různými farmakokinetickými vlastnostmi a odlišným mechanismem účinku na mozkovou aktivitu. Z historického hlediska mohou být antiepileptika rozdělena do tří skupin první generace (fenobarbital, phenytoin, primidon, ethosuximid), druhá generace (karbamazepin, benzodiazepiny, valproát), třetí generace (gabapentin, lamotrigin, levetiracetam, topiramát, vigabatrin, zonisamid). Nová antiepileptika třetí generace jsou charakteristická menším počtem nežádoucích účinků a nižším tendencím k interakcím v kombinaci s jinými antiepileptiky nebo s jinými užívanými léčivy (Šulcová, 2007). Snahou farmakoterapie je výrazně zredukovat nebo úplně vyloučit výskyt epileptických záchvatů. Podle typu epilepsie, resp. druhu epileptického záchvatu se využívá monoterapie, která je také upřednostňována před užíváním kombinace více antiepileptik. Nezbytným předpokladem úspěšné farmakoterapie je terapeutické monitorování těchto léčiv. Typickými indikacemi pro terapeutické monitorování antiepileptik je zahájení léčby, periodická kontrola při účinné terapii, kontrola při poklesu účinnosti farmakoterapie, při podezření na toxicitu, při podezření na nedostatečné dávkování nebo non-compliance a při změně dávkování či antiepileptika. Cílem je optimalizace dávkování léčiva individuálně pro každého pacienta bez nebo s minimalizací nežádoucích projevů (Dhillon a Sander, 2003). S potřebou terapeutického monitorování antiepileptik bylo nutné zavést analytické metody pro stanovení hladin antiepileptik v biologických materiálech. V literaturách jsou uvedeny různé analytické přístupy zahrnující například imunoanalytické, elektromigrační nebo chromatografické metody s využitím různých detektorů (Neels et al., 2004). Vysokoúčinná kapalinová chromatografie s hmotnostní detekcí HPLC-MS, resp. tandemovou hmotnostní spektrometrií HPLC-MS-MS se stala nejpreferovanější a nejefektivnější metodou pro spolehlivé, snadné, rychlé, přesné, reprodukovatelné a selektivní stanovení antiepileptik s velmi malou spotřebou vzorku (Matar, 2010). 2

10 3 SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY 3.1 Epilepsie Epilepsie je onemocnění CNS, které se manifestuje řadou poruch nervové činnosti, z nichž nejmarkantnější jsou epileptické záchvaty. Epileptický záchvat je přechodný nával abnormálních nekontrolovatelných výbojů většího množství neuronů mozkové kůry (Šulcová, 2007). Tato populace epileptických neuronů je známa jako tzv. epileptické ohnisko (fokus). Výboje jsou způsobené patologickými procesy, které postihují mozek. Opakující se epileptické záchvaty nastávají nepředvídatelně a spontánně přestávají. Epilepsie se projevuje epizodicky. Mezi opakovanými záchvaty jsou fyziologické funkce nervového systému obvykle zachovány v normální míře. Diagnostika a klasifikace epilepsie se opírá jak o objektivní a subjektivní popis příznaků před, během a po záchvatu, zhodnocení možných provokujících faktorů, délku trvání záchvatu a dobu následné regenerace, tak elektroencefalografické vyšetření - EEG, jehož cílem je zaznamenat abnormální nervové výboje, resp. jejich ohnisko a šíření. Problémem je, že více než 5 % lidí má v EEG záznamu nespecifikovatelné abnormality, zatímco více než 40 % pacientů trpící epilepsií má mezi záchvaty EEG záznam normální. Přesto je EEG nezbytnou součástí diagnostiky a klasifikace epilepsie. Dalším užívaným vyšetřením je magnetická rezonance, která je důležitá pro zobrazení strukturálních abnormalit, například nádor, prodělání mrtvice, vrozené odchylky apod. (Dhillon a Sander, 2003). Podle nejobecnějšího řazení se epilepsie klasifikuje do tří skupin idiopatická, kryptogenní a symptomatická. Příčinou idiopatické epilepsie je s největší pravděpodobností genetický původ. Kryptogenní epilepsie je také nejasného původu. Jedno z možných vysvětlení je abnormalita v metabolických nebo biochemických procesech CNS. U symptomatické epilepsie je příčina známá. Může se jednat o mikroskopické léze nebo nádory na mozku. Epileptický záchvat může být také vyprovokovaný například infekcí nervového systému, horečnatými stavy, cerebrovaskulárními nemocemi nebo po úrazu hlavy (Dhillon a Sander, 2003). Mezi klinické projevy epilepsie patří porucha vědomí, abnormální motorická aktivita (generalizované či lokální křeče), vegetativní příznaky (např. nevolnost, závratě, pocení, slinění), somatosenzorické příznaky (např. halucinace), psychické příznaky (Šulcová, 2007). 3

11 Díky epilepsii, resp. zhoršené pohybové koordinaci a pozornosti je u těchto pacientů morbidita i mortalita zvýšená oproti normální populaci, a to zejména v důsledku různých úrazů hlavy, pádů, zlomenin končetin. Nejčastěji však jde o dopravní nehody, jejichž riziko je asi 7x vyšší. Popáleniny a topení patří také mezi časté a nebezpečné nehody hlavně u dětí (Vojtěch, 2005). V průmyslových zemích asi 1 % dospělé populace trpí epilepsií. V průběhu života prodělá alespoň jeden epileptický záchvat asi 6 8 % lidí (Bušek, 2013). Incidence v rozvojových zemích je vyšší, pravděpodobně z důvodu častějších parazitárních onemocnění, neuroinfekcí nebo traumat. Z důvodu četnějších rizikových faktorů, mají muži incidenci epilepsie vyšší než ženy. V posledních letech byl zaznamenán pokles výskytu epilepsií u dětí, ale nárůst u starší populace. Incidence jednotlivých typů záchvatů se podle různých studií liší. Obecně incidence záchvatů klesá v pořadí komplexní parciální, jednoduché parciální, neklasifikované parciální, generalizované tonicko-klonické, absence, myoklonické, ostatních generalizované a neklasifikované. Lze tedy říci, že z více než 50% se vyskytují u nemocných parciální záchvaty (Vojtěch, 2005). Prevalence zohledňuje kromě nově diagnostikovaných pacientů také trvání nemoci, remisi onemocnění, úmrtnost a migraci. Opakovaná optimalizace farmakoterapie a dlouhodobá léčba může vést k trvalé kompenzaci pacienta, což udává celoživotní prevalence (2 5 %), ze které plyne, že většina pacientů s epilepsií má šanci na dlouhodobou remisi (Vojtěch, 2005). 3.2 Typy epileptických záchvatů Epileptické záchvaty lze rozdělit na dvě hlavní skupiny v závislost na oblasti mozku, ve které dochází ke vzniku abnormálního výboje. Pokud výboj začne na lokalizovaném místě v mozku, jedná se o parciální (fokální, ložiskový) záchvat. Pokud původní aktivace záchvatu postihuje obě mozkové hemisféry, jedná se o generalizovaný záchvat (Dhillon a Sander, 2003). 4

12 3.2.1 Parciální epileptické záchvaty Parciální záchvaty se dělí na simplexní parciální záchvat, komplexní parciální záchvat, sekundárně generalizovaný záchvat. Simplexní parciální záchvat postihuje jen určitou část mozku (nejčastěji spánkový nebo čelní lalok) a probíhá za plného vědomí. Tento typ záchvatu se objevuje velmi zřídka a většinou se vyvine v jiný typ parciálního záchvatu. S ohledem na postiženou oblast mozku se projevují příznaky záchvatu. Mezi typické příznaky patří lokalizované záškuby končetin nebo obličeje, ztuhlost nebo záškuby jedné části těla, necitlivost nebo abnormální smyslové vnímání (Dhillon a Sander, 2003). Pokud záchvat pokročí do fáze, kdy dochází k poruchám vědomí, jedná se o komplexní parciální záchvat, který postihuje širší část spánkového nebo čelního laloku. U pacienta se vyskytne změna v běžném chování s typickou pomateností, například škubání oblečení, svlékání, mlaskání, provádění bezcílené činnost, chování podobné opilosti (Dhillon a Sander, 2003). Sekundárně generalizovaný záchvat může být původem buď jednoduchý nebo komplexní záchvat, u kterého se výboj šíří po celém mozku. Postižení celého mozku vede ke křečovitým stavům se stejným charakterem jako u generalizovaného tonicko-klonického záchvatu (Dhillon a Sander, 2003) Generalizované epileptické záchvaty Je známo několik typů generalizovaných záchvatů, které mohou být doprovázeny s křečemi nebo bez křečí a vždy mají za následek poruchu vědomí. Mezi ně patří záchvat tonicko-klonický, absence, myoklonický, tonický, klonický a atonický (Dhillon a Sander, 2003). Tonicko-klonický typ záchvatu, také známý jako grand mal je nejběžnější u epileptických pacientů. Probíhá několik minut s následnou regenerací, která může trvat minuty až hodiny. Záchvat začíná náhlým tonickým stahem svalstva a pádem na zem, následuje fáze klonická doprovázená typickými projevy, jako například křeče, pokousání, slinění, pěna u úst a pomočení. Regenerační fází u většiny pacientů je spánek (Vojtěch, 2005). 5

13 Další typ generalizovaného záchvatu je tzv. absence, často nazývaný jako petit mal. Jedná se o vzácnější formu, která se objevuje zejména v dětském věku. Typickým projevem je náhlé přerušení činnosti a zahledění. Prodělaný záchvat trvá jen několik sekund a často bývá bez povšimnutí (Vojtěch, 2005). Myoklonický záchvat nastává zejména krátce po probuzení s nekontrolovatelnými, náhlými a krátkými kontrakcemi celého těla, horních končetin nebo hlavy. Návrat do původního stavu je okamžitý (Dhillon a Sander, 2003). Tonický záchvat se projevuje svalovou abnormální kontrakcí končetin, hlavy a trupu (Vojtěch, 2005). Rychlou ztrátou svalového napětí s náhlým pádem na zem je typický atonický záchvat. Tento typ záchvatu je velmi vzácný, postihuje méně než 1 % epileptiků, ale je mnohem častější epileptických kojenců (Dhillon a Sander, 2003). 3.3 Terapeutické možnosti při léčbě epilepsie Racionální péče o pacienty trpících epilepsií obecně zahrnuje několik přístupů. Před zahájením léčby by se měl lékař ujistit o etiopatogenetické podstatě záchvatů. Důležitou roli v léčbě epilepsie mají režimová opatření, mezi která patří pravidelnost spánkového režimu, zákaz užívání alkoholu nebo eliminace extrémní fyzické i psychické zátěže. Na základě správné diagnostiky je prvním krokem při léčbě epilepsie farmakoterapie (monoterapie, polyterapie). Pokud pacient trpí farmakorezistentními záchvaty, tj. pokud u pacienta nedošlo do dvou let k uspokojivé redukci či úplnému vymizení záchvatů, využívá se chirurgického zákroku. Dalším indikačním kritériem pro volbu epileptochirurgie může být jasná lokalizace epileptogenní zóny, která je lokalizována v operovatelné oblasti. Mezi základní typy epileptochirurgických zákroků patří resekční výkony (nejlepší výsledky jsou u pacientů s epilepsií spánkového laloku), kalosotomie nebo vágová stimulace. Stimulace nervus vagus (pomocí implantovaného stimulátoru) se provádí, pokud nelze provést resekční zákrok (Brázdil, 2009). Krajní možností terapie farmakorezistentní epilepsie je stereotaktická operace. Principem je zasažení přesně definovaného nitrolebního cíle dle předem stanovené trajektorie. Přesné prostorové zaměření cílového objektu je definováno pomocí rámu, který je fixován k hlavě pacienta (Chrastina et al., 2009). 6

14 3.4 Farmakoterapie Léčbou první volby epilepsie je farmakoterapie, jejímiž základními charakteristikami je, že je dlouhodobá, kontinuální a symptomatická. Současné farmakoterapeutické postupy umožňují dosáhnout úplné eliminace epileptických záchvatů u většiny pacientů (70 80 %) nebo alespoň významnému snížení jejich frekvence. Přesto se však vyskytují případy farmakorezistentní epilepsie, kdy se obvykle přistupuje ke stereotaktickým neurochirurgickým zásahům. Jednoznačná diagnostika epilepsie, resp. epileptických záchvatů je nejdůležitější pro léčbu cílenými antiepileptiky. V závislosti na okolnostech léčba trvá nejméně tři roky, ale většinou celý život. Farmakoterapie mnohdy selhává z důvodu nedodržování pravidelnosti podávání léků. Pacient proto musí být plně seznámen s cílem terapie a důležitostí pravidelného užívání AE (Dhillon a Sander, 2003). Cílem terapie je minimalizace záchvatů s užíváním nejnižší možné dávky jednoho léčiva (monoterapie), které vyvolá nejméně nežádoucích účinků (Eadie, 2001). U zahájení terapie u nově diagnostikovaného pacienta je důležité začít s nízkou dávkou a postupně dle potřeby pacienta dávku zvyšovat až do dosažení konstantní udržovací dávky. Léčba je zahájena většinou nasazením AE první volby (např. karbamazepin, fenytoin, valproát, lamotrigin). Není jednoduché nastavit optimální dávku AE pro každého pacienta, jelikož druh a dávkování léčiva je velmi individuální v závislosti na správné diagnostice a klasifikaci typu záchvatu. Někdy epileptické záchvaty nejsou plně pod kontrolou ani po užívání nejvyšší tolerovatelné dávky nebo se u pacienta dostaví nežádoucí až toxické účinky. Lékař může využít dva přístupy řešení selhání AE první volby. Buď se část dávky postupně substituuje jiným AE první volby nebo je nezbytné dané AE úplně vysadit a nahradit jiným, většinou AE druhé volby (např. topiramát, vigabatrin, gabapentin, levetiracetam). Sedativní léčiva, jako například barbituráty nebo benzodiazepiny, se užívají pouze v případě, je-li to zcela nezbytné. Příklady volby AE u různých typů epileptických záchvatů jsou uvedeny v Tab. 1 (Dhillon a Sander, 2003). U pacientů, kteří dlouhodobě netrpí epileptickými záchvaty (více než 2 roky), lze uvažovat o bezpečném, tj. postupném vysazování AE. Riziko relapsu u těchto pacientů je asi 40 %. Čím déle je pacient bez záchvatů, tím nižší je pravděpodobnost jejich návratu. Pacienti trpící mentálními poruchami, neurologickými příznaky nebo 7

15 jiným poškozením mozku mají větší riziko relapsu epileptických záchvatů, proto je úplné vysazení AE vyloučeno (Dhillon a Sander, 2003). Tab. 1 Příklady volby antiepileptik u různých typů epileptických záchvatů (Dhillon a Sander, 2003). Typ záchvatu Lék první volby Lék další volby Karbamazepin Vigabatrin Phenytoin Clobazam Parciální Valproát Fenobarbital Lamotrigin Gabapentin Topiramát Generalizované Tonicko-klonické Valproát Vigabatrin Tonické Karbamazepin Clobazam Klonické Phenytoin Fenobarbital Lamotrigin Absence Ethosuximid Clonazepam Valproát Lamotrigin Atonie Clonazepam Lamotrigin Clobazam Karbamazepin Phenytoin Myoklonické Valproát Fenobarbital Clonazepam Terapeutické monitorování antiepileptik Velmi důležité při farmakoterapii je tzv. terapeutické monitorování (therapeutic drug monitoring, TDM) hladin AE v biologickém materiálu (zejména v séru nebo v plazmě). Terapeutické monitorování léčiv představuje proces stanovení koncentrace léčiva v příslušném biologickém materiálu (v závislosti na farmakokinetickém profilu sérum, plasma nebo plná krev) ve vhodných časových intervalech, následnou interpretaci naměřených dat se zohledněním velikosti distribučního prostoru, renálních a hepatálních funkcí, mezilékových interakcí a eventuální úpravu dávky a jejího intervalu. Důvodem pro TDM je, že koncentrace AE (terapeutické i toxické) více koreluje s koncentrací v séru, resp. plazmě než s dávkou. léčiva v extracelulární tekutině okolo neuronu odpovídá koncentraci léčiva přítomného v séru, resp. plazmě. Mnoho AE vykazují nízký terapeutický index, a proto relativně malá 8

16 změna koncentrace v séru, resp. plazmě může vést k rozvoji závažných nežádoucích účinků až systémové toxicitě. Řada AE vykazuje četné mezilékové interakce, které nejčastěji souvisejí s ovlivněním aktivit cytochromu P450 (Eadie, 2001). Typickými indikacemi pro TDM antiepileptik je zahájení léčby, periodická kontrola při účinné terapii, kontrola při poklesu účinnosti farmakoterapie, při podezření na toxicitu, při podezření na nedostatečné dávkování nebo non-compliance a při změně dávkování či AE. Cílem TDM je nalézt optimální terapeutickou dávku léčiva individuálně pro každého pacienta bez nebo s minimálními projevy vedlejších účinků. Kromě podávání léčiva v pravidelných intervalech se také musí zohlednit genetický profil, pohlaví, věk, celkový zdravotní stav pacienta nebo současné užívání jiných léčiv (Dhillon a Sander, 2003). Bylo zaznamenáno, že z populace pacientů užívající normální dávky konkrétního léku byla koncentrace AE v séru pro některé pacienty terapeutická, u některých byla naopak buď pod nebo nad terapeutickým rozmezím. Navíc terapeutické rozmezí může být odlišné u pacientů s monoterapií a polyterapií (Johannessen et al., 2003). Běžně užívané dávkovací režimy AE v klinické praxi jsou uvedeny v Tab. 2. Tab. 2 Běžně užívané dávkování antiepileptik v klinické praxi (upraveno dle Dhillon a Sander, 2003). Lék Počáteční dávka (mg) Udržovací dávka (mg d -1 ) Dávka/den Ethosuximid Fenobarbital Phenytoin Primidon * 2-3 Karbamazepin Clonazepam 0,5 0, Diazepam Clobazam Valproát Gabapentin Lamotrigin Levetiracetam Topiramát * 2 Vigabatrin Zonisamid * Údaj uvedený v Neels et al Údaj uvedený v Doležal a Zárubová, Údaj uvedený v Kuba,

17 3.5 Mechanismus působení antiepileptik Z molekulárního hlediska AE mohou působit třemi základními mechanismy (Obr. 8, Obr. 10) modulací napěťově řízených iontových kanálů (sodných, draselných a vápenatých), zesílením GABAergní inhibice a snížením glutamátergní excitace. Některá AE působí specificky na daný molekulární cíl, například VIG, LEV nebo ETH, jiná AE působí více než jedním mechanismem, například VAL nebo TOP (Kwan et al., 2001) Modulace napěťově řízených iontových kanálů Sodné kanály Sodné kanály zprostředkovávají influx sodných iontů do buňky, a to na základě aktivace kanálu díky vzrůstu neuronálního akčního potenciálu, resp. depolarizace membrány. Během několika milisekund se kanál konformuje do inaktivního stavu. Díky následné repolarizaci membrány kanál přejde do klidového stavu připravený k opětovné aktivaci (Kwan et al., 2001). Jedná se o transmembránový protein, který tvoří hlavní α-podjednotka a dvě β-podjednotky (Obr. 1C). α-podjednotka se skládá ze čtyř domén (I IV) a každá má šest α-helikálních transmembránových segmentů (S1 S6), které jsou spojeny střídavě intracelulárními a extracelulárními smyčkami. Čtyři domény v plazmatické membráně tvoří čtvercový tvar kanálu s centrickým pórem (Obr. 1B, Obr. 1D). S4 transmembránové segmenty obsahují pozitivně nabité zbytky Lys a Arg vzdálené od sebe tři aminokyseliny. Bylo zjištěno, že depolarizace membrány způsobí neutralizaci Lys a Arg, což ovlivní pohyb S4 segmentů a pór kanálu se otevře. Neutralizace aminokyselin v draselném kanálu působí opačně. Bylo prokázáno, že motiv S4 segmentů je zachován také u vápenatého, draselného kanálu, což poukazuje na podobný mechanismus otevírání, resp. uzavírání u těchto různých kanálů. Nejdůležitější extracelulární částí póru jsou tzv. P-smyčky mezi S5 a S6 segmenty, které jsou zodpovědné za selekci iontů. Na cytoplazmatické části membrány se nacházejí smyčky mezi doménami III a IV, které po delším otevření kanálu (po dosažení maxima akčního potenciálu) uzavřou ústí póru a nedochází k toku iontů. Na těchto smyčkách se nachází tři hydrofóbní aminokyseliny (Ile, Phe, Met), které interagují s kanálem a tvoří tzv. západku. Kanál se stává inaktivní. Po poklesu akčního 10

18 potenciálu (repolarizaci membrány) se kanál vrátí zpět do neaktivního stavu (Obr. 1A). Pokud kanály jsou otevřené abnormálně dlouho, může dojít k epileptickému záchvatu (Guy a Seetharamulu, 1986). Dále kanál tvoří dvě pomocné β-podjednotky, které pravděpodobně regulují expresi a funkčnost (rychlost aktivace, resp. inaktivace) α-podjednotky (Kwan et al., 2001). Na sodné kanály působí řada AE, které jsou strukturně odlišné (PHE, KAR, LAM, VAL, TOP, ZON), ale jejich farmakologické profily jsou obdobné. Tento typ léčiv je účinný u pacientů s parciálními a generalizovanými tonicko-klonickými záchvaty (Kwan et al., 2001). Obr. 1 Strukturální a funkční vlastnosti napěťově řízeného sodného kanálu. (A) Modelová aktivace sodného kanálu, která je zapříčiněná pohybem S4 segmentů (v reakci na depolarizaci membrány). Inaktivace kanálu nastává po uzavření póru intracelulární smyčkou. (B) Uspořádání domén α-podjednotky kolem centrálního póru kanálu. (C) Schematické znázornění sodného kanálu složený z α-podjednotky a dvou β-podjednotek. (D) α-podjednotka sodného kanálu je tvořená čtyřmi doménami (I IV) a každá má šest α-helikálních transmembránových segmentů (S1 S6), které jsou spojené smyčkami. S4 segmenty zprostředkovávají průchodnost kanálu a P smyčky jsou zodpovědné za selekci iontů (Upraveno dle Ragsdale a Avoli, 1998). 11

19 Draselné kanály Draselné kanály jsou membránové proteinové komplexy, u kterých (na rozdíl od α-podjednotky sodného kanálu) musí dojít ke spojení čtyř podjednotek, které pak tvoří funkční a selektivní pór kanálu. Jsou známé homotetramerní i heterotetramerní draselné kanály. Strukturně a geneticky jsou podobné α-podjednotce sodného nebo α 1 -podjednotce vápenatého kanálu. Každá podjednotka se také skládá ze šesti transmembránových segmentů. Dva hydrofobní segmenty (S5 a S6) jsou spojeny na extracelulární straně tzv. P-smyčkou, která obsahuje charakteristickou aminokyselinovou sekvenci (TVGYG), která je zodpovědná za selekci iontů (Obr. 2). Způsob inaktivace kanálu probíhá obdobně jako u sodného kanálu (Doyle et al., 1998). Obr. 2 Podjednotka draselného kanálu. Podjednotka je tvořena šesti α-helikálními transmembránovými segmenty (S1 S6), které jsou spojené smyčkami. S4 segmenty zprostředkovávají průchodnost kanálu a P smyčky jsou zodpovědné za selekci iontů. Funkční a selektivní kanál je tvořen spojením těchto čtyř podjednotek (Upraveno dle Vojtěch, 2005). Draselné kanály jsou zodpovědné za influx draselných iontů do extracelulárního prostoru, což má za následek snížení akčního potenciálu a tedy repolarizaci plazmatické membrány. Draselné kanály se vyznačují značnou variabilitou. V závislosti na aktivačním napětí a způsobu inaktivace mohou mít odlišnou rychlost a délku hyperpolarizace (Kwan et al., 2001). Interakce s draselným kanálem se využívá u retigabinu, který působí jako allosterický aktivátor na konkrétní podtypy kanálu - KCNQ2/3 (Main et al., 2000). 12

20 Vápenaté kanály Vápenaté kanály významně přispívají ke vzrušivosti neuronu, buď přímo napětím řízeným tokem vápenatých iontů do neuronu nebo nepřímo, například zvýšením intracelulární koncentrace vápenatých iontů potřebných pro vazbu vezikul a uvolnění transmiteru (Vojtěch, 2005). Vápenaté kanály jsou svými klíčovými sekvenčními a strukturními prvky také velmi homologní k sodným kanálům. Vápenatý kanál je tvořen α 1 -podjednotkou, u které bylo prokázáno, že je homologem k α-podjednotce sodného kanálu. Neuronální α 1 -podjednotka je různorodě spojena s jinými podjednotkami (β, γ, a δ). Na základě velikosti aktivačního membránového potenciálu, lze vápenaté kanály rozdělit do dvou skupin nízkoprahové a vysokoprahové (Kwan et al., 2001). Nízkoprahový T-typ vápenatého kanálu se nachází především v thalamokortikální oblasti mozku. Mutace těchto kanálů je charakteristická pro generalizované záchvaty typu absence. Dle farmakologických vlastností se vysokoprahové vápenaté kanály dělí na L, N, P, Q, R-typ. Tyto typy lze nalézt po celé nervové soustavě (na dendritech, tělech a synapsích neuronů). N, P a Q-typ zejména regulují uvolňování neurotransmiterů v synapsích. Typickým zástupcem inhibičního působení na nízkoprahové vápenaté kanály je ETH nebo z menší části také ZON a VAL, zatímco GAB působí na vysokoprahové vápenaté kanály (Stefani et al., 1997) Modulace excitační a inhibiční neurotransmise GABAergní inhibice Kyselina γ-aminomáselná (GABA) je jedna z hlavních inhibičních neurotransmiterů v centrálním nervovém systému. Interaguje s třemi typy receptorů GABA A, GABA B, GABA C. GABA B receptory patří do skupiny metabotropních receptorů, které po navázání GABA aktivují G-proteinovou kaskádu, což způsobí otevření kanálu a zvýšení toku draselných iontů. Ionotropní GABA C receptory se v podstatě nevyskytují v CNS, ale jsou běžné pro buňky sítnice (Czapinski et al., 2005). 13

21 Významnější pro inhibiční činnost jsou ionotropní GABA A receptory (Obr. 3). GABA A receptory jsou ligandem řízené iontové kanály, které se po vazbě (na rozhraní α a β podjednotek) dvou molekul GABA otevřou a chloridové ionty proudí do neuronu, což způsobí hyperpolarizaci membrány, která se stává stabilizovaná vůči dalšímu akčnímu potenciálu. Neuron je méně excitabilní a dochází k potlačení epileptických výbojů (Treiman, 2001). GABA A receptor se skládá z různých kombinací pěti podjednotek α (1 6), β (1 3), γ (1 3), δ, ε. Na základě složení podjednotek se liší fyziologie a farmakologie receptoru. Po aktivaci receptoru je GABA recyklována nebo metabolizována ze synaptické štěrbiny do lokalizovaných nervových zakončení a gliových buněk pomocí specifických GABA transportérů 1 a 3 (GAT-1, GAT-3). V GABAergních nervových zakončeních probíhá rychlá recyklace a uložení GABA do váčků k opětovnému použití. V gliích probíhá metabolismus GABA působením mitochondriální GABA-transaminasy (GABA-T) za vzniku intaktní molekuly semialdehydu kyseliny jantarové (SSA). Naopak syntéza GABA je lokalizována v GABAergních neuronech z glutamátu působením glutamátdekarboxylasy (GAD) (Treiman, 2001). Na těchto receptorech se nachází vazebná místa také pro BZD a barbituráty (Treiman, 2001). Několik typů AE (např. BZD, barbituráty, VIG nebo VAL) působí přímo či nepřímo na GABAergní systém - některé z nich mohou přispívat k vyšší produkci GABA, k vyšší neurotransmisi GABA, ke snížení inaktivace systému nebo působí jako allosterické modulátory (Kwan et al., 2001). 14

22 Obr. 3 Schematické znázornění GABA A receptoru. Vazbou dvou molekul GABA na rozhraní α a β podjednotek se kanál aktivuje a stane se vodivý pro chloridové ionty. Benzodiazepiny a barbituráty působí jako allosterické modulátory kanálu. Vazebné místo pro benzodiazepiny se nachází na rozhraní α a γ podjednotek a pro barbituráty se nachází na α a β podjednotkách (upraveno dle Šulcová, 2007) Glutamátergní excitace V mozku savců je hlavním excitačním neutrotransmiterem glutamát. Glutamát je syntetizován v glutamátergních neuronech z glutaminu působením mitochondriální glutaminasy. Prekurzorem může být také α-ketoglutarát, který je přeměněn na glutamát glutamátdehydrogenasou. Po synaptickém uvolnění glutamát působí na několik ionotropních a metabotropních receptorů. Odstranění glutamátu ze synaptické štěrbiny probíhá do nervových zakončení nebo glií za účasti několika specifických transportérů (glutamát-aspartátový transportér GLAST, glutamátový transportér 1 GLT-1, excitatory amino acid carrier 1 EAAC-1). Zásadní význam má vychytávání glutamátu gliovými buňkami, kde dochází působením glutaminsyntetasy k fixaci amoniaku za vzniku glutaminu, resp. dochází ke konverzi glutamátu na α-ketoglutarát glutamátdehydrogenasou. Glutamin a α-ketoglutarát jsou následně zpětně transportovány do vezikul glutamátergních neuronů pro resyntézu glutamátu (Daikhin a Yudkoff, 2000). Podobně jako u GABA A receptoru, ionotropní glutamátové receptory jsou složeny z kombinace různých podjednotech, které tvoří tetramerní a pentamerní struktury. Jsou známy tři specifické typy receptorů (Obr. 4) α-amino-3-hydroxy-5- methylisoxazol-4-propionátové (AMPA), kainátové, N-methyl-D-aspartátové (NMDA), 15

23 které jsou po vazbě ligandu propustné pro sodné a vápenaté ionty, v závislosti na typu a složení receptoru (Daikhin a Yudkoff, 2000). NMDA receptory jsou heterodimery tvořené různými isoformami NR1 a NR2 podjednotek. NMDA receptory mají vysokou afinitu ke glutamátu (vazebná místa na NR2 podjednotkách). Na receptoru se také nachází vazebná místa na NR1 podjednotkách pro glycin, který funguje jako nezbytný koagonista. Pokud je membrána ve stavu hyperpolarizace, kanál je stále neprůchodný z důvodu vazby antagonistického hořečnatého iontu. K aktivaci kanálu a proudu sodných, vápenatých a draselných iontů dochází až po delší depolarizaci a uvolnění hořečnatého iontu z vazebného místa (Meldrum et al., 1999). Na rozdíl od NMDA receptoru AMPA a kainátový receptor (souhrnně non-nmda receptory) podléhá rychlé excitační neurotransmisi. AMPA receptor je tvořen čtyřmi podjednotkami GluR1 až GluR4. Například v hipokampu se vykytují hlavně heteromerní komplexy složené z GluR1-GluR2 a GluR2-GluR3 podjednotek. Strukturně je kainátový receptor heteropentamer, složený z GluR5 až GluR7, KA1 a KA2 podjednotek. Aktivací se oba receptory stanou průchodné pro sodné a draselné ionty. Afinita ke glutamátu mnohem menší a také influx vápenatých iontů velmi omezený. (Vojtěch, 2005). Antikonvulzivní účinek inhibicí non-nmda receptorů je znám u TOP. Molekulární cíl felbamátu jsou NMDA receptory (Kwan et al., 2001). Obr. 4 Ionotropní glutamátové receptory. non-nmda receptor se aktivuje po vazbě dvou molekul Glu, selektivními agonisty je kainát a AMPA. Po aktivaci je kanál propustná pro sodné a draselné ionty (vlevo). NMDA receptor se také aktivuje po vazbě dvou molekul Glu na NR2 podjednotky (selektivním agonistou je NMDA) a vazbou dvou molekul Gly na NR1 podjednotky. Až po vyvázání blokujícího hořečnatého iontu se kanál stává propustný pro sodné, vápenaté a draselné ionty (vpravo) (Upraveno dle Kandel et al., 2000) 16

24 3.6 Rozdělení antiepileptik Z historického hlediska, resp. podle zavedení do klinické praxe se AE mohou klasifikovat do tří generací. Do I. generace (od dvacátých let 19. století) se řadí fenobarbital (1912), fenytoin (1938), primidon (1949) ethosuximid (1950). Od sedmdesátých let 20. století se na trh dostává II. generace AE, mezi které patří karbamazepin, valproát a benzodiazepiny (clonazepam, diazepam, clobazam). Od devadesátých let 20. století se začínají indikovat nová AE III. generace. Mezi nová AE patří gabapentin, lamotrigin, levetiracetam, topiramát, vigabatrin, zonisamid a další (Šulcová, 2007). Všechna AE jsou charakteristická svými farmakokinetickými vlastnostmi (Tab. 3) a mechanismem působení (Obr. 8 a Obr. 10). Orientační sérové terapeutické a toxické hladiny jednotlivých AE jsou uvedeny v Tab. 4. Hlavní cesty biotransformace AE, jejich vliv na aktivitu CYP a příklady některých lékových interakcí jsou uvedeny v Tab. 5 a Tab. 6. Výčet nejběžnějších vyskytujících nežádoucích účinků při užívání AE v monoterapii je uveden v Tab. 7. Tab. 3 Farmakokinetická data antiepileptik. V tabulce jsou shrnuty farmakokinetické vlastnosti jednotlivých antiepileptik biologická dostupnost F, dosažení maximální sérové koncentrace t max (h), distribuční objem D d (l kg -1 ), vazba na proteiny PB, biologický poločas t 1/2 (h), produkce aktivního metabolitu (upraveno dle Neels et al., 2004). Lék F t max D d PB t 1/2 Aktivní (h) (l kg -1 ) (h) metabolit Ethosuximid * 3-7 0, Ne Fenobarbital , Ne Phenytoin ,5-1, Ne Primidon * 0,5-9 0,6 < Ano Karbamazepin , Ano Clonazepam , Ne Diazepam ,5 1,5 0,7 2, Ano Clobazam , Ano Valproát ,15-0, Ne Gabapentin , Ne Lamotrigin , Ne Levetiracetam ,5-0,7 < Ne Topiramát ,6-0, ,30 Ne Vigabatrin , Ne Zonisamid , Ne * Údaj uvedený v Dhillon a Sander, Údaj uvedený v Johannessen et al., Údaj uvedený v Komárek et al.,

25 3.6.1 Antiepileptika I. generace Ethosuximid Ethosuximid, ETH, systematickým názvem 3-ethyl-3-methylpyrrolidin-2,5-dion (Obr. 5) se používá výhradně při epileptických záchvatech typu absence. Tento derivát kyseliny jantarové byl objeven při hledání méně toxického léčiva, než původně používaný trimethadion, který vyvolával výrazné sedativní účinky a hypersenzitivní reakce (Šulcová, 2007). Obr. 5 Strukturní vzorec ethosuximidu. Farmakodynamický profil Jediným známým mechanismem účinku ETH je inhibiční vliv na nízkoprahové T-typy vápenatých kanálů na thalamokortikálních neuronech (Coulter et al., 1989). Farmakokinetický profil ETH se vstřebává úplně a velmi rychle po perorálním podání. Maximální koncentrace v séru dosahuje za 3-7 h po podání dávky. ETH se neváže na sérové proteiny. Biologický poločas je u dospělých pacientů h. Distribuční objem je asi 0,7 l kg -1. EHT je v játrech metabolizován na farmakologicky neaktivní metabolity. Přibližně % látky se vylučuje v nezměněné formě (Neels et al., 2004). Léková interakce Ačkoli metabolismus ETH, resp. jeho sérová koncentrace je závislá na induktorech (PHE, KAR, PRI) a inhibitorech (VAL) jaterních enzymů, jejich působení mají na účinnost EHT minimální vliv. Při současném užití jiného léčiva působící na CNS dochází k výraznému prohloubení sedace (Slíva, 2011). 18

26 Fenobarbital Fenobarbital, PBT je nejstarším léčivem v léčbě epilepsie. Na trhu se vyskytl v roce Chemicky se jedná o derivát kyseliny barbiturové, sumárním názvem 5-ethyl-5-fenylpyrimidin-2,4,6(1H,3H,5H)-trion (Obr. 6). Ve srovnání s ostatními barbituráty, které se primárně využívají jako sedativa, hypnotika a celková anestetika, má PBT pouze mírné sedativní účinky. PBT působí při léčbě parciálních a generalizovaných záchvatů, ale nikoliv absencí. PBT je stejně účinný jako KAR nebo PHE, ale neužívá se jako lék první volby právě z důvodu sedativních účinků (Šulcová, 2007). Obr. 6 Strukturní vzorec fenobarbitalu. Farmakodynamický profil PBT uplatňuje své farmakologické účinky prostřednictvím allosterické aktivace GABA A receptoru, kde se nachází vazebné místo (na α a β podjednotce) pro barbituráty. Receptor může být aktivován i bez vazby GABA, což je vlastnost, která může být základem jejich sedativních účinků (Macdonald a Twyman, 1991). Farmakokinetický profil Léčivo je velmi dobře absorbováno, asi 50 % se váže na sérové proteiny. Distribuční objem je přibližně 0,5 l kg -1. PBT podléhá v játrech biotransformaci p-hydroxylaci s následnou konjugací. Biologický poločas je o mnoho delší než u ostatních AE, tj h u dospělých pacientů. Asi 25 % se eliminuje v nezměněné formě močí, zbylých 75 % se vylučuje jako farmakologicky nevýznamný metabolit (Neels et al., 2004). 19

27 Lékové interakce Jelikož PBT patří mezi silné induktory jaterních enzymů (cytochromů P450, CYP), lékové interakce jsou významné. Například VAL nebo PHE zvyšuje sérovou koncentraci PBT. Existuje řada léčiv včetně ostatních AE, u kterých může být vlivem PBT účinnost snížená, například u tricyklických antidepresiv, kortikoidů, cyklosporinu nebo teofylinu. Z ostatních AE jsou to například KAR nebo ETH (Slíva, 2011). Byly také prokázány interakce s vitaminy, konkrétně PBT indukuje katabolismus vitaminu K nebo také vitaminu D, což obvykle vede ke snížení absorpce vápníku. PBT snižuje hladinu folátů zhoršenou absorpcí. Naopak vysoké dávky folátů mohou narušovat antikonvulzivní účinky PBT (Hronek a Kovařík, 2012) Phenytoin Phenytoin, PHE patří mezi hydantoiny se systematickým názvem 5,5-difenylimidazolidin-2,4-dion (Obr. 7). Jedná se o analog PBT bez sedativních účinků. PHE je užitečný při terapii komplexních parciálních záchvatů a generalizovaných tonicko-klonických záchvatů, ale nepůsobí proti absencím. Do terapie byl PHE zaveden už v roce 1938 (Šulcová, 2007). Obr. 7 Strukturní vzorec phenytoinu. Farmakodynamický profil Hlavní antikonvulzivní účinek je založen na působení na napěťově závislé sodné kanály. PHE se váže na inaktivní konformaci kanálu, zpomaluje jeho návrat zpět do neaktivního stavu, a tím se snižuje frekvence opakovaných akčních potenciálů. PHE je účinný pouze při vyšší frekvenci stimulace neuronu. Také bylo zaznamenáno, 20

28 že pravděpodobně PHE blokuje vysokoprahové vápenaté kanály a snižuje uvolňování glutamátu (McLean a Macdonald, 1983). Farmakokinetický profil PHE se po perorálním podání vstřebává pomalu a neúplně až ve střevě. Gastrointestinální absorpce je závislá na stáří pacienta a na případném užívání léků měnící gastrointestinální motilitu. Zejména například antacida snižují absorpci PHE. Maximální sérová koncentrace se pohybuje mezi 4-8 h po podání. Distribuční objem je přibližně 0,6 l kg -1. Okolo 90 % PHE je vázáno na sérové proteiny, což výrazně zvyšuje eliminační poločas. PHE je metabolizován převážně p-hydroxylací za vzniku farmakologicky neaktivních metabolitů. Většina z podané dávky (60-70 %) se eliminuje močí ve formě volného nebo konjugovaného metabolitu, méně než 5 % se vylučuje v nezměněném stavu. PHE podléhá autoindukčním účinkům a jeho biologický poločas se po ustálení hladiny v séru pohybuje v rozsahu h a roste se zvyšující se dávkou. Mezi sérovou koncentrací a dávkou není lineární vztah a rychlost eliminace je popsána kinetikou nultého řádu. PHE patří mezi AE indukující jaterní enzymy. Jelikož enzymy jsou při vyšších koncentrací PHE v séru saturované, mohou další nepatrné dávky PHE zvýšit eliminační poločas tzn., že může vést k výraznému zvýšení sérových hladin a případné intoxikaci (Neels et al., 2004). Lékové interakce Farmakokinetika PHE je značně složitá, navíc je z většiny vázán na proteiny a podléhá rozsáhlé biotransformaci, takže interakce s různými léčivy včetně jiných AE jsou významné. Některá léčiva mohou zvýšit nebo snížit hladinu PHE v séru. Naopak PHE může ovlivnit hladiny jiných léčiv (PHE patří mezi silné induktory aktivity CYP). Ke zvýšení hladiny PHE v séru může dojít například u polyterapie s VAL, ETH nebo s některými BZD, z jiných léčiv to může být například amiodaron, flukonazol nebo fluoxetin. Mezi AE, která mohou snížit hladinu PHE v séru patří například VIG, PBT nebo KAR, z jiných léčiv například furosemid (Slíva, 2011). Byly popsány také interakce s vitaminy, například při vysoké hladině vitaminu B 6 dochází ke snížení hladiny PHE v séru. Dále PHE snižuje absorpci folátů, ale naopak vysoké hladiny folátů antagonizují působení PHE. U interakce s vitaminem D dochází ke zvýšení jeho kostního obratu (Hronek a Kovařík, 2012). 21

29 Obr. 8 Ilustrační zobrazení molekulárních cílů antiepileptik excitační synapse. AE mají schopnost přímo nebo nepřímo ovlivňovat excitační signalizaci v CNS. TOP zeslabuje glutamátergní excitaci antagonistickou vazbou na AMPA a kainátové receptory. Většina AE (PHE, VAL, KAR, LAM TOP, ZON) působí na sodné kanály (v inaktivním stavu) na postsynaptických neuronech. LAM také působí na sodné kanály na presynapsích. Dalšími molekulárními cíly jsou vápenaté kanály, vysokoprahové kanály inhibuje GAB, nízkoprahové kanály inhibuje EHT, VAL, ZON. LEV působí na vezikuly s glycinem a glutamátem specifickou vazbou synaptický vezikulární glykoprotein 2A (Upraveno dle Bialer a White, 2010) Primidon Primidon, PRI, systematickým názvem 5-ethyldihydro-5-fenylpyrimidin-4,6(1H,5H)- dion (Obr. 9). Jeho antikonvulzivní účinky byly rozpoznány v roce Podobně jako PBT je PRI účinný při léčbě parciální a tonicko-klonických generalizovaných záchvatech, neúčinný při absencích. Někdy se užívá u dětí s myoklonickými záchvaty (Williams, 1956). Ve většině západoevropských zemí byl PRI od roku 2004 stažen z prodeje (Neels et al., 2004). 22

30 Obr. 9 Strukturní vzorec primidonu. Farmakodynamický profil Mechanismus účinku PRI je doposud nejasný, zejména z důvodu velmi rychlé konverze na metabolity. Předpokládalo se, že hlavní úlohu antikonvulzivního účinku hraje metabolit PBT, ale studie prokázaly, že PRI vykazuje samostatnou antikonvulzivní aktivitu. Bylo zjištěno, že farmakodynamický profil se více podobá KAR a PHE, než PBT. PRI tedy pravděpodobně působí na napěťově řízené sodné kanály a na GABAergní nebo glutamátergní neurotransmisi nemá vliv (Michelucci et al., 2009). Farmakokinetický profil PRI je velmi dobře absorbován z gastrointestinálního traktu. Distribuční objem je 0,6 l kg -1. Vazba na sérové proteiny nepřesahuje 20 %. Eliminační poločas je 5 16 h. PRI je metabolizován v játrech za vzniku dvou farmakologicky aktivních metabolitů PBT, phenylethylmalonamidu (PEMA). Asi 92 % z podané dávky se vylučuje močí, z toho asi % v nezměněné formě, % jako PEMA a 1-8 % jako PBT a jeho metabolity (Neels et al., 2004). Při TDM je nutné sledovat hladinu PRI i PBT. Farmakologická účinnost PEMA je zanedbatelná. Jelikož eliminační poločas PBT je asi 10x vyšší, je nebezpečí, že u pacientů léčených PRI může docházet k toxické akumulaci PBT. Okamžité vysazení léku se nedoporučuje, z důvodu abstinenčních příznaků (Neels et al., 2004). 23

31 Lékové interakce PBT vzniklý biotransformací PRI vykazuje shodné lékové interakce, jako jsou popsány pro samostatné léčivo. Relevantní lékové interakce mohou nastat při polyterapii s PHE a KAR. Jejich vlivem dochází k rychlejší biotransformaci PRI. Naopak VAL můžu zvýšit hladinu metabolitů (zejména PBT) inhibicí metabolismu PBT a tím může dojít k výraznému vzrůstu hladiny PRI. Vliv PRI jako silného induktoru CYP na jiné léčiva je podobný jako u PBT (Michelucci et al., 2009). Byly popsány také interakce s vitaminy. PRI snižuje sérové hladiny vitaminu B 6, snižuje absorpci folátů. Vlivem folátů může docházet ke zvýšení metabolismu PRI. Dále PRI zvyšuje rozklad vitaminu K a vitaminu D (Hronek a Kovařík, 2012). Obr. 10 Ilustrační zobrazení molekulárních cílů antiepileptik inhibiční synapse. AE mají schopnost přímo nebo nepřímo ovlivňovat inhibiční signalizaci v CNS. BZD, TOP a barbituráty se váží jako agonisté na různá místa na GABA A receptoru a allostericky zvyšují GABAergní signalizaci. GABAergní neurotransmise může být nepřímo modulována ZON inhibicí zpětného vychytávání GABA na presynaptických nervových zakončeních nebo gliových buňkách. VIG a VAL inhibují degradaci GABA a VAL podporuje syntézu GABA. LEV specificky působní na synaptický vezikulární glykoprotein 2A a neurotransmisi GABA (Upraveno dle Bialer a White, 2010). 24

32 3.6.2 Antiepileptika II. generace Karbamazepin Karbamazepin, KAR je tricyklické antiepileptikum se systematickým názvem 5H-dibenzo(b,f)azepin-5-karboxamid. Je jedním z nejčastěji předepisovaných léčiv při tonicko-klonických a parciálních záchvatech. KAR není účinný proti absencím nebo myoklonickým záchvatům. KAR má také antidiuretické vlastnosti, což je velmi omezující u terapie starších pacientů s kardiovaskulárním onemocněním (Šulcová, 2007). Obr. 11 Schematické znázornění epoxidace karbamazepinu. Epoxidací karbamazepinu vzniká farmakologicky aktivní metabolit karbamazepin-10,11-epoxid (Upraveno dle Pearce et al., 2002). Farmakodynamický profil KAR patří mezi AE, která inhibičně působí na iontové kanály. Jeho hlavní úlohou je stabilizace inaktivních forem vysokofrekvenčních sodných kanálů. KAR zpomaluje návrat kanálu z inaktivní na neaktivní konformaci obdobně jako u PHE (Kuo et al., 1997). Farmakokinetický profil KAR je po perorálním podání vstřebáván téměř zcela, ale relativně nepravidelně a pomalu % KAR je vázán na sérové proteiny. Jaterní metabolismus poskytuje farmakologicky aktivní metabolit karbamazepin-10,11-epoxid (EPO), který se váže na sérové proteiny z % (Obr. 11). Biologický poločas po jednorázové dávce je asi 30 h, ale jelikož se jedná o AE, u kterého dochází k významné autoindukci vlastní biodegradace, biologický poločas po opakovaném podávání KAR se snižuje asi na 15 h. 25

33 K ustálení hladiny většinou dochází za 2 3 týdny. Eliminační poločas EPO je přibližně 6 hodin. Většina podané dávky se vylučuje močí ve formě metabolitů (Neels et al., 2004). Lékové interakce KAR patří mezi silné induktory aktivity CYP. Pokud je pacientovi zavedena polyterapie s jinými indukujícími AE (PHE, PBT), sérová koncentrace se může významně snížit, naproti tomu sérová koncentrace EPO může vzrůst. Současné podání inhibitorů jaterních enzymů (VAL) vyvolá zvýšení sérové koncentrace KAR. Mezi další léčiva, která mohou vyvolat zvýšení hladiny, patří například erythromycin, trazodon nebo isoniazid (Slíva, 2011). Tab. 4 Orientační terapeutické a toxické hladiny AE v séru (upraveno dle Schulz a Schmoldt, 2003). Lék Terapeutická Hladina v séru (mg l -1 ) Toxická Ethosuximid Fenobarbital Phenytoin Primidon Karbamazepin Clonazepam 0,01-0,08 0,1 Diazepam 0, Clobazam 0,1-0,4 Valproát Gabapentin 5, Lamotrigin Levetiracetam Topiramát 3,4-5,2 Vigabatrin 2-9 Zonisamid

34 Benzodiazepiny Benzodiazepiny (BZD) patří mezi léčiva, která vyvolávají sedativní, hypnotické, anxiolytické, myorelaxační, amnestické nebo antikonvulzivní účinky. Antikonvulzivní vlastnost je zajištěna specifickým působením na allosterické vazebné místo pro BZD na rozhraní α a γ podjednotek GABA A receptoru. Touto vazbou dochází ke zvýšení afinity pro navázání GABA. Na rozdíl od barbiturátů, BZD nejsou schopny aktivovat GABA A receptor bez přítomnosti GABA. Nejčastěji používanými BZD pro terapii epilepsie jsou diazepam, clonazepam a clobazam. Z klinického hlediska se využívají při prevenci absencí, myoklonických nebo tonicko-klonických záchvatech. BZD (hlavně diazepam) se také podávají intravenózně jako první pomoc při status epilepticus. Všechny BZD vykazují obdobné nežádoucí účiny, mezi které patří sedace, ospalost, svalová slabost, ataxie, bolesti hlavy, závratě a dvojité vidění. Hlavní nevýhodou a zároveň příčinou omezeného předepisování BZD je relativně rychlý, ale individuální vývoj tolerance s následnou fyzickou závislostí a vysazením léků může dojít k abstinenčním příznakům (Šulcová, 2007). Při polyterapii s PHE, PBT nebo KAR mohou tyto AE urychlit metabolismus BZD a tím snížit jich hladinu v séru. Při současném podávání látek tlumících CNS dochází k výraznějším projevům vedlejších příznaků a možnosti předávkování (Šulcová 2007) Clonazepam Clonazepam, CLO, systematickým názvem 5-(2-chlorfenyl)-7-nitro-1,3-dihydro-2H- 1,4-benzodiazepin-2-on (Obr. 12) je výhodný zejména při myoklonických záchvatech. Vývoj tolerance je méně častý než u DIA (Nešpor, 2003). Obr. 12 Strukturní vzorec clonazepamu. 27

35 Farmakokinetický profil CLO se velmi dobře vstřebává perorálně a maximální koncentrace dosahuje po 1 4 h. Na sérové proteiny se váže asi 86 %. CLO je metabolizován v játrech na 7-aminoclonazepam, který vykazuje pouze slabou farmakologickou účinnost. Biologický poločas se pohybuje v rozmezí h. Renální eliminací se vyloučí % z podané dávky a % stolicí ve formě metabolitů (Neels et al., 2004) Diazepam Diazepam, DIA, 7-chlor-5-fenyl-1-methyl-1,3-dihydro-2H-1,4-benzodiazepin-2-on je jedním z nejsilnějších AE. Užívá se zejména při akutních záchvatech nejlépe intravenózním či rektálním podáním. Indikace DIA může být výhodná pro zvládnutí nutného časového úseku, například při změně léčby. Dlouhodobá terapie se nedoporučuje (Nešpor, 2003). Obr. 13 Schematické znázornění metabolismu diazepamu. Z diazepamu vzniká N-dealkylací hlavní metabolit nordiazepam nebo 3-hydroxylací temazepam. Následuje 3-hydroxylace nordiazepamu, resp. N-dealkylace temazepamu za vzniku oxazepamu (Bílková, 2004). 28

36 Farmakokinetický profil Po perorálním podání je DIA rychle absorbován a má velmi rychlá nástup účinku. V závislosti na způsobu podání, se liší doba dosažení maximální hladiny. Maximální sérová hladina po perorálním podání dávky je dosažena během 0,5 1,5 h. V případě nutnosti okamžitého zásahu a intravenózní aplikace je maximální koncentrace dosažena do 5 min. DIA se téměř zcela váže na sérové proteiny (96 %). V játrech DIA podléhá biotransformaci (dealkylaci a hydroxylaci) za vzniku několika aktivních metabolitů (Obr. 13). Hlavním metabolitem je N-desmethyldiazepam (nordiazepam, NORD), dalšími významnými metabolity jsou temazepam (TEMA) a oxazepam (OXA). Tyto metabolity se vylučují močí jako glukuronidy. Biologický poločas DIA je h. U nordiazepamu se biologický poločas pohybuje v rozmezí h (Neels et al., 2004) Clobazam Clobazam, CLB (1,5-benzodiazepin) má odlišnou chemickou strukturu než DIA a CLO (1,4-benzodiazepiny), konkrétně se jedná o 7-chlor-5-fenyl-1-methyl-1H-1,5- benzodiazepin-2,4(3h,5h)-dion. Ve srovnání s DIA a CLO, CLB způsobuje menší sedativní účinky a má podstatně menší vliv na motorickou koordinaci (Nešpor, 2003). Farmakokinetický profil CLB je dobře vstřebáván po perorálním podání a po 1 4 h CLB dosahuje maximální koncentrace. CLB je vysoce lipofilní látka, která rychle prostupuje hematoencefalickou bariérou. Na sérové proteiny se CLB váže z 85 %. CLB je v játrech metabolizován převážně dealkylací na N-desmethylclobazam (norclobazam), který je částečně aktivní (Obr. 14). Dalšími produkty jsou 4-hydroxyclobazam (hydroxylací) a 4-hydroxy-N-desmethylclobazam (dealkylací a hydroxylací). Eliminační poločas CLB je přibližně 30 h (Neels et al., 2004). 29

37 Obr. 14 Schematické znázornění metabolismu clobazamu. N-dealkylací clobazamu vzniká hlavní metabolit N-desmethylclobazam, dále 4-hydroxylací vzniká 4-hydroxyclobazam a 4-hydroxylací a N-alkylací vzniká 4-hydroxy-N-desmethylclobazam (Upraveno dle Giraud et al, 2004). 30

38 Tab. 5 Hlavní cesty biotransformace antiepileptik a jejich vliv na aktivitu cytochromů P450. Karbamazepin, phenytoin, fenobarbital a primidon patří mezi silné induktory aktivity CYP. Naopak valproát a topiramát působí jako inhibitory aktivity CYP. Obecně induktory snižují a inhibitory zvyšují sérovou hladinu současně podávaných léčiv (Upraveno dle Dostálek et al., 2009). Lék Ethosuximid Fenobarbital Hlavní cesta biotransformace Oxidace Oxidace, N-glukosidace, Renální exkrece Metabolismus Indukce Inhibice CYP3A4 CYP2E CYP2B CYP2C CYP2C9 CYP2C19 CYP2E1 Phenytoin Oxidace CYP2C9 CYP2C19 Primidon Karbamazepin Clonazepam Diazepam Clobazam Valproát Oxidace, N-glukosidace, Renální exkrece Oxidace Hydroxylace, Redukce Dealkylace, Hydroxylace Dealkylace, Hydroxylace Oxidace, Glukuronidace CYP2C9 CYP2C19 CYP2E3 CYP2C9 CYP2C19 CYP3E4 CYP2C8 CYP1A2 CYP3A4 CYP2C19 CYP3A CYP2C19 CYP3A CYP2C9 CYP2C19 CYP2B6 β-oxidace UGT CYP2A6 CYP2C9 CYP3A4 UGT CYP2C9 CYP3A4 UGT CYP2C9 CYP3A4 UGT CYP2C9 CYP3A4 CYP1A2 Gabapentin Renální exkrece - Lamotrigin Glukuronidace UGT UGT Levetiracetam Renální exkrece, Hydrolýza hydrolasy Topiramát Oxidace, Renální exkrece Inducibilní CYP Vigabatrin Renální exkrece - Zonisamid Oxidace, redukce, CYP3A4, N-acetylace, N-acetyltransferasy Renální exkrece Pozn.: UGT uridindifosfátglukurosyltransferasa CYP2C9 CYP2D6 CYP2C9 UGT CYP2C19 31

39 Valproát Kyselina valproová (systematicky kyselina 2-propylpentanová, Obr. 15) a její sodná sůl se vyznačují širokým spektrem účinku. Tato léčiva jsou využívána u pacientů se všemi typy záchvatů, zejména u pacientů s idiopatickou epilepsií. Jelikož kyselina valproová i valproát sodný v krevním řečišti disociují, jsou často souhrnně označovány jako valproát VAL (Komárek et al., 2006). Obr. 15 Strukturní vzorec valproátu. Farmakodynamický profil Antikonvulzivní účinky VAL jsou zajištěny několika mechanismy působení. Podobně jako PHE nebo KAR působí na vysokofrekvenční sodné kanály. VAL také může inhibovat T-typ vápenatých kanálů. Dalším možným mechanismem VAL je celkové zvyšování koncentrace GABA různými způsoby, tj. snížením katabolismu GABA inhibicí GABA-T, podporou syntézy GABA indukcí aktivity GAD (Owens a Nemeroff, 2003). Farmakokinetický profil VAL se dobře absorbuje perorálně. Významná je vazba na sérové proteiny (asi 90 %), která je závislá na dávce. Maximální sérová koncentrace je dosažena po 1 4 h po podání léků. Distribuční objem je 0,15 0,4 l kg -1. Biologický poločas se pohybuje mezi 8 20 h. VAL podléhá metabolismu v játrech (zejména dochází ke glukuronidaci a β-oxidaci) za vzniku farmakologicky neaktivních metabolitů. Vylučování probíhá hlavně renální cestou, zejména ve formě glukuronidu (70 %), v nezměněné formě se eliminuje asi 7 % z podané dávky (Neels et al., 2004). 32

40 Lékové interakce VAL je středně silný inhibitor aktivity CYP, tudíž dochází ke zpomalení metabolické dráhy (inhibicí glukuronidace). K interakci dochází zejména v polyterapii s PHE, PBT, KAR a PRI, což vede ke snížení sérové hladiny VAL (Komárek et al., 2006). Tab. 6 Příklady některých lékových interakcí antiepileptik (Upraveno dle Šulcová, 2007). Změna účinku léku Ethosuximidu Fenobarbitalu Phenytoinu Vlivem léku Sérová hladina Mechanismus VAL Zvýšená Enzymová inhibice KAR, PPI, PHE Snížená Enzymová indukce VAL, PHE Zvýšená Enzymová inhibice rifampicinu, tricyklická antidepresiva VAL, LEV, chloramphenicolu, amiodaronu, flukonazolu, fluoxetinu Snížená Zvýšená Enzymová indukce Enzymová inhibice VIG, PBT, KAR Snížená Enzymová indukce Primidonu VAL, PHE Zvýšená Enzymová inhibice PHE, PBT Snížená Enzymová indukce Karbamazepinu VAL, Cimetidinu, erythromycinu, isoniazidu Zvýšená Enzymová inhibice Benzodiazepinů PHE, PBT, KAR Snížená Enzymová indukce Valproátu PHE, KAR, PBT, PRI, salicyláty Snížená Enzymová indukce Gabapentinu - Lamotriginu VAL, sertralin Zvýšená Enzymová inhibice PHE, KAR, PBT, PRI Snížená Enzymová indukce Levetiracetamu - Topiramátu KAR, PHE Snížená Enzymová indukce Vigabatrinu - Zonisamidu KAR, PBT, PHE Snížená Enzymová indukce 33

41 3.6.3 Antiepileptika III. generace Gabapentin Gabapentin, GAB je využívaný v ČR v klinické praxi od roku 1997 u pacientů s parciálními záchvaty s nebo bez sekundární generalizace. Strukturně se jedná o analog GABA, tj. 1-(aminomethyl)-cyklohexanoctovou kyselinu (Obr. 16) (Kuba, 2006). Obr. 16 Strukturní vzorec gabapentinu. Farmakodynamický profil Ačkoli se předpokládalo agonistické působení na GABA A receptory, tato hypotéza nebyla potvrzena. Mechanismus působení GAB byl dlouho nejasný. Hendrich et al. (2008) prokázali, že GAB vykazuje vysokou afinitu na napěťově řízené vápenaté kanály N, L, P a Q-typu složené z α2δ-1 nebo α2δ-2 podjednotek, což vede k inhibici toku vápenatých iontů. Také bylo sledováno snížení exprese podjednotek. Farmakokinetický profil Absorpce GAB probíhá v proximální části tenkého střeva. Po perorálním podání je maximální hladina v séru dosažena po 2-3 h. Biologická dostupnost je závislá na dávce, zřejmě z důvodu omezené kapacity GABA transportéru. Distribuční objem je 0,9 l kg -1. GAB v séru se lineárně zvyšuje s dávkou. GAB není metabolizován ani vázán na sérové proteiny. Eliminace je výhradně renální. U pacientů s normální funkcí ledvin je eliminační poločas v séru 5-7 h. Pacienti s ledvinnou nedostatečností je nutná úprava dávkování, jelikož může docházet ke kumulaci GAB (Neels et al., 2004). 34

42 Lékové interakce GAB neovlivňuje jaterní enzymy, proto interakce s jinými léčivy není prakticky žádná. Také nebyla zaznamenána interakce GAB a ostatních AE. Bylo prokázáno, že antacida obsahující sloučeniny hliníku a hořčíku mohou snižovat absorpci GAB až o 20 % (Slíva, 2011) Lamotrigin Lamotrigin, LAM je fenyltriazinový derivát, konkrétně 3,5-diamino-6-(2,3- dichlorofenyl)-1,2,4-triazin (Obr. 17), který se mimo jiné řadí do skupiny antagonistů kyseliny listové, tzv. antifolátů. LAM je registrovaný v ČR od roku 1991 a má široké spektrum pro klinické využití zejména v monoterapii je účinný při parciálních záchvatech, primárně i sekundárně generalizovaných tonicko-klonických záchvatech, při záchvatech typu absence a u pacientů trpících Lennox-Gastautovým syndromem (Zárubová a Doležal, 2002). Obr. 17 Strukturní vzorec lamotriginu. Farmakodynamický profil LAM působí dvěma hlavními mechanismy. Presynapticky inhibuje uvolňování glutamátu z vezikul prostřednictvím inhibice sodných kanálů. Postsynapticky působí inhibičně na napětím řízené sodné kanály stabilizací inaktivního stavu kanálu. Také byla prokázána inhibice vysokoprahových N- a P-typů vápenatých kanálů (Pisani et al., 2004). 35

43 Farmakokinetický profil Vstřebávání LAM probíhá velmi rychle v gastrointestinálním traktu s biologickou dostupností 98 %. Maximální sérové hladiny je dosaženo za 1 3 h. Absorpce je lineárně závislá na dávce a není ovlivněna příjmem potravy. LAM se váže na sérové proteiny z 55 % a distribuční objem je 1,2 l kg -1. LAM podléhá v játrech konjugaci, kterou vnikají farmakologicky neaktivní metabolity 2-N a 5-N-glukuronidy. Lék se vylučuje primárně ledvinami. Poločas eliminace je h (pokud je podáván v monoterapii), s užíváním jiného AE indukující jaterní enzymy se poločas sníží na 8-20 h. Nicméně, VAL brzdí clearance LAM tak, že ho vytěsňuje z vazby na sérové proteiny, takže se jeho poločas eliminace prodlužuje až na 60 h (Neels et al., 2004) U LAM byl pozorován při opakovaném podávání slabý autoindukční efekt. Asi po dvou týdnech dochází k ustálení a hladina LAM v séru je asi o 20 % nižší než na počátku (Zárubová a Doležal, 2002). Lékové interakce LAM vykazuje lékové interakce v polyterapii s PHE, který má silný indukční účinek (více než fenobarbital nebo KAR), PHE také kompenzuje vliv VAL. PBT a KAR má srovnatelný indukční vliv. Pokud pacient užívá VAL, je nutné podávat nižší dávky LAM. Také bylo zaznamenáno, že užíváním některých antidepresiv (např. sertralinu) se koncentrace LAM zvyšuje. Dále například paracetamol urychluje metabolismus LAM (Johannessen et al., 2003) Levetiracetam Levetiracetam, LEV, chemicky (S)-α-ehyl-2-oxo-1-pyrrolidinacetamid (Obr. 18) je jedním z nejnovějších AE. V ČR byl LEV registrován až od roku 2001 a je indikován pacientům trpících parciálními i generalizovanými záchvaty (Kuba et al., 2003). Obr. 18 Strukturní vzorec levetiracetamu. 36

44 Farmakodynamický profil Nejdůležitější mechanismus účinku LEV je prostřednictvím specifické vazby na proteiny SV2A synaptických vezikul. Vazbou na SV2A proteiny se sníží rychlost uvolňování glutamátu z vezikul (Lynch et al., 2004). Bylo prokázáno, že LEV působí minoritně i na jiné molekulární cíle. LEV antagonisticky působí proti negativním modulátorům (zinek, β-karboliny) glycinových a GABA receptorů (Rigo et al., 2002). Také má významný inhibiční vliv na N-typ a částečný na P a Q-typy vysokoprahových vápenatých kanálů (Pisani et al., 2004). Farmakokinetický profil LEV je rychle a téměř úplně absorbován po perorálním podání dávky. Jeho biologická dostupnost je téměř 100 %. Sérová koncentrace se zvyšuje lineárně s dávkou a maximální hodnoty dosahuje po 1 h. LEV se téměř neváže na sérové proteiny (< 10 %). Distribuční objem se pohybuje v rozmezí 0,5 0,7 l kg -1. LEV je minimálně metabolizován (enzymatickou hydrolýzou, která je nezávislá na CYP). U LEV nebylo prokázáno působení na aktivitu jaterních enzymů. Většina z podané dávky (asi 76 %) se vyloučí močí v nezměněné podobě a zbytek látky se vylučují jako neaktivní metabolity. Eliminační poločas je u dospělých 6 8 h (Neels et al., 2004). Lékové interakce Vzhledem k tomu, že LEV je v játrech minimálně metabolizován a minimálně vázán na sérové proteiny, je nepravděpodobná interakce se současně podávanými léky nebo jinými AE. Nicméně při polyterapii s PHE působí na zvýšení koncentrace PHE v séru až o 50 % (Slíva, 2011) Topiramát Topiramát, TOP byl poprvé syntetizován v roce 1979 vědeckými pracovníky ve farmaceutické firmě jako antidiabetikum. Později byl TOP testován na potenciální antikonvulzivní účinky a studie na myších a potkanech potvrdily jeho vysokou aktivitu. Strukturně se jedná o derivát odvozený od D-fruktosy, se systematickým názvem 2,3:4,5-bis-O-(1-methylethyliden)-β-D-fruktopyranososulfamát (Obr. 19) (Maryanoff et al., 1987). TOP byl schválen v ČR v roce 1996 pro adjutivní terapii nebo monoterapii 37

45 u parciálních a generalizovaných epileptických záchvatů, včetně Lennox-Gastautova syndromu a tonicko-klonických záchvatů (Kuba et al., 2004). Obr. 19 Strukturní vzorec topiramátu. Farmakodynamický profil Antikonvulzivní účinky TOP jsou zajištěny několika způsoby jeho působení na CNS, mezi které patří inhibice napěťově řízených sodných kanálů. TOP zpomaluje rychlost otevírání sodných kanálů během depolarizace a vzniku akčního potenciálu. Další farmakologickou vlastností je inhibice některých isozymů karboanhydras, zesílení GABAergní inhibice působením na GABA A receptory a zeslabení glutamátergní excitace působením na AMPA a kainátové receptory (Shank a Maryanoff, 2008). Farmakokinetický profil Vstřebávání TOP je poměrně rychlé (maximální sérové koncentrace je dosaženo za 1 4 h), vazba na sérové proteiny je nízká (13 17 %) a biologická dostupnost dosahuje %. Distribuční objem je 0,6 0,8 l kg -1 (Neels et al., 2004). TOP není extenzivně metabolizován (cca z 20 %). Celkem se podařilo stanovit několik metabolitů, které vznikly hydroxylací, hydrolýzou a glukuronidací. Metabolity nevykazují prakticky žádnou farmakologickou aktivitu. Doposud nebyly identifikovány specifické isoenzymy CYP odpovědné za biotransformaci TOP (Patsalos, 2013), ale bylo prokázáno, že hlavní roli hrají zejména isoenzymy indukované KAR a PHE (Britzi et al., 2005). K eliminaci dochází hlavně v ledvinách primárně v nezměněném stavu (80 %). Biologický poločas v séru je 20 až 30 h (Neels et al., 2004). 38

46 Lékové interakce TOP působí jako středně silný inhibitor aktivity CYP, tím způsobuje u některých pacientů zvýšení sérové koncentrace PHE. Také bylo zaznamenáno snížení účinnosti hormonální antikoncepce snížením koncentrace estrogenu. U pacientů léčených i jinými AE indukující jaterní enzymy (zejména v polyterapii s KAR) se hladina TOP v séru snížila asi o 50 % (Johannessen et al., 2003). Tab. 7 Nežádoucí účinky nejvýznamnějších antiepileptik (upraveno dle Dhillon a Sander, 2003). Lék Na dávce závislý účinek Na dávce nezávislý účinek Ethosuximid Fenobarbital Phenytoin Karbamazepin Benzodiazepiny Valproát Gabapentin Lamotrigin Topiramát Nevolnost, zvracení, bolesti hlavy, ospalost, deprese Unavenost, závratě, deprese, poruchy paměti, impotence, kognitivní poruchy, hypokalcémie, osteomalacie, karance kyseliny listové Ataxie, nystagmus, zmatenost, nervozita, ospalost, hyperplazie dásní, hirsutismus, dvojité vidění, karence kyseliny listové, orofaciální dyskineze Dvojité vidění, ospalost, bolesti hlavy, nevolnost, srdeční arytmie, orofaciální dyskineze Únavnost, ospalost, ataxie, svalová slabost, bolesti hlavy, závratě, dvojité vidění Dyspeptické obtíže, nevolnost, vomitus, ospalost, ztráta vlasů, nechutenství Ospalost, dvojité vidění, ataxie, bolesti hlavy, přírůstek tělesné hmotnosti Bolesti hlavy, ospalost, dvojité vidění, ataxie Ospalost, unavenost, nervozita, nežádoucí úbytek tělesné hmotnosti 39 Vyrážka, Stevensův- Johnsonův syndrom Makropapulární vyrážka, hepatotoxicita Vyrážka, krevní dyskrazie, hepatotoxicita, teratogenní působení (rozštěpy patra) Fotosenzibilizace, hepatotoxicita, agranulocytóza, aplastická anémie, Stevensův-Johnsonův syndrom Vyrážka, trombocytopenie Aplastická anémie, trombocytopenie, hepatotoxicita, akutní pankreatitida Není znám Vyrážka, selhání jater Není znám Levetiracetam * Ospalost, závratě, svalová slabost Není znám Vigabatrin Ospalost, zmatenost, přírůstek tělesné hmotnosti, porucha zorného pole Zonisamid Ataxie, závratě, třes, poruchy paměti, ospalost * Údaj uvedený v Doležal a Zárubová, Údaj uvedený v Brázdil a Doležal, Poruchy chování, psychóza Ledvinové kameny

47 Vigabatrin Vigabatrin, VIG je strukturní analog inhibičního neurotransmiteru GABA. Konkrétně se jedná o γ-vinyl GABA, (±)-4-amino-5-hexanovou kyselinu (Obr. 20). Léková forma je racemická směs R(-) a S(+) izomerů v poměru 50:50, ale farmakologicky aktivní je pouze S(+) enantiomer. VIG se užívá při léčbě infantilních spasmů u dětí (Westův syndrom) a dále zejména pří léčbě rezistentní parciální epilepsie s i bez sekundární generalizace, které nelze zvládnout jinými AE. V ČR je tento lék dostupný od roku 1990 (Kuba, 2006). Při terapii VIG je nutná pravidelná kontrola zorného pole. Pokud se porucha objeví (přibližně u % pacientů), je nutné léčbu ukončit (Rektor a Kuba, 2007). Obr. 20 Strukturní vzorec vigabatrinu. Farmakodynamický profil VIG působí jako irreverzibilní inhibitor GABA-T, enzymu odpovědného za katabolismus GABA.. Důsledkem inhibice je zvýšená koncentrace GABA (Johannessen et al., 2003). Farmakokinetický profil Absorpce VIG probíhá v gastrointestinálním traktu (maximální sérové hladiny je dosaženo za cca 1 hodinu) s biologickou dostupností %. VIG se neváže na sérové proteiny. VIG v séru je lineárně závislá na dávce. Distribuční objem činí 0,8 l kg -1. VIG nepodléhá metabolizaci a je primárně eliminován močí v nezměněné formě (70 %). Eliminační poločas v séru je 5-8 h (Neels et al., 2004). Lékové interakce Ačkoli VIG nepodléhá metabolismu a není vázán na sérové proteiny, je zaznamenán vliv při polyterapii s PHE (dochází ke snížení PHE v séru). Interakce s jinými léčivy nejsou pozorovány (Slíva, 2011). 40

48 Zonisamid Zonisamid, ZON, 1,2-benzisoxazol-3-methansulfonamid (Obr. 21) je od roku 2008 k dispozici pro pacienty v ČR k přídatné terapii parciálních záchvatů (Brázdil a Doležal, 2008). Obr. 21 Strukturní vzorec zonisamidu. Farmakodynamický profil Hlavní mechanismus působení ZON je založen na stabilizaci inaktivních stavů sodných kanálů. Dále ZON inhibičně působí na nízkoprahové T-typy vápenatých kanálů, což je výhodné při léčbě absencí. Podobně jako TOP, také ZON je slabým inhibitorem některých isozymů karbohydratasy, ale vliv na antikonvulzivní účinek je nevýznamný (Johannessen et al., 2003). ZON působí na snížení produkce GABA transportérů GAT-1 a zvýšení produkce glutamátergních transportérů EAAC-1 (Ueda et al., 2003). Farmakokinetický profil Po perorálním podání ne ZON rychle absorbován a maximální hladiny dosahuje po 2 6 hodinách po užití léků % ZON se váže na sérové proteiny. ZON také zabírá místo na erytrocytech, což má za následek 4x až 8x vyšší koncentraci než je v séru. ZON je extenzivně metabolizován N-acetylací a konjugací, avšak metabolit (N-acetylzonisamid) je farmakologicky nevýznamný. Biologický poločas ZON v séru je h. Při současném podávání s PHE, PBT nebo KAR se snižuje přibližně na polovinu (Neels et al., 2004). Lékové interakce ZON nepůsobí na jaterní enzymy, ale indukující AE (PBT, PHE, KAR) zvyšují jeho metabolismus (Slíva, 2011). 41

49 3.7 Analytické metody pro stanovení antiepileptik v biologickém materiálu Jelikož při farmakoterapii je nezbytnou součástí TDM, bylo nutné zavést analytické metody pro stanovení hladin AE v biologických materiálech. V mnoha literaturách jsou uvedeny různé analytické přístupy, které lze obecně rozdělit na imunoanalytické (EMIT, FIA, FPIA, RIA, NIA, TIA, CLIA) metody, separační chromatografické (TLC, HPLC, GC) a elektromigrační (CELFO, CZE, MECC) metody (Neels et al., 2004). Nejstarší technikou pro stanovení AE je klasická tenkovrstevná chromatografie (TLC). Jednu z prvních prací představil Olesen (1965), konkrétně se jednalo o stanovení PHE. Fenimore et al. (1978) využili pro stanovení PHE a PBT vysokoúčinnou TLC (HPTLC). Předností TLC je její rychlost, nenáročnost na přístrojové vybavení, nevýhodou je obtížná standardizace podmínek dělení. Další metodou je imunoanalýza (Tab. 8), nejběžněji používanou komerční metodou je enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT). Další užívanou metodou je například fluorescenční imunoanalýza (FIA), fluorescenční polarizační imunoanalýza (FPIA), radioimunoanalýza (RIA), nefelometrická (NIA), turbidimetrická (TIA) nebo chemiluminiscenční (CLIA) imunoanalytická metoda (Neels et al, 2004). Imunochemické metody jsou v současnosti v rámci TDM antiepileptik pravděpodobně nejužívanějšími v klinické laboratorní praxi pro svou jednoduchost a instrumentální nenáročnost. Dalšími nezanedbatelnými výhodami jsou možnost začlenění těchto vyšetření do automatizovaných modulárních systémů, minimální nároky na přípravu vzorku, možnost provádění paralelních analýz, s tím spojený rychlý průchod vzorku a zkrácení doby odezvy u statimových požadavků. Nevýhodou imunochemických metod při TDM antiepileptik je vysoká cena a absence vhodných diagnostických souprav pro vybrané analyty, zejména farmak třetí generace a dále nemožnost současné analýzy metabolitů. V biologickém vzorku také často dochází ke zkříženým reakcím (Wilson et al., 1983). Ačkoli ke zkřížené reakci dochází například u KAR a jeho aktivního metabolitu EPO, tak Hermida a Tutor (2003) stanovili metodou EMIT volný KAR. Starší AE (PBT nebo PRI) nejsou léky první volby, takže trend předepisovat tyto AE stále klesá. Jelikož diagnostické soupravy jsou limitovány expirací, je finančně nežádoucí provádět stanovení imunoanalyticky (Neels et al., 2004). 42

50 Tab. 8 Příklady stanovení některých antiepileptik v biologických materiálech imunoanalytickými metodami. Metoda Biologický materiál Analyt Reference EMIT Sérum PBT, PHE Booker a Darcey, FPIA Sérum, Plazma ETH Stewart a Bottorff, EMIT Sérum KAR, PHE, PRI, ETH, VAL Wilson et al., FIA Sérum KAR, PHE, PRI, ETH, VAL Wilson et al., FPIA Sérum KAR, PHE, PRI, ETH, VAL Wilson et al., NIA Sérum KAR, PHE, PRI Wilson et al., RIA Sérum PHE Wilson et al., EMIT Sérum KAR, PHE Rambeck et al., FPIA Sérum KAR, PHE Rambeck et al., FPIA Sérum PBT Bereczki et al., RIA Sérum PBT Bereczki et al., CLIA Sérum KAR, EPO, PBT, PHE, VAL Frank et al., EMIT Sérum KAR, EPO, PBT, PHE, VAL Frank et al., FPIA Sérum KAR, EPO, PBT, PHE, VAL Frank et al., FPIA TIA Sérum, Plazma Sérum, Plazma VAL Datta a Dasgupta, VAL Datta a Dasgupta, V současné době se pro TDM začínají uplatňovat také elektromigrační separační metody. Výhodou těchto metod oproti chromatografickým metodám je nižší spotřeba vzorku a možnost jeho přímého nástřiku, dále nižší spotřeba chemikálií. Mezi hlavní elektromigrační metody pro stanovení AE patří kapilární elektroforéza (CELFO) a její ostatní módy, tj. kapilární zónová elektroforéza (CZE), micelární elektrokinetická kapilární chromatografie (MECC) a kapilární elektrochromatografie (CEC) nejčastěji s UV detekcí (Pavlíková et al., 2007). Příklady využití elektromigračních metod pro stanovení AE v biologických materiálech jsou shrnuty v Tab

51 Tab. 9 Příklady stanovení některých antiepileptik v biologických materiálech elektromigračními metodami s UV detekcí. V tabulce jsou zohledněny vlnové délky (λ, nm), které byly použity v jednotlivých experimentech. Metoda Biologický materiál Analyt λ (nm) Reference MECC Sérum PBT, PHE, PRI, ETH 220 Schmutz a Thormann, CELFO Sérum, Moč BZD 200 Tomita a Okuyama, MECC Sérum, Sliny PBT, KAR 240 Thormann et al., MECC Sérum PBT, PRI, PHE, KAR, EPO, EHT, ZON 210 Kataoka et al., CELFO Plazma VAL 210 Pucci et al., CEC Sérum LEV 214 Shihabi et al., MECC Plazma PBT, PHE, PRI, LAM, KAR, EPO 210, 285 Lancas et al., Další užívanou metodou je plynová chromatografie (GC) s využitím několika typů detektorů plamenově ionizační detektor (FID), dusíko-fosforový detektor (NPD), detektor elektronového záchytu (ECD) a hmotnostní spektrometr (MS). Hlavními výhodami GC je jednoduchost a rychlost analýzy, účinnost separace látek a spotřeba malého množství vzorku. Nevýhodou je nutnost derivatizace řady analytů a s tím spojená náročnější příprava vzorku (Neels et al., 2004). Příklady prací zabývajících se stanovením AE metodou GC jsou vypsány v Tab

52 Tab. 10 Příklady stanovení některých antiepileptik v biologických materiálech metodou plynové chromatografie s využitím několika detektorů. Metoda Biologický materiál Analyt Reference GC-FID Sérum PHE, PBT Booker a Darcey, Plazma KAR, VAL, PHE, PRI, PBT, ETH Sengupta a Peat, Plazma KAR Ranise et al., Plazma TOP Holland et al., Sérum GAB Wolf et al., GC-MS Moč KAR, PHE, PRI, PBT, ETH Maurer, Vlasy PBT Goulle et al., Plazma CLO Song et al., Sérum KAR, LAM, EPO Hallbach et al., Plazma GAB Kushnir et al., KAR, VAL, PHE, PRI, PBT, ETH Speed et al., KAR, EPO Minkova a Getova, GC-ECD Plná krev ETH Wallace et al., Plazma, Plná krev BZD Lillsunde a Seppala, GC-NPD Plazma, Plná krev Sérum, Plazma BZD Lillsunde a Seppala, LAM Watelle et al, Řada klinických laboratoří využívá reverzní kapalinovou chromatografii nejčastěji s UV detekcí (RP-HPLC-UV) s fixní vlnovou délkou, měnitelnou vlnovou délkou nebo diodovým polem. Tyto metody běžně využívají C18 kolony a mobilní fáze acetonitril/vodná fáze. Nejčastější příprava vzorku je precipitace proteinů acetonitrilem (ACN) nebo extrakce do organického rozpouštědla (LLE). Prvotní zmínky využití HPLC-UV ke stanovení několika AE v biologickém materiálu se datují od roku Soldin a Hill (1976) využili HPLC-UV (absorbance látek při vlnové délce λ = 200 nm) k detekci několika AE (PBT, PHE, PRI, ETH, KAR). Další příklady stanovení různých AE v biologických materiálech metodou RP-HPLC-UV jsou uvedeny v Tab. 11. Také jsou známy práce, které odkazují na využití fluorescenčních detektorů (HPLC-F). Příkladem je stanovení GAB a VIG v séru a moči (Wad a Kramer, 1998) nebo TOP v séru (Bahrami et al., 2004). Dále byla popsána separace a kvantifikace VAL, PRI 45

53 a KAR metodou HPLC-ELSD (evaporative light scattering detector) (Babu, 2004). Lensmeyer et al. (1997) využili ke stanovení LAM, PHE, KAR a EPO v séru chromatografii na normální fázi s UV detekcí (NP-HPLC-UV). Tab. 11 Příklady stanovení některých antiepileptik v biologických materiálech metodou RP-HPLC-UV. V tabulce jsou zohledněny vlnové délky (λ, nm), které byly použity v jednotlivých experimentech. Biologický materiál Analyt λ (nm) Reference Sérum PBT, PHE, PRI, ETH, KAR 195 Kabra et al., Plazma PBT, PHE, PRI, KAR, VAL 200 Kushida a Ishizaki, Sérum PBT, PHE, PRI, KAR, EPO, ETH, ZON 205 Juergens, Sérum, Sliny, Moč PBT, PHE, PRI, ETH, KAR, EPO 200 Liu et al., 1993 Plazma PBT, PHE, LAM, KAR 205 Meyler et al., Plazma PBT, PHE, PRI, KAR, EPO 210 Romanyshyn et al., Plazma PBT, PHE, PRI, ETH, KAR, LAM 220 Matar et al., Plazma, Mateřské mléko KAR, EPO 254 Shimoyama et al., Sérum, Plazma BZD 254 El Mahjoub a Staub, Sérum, Moč CLB 228 Kunicki, Sérum LAM 330 Croci et al., Sérum PBT, PHE, KAR, EPO 240 Levert et al., Plazma LEV 205 Martens-Lobenhoffer a Bode-Boger, Sérum TOP 264 Bahrami et al., Plazma PBT, PHE, PRI, KAR, EPO, LAM 237 Serralheiro et al., Vysokoúčinná kapalinová chromatografie s hmotnostní detekcí HPLC-MS, resp. tandemovou hmotnostní spektrometrií HPLC-MS-MS se stala nejpreferovanější a nejefektivnější metodou pro spolehlivé, snadné, rychlé, přesné, reprodukovatelné a selektivní stanovení AE s velmi malou spotřebou vzorku (Matar, 2010). V některých studiích bylo využíváno pro stanovení TOP v plazmě HPLC-MS-MS chromatografický systém, který obsahoval C18 kolonu (5 µm; 3,9 x 50 mm), mobilní fázi složenou z ACN a 0,1% triethylaminu (80:20 v/v). Pro ionizaci v MS byla využita ionizace elektrosprejem (ESI) v negativním módu 46

54 s detekcí v multiple reaction monitoring (MRM) režimu. Kvantifikace byla provedena pomocí deuterovaného interního standardu (IStd) TOP-d 12 (Matar, 2010). Guo et al. (2007) představili metodu stanovení LEV v několika biologických tekutinách (plazma, sérum, sliny). V chromatografickém systému byla využita kolona C18 kolona (3 µm; 3,0 x 33 mm) a gradientová eluce, mobilní fáze 1: 2% methanol v 15 mmol l -1 octanu amonném (v/v) s 0,1% kyselinou octovou a mobilní fáze 2: 97% methanol v 15 mmol l -1 octanu amonném (v/v) s 0,1% kyselinou octovou. Ke stanovení byl využit MS s ESI v pozitivním módu s detekcí v MRM režimu a kvantifikace byla provedena pomocí ritonaviru jako IStd. Kim et al. (2011) představili HPLC-MS-MS metodu pro stanovení několika AE v plazmě (LEV, TOP, GAB, VAL, LAM, ZON, PHE, KAR a EPO). Pro stanovení byla použita C18 kolona (3 µm; 2,0 x 100 mm), mobilní fáze obsahovala 90% ACN a 5 mmol l -1 mravenčanový pufr (ph 7,8; 60:40 v/v). Detekce v MS byla zajištěna ionizací ESI v pozitivním a negativním módu v MRM režimu. Kvantifikace byla provedena pomocí zvolených IStd, v pozitivním módu PHE-d 10 a v negativním módu VAL-d 6. Dalším příkladem využití HPLC-MS-MS je stanovení PHE, PBT, LAM a TOP v séru. Při tomto experimentu byla použita C18 kolona (5 µm; 2,0 x 150 mm). Mobilní fáze byla složena z vody a methanolu (51:49 pro PHE, 50:50 pro PBT, 65:35 pro LAM, 35:65 pro TOP) a obsahovala 5 mmol l -1 octan amonný. Detekce v MS byla zajištěna ionizací ESI v pozitivním a negativním módu v MRM režimu. Kvantifikace byla provedena pomocí isotopicky značených IStd (PHE- 13 C 15 N, LAM- 13 C 15 N, TOP-d 12, PBT-d 5 ) (Tai et al., 2011). V roce 2004 firma Waters přišla na trh s vylepšením HPLC, představila technologii UPLC (ultra performance liquid chromatography), která využívá krátké chromatografické kolony se sorbenty o menším průměru částic (1,7 μm). Celý systém pracuje za velmi vysokých tlaků (až psi). Oproti HPLC má UPLC několik výhod, jako například zvýšení separační účinnosti, zvýšení citlivosti, snížení meze detekce, zkrácení doby analýzy a snížení spotřeby mobilních fází. Tyto výhody přináší pro rutinní laboratoře celkové snížení nákladů na analýzy (Swartz a Murphy, 2004). Metoda UPLC-MS-MS byla využita pri stanovení 22 AE v plazmě. Separace látek byla zajištěna C18 kolonou (1,7 µm; 2,1 x 50 mm) a gradientovou elucí (mobilní fáze 1: 10 mmol l -1 octan amonný (v/v) s 0,1% kyselinou mravenčí, mobilní 47

55 fáze 2: 85% methanol). Ke stanovení byl využit MS s ESI v pozitivním a negativním módu s detekcí v MRM režimu a kvantifikace byla provedena metodou kalibrační křivky (Shibata et al., 2012). Kuhn a Knabbe (2013) uvedli jiný přístup využití UPLC-MS-MS metody pro stanovení několika AE v séru a plazmě (LAM, LEV, PRI, TOP, ZON). Byla použita Phenyl kolona (1,7 µm; 2,1 x 50 mm) a gradientová eluce, mobilní fáze 1: 0,1% kyselina mravenčí ve vodě obsahující 2 mmol l -1 octan amonný (v/v) a mobilní fáze 2: 0,1% kyselina mravenčí v methanolu obsahující 2 mmol l -1 octan amonný (v/v). Detekce v MS byla zajištěna ionizací ESI v pozitivním módu v MRM režimu. Kvantifikace byla provedena pomocí IStd (LAM- 13 C,d 3, LEV-d 3, PRI-d 5, TOP-d 12, ZON-d 4 ). 48

56 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Cílem experimentální části je vyvinout co nejjednodušší metodu, jejíž ekonomická a časová náročnost bude minimální při zachování vysoké citlivosti, specifičnosti a nároků na klinickou laboratorní praxi. 4.1 Materiály a chemikálie Biologický materiál Vzorky negativního séra byly získány od dárců z krevní banky Laboratoří AGEL a.s. v Novém Jičíně. Reálné vzorky analyzovaného séra byly získány od pacientů vyšetřovaných na Úseku instrumentálních metod Laboratoří AGEL a.s. v Novém Jičíně v období od října 2012 do března Chemikálie Standardy: Levetiracetam (Sigma Aldrich, USA) Gabapentin (Sigma Aldrich, USA) Vigabatrin (Sigma Aldrich, USA) Topiramát (Sigma Aldrich, USA) Izotopicky značené standardy: Levetiracetam-d 6 (Chromservis, ČR) Gabapentin-d 4 (Chromservis, ČR) Vigabatrin- 13 C,d 2 (Chromservis, ČR) Topiramát-d 12 (Sigma Aldrich, USA) Diazepam-d 5 (Lipomed, USA) 49

57 Certifikované kontrolní a kalibrační referenční materiály IVD-CE: Benzodiazepines Plasma Control/HR, Level I, lot 4410, exp. 05/14 (Chromsystems, Německo) Benzodiazepines Plasma Control/HR, Level II, lot 4410, exp. 05/14 (Chromsystems, Německo) Biopath U, lot 1021, exp. 02/15 (BioVendor, ČR) ClinChek Serum Control, Level I, II, lot 341, exp. 10/16 (RECIPE, Německo) e-check (XE) Controls Level 1, 2, 3, lot 4068, exp. 05/14 (Sysmex, ČR) Liquichek Therapeutic Drug Monitoring Control (TDM) Levels I, III, lot 25760, exp. 04/15 (Bio-Rad, USA) Plasma Calibration Standard Benzodiazepines/HR, lot 4312, exp. 10/14 (Chromsystems, Německo) Serum Calibration Standard Levetiracetam (Keppra), lot 2313, exp. 06/15 (Chromsystems, Německo) Serum Calibration Standard Pregabalin / Vigabatrin / Gabapentin, lot 5013, exp. 12/16 (Chromsystems, Německo) Ostatní chemikálie: Acetonitril HPLC grade (Sigma Aldrich, USA) Borátový pufr (ph 9,0 9,5) (Lékárna AGEL, Nový Jičín) Dichlormethan HPLC grade (Chromservis, ČR) Fosfátový pufr (ph 6,5) s azidem sodným (BioSystems, Španělsko) Kyselina mravenčí pro LC-MS (Sigma Aldrich, USA) Kyselina octová p.a. (Lach-Ner, ČR) Methanol absolute pro LC-MS (Biosolve, Nizozemsko) Mravenčan amonný pro LC-MS (Sigma Aldrich, USA) Octan amonný pro LC-MS (Sigma Aldrich, USA) Toluen GC/ECD residue analysis (Chromservis, ČR) Triethylamin (Sigma Aldrich, USA) Trichloroctová kyselina pro LC/MS (Sigma Aldrich, USA) Voda HPLC grade (Sigma Aldrich, USA) 50

58 4.1.3 Ostatní materiál Analytické kolony: Gemini C18 (5 µm; 2,0 x 50 mm), Synergi Polar-RP (2,5 µm; 2,0 x 100 mm), Synergi 4u Hydro-RP 80A (4 µm; 2,0 x 50 mm), Synergi 4u Fusion-RP 80A (4 µm; 2,0 x 50 mm) a Kinetex PFP 100A (5 µm; 2,1 x 50 mm) byly zakoupeny od firmy Phenomenex (USA). YMC-Triart C18 (3 µm; 2,0 x 50 mm) byla zakoupena od firmy Chromservis (ČR). 4.2 Přístrojové vybavení Centrifuga (Eppendorf, Německo) ph metr (RADIOMETER, Francie) Spektrofotometr (Eppendorf, Německo) Třepačka (Edmund Bühler, Německo) UPLC-MS-MS (AB SCIEX, USA) Vortex (Vibromix, ČR) 4.3 Příprava zásobních roztoků standardů Vodné zásobní roztoky LEV, GAB, VIG, LEV-d 6, GAB-d 4 a VIG- 13 C,d 2, byly připraveny o koncentraci 1 g l -1. Methanolické zásobní roztoky TOP, TOP-d 12 a DIA-d 5 byly připraveny o koncentraci 1 g l -1. Postupným ředěním zásobních roztoků byly připraveny pracovní roztoky s požadovanými koncentracemi. Ostatní standardy (CLB, CLO, DIA, NORD, OXA a TEMA) byly izolovány extrakcí do methanolu z farmaceutických přípravků a byly mi poskytnuty laskavostí Mgr. Sokolové, Ph.D. 51

59 4.4 Použitá instrumentace Analýzy byly provedeny na přístroji LC-MS (Obr. 22) firmy AB SCIEX (Framingham, USA). Chromatografický systém (Eksigent ultalc System) se skládá ze dvou pump (ekspert 100 Pump), autosampleru (ekspert 100-XL Autosampler) a kolonového termostatu (ekspert 100 Column Oven). Hmotnostní spektrometr (QTRAP 4500 System) obsahoval trojitý kvadrupólový analyzátor, jako iotový zdroj byl použit elektrosprej (ESI). Dusík byl využit jako kolizní, zmlžující, sušící plyn a curtain gas. Měřením ve scan módu byla získána hmotnostní spektra, podle kterých byly jednotlivé analyty identifikovány. Dále byly provedeny analýzy v MRM módu, kdy studované analyty byly identifikovány podle svých produktových iontů a retenčních časů. Obr. 22 Fotografie UPLC systému s hmotnostním spektrometrem od firmy AB SCIEX Optimalizace parametrů MS Cílem zvolení vhodných parametrů MS je dosažení optimální ionizace a fragmentace analytů. Byly zohledňovány tyto parametry: deklasterační potenciál DP (V), kolizní energie CE (V), výstupní potenciál kolizní cely CXP (V), vstupní potenciál EP (V), napětí na kapiláře v iontovém zdroji IS (V), teplota zmlžujícího plynu TEM ( C), 52

60 tlak curtain gas CUR (psi), tlak kolizního plynu CAD, tlak zmlžujícího plynu GS1 (psi) a tlak sušícího plynu GS2 (psi). Pro experimenty byly použity roztoky standardů TOP, TOP-d 12, LEV, LEV-d 6, GAB, GAB-d 4 VIG, VIG- 13 C,d 2, DIA-d 5, CLB, CLO, DIA, NORD, OXA a TEMA o koncentraci 0,2 mg l -1. Na základě navolených parametrů byly sledovány odezvy jednotlivých analytů. Experimenty byly provedeny v tripletech Optimalizace podmínek LC Pro určený optimálních podmínek separace jednotlivých analytů bylo vyzkoušeno několik mobilních fází a analytických kolon. Pro experimenty byly použity roztoky standardů TOP, LEV, LEV-d 6, GAB, GAB-d 4 VIG, VIG- 13 C,d 2 a DIA-d 5 o koncentraci 10 mg l -1 ; TOP-d 12 o koncentraci 5 mg l -1 ; CLB, CLO, DIA, NORD, OXA a TEMA o koncentraci 0,1 mg l -1. Experimenty byly provedeny v tripletech. Použité kolony: Gemini C18 (5 µm; 2,0 x 50 mm) Synergi Polar-RP (2,5 µm; 2,0 x 100 mm) Synergi 4u Hydro-RP 80A (4 µm; 2,0 x 50 mm) Synergi 4u Fusion-RP 80A (4 µm; 2,0 x 50 mm) YMC-Triart C18 (3 µm; 2,0 x 50 mm) Použité mobilní fáze: 0,05% vodný roztok kyseliny mravenčí (ph 3,1) a ACN (isokratická eluce 40 % : 60 %) 0,05% vodný roztok kyseliny octové (ph 3,8) a ACN (isokratická eluce 40 % : 60 %) 0,1 mol l -1 vodný roztok octanu amonného s 0,1% kyselinou mravenčí (výsledné ph 3,6) a ACN (isokratická eluce 50 % : 50 %) 0,1 mol l -1 vodný roztok octanu amonného s 0,1% kyselinou mravenčí (výsledné ph 3,6) a 0,1 mol l -1 vodný roztok octanu amonného s 0,1% kyselinou mravenčí v ACN (10:90 v/v) (isokratická eluce 40 % : 60 %) 53

61 0,1 mol l -1 vodný roztok octanu amonného s 0,1% kyselinou mravenčí (výsledné ph 3,6) a methanol (isokratická eluce 65 % : 35 %) 0,1% vodný roztok triethylaminu a ACN (isokratická eluce 20 % : 80 %) 5 mmol l -1 vodný roztok mravenčanu amonného (ph 6,8) a ACN (isokratická eluce 65 % : 35 %) 4.5 Příprava vzorku Precipitace proteinů Vzorek séra o objemu 10 μl, spikovaný standardy LEV, GAB a VIG o dané koncentraci, byl naředěn 200 μl vody, dále bylo přidáno 20 μl interního standardu o koncentraci c = 10 mg l -1 (pro LEV LEV-d 6, pro GAB GAB-d 4 a pro VIG VIG- 13 Cd 2 ). Nakonec byl vzorek precipitován přídavkem 200 μl 10% vodné trichloroctové kyseliny. Po důkladném promíchání na vortexu, byl vzorek centrifugován (10 min, g, při laboratorní teplotě). Pro analýzu bylo použito 50 μl. Ke vzorku séra o objemu 30 μl, spikovaný standardem TOP o dané koncentraci, bylo přidáno 10 μl interního standardu o koncentraci c = 5 mg l -1 (TOP-d 12 ). Nakonec byl vzorek precipitován přídavkem 60 μl ACN. Po důkladném promíchání na vortexu, byl vzorek centrifugován (10 min, g, při laboratorní teplotě). Pro analýzu bylo použito 50 μl. Stejným postupem byl pro každou sérii vzorků zpracován negativní vzorek séra a pro ověření správnosti naměřených dat byly rovněž do série zařazeny komerčně dostupné certifikované kontrolní referenční materiály IVD-CE. Příprava vzorku byla shodná také v případě zpracování hemolytického séra a jiných certifikovaných referenčních materiálů (Biopath U, Liquichek Therapeutic Drug Monitoring Control) pro ověření specifičnosti metody. 54

62 4.5.2 Extrakce kapalina/kapalina Ke vzorku séra o objemu 200 μl, spikovaný komerčně dostupným certifikovaným kontrolním referenčním materiálem pro CLB, CLO, DIA, NORD, OXA a TEMA (Benzodiazepines Plasma Control/HR, Level I a Level II) o dané koncentraci, bylo přidáno 25 μl interního standardu o koncentraci c = 10 mg l -1 (DIA-d 5 ). Dále byl přidán borátový pufr (0,1 mol l -1, ph 9,0 9,5). Extrakce byla provedena směsí 900 μl toluenu a 100 μl dichlormethanu. Účinná extrakce byla zajištěna 10 min třepáním. Následně odebraný 4 ml organický extrakt byl při laboratorní teplotě odpařen v proudu dusíku. Odparek byl rozpuštěn ve 100 μl methanolu a 80 μl bylo použito pro analýzu. Stejným postupem byl pro každou sérii vzorků zpracován negativní vzorek séra a pro ověření správnosti naměřených dat byly rovněž do série zařazeny komerčně dostupné certifikované kontrolní referenční materiály IVD-CE. Příprava vzorku byla shodná také v případě zpracování hemolytického séra a jiných certifikovaných referenčních materiálů (Biopath U, Liquichek Therapeutic Drug Monitoring Control) pro ověření specifičnosti metody. 4.6 Kvantifikace Pro kvantifikaci byly ke vzorkům přidány izotopicky značené interní standardy. Diazepam-d 5 byl použit pro stanovení koncentrace CLB, CLO, DIA, NORD, OXA a TEMA v séru. Levetiracetam-d 6 byl použit pro stanovení koncentrace LEV v séru. Gabapentin-d 4 byl použit pro stanovení koncentrace GAB v séru. Vigabatrin- 13 Cd 2 byl použit pro stanovení koncentrace VIG v séru. Topiramátu-d 12 byl použit pro stanovení koncentrace TOP v séru. jednotlivých analytů byly vypočteny na základě odečtených ploch píků pod křivkou (AUC) v programu Analyst Software. 55

63 4.7 Validace metody Příprava pracovních roztoků standardů a pracovních vzorků Pracovní roztoky izotopicky značených standardů byly připraveny naředěním zásobních roztoků o koncentraci 1 g l -1. Výsledná koncentrace LEV-d 6, GAB-d 4, VIG- 13 C,d 2 a DIA-d 5 činila 10 mg l -1. Výsledná koncentrace TOP-d 12 byla 5 mg l -1. Ze zásobních roztoků standardů (TOP, LEV, GAB a VIG) byly naředěním připraveny pomocné pracovní roztoky standardů o výsledných koncentracích 10 a 100 mg l -1. Pracovní vzorky pro měření TOP byly připraveny naspikováním pracovních roztoků standardů do 1 ml negativního séra. Výsledné koncentrace TOP byly: 0,1; 0,8; 4; 8; 10 a 16 mg l -1, přičemž sérum o výsledné koncentraci 10 mg l -1 bylo použito jako kalibrační standard ve všech stanoveních TOP. Pracovní vzorky pro měření LEV, GAB a VIG byly připraveny naspikováním pracovních roztoků standardů do 1 ml negativního séra. Výsledné koncentrace LEV byly: 0,5; 5; 20; 40 a 60 mg l -1. Výsledné koncentrace GAB byly: 0,5; 5; 10; 20 a 40 mg l -1. Výsledné koncentrace VIG byly: 0,5; 5; 10; 20 a 40 mg l -1. Pracovní vzorky pro měření CLB, CLO, DIA, NORD, OXA a TEMA byly připraveny naspikováním certifikovaných kontrolních referenčních materiálů IVD-CE Benzodiazepines Plasma Control/HR, Level I (kontrola1, K1) a Level II (kontrola2, K2) do 1 ml negativního séra. Výsledné koncentrace systematického ředění kontrolních referenčních materiálů K1 a K2 jsou přehledně uvedeny v Tab. 12. Tab. 12 Výsledné koncentrace benzodiazepinů ředění kontrolních referenčních materiálů K1 a K2 negativním sérem. Poměr ředění CLB (μg l -1 ) CLO (μg l -1 ) DIA (μg l -1 ) NORD (μg l -1 ) OXA (μg l -1 ) TEMA (μg l -1 ) 1/10 K1 14,3 2,3 14 8,4 14,8 8,2 K , , ,7 2/3 K1 + 1/3 K2 1/3 K1 + 2/3 K2 283,3 39,1 584,7 343,2 599,7 325,8 423,7 54,9 1029,3 602,6 1051,3 569,9 K ,

64 4.7.2 Selektivita Před zahájením validace metody bylo analyzováno deset vzorků negativního séra na možnou přítomnost interferujících píků, které by mohly ovlivňovat identifikaci a kvantifikaci jednotlivých analytů Specifičnost Specifičnost metody byla ověřena na možnou přítomnost interferujících píků způsobenou jinými léčivy (např. antipyretiky, antiarytmiky, antiastmatiky a antibiotiky), přítomností hemoglobinu nebo bilirubinu v hemolytickém, resp. ikterickém séru. Analýzy byly provedeny v tripletech. Pro vyloučení interferencí jinými léčivy byly využity certifikované referenční materiály Liquichek Therapeutic Drug Monitoring (TDM) Control Level I a Level III, jejichž koncentrace jsou uvedeny v Tab. 13. Hodnoty Control Level I udávají normální hladiny, naopak hodnoty Control Level III udávají vysoké až toxické hladiny při užívání těchto léčiv. Z důvodu přítomnosti DIA a CLO v použitých referenčních materiálech nebyla pro tyto analyty ověřena přítomnost interferencí způsobených jinými léčivy. Vyšetřované hemolytické sérum obsahovalo 295 g l -1 volného hemoglobinu (referenční rozmezí u zdravých jedinců se pohybuje g l -1 u žen a g l -1 u mužů). hemoglobinu byla stanovena přímým fotometrickým měřením při vlnové délce 415 nm metodou kalibrační přímky. K přípravě vzorku bylo zapotřebí použít komerčně dodávaný reagent obsahující fosfátový pufr (72 mmol l -1, ph 6,5) s azidem sodným (0,95 g l -1 ). Také byl ověřen vliv bilirubinu na stanovení jednotlivých analytů. Pro analýzy byl využit certifikovaný referenční materiál Biopath U, ve kterém byla hladina celkového bilirubinu deklarována na 105 μmol l -1 (referenční hodnoty u zdravých jedinců se pohybují v rozmezí 4,7 24 μmol l -1 ). 57

65 Tab. 13 léčiv v certifikovaném referenčním materiálu Liquichek Therapeutic Drug Monitoring (TDM) Control. Liquichek Therapeutic Drug Monitoring (TDM) Control Jiná léčiva Level I (mg l -1 ) Level III (mg l -1 ) Acetaminofen 16,4 139,0 Digoxin 0, , Chinidin 1,32 4,98 Theofylin 4,99 28,0 Amikacin 5,77 31,8 Vankomycin 5,07 38,5 Gentamicin 1,65 7, Linearita Linearita byla ověřena v určeném koncentračním rozsahu pro všechny analyty (Tab. 18) během čtyřech následujících dní. Kalibrační závislost byla tvořena z pěti bodů (pracovních vzorků). Kalibrační řada byla sestavena z koncentrací: pro TOP (0,1; 0,8; 4; 8 a 16 mg l -1 ), pro LEV (0,5; 5; 20; 40 a 60 mg l -1 ), pro GAB (0,5; 5; 10; 20 a 40 mg l -1 ), pro VIG (0,5; 5; 10; 20 a 40 mg l -1 ), pro CLB, CLO, DIA, NORD, OXA a TEMA viz Tab. 12. Mírou lineárního vztahu je korelační koeficient (R 2 ) a kalibrační přímka je popsána obecnou rovnicí y = ax + b. V měřeních byl zohledněn variační koeficient (CV), hodnota BIAS a celková analytická chyba měření (TE a ) Preciznost a přesnost Preciznost a přesnost měření byla spočítána ze třech koncentrací pracovních vzorků (Tab. 14). Preciznost a přesnost byla měřena v jednom dni (intra-day) v deseti opakováních a v různých deseti dnech (inter-day) ve třech opakováních. Variační koeficient (CV) charakterizuje preciznost měření a hodnota BIAS (systematická chyba, resp. vychýlení) přesnost měření. Z analýz byla také vypočítána celková analytická chyba měření (TE a ). 58

66 Hodnota BIAS byla vypočtena ze vztahu (1): BIAS = 100, kde (1) je průměr naměřených koncentrací a je referenční hodnota. Variační koeficient byl vypočten ze vztahu (2): CV = 100, kde (2) s je směrodatná odchylka měření a je průměr naměřených koncentrací Celková analytická chyba měření byla vypočtena ze vztahu (3): TE a = 1,96 CV + BIAS (3) Tab. 14 Preciznost a přesnost intra-day a inter-day, také výtěžnost (recovery) byla vypočtena na základě měření třech koncentrací (nízké, střední a vysoké) jednotlivých analytů. Analyt Nízká koncentrace (mg l -1 ) Střední koncentrace (mg l -1 ) Vysoká koncentrace (mg l -1 ) TOP 0, LEV 0, GAB 0, VIG 0, CLB 14, ,143 0,564 CLO 2, , , DIA ,140 1,474 NORD 8, , ,862 OXA 14, ,148 1,503 TEMA 8, , , Limit detekce a limit kvantifikace Limit detekce (LOD) byl stanoven jako trojnásobek šumu (signál/šum = 3) a limit kvantifikace (LOQ) byl stanoven jako desetinásobek šumu (signál/šum = 10). 59

67 4.7.7 Výtěžnost Výtěžnost (recovery, R e ) je mírou účinnosti metody a pro stanovení byly vybrány tři koncentrace (nízká, střední a vysoká), jejichž hodnoty jsou uvedeny v Tab. 14. Měření byla provedena intra-day v deseti opakováních. Výtěžnost měření byla vypočtena ze vztahu (4): R e = 100, kde (4) je průměr naměřených koncentrací a je referenční hodnota. 4.8 Posouzení vybraných farmakokinetických parametrů antiepileptik levetiracetamu a topiramátu Pro LEV byla sledována korelace mezi denní dávkou LEV na kilogram hmotnosti pacienta a sérovou koncentrací tohoto léčiva. Cílem této statistické studie bylo potvrdit či vyvrátit interindividuální variabilitu farmakokinetiky tohoto léčiva. Pro TOP byly porovnány dvě skupiny pacientů: u první skupiny se jednalo o monoterapii TOP, zatímco u druhé skupiny se jednalo o kombinaci TOP a KAR. U těchto skupin byla porovnána denní dávka TOP na kilogram hmotnosti pacienta, kterou je nutné podat, aby koncentrace TOP v séru dosáhla hodnoty 1,0 mg l -1. Cílem této statistické studie bylo potvrdit či vyvrátit mezilékovou interakci mezi TOP a KAR, resp. vliv KAR na rychlost metabolismu TOP na neúčinné metabolity. Skupiny byly porovnány metodou srovnání jejich mediánů. Analyzovaná data byla získána z rutinně vyšetřovaných vzorků pacientů na Úseku instrumentálních metod Laboratoří AGEL a.s. v Novém Jičíně za rok Potřebné údaje o dávkovacích režimech, hmotnostech pacientů a délce trvání terapie byly získány z příslušných žádanek pacientů. Ze statistického zhodnocení dat byli vyloučeni pacienti s indikací TDM při úvodu do terapie, s podezřením na non-compliance a s významnou poruchou hepatálních nebo renálních funkcí (ALT > 0,92 μkat l -1 a sérový kreatinin > 120 μmol l -1 ). Sérové koncentrace KAR byly stanoveny HPLC-UV metodou Reagent kit for the HPLC Analysis of all relevant Antiepileptic Drugs in Serum/Plasma (Chromsystems, Německo). 60

68 V případě LEV byla z naměřených a uvedených dat vypočítána dávka standardizovaná D s z následujícího vztahu (5): D s (mg d -1 kg -1 ) =, kde (5) D je celková denní dávka LEV (mg d -1 ) a m je hmotnost pacienta (kg). V případě TOP byla z naměřených a uvedených dat vypočítána denní dávka D 1 nutná k dosažení koncentrace 1,0 mg l -1 TOP v séru z následujícího vztahu (6): D 1 (mg d -1 kg -1 ) =, kde (6) D s je standardizovaná dávka TOP (mg d -1 kg -1 ) a c je sérová koncentrace TOP (mg l -1 ) a c 1 je sérová koncentrace TOP rovná 1,0 mg l -1. Vztah (6) lze aplikovat za předpokladu přímé závislosti sérové koncentrace na podané celkové denní dávce. Tato závislost je popsána obecnou rovnicí (7): c = k D, kde (7) c je sérová koncentrace (závisle proměnná), D je denní dávka (nezávisle proměnná) a k je směrnice přímky. Data byla hodnocena s využitím statistického softwaru Medcalc

69 5 VÝSLEDKY 5.1 Optimalizace parametrů MS Měřením ve scan módu byla získána hmotnostní spektra, podle kterých byly jednotlivé analyty identifikovány. Na Obr. 23, resp. Obr. 24 je znázorněn příklad hmotnostního a fragmentačního spektra, konkrétně se jedná o hmotnostní spektra gabapentinu. Dále byly provedeny analýzy v MRM módu, kdy studované analyty byly identifikovány podle svých produktových iontů a retenčních časů (Tab. 15a). Na Obr. 25a-c jsou záznamy chromatogramů jednotlivých analytů rozdělených podle výsledných použitých metod. Intenzity a plochy píků odpovídají středním koncentracím analytů. Cílem optimalizace je nalezení jednotného nastavení parametrů MS, při kterých by všechny stanovované analyty poskytovaly nejlepší výsledky. Na základě toho byly zoptimalizovány hodnoty MS pro stanovení TOP ( metoda 1 ), LEV, GAB a VIG ( metoda 2 ), CLB, CLO, DIA, NORD, OXA a TEMA ( metoda 3 ) a jejich IStd. Podmínky MS jsou přehledně uvedeny v Tab. 15a a Tab. 15b. Obr. 23 Hmotnostní spektrum gabapentinu. 62

70 Obr. 24 Fragmentační spektrum gabapentinu. Pro další analýzy byl zvolen MRM přechod 172,0 > 154,1. Obr. 25a Chromatogram topiramátu a jeho interního standardu. Intenzity a plochy píků odpovídají středním koncentracím analytů. 63

71 Obr. 25b Chromatogramy levetiracetamu, gabapentinu, vigabatrinu a jejich interních standardů. Intenzity a plochy píků odpovídají středním koncentracím analytů. 64

72 Obr. 25c Chromatogramy benzodiazepinů a jejich interního standardu. Intenzity a plochy píků odpovídají středním koncentracím analytů. 65

73 Tab. 15a Individuální podmínky MS a retenční čas antiepileptik. Analyt Molekulová hmotnost (Da) Prekurzorový > Produktový ion (m/z, Da) DP (V) CE (V) CXP (V) Retenční čas (min) TOP 339,4 338,0 > 78, ,31 TOP-d ,4 350,0 > 78, ,35 LEV 170,2 171,085 > 126, ,39 LEV-d 6 176,2 177,0 > 160, ,38 GAB 171,2 172,0 > 154, ,48 GAB-d 4 175,2 176,06 > 158, ,47 VIG 129,2 130,0 > 71, ,34 VIG- 13 C,d 2 132,2 133,0 > 74, ,34 CLB 300,7 301,1 > 259, ,89 CLO 315,7 316,1 > 270, ,54 DIA 284,7 285,1 > 193, ,45 NORD 270,7 271,1 > 140, ,80 OXA 286,7 287,1 > 241, ,38 TEMA 300,7 301,1 > 255, ,76 DIA-d 5 289,8 291,15 > 199, ,40 Tab. 15b Další optimalizované parametry MS pro stanovení antiepileptik. Pro přehlednost jsou podmínky rozděleny do metod : metoda 1 pro TOP a jeho IStd, metoda 2 pro LEV, GAB, VIG a jejich IStd a metoda 3 pro CLB, CLO, DIA, NORD, OXA, TEMA a jejich IStd. ESI mód EP IS TEM CUR GS1 GS2 GAD (V) (V) ( C) (psi) (psi) (psi) metoda 1 Negativní Medium metoda 2 Pozitivní Medium metoda 3 Pozitivní Medium Optimalizace podmínek LC Cílem optimalizace je využití jednotné kolony a mobilní fáze, které by poskytovaly nejúčinnější separace pro všechny stanovované analyty. Na základě toho byly určeny optimální podmínky LC pro stanovení TOP ( metoda 1 ), LEV, GAB a VIG ( metoda 2 ), CLB, CLO, DIA, NORD, OXA, TEMA ( metoda 3 ) a jejich IStd. Optimalizace podmínek LC je přehledně uvedena v Tab. 16a-c. Další nastavení LC systému je uvedeno v Tab

74 Tab. 16a Optimalizace chromatografických podmínek pro stanovení TOP v séru. metoda 1 Kolona Mobilní fáze Synergi Polar-RP (2,5 µm; 2,0 x 100 mm) 0,1 mol l -1 vodný roztok octanu amonného s 0,1% kyselinou mravenčí (ph 3,6) a ACN Eluce Isokrat (50:50) Tab. 16b Optimalizace chromatografických podmínek pro stanovení LEV, GAB a VIG v séru. metoda 2 Kolona Mobilní fáze Synergi Polar-RP (2,5 µm; 2,0 x 100 mm) 0,1 mol l -1 vodný roztok octanu amonného s 0,1% kyselinou mravenčí ( ph 3,6) a 0,1 mol l -1 vodný roztok octanu amonného s 0,1% kyselinou mravenčí v ACN (10:90 v/v) Eluce Isokrat (40:60) Tab. 16c Optimalizace chromatografických podmínek pro stanovení CLB, CLO, DIA, NORD, OXA a TEMA v séru. metoda 3 Kolona Mobilní fáze Gemini C18 (5 µm; 2,0 x 50 mm) 0,1 mol l -1 vodný roztok octanu amonného s 0,1% kyselinou mravenčí (ph 3,6) a ACN Eluce Isokrat (50:50) Tab. 17 Další nastavení LC systému pro stanovení antiepileptik v séru. Teplota autosampleru ( C) Teplota kolonového termostatu ( C) Nástřik vzorku (μl) Průtok (ml min -1 ) ,2 67

75 5.3 Validace metod pro stanovení antiepileptik v séru Selektivita Analýzy negativního séra (Obr. 26) neprokázaly přítomnost žádných interferujících látek v retenčních časech (Tab. 15a), které jsou charakteristické pro stanovované analyty, tudíž jejich identifikace a kvantifikace není ovlivněna. Obr. 26 Chromatogramy stanovovaných analytů v negativním séru. V analýzách negativního séra nebyla zaznamenána přítomnost interferujících píků v retenčních časech stanovovaných analytů. 68

76 5.3.2 Specifičnost Analýzy v přítomnosti jiných léčiv (v normálních a vysokých, resp. toxických koncentrací) nepotvrdily interferenty v retenčních časech analytů (mimo DIA a CLO, pro které analýza nebyla využita z důvodu jejich přítomnosti v použitých referenčních materiálech). Měřením negativního hemolytického a ikterického séra byla vyloučena interference s hemoglobinem a bilirubinem. V případě hemolýzy a ikterity nebyl zaznamenán vliv na identifikaci a kvantifikaci jednotlivých analytů tzn., že v analýzách se nevyskytovaly interferující píky v retenčních časech charakteristických pro stanovované analyty. Při analýze CLO v hemolytickém a ikterickém vzorku se v chromatografických záznamech objevuje signál (ve stejném čase jako u analýzy negativního séra, tj. 2,37 min, viz Obr. 26). Jelikož retenční čas signálu neodpovídá retenčnímu času CLO (Obr. 25c), nemůže být jeho identifikace a kvantifikace ovlivněna tímto signálem Linearita Linearita studovaných metod byla ověřena v rozsahu koncentrací uvedených v Tab. 18. Korelační koeficienty lineární závislosti (Tab. 18) vyhovují požadavkům validace metody, tj. R 2 0,99. Souhrn naměřených hodnot koncentrací a grafické znázornění linearity lze vidět v Tab. 19 Tab. 28, resp. na Obr. 27 Obr. 36. Tab. 18 Koncentrační rozsah jednotlivých analytů a korelační koeficient lineární závislosti. Analyt Koncentrační rozsah (mg l -1 ) Korelační koeficient (R 2 ) TOP 0, LEV 0,5-60 0,9999 GAB 0,5-40 0,9996 VIG 0,5-40 0,9997 CLB 14, ,564 0,9994 CLO 2, , ,9999 DIA ,474 1 NORD 8, ,862 0,9994 OXA 14, ,503 0,9994 TEMA 8, ,814 0,

77 AUC (topiramát/istd) Vyhodnocení a grafické znázornění linearity pro TOP je uvedeno v Tab. 19a-b, resp. na Obr. 27. Tab. 19a Souhrn naměřených hodnot koncentrací topiramátu v séru ve čtyřech dnech pro stanovení linearity. (mg l -1 ) 1. den 2. den 3. den 4. den 0,1 0,09 0,09 0,11 0,10 0,8 0,80 0,79 0,79 0,79 4 4,08 3,98 4,02 4,02 8 7,88 7,95 7,97 7, ,02 16,06 15,84 15,85 Tab. 19b Preciznost a přesnost metody stanovení topiramátu v séru v rozsahu lineární oblasti. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (mg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 0,1 0,10 0,0069 6,97-1,51 15,18 0,8 0,79 0,0073 0,92-1,00 2,80 4 4,02 0,0349 0,87 0,59 2,29 8 7,88 0,0897 1,14-1,44 3, ,94 0,0991 0,62-0,37 1, y = 1,0671x - 0,0037 R² = (mg l -1 ) Obr. 27 Pracovní rozsah měření (linearita) topiramátu v séru. Graf závislosti poměru ploch (AUC) topiramátu a interního standardu na koncentraci ve vzorku. Linearita ověřena pro koncentrační rozsah 0,1 16 mg l

78 AUC (levetiracetam/istd) Vyhodnocení a grafické znázornění linearity pro LEV je uvedeno v Tab. 20a-b, resp. na Obr. 28. Tab. 20a Souhrn naměřených hodnot koncentrací levetiracetamu v séru ve čtyřech dnech pro stanovení linearity. (mg l -1 ) 1. den 2. den 3. den 4. den 0,5 0,52 0,53 0,52 0,50 5 5,07 5,31 5,01 5, ,47 20,42 20,00 20, ,94 39,50 39,74 39, ,71 58,93 59,24 58,47 Tab. 20b Preciznost a přesnost metody stanovení levetiracetamu v séru v rozsahu lineární oblasti. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (mg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 0,5 0,52 0,0105 2,02 3,69 7,64 5 5,16 0,1227 2,38 3,20 7, ,24 0,2050 1,01 1,21 3, ,78 0,1840 0,46-0,54 1, ,83 0,2844 0,48-1,94 2,89 2,5 2 1,5 1 0,5 0 y = 0,0388x + 0,0119 R² = 0, (mg l -1 ) Obr. 28 Pracovní rozsah měření (linearita) levetiracetamu v séru. Graf závislosti poměru ploch (AUC) levetiracetamu a interního standardu na koncentraci ve vzorku. Linearita ověřena pro koncentrační rozsah 0,5 60 mg l

79 AUC (gapapentin/istd) Vyhodnocení a grafické znázornění linearity pro GAB je uvedeno v Tab. 21a-b, resp. na Obr. 29. Tab. 21a Souhrn naměřených hodnot koncentrací gabapentinu v séru ve čtyřech dnech pro stanovení linearity. (mg l -1 ) 1. den 2. den 3. den 4. den 0,5 0,49 0,51 0,49 0,50 5 5,08 5,05 4,95 5, ,93 10,06 9,86 10, ,33 20,48 20,17 20, ,62 39,07 38,76 39,88 Tab. 21b Preciznost a přesnost metody stanovení gabapentinu v séru v rozsahu lineární oblasti. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (mg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 0,5 0,50 0,0103 2,09-0,95 5,04 5 5,03 0,0506 1,00 0,63 2, ,98 0,0941 0,94-0,17 2, ,27 0,1473 0,73 1,36 2, ,09 0,4881 1,25-2,29 4,73 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 y = 0,0212x + 0,0044 R² = 0, (mg l -1 ) Obr. 29 Pracovní rozsah měření (linearita) gabapentinu v séru. Graf závislosti poměru ploch (AUC) gabapentinu a interního standardu na koncentraci ve vzorku. Linearita ověřena pro koncentrační rozsah 0,5 40 mg l

80 AUC (vigabatrin/istd) Vyhodnocení a grafické znázornění linearity pro VIG je uvedeno v Tab. 22a-b, resp. na Obr. 30. Tab. 22a Souhrn naměřených hodnot koncentrací vigabatrinu v séru ve čtyřech dnech pro stanovení linearity. (mg l -1 ) 1. den 2. den 3. den 4. den 0,5 0,52 0,53 0,52 0,51 5 5,15 5,27 5,37 5, ,29 10,92 10,27 10, ,04 20,52 20,49 20, ,61 40,22 39,66 40,08 Tab. 22b Preciznost a přesnost metody stanovení vigabatrinu v séru v rozsahu lineární oblasti. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (mg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 0,5 0,52 0,0068 1,30 4,17 6,72 5 5,22 0,1065 2,04 4,40 8, ,40 0,3105 2,99 3,97 9, ,38 0,2013 0,99 1,92 3, ,64 0,6330 1,60-0,89 4,02 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 y = 0,1146x + 0,0364 R² = 0, (mg l -1 ) Obr. 30 Pracovní rozsah měření (linearita) vigabatrinu v séru. Graf závislosti poměru ploch (AUC) vigabatrinu a interního standardu na koncentraci ve vzorku. Linearita ověřena pro koncentrační rozsah 0,5 40 mg l

81 AUC (clobazam/istd) Vyhodnocení a grafické znázornění linearity pro CLB je uvedeno v Tab. 23a-b, resp. na Obr. 31. Tab. 23a Souhrn naměřených hodnot koncentrací clobazamu v séru ve čtyřech dnech pro stanovení linearity. (μg l -1 ) 1. den 2. den 3. den 4. den 14,3 14,79 14,26 14,67 15, ,76 143,80 141,00 144,59 283,3 287,45 277,30 292,68 289,35 423,7 406,19 405,28 417,20 412, ,68 537,29 564,12 552,53 Tab. 23b Preciznost a přesnost metody stanovení clobazamu v séru v rozsahu lineární oblasti. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (μg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 14,3 14,72 0,3228 2,19 2,93 7, ,29 1,9792 1,39-0,50 3,22 283,3 286,69 5,7409 2,00 1,20 5,12 423,7 410,35 4,8922 1,19-3,15 5, ,40 9,5167 1,73-2,23 5, y = 0,0182x + 0,067 R² = 0, (μg l -1 ) Obr. 31 Pracovní rozsah měření (linearita) clobazamu v séru. Graf závislosti poměru ploch (AUC) clobazamu a interního standardu na koncentraci ve vzorku. Linearita ověřena pro koncentrační rozsah 14,3 564 μg l

82 AUC (clonazepam/istd) Vyhodnocení a grafické znázornění linearity pro CLO je uvedeno v Tab. 24a-b, resp. na Obr. 32. Tab. 24a Souhrn naměřených hodnot koncentrací clonazepamu v séru ve čtyřech dnech pro stanovení linearity. (μg l -1 ) 1. den 2. den 3. den 4. den 2,3 2,29 2,31 2,19 2,37 23,4 22,88 23,59 23,45 23,37 39,1 39,24 39,84 39,93 40,30 54,9 54,30 55,15 55,41 56,60 70,6 72,05 70,62 72,63 70,17 Tab. 24b Preciznost a přesnost metody stanovení clonazepamu v séru v rozsahu lineární oblasti. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (μg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 2,3 2,29 0,0633 2,76-0,40 5,82 23,4 23,32 0,2657 1,14-0,33 2,56 39,1 39,83 0,3793 0,95 1,86 3,72 54,9 55,36 0,8219 1,48 0,85 3,76 70,6 71,37 1,0055 1,41 1,09 3,85 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 y = 0,0031x - 0,0003 R² = 0, (μg l -1 ) Obr. 32 Pracovní rozsah měření (linearita) clonazepamu v séru. Graf závislosti poměru ploch (AUC) clonazepamu a interního standardu na koncentraci ve vzorku. Linearita ověřena pro koncentrační rozsah 2,3 70,6 μg l

83 AUC (diazepam/istd) Vyhodnocení a grafické znázornění linearity pro DIA je uvedeno v Tab. 25a-b, resp. na Obr. 33. Tab. 25a Souhrn naměřených hodnot koncentrací diazepamu v séru ve čtyřech dnech pro stanovení linearity. (μg l -1 ) 1. den 2. den 3. den 4. den 14 14,41 14,46 13,58 13, ,12 143,09 140,83 144,00 584,7 614,93 585,14 575,01 584, ,3 1052, , , , , , , ,60 Tab. 25b Preciznost a přesnost metody stanovení diazepamu v séru v rozsahu lineární oblasti. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (μg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 14 14,10 0,3614 2,56 0,69 5, ,01 1,5911 1,12 1,44 3,63 584,7 589,81 15,0320 2,55 0,87 5, ,3 1026,84 15,5255 1,51-0,24 3, ,14 16,5210 1,13-0,94 3, y = 0,0063x + 0,0201 R² = (μg l -1 ) Obr. 33 Pracovní rozsah měření (linearita) diazepamu v séru. Graf závislosti poměru ploch (AUC) diazepamu a interního standardu na koncentraci ve vzorku. Linearita ověřena pro koncentrační rozsah μg l

84 AUS (nordiazepam/istd) Vyhodnocení a grafické znázornění linearity pro NORD je uvedeno v Tab. 26a-b, resp. na Obr. 34. Tab. 26a Souhrn naměřených hodnot koncentrací nordiazepamu v séru ve čtyřech dnech pro stanovení linearity. (μg l -1 ) 1. den 2. den 3. den 4. den 8,4 8,74 8,90 8,37 8,86 83,8 79,53 81,78 82,60 83,90 343,2 351,77 340,65 352,17 353,12 602,6 602,58 570,75 603,68 596, ,37 841,03 895,53 889,89 Tab. 26b Preciznost a přesnost metody stanovení nordiazepamu v séru v rozsahu lineární oblasti. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (μg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 8,4 8,72 0,2097 2,41 3,77 8,49 83,8 81,95 1,5883 1,94-2,20 6,00 343,2 349,43 5,0882 1,46 1,81 4,67 602,6 593,32 13,3327 2,25-1,54 5, ,46 21,4643 2,45 1,79 6,59 2,5 2 1,5 1 0,5 0 y = 0,0022x - 0,0046 R² = 0, (μg l -1 ) Obr. 34 Pracovní rozsah měření (linearita) nordiazepamu v séru. Graf závislosti poměru ploch (AUC) nordiazepamu a interního standardu na koncentraci ve vzorku. Linearita ověřena pro koncentrační rozsah 8,4 862 μg l

85 AUC (oxazepam/istd) Vyhodnocení a grafické znázornění linearity pro OXA je uvedeno v Tab. 27a-b, resp. na Obr. 35. Tab. 27a Souhrn naměřených hodnot koncentrací oxazepamu v séru ve čtyřech dnech pro stanovení linearity. (μg l -1 ) 1. den 2. den 3. den 4. den 14,8 14,79 14,90 14,09 13, ,99 149,48 155,06 153,30 599,7 622,22 606,59 623,41 617, ,3 1016, , , , , , , ,26 Tab. 27b Preciznost a přesnost metody stanovení oxazepamu v séru v rozsahu lineární oblasti. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (μg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 14,8 14,38 0,4781 3,32-2,81 9, ,96 5,0240 3,35 1,32 7,89 599,7 617,38 6,6372 1,08 2,95 5, ,3 1033,31 13,3186 1,29-1,71 4, ,15 37,9019 2,49 1,21 6,09 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 y = 0,0025x + 0,0023 R² = 0, (μg l -1 ) Obr. 35 Pracovní rozsah měření (linearita) oxazepamu v séru. Graf závislosti poměru ploch (AUC) oxazepamu a interního standardu na koncentraci ve vzorku. Linearita ověřena pro koncentrační rozsah 14, μg l

86 AUC (temazepam/istd) Vyhodnocení a grafické znázornění linearity pro TEMA je uvedeno v Tab. 28a-b, resp. na Obr. 36. Tab. 28a Souhrn naměřených hodnot koncentrací temazepamu v séru ve čtyřech dnech pro stanovení linearity. (μg l -1 ) 1. den 2. den 3. den 4. den 8,2 8,01 8,87 8,15 8,78 81,7 74,30 82,09 85,69 82,51 325,8 319,04 322,55 308,59 321,41 569,9 552,78 534,31 577,53 578, ,27 785,41 825,21 811,51 Tab. 28b Preciznost a přesnost metody stanovení temazepamu v séru v rozsahu lineární oblasti. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (μg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 8,2 8,45 0,3769 4,46 3,09 11,83 81,7 81,15 4,1916 5,17-0,68 10,80 325,8 317,89 5,5211 1,74-2,43 5,83 569,9 560,78 18,4289 3,29-1,60 8, ,35 14,3967 1,78-0,69 4, y = 0,0111x - 0,02 R² = 0, (μg l -1 ) Obr. 36 Pracovní rozsah měření (linearita) temazepamu v séru. Graf závislosti poměru ploch (AUC) temazepamu a interního standardu na koncentraci ve vzorku. Linearita ověřena pro koncentrační rozsah 8,2 814 μg l

87 5.3.4 Preciznost a přesnost Preciznost a přesnost metody byla vypočtena z měření třech vybraných koncentrací v deseti opakováních během jednoho dne (intra-day) a v průběhu deseti dnů ve třech opakováních (inter-day). Preciznost je charakterizována hodnotou CV a přesnost hodnotou BIAS. Dále byla vypočítána pro každý analyt celková analytická chyba TE a. Získané výsledky preciznosti a přesnosti intra-day a inter-day (Tab. 29 Tab. 38) jsou dostačující pro aplikaci metod v klinické praxi a prokazují, že vyvinuté metody jsou vyhovující pro požadovaný klinický účel a splňují nároky kladené na in-house metody dle platného doporučení ČSKB ČSL JEP, tj. CV 10 %, BIAS 10 %, TE a 30 %. Souhrn naměřených hodnot koncentrací TOP v séru, preciznost a přesnost intra-day, resp. inter-day jsou uvedeny v Tab. 29a-d. Tab. 29a Souhrn naměřených hodnot koncentrací topiramátu v séru intra-day. (mg l -1 ) Měření v jednom dni (n = 10) ,8 0,79 0,79 0,83 0,81 0,82 0,83 0,80 0,78 0,82 0,81 4 4,04 3,95 3,99 3,97 4,14 4,06 4,03 4,10 4,05 4, ,79 15,71 15,73 16,26 16,10 15,83 15,85 15,58 15,77 15,69 Tab. 29b Preciznost a přesnost metody stanovení topiramátu v séru intra-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (mg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 0,8 0,81 0,0160 1,98 1,01 5,15 4 4,04 0,0553 1,37 0,88 6, ,83 0,1936 1,22-1,06 10,09 80

88 Tab. 29c Souhrn naměřených hodnot koncentrací topiramátu v séru inter-day. (mg l -1 ) Průměr koncentrací při měření v aktuálním dni (n = 3) 1. den 2. den 3. den 4. den 5. den 6. den 7. den 8. den 9. den 10. den 0,8 0,80 0,79 0,77 0,78 0,74 0,77 0,74 0,76 0,77 0,79 4 4,08 4,01 3,96 4,08 3,75 3,73 3,92 3,73 4,01 4, ,14 15,97 16,15 15,82 16,06 15,69 16,23 15,83 16,09 15,98 Tab. 29d Preciznost a přesnost metody stanovení topiramátu v séru inter-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (mg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS 0,8 0,78 0,0207 2,67-2,79 6,95 4 3,98 0,1202 3,02-0,61 2, ,03 0,1237 0,77 0,18 4,46 TE a Souhrn naměřených hodnot koncentrací LEV v séru, preciznost a přesnost intra-day, resp. inter-day jsou uvedeny v Tab. 30a-d. Tab. 30a Souhrn naměřených hodnot koncentrací levetiracetamu v séru intra-day. (mg l -1 ) Měření v jednom dni (n = 10) ,5 0,53 0,50 0,53 0,54 0,54 0,52 0,51 0,50 0,51 0, ,21 20,81 20,41 20,15 19,80 20,53 21,15 20,83 20,49 20, ,90 56,22 58,04 58,34 57,36 58,86 57,52 55,37 57,77 56,71 Tab. 30b Preciznost a přesnost metody stanovení levetiracetamu v séru intra-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (mg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 0,5 0,52 0,0153 2,92 4,46 10, ,54 0,4394 2,14 2,72 6, ,31 0,9869 1,72-4,49 7,86 81

89 Tab. 30c Souhrn naměřených hodnot koncentrací levetiracetamu v séru inter-day. (mg l -1 ) Průměr koncentrací při měření v aktuálním dni (n = 3) 1. den 2. den 3. den 4. den 5. den 6. den 7. den 8. den 9. den 10. den 0,5 0,52 0,51 0,51 0,52 0,50 0,50 0,50 0,51 0,52 0, ,07 19,54 19,79 20,38 19,69 19,42 19,48 19,53 19,62 19, ,96 59,09 58,42 57,69 59,57 59,43 59,12 59,26 58,82 58,18 Tab. 30d Preciznost a přesnost metody stanovení levetiracetamu v séru inter-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (mg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 0,5 0,51 0,0053 1,04 2,67 4, ,90 0,3001 1,51-0,52 3, ,75 0,6431 1,09-2,09 4,24 Souhrn naměřených hodnot koncentrací GAB v séru, preciznost a přesnost intra-day, resp. inter-day jsou uvedeny v Tab. 31a-d. Tab. 31a Souhrn naměřených hodnot koncentrací gabapentinu v séru intra-day. (mg l -1 ) Měření v jednom dni (n = 10) ,5 0,52 0,52 0,50 0,50 0,52 0,50 0,53 0,54 0,53 0, ,43 10,55 10,17 10,32 10,13 10,66 10,08 10,39 10,26 10, ,58 37,51 38,16 38,25 36,87 38,17 39,44 37,65 39,38 38,83 Tab. 31b Preciznost a přesnost metody stanovení gabapentinu v séru intra-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (mg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 0,5 0,52 0,0145 2,80 3,82 9, ,30 0,1939 1,88 3,05 6, ,18 0,7912 2,07-4,54 8,60 82

90 Tab. 31c Souhrn naměřených hodnot koncentrací gabapentinu v séru inter-day. (mg l -1 ) Průměr koncentrací při měření v aktuálním dni (n = 3) 1. den 2. den 3. den 4. den 5. den 6. den 7. den 8. den 9. den 10. den 0,5 0,52 0,51 0,53 0,53 0,52 0,53 0,50 0,49 0,53 0, ,24 10,07 10,26 10,38 9,83 9,94 10,14 9,82 9,98 10, ,89 39,80 38,09 38,94 38,42 39,65 40,03 39,38 40,64 39,66 Tab. 31d Preciznost a přesnost metody stanovení gabapentinu v séru inter-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (mg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 0,5 0,52 0,0086 1,66 4,26 7, ,16 0,1907 1,88 1,56 5, ,03 0,7204 1,85-2,43 6,05 Souhrn naměřených hodnot koncentrací VIG v séru, preciznost a přesnost intra-day, resp. inter-day jsou uvedeny v Tab. 32a-d. Tab. 32a Souhrn naměřených hodnot koncentrací vigabatrinu v séru intra-day. (mg l -1 ) Měření v jednom dni (n = 10) ,5 0,52 0,52 0,50 0,52 0,51 0,51 0,54 0,55 0,50 0, ,40 10,56 10,60 10,48 10,52 10,22 10,52 10,70 10,49 10, ,23 40,04 37,76 37,98 39,26 40,11 39,54 39,80 38,65 39,69 Tab. 32b Preciznost a přesnost metody stanovení vigabatrinu v séru intra-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (mg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 0,5 0,52 0,0182 3,54 3,07 10, ,49 0,1236 1,18 4,89 7, ,31 0,8421 2,14-1,73 5,93 83

91 Tab. 32c Souhrn naměřených hodnot koncentrací vigabatrinu v séru inter-day. (mg l -1 ) Průměr koncentrací při měření v aktuálním dni (n = 3) 1. den 2. den 3. den 4. den 5. den 6. den 7. den 8. den 9. den 10. den 0,5 0,80 0,79 0,77 0,78 0,74 0,77 0,74 0,76 0,77 0, ,08 4,01 3,96 4,08 3,75 3,73 3,92 3,73 4,01 4, ,14 15,97 16,15 15,82 16,06 15,69 16,23 15,83 16,09 15,98 Tab. 32d Preciznost a přesnost metody stanovení vigabatrinu v séru inter-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (mg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 0,5 0,78 0,0207 2,67-2,79 8, ,98 0,1202 3,02-0,61 4, ,03 0,1237 0,77 0,18 3,09 Souhrn naměřených hodnot koncentrací CLB v séru, preciznost a přesnost intra-day, resp. inter-day jsou uvedeny v Tab. 33a-d. Tab. 33a Souhrn naměřených hodnot koncentrací clobazamu v séru intra-day. (μg l -1 ) Měření v jednom dni (n = 10) ,3 14,29 14,37 13,99 14,72 14, ,53 144,77 154,35 139,55 143, ,85 570,38 540,91 525,67 543, ,3 14,84 14,74 14,52 14,68 14, ,92 147,89 142,11 145,54 145, ,62 523,16 540,33 531,01 527,42 84

92 Tab. 33b Preciznost a přesnost metody stanovení clobazamu v séru intra-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (μg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 14,3 14,54 0,26 1,77 1,69 6, ,95 3,81 2,63 1,36 7, ,72 15,94 2,95-4,30 14,22 Tab. 33c Souhrn naměřených hodnot koncentrací clobazamu v séru inter-day. (μg l -1 ) Průměr koncentrací při měření v aktuálním dni (n = 3) 1. den 2. den 3. den 4. den 5. den 14,3 14,34 14,28 14,30 14,61 15, ,34 144,74 145,39 142,72 145, ,81 551,07 550,90 547,32 570,88 6. den 7. den 8. den 9. den 10. den 14,3 13,98 14,24 14,00 14,51 14, ,32 144,24 140,09 142,61 145, ,67 562,48 561,59 559,43 577,15 Tab. 33d Preciznost a přesnost metody stanovení clobazamu v séru inter-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (μg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 14,3 14,56 0,3803 2,61 1,83 8, ,07 1,2829 0,89 0,75 3, ,40 8,3195 1,50-1,53 5,93 85

93 Souhrn naměřených hodnot koncentrací CLO v séru, preciznost a přesnost intra-day, resp. inter-day jsou uvedeny v Tab. 34a-d. Tab. 34a Souhrn naměřených hodnot koncentrací clonazepamu v séru intra-day. (μg l -1 ) Měření v jednom dni (n = 10) ,3 2,34 2,19 2,39 2,40 2,17 2,12 2,42 2,13 2,25 2,54 23,4 23,37 23,31 23,90 23,14 22,66 24,36 23,66 22,48 22,63 22,98 70,6 74,60 74,57 70,79 74,14 74,88 70,34 70,96 70,48 70,36 71,92 Tab. 34b Preciznost a přesnost metody stanovení clonazepamu v séru intra-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (μg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 2,3 2,29 0,14 5,94-0,23 11,87 23,4 23,25 0,57 2,46-0,65 5,46 70,6 72,30 1,89 2,61 2,41 7,53 Tab. 34c Souhrn naměřených hodnot koncentrací clonazepamu v séru inter-day. (μg l -1 ) Průměr koncentrací při měření v aktuálním dni (n = 3) 1. den 2. den 3. den 4. den 5. den 6. den 7. den 8. den 9. den 10. den 2,3 2,22 2,19 2,17 2,08 2,16 2,22 2,47 2,46 2,25 2,75 23,4 23,09 22,67 22,21 22,91 23,56 23,35 22,92 23,56 23,48 23,81 70,6 69,84 71,35 70,15 70,23 71,05 69,87 71,04 70,49 70,97 71,45 Tab. 34d Preciznost a přesnost metody stanovení clonazepamu v séru inter-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (μg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 2,3 2,16 0,0486 2,25-5,97 10,38 23,4 22,89 0,4459 1,95-2,18 6,00 70,6 70,52 0,5758 0,82-0,11 1,71 86

94 Souhrn naměřených hodnot koncentrací DIA v séru, preciznost a přesnost intra-day, resp. inter-day jsou uvedeny v Tab. 35a-d. Tab. 35a Souhrn naměřených hodnot koncentrací diazepamu v séru intra-day. (μg l -1 ) Měření v jednom dni (n = 10) ,84 14,04 14,03 13,79 13, ,14 139,33 140,76 140,70 139, , , , , , ,34 14,86 14,63 13,98 14, ,64 140,16 142,77 139,73 137, , , , , ,18 Tab. 35b Preciznost a přesnost metody stanovení diazepamu v séru intra-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (μg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 14 14,17 0,36 2,57 1,23 6, ,01 1,36 0,97 0,01 1, ,28 22,58 1,57-2,15 5,22 Tab. 35c Souhrn naměřených hodnot koncentrací diazepamu v séru inter-day. (μg l -1 ) Průměr koncentrací při měření v aktuálním dni (n = 3) 1. den 2. den 3. den 4. den 5. den 14 14,03 14,08 13,75 14,44 14, ,73 138,16 140,07 138,57 140, , , , , ,39 6. den 7. den 8. den 9. den 10. den 14 14,58 14,19 14,28 13,45 14, ,68 129,92 144,85 144,31 144, , , , , ,24 87

95 Tab. 35d Preciznost a přesnost metody stanovení diazepamu v séru inter-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (μg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 14 14,21 0,3499 2,46 1,50 6, ,56 1,6280 1,17-1,03 3, ,74 14,8837 1,02-1,24 3,24 Souhrn naměřených hodnot koncentrací NORD v séru, preciznost a přesnost intra-day, resp. inter-day jsou uvedeny v Tab. 36a-d. Tab. 36a Souhrn naměřených hodnot koncentrací nordiazepamu v séru intra-day. (μg l -1 ) Měření v jednom dni (n = 10) ,4 8,32 8,31 8,49 8,85 8,40 83,8 83,52 80,04 84,15 83,44 79, ,10 888,83 875,62 888,13 864, ,4 8,26 8,61 8,40 8,48 8,36 83,8 86,11 81,81 78,19 81,17 80, ,25 864,49 902,33 864,73 898,27 Tab. 36b Preciznost a přesnost metody stanovení nordiazepamu v séru intra-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (μg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 8,4 8,45 0,17 1,95 0,56 4,39 83,8 81,82 2,32 2,84-2,37 7, ,88 14,16 1,61 2,31 5,45 88

96 Tab. 36c Souhrn naměřených hodnot koncentrací nordiazepamu v séru inter-day. (μg l -1 ) Průměr koncentrací při měření v aktuálním dni (n = 3) 1. den 2. den 3. den 4. den 5. den 8,4 8,29 8,63 8,02 8,39 8,13 83,8 81,47 81,05 81,59 79,94 81, ,24 855,84 829,55 840,34 877,59 6. den 7. den 8. den 9. den 10. den 8,4 8,03 8,67 8,60 8,30 8,62 83,8 80,95 83,62 83,98 83,45 84, ,20 871,01 883,91 868,86 874,15 Tab. 36d Preciznost a přesnost metody stanovení nordiazepamu v séru inter-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (μg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 8,4 8,29 0,2111 2,55-1,27 6,26 83,8 81,04 0,5875 0,72-3,29 4, ,31 16,4315 1,93-1,47 5,26 Souhrn naměřených hodnot koncentrací OXA v séru, preciznost a přesnost intra-day, resp. inter-day jsou uvedeny v Tab. 37a-d. Tab. 37a Souhrn naměřených hodnot koncentrací oxazepamu v séru intra-day. (μg l -1 ) Měření v jednom dni (n = 10) ,8 13,49 14,62 14,36 14,77 14, ,85 140,49 150,34 145,98 147, , , , , , ,8 14,38 14,19 14,02 13,95 14, ,88 144,73 142,96 144,03 142, , , , , ,99 89

97 Tab. 37b Preciznost a přesnost metody stanovení oxazepamu v séru intra-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (μg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 14,8 14,26 0,35 2,48-3,66 8, ,25 2,82 1,94-1,86 5, ,62 26,58 1,75 0,91 4,34 Tab. 37c Souhrn naměřených hodnot koncentrací oxazepamu v séru inter-day. (μg l -1 ) Průměr koncentrací při měření v aktuálním dni (n = 3) 1. den 2. den 3. den 4. den 5. den 14,8 14,40 14,25 14,64 14,42 14, ,75 145,49 145,86 146,22 143, , , , , ,27 6. den 7. den 8. den 9. den 10. den 14,8 14,95 14,79 15,42 14,65 15, ,12 148,47 147,68 148,76 148, , , , , ,03 Tab. 37d Preciznost a přesnost metody stanovení oxazepamu v séru inter-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (μg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 14,8 14,47 0,1474 1,02-2,24 4, ,62 1,0170 0,70-1,61 2, ,79 14,7095 0,99-0,75 2,68 90

98 Souhrn naměřených hodnot koncentrací TEMA v séru, preciznost a přesnost intra-day, resp. inter-day jsou uvedeny v Tab. 38a-d. Tab. 38a Souhrn naměřených hodnot koncentrací temazepamu v séru intra-day. (μg l -1 ) Měření v jednom dni (n = 10) ,2 8,06 8,29 8,63 8,58 8,06 81,7 78,92 78,92 84,96 86,51 81, ,64 827,16 787,24 781,37 807, ,2 8,46 8,73 8,29 8,20 8,44 81,7 81,46 83,50 78,75 82,06 81, ,38 814,05 799,39 804,52 805,50 Tab. 38b Preciznost a přesnost metody stanovení temazepamu v séru intra-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (μg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 8,2 8,37 0,22 2,64 2,11 7,29 81,7 81,84 2,47 3,02 0,17 6, ,93 12,36 1,54-1,24 4,25 Tab. 38c Souhrn naměřených hodnot koncentrací temazepamu v séru inter-day. (μg l -1 ) Průměr koncentrací při měření v aktuálním dni (n = 3) 1. den 2. den 3. den 4. den 5. den 8,2 8,25 8,13 8,22 8,14 8,36 81,7 81,78 78,98 80,60 81,34 81, ,25 813,47 806,02 811,80 771,49 6. den 7. den 8. den 9. den 10. den 8,2 7,40 8,27 8,65 8,00 8,36 81,7 79,42 80,71 80,38 81,06 83, ,24 831,74 799,06 804,35 820,07 91

99 Tab. 38d Preciznost a přesnost metody stanovení temazepamu v séru inter-day. V tabulce je také vypočítána celková analytická chyba měření. (μg l -1 ) Průměr měření Směrodatná odchylka CV BIAS TE a 8,2 8,22 0,0826 1,00 0,22 2,19 81,7 80,79 0,9817 1,22-1,11 3, ,00 15,9653 1,99-1,35 5, Limit detekce a limit kvantifikace Hodnoty LOD a LOQ jednotlivých antiepileptik jsou uvedeny v Tab. 39. Tab. 39 Limit detekce a limit kvantifikace jednotlivých antiepileptik. Analyt LOD LOQ (mg l -1 ) (mg l -1 ) TOP 0,03 0,1 LEV 0,15 0,5 GAB 0,15 0,5 VIG 0,15 0,5 CLB 4, , CLO 0, , DIA 4, NORD 2, , OXA 4, , TEMA 2, , Výtěžnost Výtěžnost jednotlivých analytů byla vypočtena z měření tří vybraných koncentrací (nízká, střední a vysoká) intra-day v deseti opakováních a je uvedena v Tab. 40. Naměřené hodnoty intra-day lze vidět v Tab. 29a,b 38a,b. 92

100 Tab. 40 Výtěžnost metody jednotlivých analytů při měření tří koncentrací intra-day. Analyt Nízká koncentrace Střední koncentrace Vysoká koncentrace TOP 101,01 100,88 98,94 LEV 104,46 102,72 95,51 GAB 103,82 103,05 95,46 VIG 103,07 104,89 98,27 CLB 101,69 101,36 95,70 CLO 99,77 99,35 102,41 DIA 101,23 100,01 97,85 NORD 100,56 97,63 102,31 OXA 96,34 98,14 100,91 TEMA 102,11 100,17 98,76 Výtěžnost metod stanovovaných analytů je dostačující pro jejich aplikaci v klinické praxi a splňuje nároky kladené na in-house metody dle platného doporučení ČSKB ČSL JEP, tj. R e = %. 5.4 Posouzení vybraných farmakokinetických parametrů antiepileptik levetiracetamu a topiramátu Cílem této části práce bylo dokumentovat význam TDM u nových AE, která mají ve srovnání s AE I. a II. generace málo významné vedlejší účinky a interakce s jinými léčivy a nepodléhají biotransformaci nebo vznikají pouze farmakologicky neaktivní metabolity. Pro tuto studii byla zvolena antiepileptika LEV a TOP. V Tab. 41 jsou uvedena základní statistická data pro vyhodnocení LEV a na Obr. 37 je znázorněna korelace mezi standardizovanou dávkou a sérovou hladinou LEV pro studovaný soubor pacientů léčených monoterapií LEV. Statistické vyhodnocení vypovídá o slabé korelaci mezi standardizovanou dávkou a sérovou koncentrací hodnota Pearsonova korelačního koeficientu r 2 = 0,1638 a pravděpodobnost P = 0,0001. Na základě této statistické analýzy lze konstatovat, že pouze 16,38 % vyšetřovaných pacientů vykazuje definovatelnou závislost sérové koncentrace LEV na podané denní dávce. V případě LEV byla v provedené studii prokázána významná interindividuální variabilita sérových koncentrací při podané standardizované dávce. Tato studie dokumentuje praktický význam TDM tohoto AE. 93

101 Tab. 41 Základní statistická data korelace mezi standardizovanou dávkou a sérovou koncentrací LEV. Velikost souboru 93 Nejnižší denní dávka 7,04 mg d -1 kg -1 Nejvyšší denní dávka 90,09 mg d -1 kg -1 Nejnižší sérová koncentrace 0,5 mg l -1 Nejvyšší sérová koncentrace 66,32 mg l -1 Pearsonův korelační koeficient (r 2 ) 0, % interval spolehlivosti pro r 2 0,0480-0,3160 Pravděpodobnost (P) 0,0001 Obr. 37 Korelace mezi standardizovanou dávkou a sérovou koncentrací LEV. Modrá přímka značí ideální průběh korelace a červené vymezení značí relaci 95% intervalu spolehlivosti. 94

102 V Tab. 42 jsou uvedena základní statistická data pro vyhodnocení TOP a na Obr. 38 je znázorněno porovnání dávky TOP na kilogram hmotnosti pacienta, kterou je nutné podat, aby koncentrace TOP v séru dosáhla hodnoty 1,0 mg l -1 v případě monoterapie TOP a polyterapie s KAR. Vzhledem k nenormálnímu rozdělení obou souborů byl pro porovnání mediánů obou souborů použit Mann-Whitney test. Byl prokázán statisticky významný rozdíl mediánů studovaných souborů hodnota pravděpodobnosti pro Mann-Whitney test P = 0,0009 < 0,05 (hodnota kritická). Hypotézu o shodnosti mediánů obou souborů lze vyloučit. V případě TOP byl v provedené studii prokázán významný vliv KAR na metabolismus TOP. Vlivem současného podávání s KAR dochází ke snížení hladiny TOP v séru. Tato studie dokumentuje praktický význam TDM u tohoto AE při kombinované terapii TOP a KAR. Tab. 42 Základní statistická data porovnání denní dávky TOP na kilogram hmotnosti pacienta, kterou je nutné podat, aby koncentrace TOP v séru dosáhla hodnoty 1,0 mg l -1. Monoterapie TOP Kombinace TOP + KAR Velikost souboru Nejnižší hodnota 0,1600 0,2378 Nejvyšší hodnota 3,3484 2,7341 Medián ( ) 0,5048 0, % interval spolehlivosti pro 0,4497 0,5603 0,5869 1,0467 Pravděpodobnost (P) pro Mann-Whitney test 0,

103 Obr. 38 Porovnání denní dávky TOP na kilogram hmotnosti pacienta, kterou je nutné podat, aby koncentrace TOP v séru dosáhla hodnoty 1,0 mg l -1 v případě monoterapie TOP (levý sloupec) a kombinace TOP a KAR (pravý sloupec). Hodnoty vyloučené ze statistického vyhodnocení jsou značeny červenými body. Odlehlé hodnoty jsou značeny prázdnými modrými body. 96

104 6 DISKUSE Cílem této práce byl vývoj, optimalizace a plná validace LC-MS-MS metod pro stanovení AE v séru. Prvotní experimenty směřovaly k optimalizaci individuálních MS podmínek analytů. Pro analýzy byly vybrány nejintenzivnější m/z iontové přechody a také byly vybrány nejoptimálnější parametry hmotnostního spektrometru, konkrétně DP (V), CE (V), CXP (V), EP (V), IS (V), TEM ( C), CUR (psi), CAD, GS1 (psi) a GS2 (psi). Všechny MS podmínky byly srovnány s několika pracemi (Kuhn a Knabbe, 2013; Tai et al., 2011; Shibata et al., 2012; Kim et al., 2011; Matar, 2010; Guo et al., 2007) a v některých případech se nastavení hmotnostního spektrometru shodovalo, ale některé MS podmínky byly modifikovány za účelem získání lepší fragmentace a intenzivnějších signálů jednotlivých analytů při jejich současném stanovení v séru. Následovala optimalizace chromatografických podmínek. Nejvhodnější kolona a mobilní fáze byly vybrány na základě nejúčinnější separace při součastném stanovení analytů v séru. Všechny eluce analytů probíhaly isokraticky, což odpovídá velmi krátkým dobám analýz (TOP do 4 min, LEV, GAB a VIG do 3 min a BZD do 5 min). V různých vědeckých pracích jsou využity různé kolony a různé mobilní fáze pro stanovení AE v biologických materiálech. Příklady použitých chromatografických systémů ve vědeckých publikacích jsou shrnuty v Tab. 43. Součástí vývoje metod byla také příprava vzorku. V této práci byly využity dva přístupy přípravy vzorku, a to precipitace proteinů (ACN a vodným roztokem trichloroctové kyseliny) a LLE. Většina vědeckých prací využívá srážení pomocí ACN (Kim et al., 2011; Kuhn a Knabbe, 2013; Guo et al., 2007). V práci Vermeij a Edelbroek (2004) používají k deproteinizaci vodný roztok trichloroctové kyseliny. Další možností přípravy vzorku je například precipitace methanolem (Shibata et al., 2012). Podle práce Crouch et al. (1999) byla modifikována LLE pro stanovení BZD s využitím borátového pufru pro úpravu ph a extrakční směsi obsahující toluen a dichlormethan. V jiné práci byla použita například LLE s extrakční směsí dichlormethanu, etheru a hexanu (Marin et al., 2012). Selektivitu a specifičnost metod také potvrzují vědecké práce (Shibata et al., 2012; Kim et al., 2011; Matar, 2010), které nezaznamenaly přítomnost interferentů v retenčních časech analytů. 97

105 Tab. 43 Příklady jiných chromatografických podmínek pro stanovení antiepileptik a ostatních benzodiazepinů v biologických materiálech. Chromatografické podmínky Analyty LEV Kolona Supelco LC-18-DB (3 µm; 3 x 100 mm) Mobilní fáze 5 mmol l -1 octan amonný (ph 3,2) s kyselinou octovou a ACN Eluce Isokrat (20 : 80) Analyty Kolona Mobilní fáze TOP Symmetry C18 (5 µm; 3,9 x 50 mm) ACN a 0,1% triethylamin Eluce Isokrat (80 : 20) Analyty Kolona Mobilní fáze LEV, TOP, GAB, VAL, LAM, ZON, PHE, KAR a EPO Luna C18 (3 µm; 2,0 x 100 mm) 90% ACN a 5 mmol l -1 mravenčanový pufr (ph 7,8) Eluce Isokrat (60 : 40) Reference Jain et al., 2006 Matar, 2010 Kim et al., 2011 Analyty Kolona Mobilní fáze Eluce Analyty Kolona Mobilní fáze Eluce 22 antiepileptik včetně BZD a metabolitů BEH C18 (1,7 µm; 2,1 x 50 mm) 10 mmol l -1 octan amonný s 0,1% kyselinou mravenčí a 85% methanol Gradient 21 benzodiazepinů a jejich metabolitů BEH C18 (1,7 µm; 2,1 x 100 mm) 0,1% kyselina mravenčí ve vodě a 0,1% kyselina mravenčí v methanolu Gradient Shibata et al., 2012 Marin et al., 2012 Intra-day a inter-day preciznost a přesnost a také výtěžnost metod byly porovnány s některými pracemi. Shibata et al. (2012) zavedli metodu stanovení 22 AE současně s dobou analýzy 10 min (retenční časy analytů v rozmezí 0,54 5,95 min). Kalibrační křivka byla lineární v terapeutickém rozsahu analytů (korelační koeficient R 2 0,99. Preciznost intra-day a inter-day nepřesahovala 7,5 % a 8,0 %. Přesnost intra-day a inter-day byla nižší než 15 %. Vědecká skupina Kim et al. (2011) vyvinuli metodu pro stanovení 10 AE současně s celkovou dobou analýzy 12 min (retenční časy analytů v rozmezí 98

106 1,96 9,94 min). Korelační koeficient lineární závislosti byl vyšší než 0,997. Intra-day a inter-day preciznost a přesnost metody byla nižší než 12 % a výtěžnost měření se pohybovala mezi 89,2 107 %. 99

107 7 ZÁVĚR Byly vyvinuty a zoptimalizovány HPLC-MS-MS metody s ESI ionizací v pozitivním nebo negativním módu v MRM režimu pro identifikaci a kvantifikaci sedmi antiepileptik (TOP, LEV, GAB, VIG, CLB, CLO a DIA) a třech aktivních metabolitů DIA (NORD, TEMA, OXA) v lidském séru. Tyto metody jsou velmi jednoduché, ekonomické a časově nenáročné (příprava vzorku je založená na jednoduché precipitaci proteinů nebo LLE). Analýzy jsou dostatečně rychlé (obecně jejich doba nepřesahuje 5 min). Vyvinuté metody byly plně validovány. Byla prokázána jejich vysoká selektivita a specifičnost. Linearita studovaných metod byla ověřena (korelační koeficienty R 2 0,9994). Preciznost metod v rámci všech koncentrací byla intra-day v rozmezí 0,97 5,94 % a inter-day v rozmezí 0,70 3,02 %. Přesnost metod v rámci všech koncentrací byla intra-day v rozmezí -4,54 4,89 % a inter-day v rozmezí -5,97 4,26 %. Citlivost metod plně dostačuje potřebám v klinické praxi. Výtěžnost metod v rámci všech koncentrací odpovídá rozsahu 95,46 104,46 %. Výše zmíněné výsledky jsou dostačující pro aplikaci metod v klinické praxi a prokazují, že vyvinuté metody jsou vyhovující pro požadovaný klinický účel a splňují nároky kladené na in-house metody dle platného doporučení ČSKB ČSL JEP. Všechny optimalizované metody jsou v současné době součástí rutinní praxe na Úseku instrumentálních metod Laboratoří AGEL a.s. v Novém Jičíně. Dále na základě sestavení validačního plánu a provedené validace pro stanovení LEV v séru, byla tato metoda akreditována ČIA (viz příloha 1). Při posuzování farmakokinetických parametrů LEV a TOP bylo zjištěno, že pouze 16,38 % vyšetřovaných pacientů vykazuje definovatelnou závislost sérové koncentrace LEV na podané denní dávce tohoto léčiva. Také byl prokázán významný rozdíl mediánů studovaných souborů pacientů při monoterapii TOP a kombinaci TOP a KAR hodnota pravděpodobnosti pro Mann-Whitney test P = 0,0009 < 0,05 (hodnota kritická). V provedených statistických studiích byla prokázána významná interindividuální variabilita sérových hladin LEV při podané standardizované dávce tohoto léčiva a také meziléková interakce mezi TOP a KAR, resp. vliv KAR na urychlení metabolismu TOP na neúčinné metabolity a snížení hladiny TOP v séru. Tyto studie dokumentují praktický význam TDM v případě monoterapie LEV a kombinované léčbě TOP a KAR. 100

108 8 LITERATURA Babu M. K. M. (2004): Simultaneously separation and quantitation of four antiepileptic drugs a study with potential for use in patient drug level monitoring. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 34, Bahrami G., Mirzaei S., Kiani A. (2004): Sensitive analytical method for Topiramate in human serum by HPLC with pre-column fluorescent derivatization and its application in human pharmacokinetic studies. Journal of Chromatography B 813, Bahrami G., Mirzaei S., Mohammadi B., Kiani A. (2005): High performance liquid chromatographic determination of topiramate in human serum using UV detection. Journal of Chromatography B 822, Bereczki A., Horváth V., Horvai G. (2000): Immunoassay-based determination of phenobarbital using size-exclusion chromatography. Journal of Chromatography B 749, Bialer M., White H. S. (2010): Key factors in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Nature Reviews Drug Discovery 9, Bílková M. (2004): Biotransformace. In: Forenzní a klinická toxikologie: Laboratorní toxikologická vyšetření (Houdek L. ed.), Galén, Praha. Booker H. E., Darcey B. A. (1975): Enzymatic Immunoassay vs. Gas/Liquid Chromatography for Determination of Phenobarbital and Diphenylhydantoin in Serum. Clinical Chemistry 21, Brázdil M. (2009): Moderní racionální terapie epilepsie. Neurologie pro praxi 10, Brázdil M., Doležal T. (2008): Zonisamid. Farmakoterapie 6, Britzi M., Perucca E., Soback S., Levy R. H., Fattore C., Crema F., Gatti G., Doose D. R., Maryanoff B. E., Bialer M. (2005): Pharmacokinetic and metabolic investigation of topiramate disposition in healthy subjects in the absence and in the presence of enzyme induction by carbamazepine. Epilepsia 46, Bušek P. (2013): Epilepsie. Medicína pro praxi 10, Coulter A. C., Huguenard J. R., Prince D. A. (1989): Characterization of ethosuximide reduction of low-threshold current in thalamic neurons. Annals of neurology 25, Croci D., Salmaggi A., de Grazia U., Bernardi G. (2001): New high-performance liquid chromatographic method for plasma/serum analysis of lamotrigine. Therapeutic Drug Monitoring 23, Crouch D. J., Rollins D. E., Canfield D. V., Andrenyak D. M., Schulties J. E. (1999): Quantitation of Alprazolam and α-hydroxyalprazolam in Human Plasma Using Liquid Chromatography Electrospray Ionization MS-MS. Journal of Analytical Toxicology 23, Czapinski P., Blaszczyk B., Czuczwar S. J. (2005): Mechanisms of action of antiepileptic drugs. Current Topics in Medicinal Chememistry 5, Daikhin Y., Yudkoff M. (2000): Compartmentation of brain glutamate metabolisms in neurons and glia. The Journal of Nutrition 130, 1026S-1031S. Datta P., Dasgupta A. (2005): Analytical Performance Evaluation of a New Turbidimetric Immunoassay for Valproic Acid on the ADVIA 1650 analyzer: Effect of gross hemolysis and high bilirubin. Journal of Clinical Laboratory Analysis 19, Dhillon S., Sander J. W. (2003): Epilepsy. In: Clinical pharmacy and therapeutics 3rd ed., (Walker R., Edwards C., eds.), Elsevier, Loanhead, Scotland, Doležal T., Zárubová J. (2002): Levetiracetamum. Remedia 12, Dostálek M., Turjap M., Grundmann M. (2009): Lékové interakce antiepileptik, antiparkinsonik, inhibitorů cholinesterázy, triptanů a derivátů ergotaminu na úrovni biotransformačních procesů. Postgraduální medicína 8, Doyle D. A., Cabral J. M., Pfuetzner R. A., Kuo A. L., Gulbis J. M., Cohen S. L. Chait B. T., MacKinnon R. (1998) The structure of the potassium channel: Molecular basis of K+ conduction and selectivity. Science 280, Eadie M. J. (2001): Therapeutic drug monitoring antiepileptic drugs. British Journal of Clinical Pharmacology 52, 11S-20S. 101

109 El Mahjoub A., Staub C. (2000): High-performance liquid chromatographic method for the determination of benzodiazepines in plasma or serum using the column-switching technique. Journal of Chromatography B 742, Fenimore D. C., Chester M. D., Meyer C. J. (1978): Determination of Drugs in Plasma by High-Performance Thin-Layer Chromatography. Clinical Chemistry 24, Frank E. L., Schwarz E. L., Junke J., Annesley T. M., Roberts W. L. (2002): Performance characteristics of four immunoassays for antiepileptic drugs on the IMMULITE 2000 automated analyzer. Americal Journal of Clinical Pathology 118, Giraud C., Tran A., Rey E., Vincent J., Treluyer J. M., Pons G. (2004): In vitro characterization of clobazam metabolism by recombinant cytochrome P450 enzymes: Importance of CYP2C19. Drug Metabolism and Disposition 32, Goulle J. P., Noyon J., Layet A., Rapoport N. F., Vaschalde Y., Pignier Y., Bouige D., Jouen F. (1995): Phenobarbital in hair and drug-monitoring. Forensis Science International 70, Guo T., Oswald L. M., Mendu D. R., Soldin S. J. (2007): Determination of levetiracetam in human plasma/serum/saliva by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. Clinica Chimica Acta 375, Guy H. R., Seetharamulu P. (1986): Molecular model of the action potential sodium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 83, Hallbach J., Vogel H., Guder W. G. (1997): Determination of lamotrigine, carbamazepine and carbamazepine epoxide in human serum by gas chromatography mass spectrometry. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry 35, Hendrich J., Van Minh A. T., Heblich F., Nieto-Rostro M., Watschinger K., Striessing J., Wratten J., Davies A., Dolphin A. C. (2008): Pharmacological disruption of calcium channel trafficking by the α2δ ligand gabapentin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, Hermida J., Tutor J. C. (2003): How Suitable Are Currently Used Carbamazepine Immunoassays for Quantifying Carbamazepine-10,11-epoxide in Serum Samples? Therapeutic Drug Monitoring 25, Holland M. L., Uetz J. A., Ng K. T. (1988): Automated capillary gas-chromatographic assay using flame ionization detection for the determination of topiramate in plasma. Journal of Chromatography 433, Hronek M., Kovařík M. (2009): Interakce vitaminů s léčivy. Interní medicína pro praxi 14, Chrastina J., Novák Z., Říha I., Brázdil M., Kuba R., Rektor I. (2009): Lezionální stereotaktické operace v terapii farmakorezistentní epilepsie. Neurologie pro praxi 10, Jain D. S., Subbaiah G., Sanyal M., Pal U., Shrivastav P. S. (2006): Determination of levetiracetam in human plasma by liquid chromatography/electrospray tandem mass spectrometry and its application to bioequivalence studies. Rapid Communications in Mass Spectrometry 20, Johannessen S. I., Battino D., Berry D. J., Bialer M., Kramer G., Tomson T., Patsalos P. N. (2003): Therapeutic drug monitoring of the newer antiepileptic drugs. Therapeutic Drug Monitoring 25, Juergens U. (1987): Simultaneous determination of Zonisamide and nine other anti-epileptic drugs and metabolites in serum. Journal of Chromatography 385, Kabra P. M., Stafford B. E., Marton L. J. (1977): Simultaneous Measurement of Phenobarbital, Phenytoin, Primidone, Ethosuximide, and Carbamazepine in Serum by High-Pressure Liquid Chromatography. Clinical Chemistry 23, Kandel E. R., Siegelbaum S. A. (2000): Synaptic Integration. In: Principles of Neural Science 4th ed., (Kandel E. R., Schwartz J. H., Jessell T. M., eds.), McGraw-Hill, New York, Kataoka Y., Makino K., Oishi R. (1998) Capillary electrophoresis for therapeutic drug monitoring of antiepileptics. Electrophoresis 19,

110 Kim K. B., Seo K. A., Kim S. E., Bae S. K., Kim D. H., Shin J. G. (2011): Simple and accurate quantitative analysis of ten antiepileptic drugs in human plasma by liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 56, Komárek V., Stopková P., Suchopár J., Zahradníková L., Vendulka O., Kučera Z. (2006): Acidum valproicum/natrii valproas. Remedia 16, Kuba R. (2006): Nová antiepileptika v klinické praxi. Neurologie pro praxi 1, Kuba R. (2012): Nové léky v terapii epilepsie. Remedia 22, Kuba R., Novotná I., Brázdil M., Křížová J., Tyrlíková I., Rektor I. (2003): Účinnost levetiracetamu u pacientů s farmakorezistentní epilepsií. Neurologie pro praxi 2, Kuba R., Novotná I., Brázdil M., Křížová J., Tyrlíková I., Rektor I. (2004): Topiramát v dlouhodobé terapii farmakorezistentní parciální epilepsie. Neurologie pro praxi 4, Kuhn J., Knabbe C. (2013): Fully validated method for rapid and simultaneous measurement of six antiepileptic drugs in serum and plasma using ultra-performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Talanta 110, Kunicki P. K. (2001): Simple and sensitive high-performance liquid chromatographic method for the determination of 1,5-benzodiazepine clobazam and its active metabolite N-desmethylclobazam in human serum and urine with application to 1,4-benzodiazepines analysis. Journal of Chromatography 750, Kuo C. C., Chen R. S., Lu L., Chen R. C. (1997): Carbamazepine inhibition of neuronal Na + currents: Quantitative distinction from phenytoin and possible therapeutic implications. Molecular Pharmacology 51, Kushida K., Ishizaki T. (1985): Concurrent determination of valproic acid with other antiepileptic drugs by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications 338, Kushnir M. M., Crossett J., Brown P. I., Urry F. M. (1999): Analysis of gabapentin in serum and plasma by solid-phase extraction and gas chromatography mass spectrometry for therapeutic drug monitoring. Journal of Analytical Toxicology 23, 1-6. Kwan P., Sills G. J., Brodie M. J. (2001): The mechanisms of action of commonly used antiepileptic drugs. Pharmacology & Therapeutics 90, Lancas F. M., Sozza M. A., Queiroz M. E. C. (2003): Simultaneous plasma lamotrigine analysis with carbamazepine, carbamazepine 10,11 epoxide, primidone, phenytoin, phenobarbital, and PEMA by micellar electrokinetic capillary chromatography (MECC). Journal of Analytical Toxicology 27, Lensmeyer G. L., Gidal B. E., Wiebe D. A. (1997): Optimized high-performance liquid chromatographic method for determination of lamotrigine in serum with concomitant determination of phenytoin, carbamazepine, and carbamazepine epoxide. Therapeutic Drug Monitoring 19, Levert H., Odou P., Robert H. (2002): Simultaneous determination of four antiepileptic drugs in serum by high-performance liquid chromatography. Biomedical Chromatography 16, Lillsunde P., Seppala T. (1990): Simultaneous screening and quantitative analysis of benzodiazepines by dual-channel gas-chromatography using electron-capture and nitrogen phosphorus detection. Journal of Chromatography 533, Liu J., Delgado M., Forman L. J., Eggers C. M., Montoya J. L. (1993): Simultaneous determination of carbamazepine, phenytoin, phenobarbital, primidone and their principal metabolites by high-performance liquid chromatography with photodiode-array detection. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications 616, Lynch B. A., Lambeng N., Nocka K., Kensel-Hammes P., Bajjalieh S. M., Matagne A., Fuks B. (2004): The synaptic vesicle protein SV2A is the binding for the antiepileptic drug levetiracetam. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, Macdonald R. L., Twyman R. E. (1991): Biophysical properties and regulation of GABA(A) receptor channels. The Neurosciences 3,

111 Main M. J., Cryan J. E., Dupere J. R. B., Cox B., Clare J. J., Burbidge S. A. (2000): Modulation of KCNQ2/3 potassium channels by the novel anticonvulsant retigabine. Molecular Pharmacology 58, Marin S. J., Roberts M., Wood M., McMillin G. A. (2012): Sensitive UPLC-MS-MS Assay for 21 Benzodiazepine Drugs and Metabolites, Zolpidem and Zopiclone in Serum or Plasma. Journal of Analytical Toxicology 36, Martens-Lobenhoffer J., Bode-Boger S. M. (2005): Determination of levetiracetam in human plasma with minimal sample pretreatment. Journal of Chromatography B 819, Maryanoff B. E., Nortey S. O., Gardocki J. F., Shank R. P., Dodgson S. P. (1987): Anticonvulsant O-alkyl sulfamates. 2,3:4,5-Bis-O-(1-methylethylidene)-beta-Dfructopyranose sulfamate and related-compounds. Journal of Medicinal Chemistry 30, Matar K. M. (2010): Therapeutic drug monitoring of topiramate by liquid chromatographytandem mass spectrometry. Clinica Chimica Acta 411, Matar K. M., Nicholls P. J., Tekle A., Bawazir S. A., Al-Hassan M. I. (1999): Liquid chromatographic determination of six antiepileptic drugs and two metabolites in microsamples of human plasma. Therapeutic Drug Monitoring 21, Maurer H. H. (1990): Detection of anticonvulsants and their metabolites in urine within a general unknown analysis procedure using computerized gas chromatography-mass spectrometry. Archives of Toxicology 64, McLean M. J., Macdonald R. L. (1986): Multiple action of phenytoin on mouse spinal cord neurons in cell culture. Journal of pharmacology and experimental therapeutics 227, Meldrum B. S., Akbar M. T., Chapman A. G. (1999): Glutamate receptors and transporters in genetic and acquired models of epilepsy. Epilepsy Research 36, Meyler M., Kelly M. T., Smyth M. R. (1993): New method for the determination of four antiepileptic drugs in human plasma by high performance liquid chromatography. Chromatographia 36, Michelucii R., Pasini E., Tassinari C. A. (2009): Phenobarbital, Primidone and Other Barbiturates. In: Treatment of Epilepsy 3rd ed. (Shorvon S. D., Perucca E., Engel J., eds.), Wiley-Blackwell, Chichester, United Kingdom, Minkova G., Getova D. (2001): Determination of carbamazepine and its metabolite carbamazepine-10,11-epoxide in serum with gas-chromatography mass spectrometry. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 23, Neels H. M., Sierens A. C., Naelaerts K., Scharpe S. L., Hatfield G. M., Lambert W. E. (2004) Therapeutic drug monitoring of old and newer anti-epileptic drugs. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 42, Nešpor E. (2003): Současné farmakologické přístupy k léčbě epilepsie. Remedia 13, Olesen O. V. (1965): Determination by Thin-Layer Chromatography of Phenytoin in Serum in The presence of Barbiturates and other Antiepileptic and Various Drugs. Acta Pharmacologica et Toxicologica 23, Owens M. J., Nemeroff C. B. (2003) Pharmacology of valproate. Psychopharmacology Bulletin 37, Patsalos P. N. (2013): Antiepileptic Drug Interactions: A Clinical Guide. 2nd ed., Springer, London. 437 stran. Pavlíková L., Brozmanová H., Kvasnička F., Grundmann M. (2007): Terapeutické monitorování léků pomocí elektromigračních metod. Klinická Framakologie a Farmacie 21, Pearce R. E., Vakkalagadda G. R., Leeder J. S. (2002): Pathways of carbamazepine bioactivation in vitro I. Characterization of human cytochromes P450 responsible for the formation of 2-and 3-hydroxylated metabolites. Drug Metabolism and Disposition 30, Pisani A., Bonsi P. Martella G., De Persis C., Costa C., Pisani F., Bernardi G., Balabresi P. (2004): Intracellular calcium increase in epileptiform activity: modulation by levetiracetam and lamotrigine. Epilepsia 45,

112 Pucci V., Mandrioli R., Raggi M. A. (2003): Determination of valproic acid (2-propylpentanoic acid) in human plasma by capillary electrophoresis with indirect UV detection. Electrophoresis 24, Ragsdale D. S., Avoli M. (1998): Sodium channels as molecular targets for antiepileptic drugs. Brain Research Reviews 26, Rambeck B., May T. W., Jurgens U., Blankenhorn V., Jurges U., Kornmerker E. (1994): Comparison of Phenytoin and Carbamazepine Serum Concentrations Measured by High-Performance Liquid Chromatography, the Standard TDx Assay, the Enzyme Multiplied Immunoassay Technique, and a New Patient-Side Immunoassay Cartridge System. Therapeutic Drug Monitoring 16, Ranise A., Benassi E., Besio G. (1981): Rapid gas chromatography method for the determination of carbamazepine and unrearranged carbamazepine-10,11-epoxide in human plasma. Journal of Chromatography 222, Rektor I., Kuba R. (2007): Nová antiepileptika u dospělých nové informace. Neurologie pro praxi 2, Rigo J. M., Hans G., Nguyen L., Rocher V., Belachew S., Malgrange B., Leprince P., Moonen G., Selak I., Matagne A., Klitgaard H. (2002): The anti-epileptic drug levetiracetam reverses the inhibition by negative allosteric modulators of neuronal GABA- and glycine-gated currents. British Journal of Pharmacology 136, Romanyshyn L. A., Wichmann J. K., Kucharczyk N., Shumaker R. C., Ward D., Sofia R. D. (1994): Simultaneous Determination of Felbamate, Primidone, Phenobarbital, Carbamazepine, Two Carbamazepine Metabolites, Phenytoin, and One Phenytoin Metabolice in Human Plasma by High-Performance Liquid Chromatography. Therapeutic Drug Monitoring 16, Sengupta A., Peat M. A. (1977): Gas-liquid-chromatography of 8 anticonvulsant drug in plasma. Journal of Chromatography 137, Serralheiro A., Alves G., Fortuna A., Rocha M., Falcao A. (2013): First HPLC UV method for rapid and simultaneous quantification of phenobarbital, primidone, phenytoin, carbamazepine, carbamazepine-10,11-epoxide, 10,11-trans-dihydroxy-10,11- dihydrocarbamazepine, lamotrigine, oxcarbazepine and licarbazepine in human plasma. Journal of Chromatography B 925, 1-9. Shank R. P., Maryanoff B. E. (2008): Molecular Pharmacodynamics, Clinical Therapeutics, and Pharmacokinetics of Topiramate. CNS Neuroscience & Therapeutics 14, Shibata M., Hashi S., Nakanishi H., Masuda S., Katsura T., Yano I. (2012): Detection of 22 antiepileptic drugs by ultraperformance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry applicable to routine therapeutic drug monitoring. Biomedical Chromatography 26, Shihabi Z. K., Oles K., Hinsdale M. (2003): Analysis of the antiepileptic drug keppra by capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A 1004, Shimoyama R., Ohkubo T., Sugawara K. (2000): Monitoring of carbamazepine and carbamazepine 10,11-epoxide in breast milk and plasma by high-performance Liquid chromatography. Annals of Clinical Biochemistry 37, Schmutz A., Thormann W. (1993): Determination of phenobarbital, ethosuximide, and primidone in human serum by micellar electrokinetic capillary chromatography with direct sample injection. Therapeutic Drug Monitoring 15, Schulz M., Schmoldt A. (2003): Therapeutic and toxic blood concentrations of more than 800 drugs and other xenobiotics. Pharmazie 58, Slíva L. (2011): Lékové interakce antiepileptik. Edukafarm FarmiNews 2, Soldin S. J., Hill J. G. (1976): Rapid Micromethod for Measuring Anticonvulsant Drugs in Serum by High-Performance Liquid Chromatography. Clinical Chemistry 22, Song D., Zhang S., Kohlhof K. (1996): Quantitative determination of clonazepam in plasma by gas chromatography-negative ion chemical ionization mass spectrometry. Journal of Chromatography B-Biomedical Applications 686,

113 Speed D. J., Dickson S. J., Cairns E. R., Kim N. D. (2000): Analysis of Six Anticonvulsant Drugs using Solid-Phase Extraction, Deuterated Internal Standards, and Gas Chromatography-Mass Spectrometry. Journal of Analytical Toxicology 24, Stefani A., Spadoni F., Bernardi G. (1997): Voltage-activated calcium channels: Targets of antiepileptic drug therapy? Epilepsia 38, Stewart C. F., Bottorff M. B. (1986): Fluorescence Polarization Immunoassay for Ethosuximide Evaluated and Compared with Two Other Immunoassay Techniques. Clinical Chemistry 32, Swartz M. E., Murphy B. J. (2004): Ultra performance liquid chromatography: tomorrow's HPLC technology today. Lab Plus international 18, 6-9. Šulcová A. (2007): Antiepileptika. In: Základní a aplikovaná farmakologie. (Lincová D., Farghali H., eds.), Galén, Praha. Tai S. S., Yeh C. Y., Phinney K. W. (2011): Development and validation of a reference measurement procedure for certification of phenytoin, phenobarbital, lamotrigine, and topiramate in human serum using isotopedilution liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry 401, Thormann W., Zhang C. X., Schmutz A. (1996): Capillary electrophoresis for drug analysis in body fluids. Therapeutic Drug Monitoring 18, Tomita M., Okuyama T. (1996): Application of capillary electrophoresis to the simultaneous screening and quantitation of benzodiazepines. Journal of Chromatography B: Biomedical Applications 678, Treiman D. M. (2001): GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia 42, Ueda Y., Doi, T., Tokumaru J., Willmore L. J. (2003) Effect of zonisamide on molecular regulation of glutamate and GABA transporter proteins during epileptogenesis in rats with hippocampal. Molecular Brain Research 116, 1-6. Vermeij T. A. C., Edelbroek P. M. (2004): Simultaneous high-performance liquid chromatographic analysis of pregabalin, gabapentin and vigabatrin in human serum by precolumn derivatization with o-phtaldialdehyde and fluorescence detection. Journal of Chromatography B 810, Vojtěch Z. (2005): EEG v epileptologii dospělých. 1st ed., Grada Publishing, Praha, 680 stran. Wad N., Kramer G. (1998): Sensitive high-performance liquid chromatographic method with fluorometric detection for the simultaneous determination of gabapentin and vigabatrin in serum and urine. Journal of Chromatography B 705, Wallace J. E., Schwertner H. A., Hamilton H. E., Shimek E. L. (1979): Electron-capture gas-liquid chromatographic determination of ethosuximide and desmethylmethsuximide in plasma or serum. Clinical Chemistry 25, Watelle M., Demedts P., Franck F., DeDeyn P. P., Wauters A., Neels H. (1997): Analysis of the antiepileptic phenyltriazine compound lamotrigine using gas chromatography with nitrogen phosphorus detection. Therapeutic Drug Monitoring 19, Williams D. (1956): Treatment of Epilepsy with Mysoline. Proceedings of the Royal Society of Medicine 49, Wilson J. F., Marshall R. W., Williams J., Richens A. (1983): Comparison of Assay Methods Used to Measure Antiepileptic Drugs in Plasma. Therapeutic Drug Monitoring 5, Wilson J. F., Tsanaclis L. M., Williams J., Tedstone J. E., Richens A. (1989): Evaluation of Assay Techniques for the Measurement of Antiepileptic Drugs in Serum - A Study Based on External Quality assurance Measurements. Therapeutic Drug Monitoring 11, Wolf C. E., Saady J. J., Poklis A. (1996): Determination of gabapentin in serum using solid-phase extraction and gas-liquid chromatography. Journal of Analytical Toxicology 20, Zárubová J., Doležal T. (2002): Lamotrigium. Remedia 12,

114 9 SEZNAM POUŽITÝCH SYMBOLŮ A ZKRATEK ACN Acetonitril AE Antiepileptika AMPA α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-propionová kyselina AUC Plocha pod křivkou BZD Benzodiazepiny CAD tlak kolizního plynu CE Kolizní energie CEC Elektrochromatografie CELFO Kapilární elektroforéza CLB Clobazam CLIA chemiluminiscenční imunoanalytická metoda CLO Clonazepam CNS Centrální nervový systém CUR Tlak curtain gas CV Variační koeficient CXP Výstupní potenciál kolizní cely CYP Cytochrom P450 CZE Kapilární zónová elektroforéza DIA Diazepam DP Deklasterační polenciál EAAC Excitatory amino acid carrier ECD Detektor elektronového záchytu EEG Elekroencefalografie ELSD Evaporative light scattering detector EMIT Enzyme-multiplied immunoassay technique EP Vstupní potenciál ESI Ionizace elektrosprejem ETH Ethosuximid FIA Fluorescenční imunoanalýza FID Plamenově ionizační detektor FPIA Fluorescenční polarizační imunoanalýza GAB Gabapentin GABA γ-aminomáselná kyselina GABA-T GABA-transaminasa GAD Glutamátdekarboxylasa GAT GABA transportér GLAST Glutamát-aspartátový transportér GLT Glutamátový transportér GS1 Tlak zmlžujícího plynu GS2 Tlak sušícího plynu HPLC-F HPLC s fluorescenčním detektorem HPTLC Vysokoúčinná tenkovrstevná chromatografie 107

115 IS IStd K1 K2 KAR LAM LEV LLE LOD LOQ MDMA MECC MRM NIA NORD NPD NP-HPLC OXA PBT PEMA PHE PRI R 2 R e RIA RP-HPLC SSA TDM TE TEM TEMA TIA TLC TOP UGT UPLC VAL VIG ZON Napětí na kapiláře v iontovém zdroji Interní standard Level I (kontrola1) Level II (kontrola2) Karbamazepin Lamotrigin Levetiracetam Extrakce kapalina/kapalina Limit detekce Limit kvantifikace N-methyl-D-aspartátová kyselina Micelární elektrokinetická kapilární chromatografie Multiple reaction monitoring Nefelometrická imunoanalytická metoda Nordiazepam Dusíko-fosforový detektor HPLC na normální fázi Oxazepam Fenobarbital Phenylethylmalonamid Phenytoin Primidon Korelační koeficient Výtěžnost (recovery) Radioimunoanalýza HPLC na reverzní fázi Sukcinát semialdehyd Terapeutické monitorování léčiv Celková chyba měření Teplota zmlžujícího plynu Temazepam Turbidimetrická imunoanalytická metoda Tenkovrstevná chromatografie Topiramát Uridindifosfátglukurosyltransferasa Ultra performance liquid chromatography Valproát Vigabatrin Zonisamid 108

116 10 PŘÍLOHA 1 109

117 110

118 111