Opora pro kombinované navazující magisterské studium Učitelství chemie pro ZŠ a SŠ BIOCHEMICKÁ CVIČENÍ

Transkript

1 UNIVERZITA JANA EVANGELISTY PURKYNĚ V ÚSTÍ NAD LABEM PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA KATEDRA CHEMIE Opora pro kombinované navazující magisterské studium Učitelství chemie pro ZŠ a SŠ BIOCHEMICKÁ CVIČENÍ Doc. PaedDr. Markéta Pečivová, CSc. RNDr. Nguyen Thi Thu Huong, Ph.D. Ústí nad Labem 2014

2 Úvod Tato skripta jsou určena posluchačům Přírodovědecké fakulty UJEP, studujících chemii v kombinovaném studiu ve všech studijních programech. Ve studijní opoře jsou zařazeny takové experimenty, ve kterých se frekventanti kurzu seznamují se základními laboratorními technikami v biochemii a s postupy stanovení některých přírodních látek. Pozornost je věnována jednak kvalitativnímu prvkovému stanovení složení organických sloučenin, dále potom analytickým stanovením charakteristik lipidů, sacharidů, bílkovin, nukleových kyselin, enzymů, některých léčiv a alkaloidů. U většiny prácí je uvedena charakteristika principu úlohy, dále potřebné pomůcky a chemikálie spolu s přesným laboratorním postupem. Na závěr každé úlohy jsou zařazeny otázky, jejichž zodpovězením posluchač prokazuje míru porozumění dané úlohy. Absolutoriem tohoto cvičení dochází nejen k praktickému procvičení dovedností posluchačů ale i prohloubení jejich vědomostí z biochemie, které získali v kurzu Základy biochemie. Cvičení je organizováno blokově. Obsah 1. bloku: V tomto bloku jsou posluchači povinni realizovat 10 úloh: 1. Důkaz přítomnosti uhlíku, síry, halogenů, fosforu, sodíku a draslíku v popelu. 2. Důkaz dusíku a síry v organických sloučeninách Lassaigneovou zkouškou. 3. Stanovení čísla kyselosti tuků. 4. Extrakce tuků z máku petroletherem v Soxhletově extraktoru. 5. Kvalitativní důkazy sacharidů. 6. Stanovení obsahu vitaminu C v potravinách. 7. Separace aminokyselin na tenké vrstvě. 8. Titrace aminokyselin podle Sörensena. 9. Kvantitativní stanovení sacharidů podle Schoorla 10. Stanovení enzymatické aktivity katalasy A. Návody a teoretický rozbor jednotlivých úloh jsou uvedeny ve studijní opoře pro tento předmět. Obsah 2. bloku: Z dalších úloh bude vybráno 10 a každý z posluchačů si z nich vybere jednu nebo dvě úlohy podle jejich časové náročnosti. Ty demonstračně provede a vysvětlí teoretickou podstatu předváděné úlohy. 2

3 Obsah Organizační pokyny a bezpečnostní předpisy 4 Seznam používaných činidel a vybraných roztoků 6 Praktické úlohy Důkaz přítomnosti uhlíku, síry, halogenů, fosforu, sodíku a draslíku 7 2. Důkaz přítomnosti: Fe, Cu, Ca, Mg 8 3. Důkaz dusíku a síry v organických sloučeninách Lassaigneovou zkouškou 8 4. Stanovení čísla kyselosti tuku Stanovení jódového čísla Ověření žluklosti tuku stanovením peroxidového čísla Extrakce tuků z máku petroletherem v Soxhletově extraktoru Důkaz cholesterolu v tuku Adsorpční chromatografie barviv papriky na sloupci oxidu hlinitého Kvalitativní důkazy sacharidů Separace sacharidů chromatografií na tenké vrstvě Kvantitativní stanovení sacharidů podle Schoorla Polarimetrické ověření inverze sacharosy Stanovení obsahu vitaminu C v potravinách Izolace ribonukleových kyselin z kvasnic Izolace deoxyribonukleoproteinu ze sleziny Hydrolytické štěpení nukleových kyselin a důkazy jejich složek Izolace L- glutamové kyseliny Separace aminokyselin chromatografií na tenké vrstvě Titrace aminokyselin podle Sörensena Stanovení izoelektrického bodu želatiny Vlastnosti močoviny Izolace alkaloidu z kávy a čaje Titrační stanovení kyseliny acetylsalicylové Alkalická hydrolýza a vlastnosti kyseliny acetylsalicylové Získávání rostlinných silic destilací s vodní parou Enzymatická hydrolýza vaječného bílku Izolace sacharasy a sledování její katalytické aktivity Prokázání substrátové specifity sacharasy a -amylasy Vliv teploty na enzymatickou aktivitu -amylasy Důkaz přítomnosti peroxidasy Stanovení enzymatické aktivity katalasy A 42 Příloha: Polarimetr 43 Seznam použité literatury 47 3

4 ORGANIZAČNÍ POKYNY - Cvičení je organizováno blokovým způsobem. - Každý účastník cvičení pracuje samostatně. Na začátku cvičení převezme od vedoucího cvičení či laborantky laboratorní stůl, který si zkontroluje podle seznamu. Na konci cvičení ho opět v původním stavu předá. Rozbité sklo každý individuálně uhradí. Chemikálie jsou seřazeny ve skříni. Po odebrání potřebného množství se musí láhev uzavřít a opět uložit na původní místo. - Úlohy jsou zpracovávány v daném pořadí popsaném ve skriptech. Pro praktické provedení úloh je nutné zvládnutí základních laboratorních technik. Pracovní postup je třeba přečíst předem, připravit se na něj, a přesně ho dodržovat. Zjistí-li vedoucí cvičení, že se posluchač na cvičení řádně nepřipravil, může ho z laboratoře vyloučit a ten může pokračovat v práci až po prostudování úlohy. - Při práci jsou všichni povinni psát laboratorní deník, ve kterém si zapisují všechny experimentální údaje, např. navážky, vlastní pozorování, výsledky a hodnoty měření apod. Záznam provádí v průběhu práce, nejpozději hned po ukončení příslušné úlohy. - Po ukončení každé úlohy předloží posluchač tyto zápisy a výsledky práce (získaný produkt nebo příslušné zkumavky u důkazových zkumavkových reakcí). Úloha bude uznána až po obhajobě příslušné práce, při které posluchač prokáže, že porozuměl principu i postupu důkazu resp. stanovení. Při zásadních neznalostech, nebo při hrubém porušení zásad bezpečnosti práce musí posluchač práci přerušit a může pokračovat až po nastudování příslušné problematiky a následném přezkoušení. - Posluchači jsou povinni udržovat v laboratoři pořádek. Po skončení práce uvede posluchač vše do původního stavu a teprve pak ohlásí vedoucímu cvičení svůj odchod. BEZPEČNOSTNÍ PŘEDPISY Povinností každého účastníka je znát a dodržovat bezpečnostní předpisy. Zvlášť je třeba dbát těchto zásad: Nenosit jídlo do laboratoře a nejíst v laboratoři. Používat předepsané ochranné pomůcky. Sestavenou aparaturu si nechat zkontrolovat a během reakce nebo ohřevu ji mít stále pod kontrolou. Nikdy nezahřívat zcela uzavřenou aparaturu. Nenechávat hořet kahan bez dozoru. Nepracovat s hořlavinami v blízkosti ohně (nalévání, jímání destilátu, extrakce atd.). S těkavými a toxickými látkami pracovat vždy v digestoři! 4

5 Při vzniku požáru vypnout kahany a elektrické spotřebiče a oheň hasit zabráněním přístupu vzduchu přiměřeným způsobem (přikrytím nádoby azbestovou síťkou, pískem, hasicím přístrojem atd.) Odpadní látky, které mohou být splachovány do výlevky, vylévat přímo do odtokového kanálku a důkladně spláchnout proudem vody. Ostatní je třeba dávat do odpadních nádob s označením (odpadní rozpouštědla, toxické odpady, těžké kovy atd.) Před odchodem uklidit stůl, uzavřít přívod plynu, vypnout přívod elektrického proudu, vypnout pojistky a uzavřít vodu. Student má dovoleno opustit laboratoř jen se souhlasem vedoucího cvičení. Služba: studenti si určí na každý den službu. Povinnosti služby je: 1. kontrolovat všechna pracovní místa, 2. kontrolovat digestoře, uzávěry plynu, vody a elektřiny, 3. kontrolovat čistotu vah, 4. vypnout přívod plynu ve skříni na chodbě, 5. vynést koše se sklem. 5

6 Seznam používaných činidel a vybraných roztoků: 1. Alkoholový roztok hydroxidu draselného: 2,8 g KOH se rozpustí ve 40 cm 3 vody a doplní ethanolem na 100 cm Molischovo činidlo: 10% roztok 1-naftolu v ethanolu. 3. Thymolové činidlo: 5% roztok thymolu v ethanolu. 4. Lugolův roztok: V odměrné baňce na 100 cm 3, zpola zaplněné vodou, rozpusťte 2,5 g KI a 1 g I 2, poté doplňte vodou po rysku. Baňka se zazátkuje a její obsah se protřepe několikerým převrácením baňky. 5. Roztok jodu: V odměrné baňce, zpola naplněné vodou, se rozpustí 1,5 g KI a 0,5 g I 2, poté se doplní vodou po rysku. Baňka se zazátkuje a její obsah se protřepe několikerým převrácením baňky. 6. Tollensovo činidlo: Ke 2 ml 5% AgNO 3 se po kapkách přidává 2% NH 3 až dojde k rozpuštění přechodné sraženiny. 7. Selivanovo činidlo: 0,05 g resorcinolu se rozpustí ve směsi 50 cm 3 HCl a 50 cm 3 vody. 8. Fehlingovo činidlo: Fehling I: 6,93 g CuSO 4.5H 2 O se rozpustí v 100 cm 3 vody. Fehling II: 10 g NaOH a 35 g vinanu draselno-sodného se rozpustí ve 100 cm 3 vody. 9. Neutrální roztok formaldehydu: K 50 cm 3 40% formaldehydu se přidá 1 cm 3 0,5% alkoholického fenolftaleinu a pak po kapkách roztok NaOH do slabě růžového zabarvení. 10. Roztok -amylasy: Ústa se vypláchnou 5 cm 3 destilované vody a roztok se přefiltruje přes 3x přeloženou gázu. 11. Roztok sacharasy: V třecí misce se rozetře 1 g kvasnic s 1 cm 3 destilované vody a 1 g křemenného písku. Směs se zředí 5 cm 3 destilované vody, opět rozetře a zfiltruje přes složenou gázu. 12. Difenylaminové činidlo: 1 g difenylaminu se rozpustí ve 100 cm 3 ledové kyseliny octové a přidá se 2,5 cm 3 kyseliny sírové.!!! POZOR, činidlo není stálé. Nesmí být zřetelně zeleně zbarveno!!!! 13. Molybdenová soluce: K 10 cm 3 destilované vody se pomalu přidává 0,625 cm 3 koncentrované HNO 3 a ve výsledné směsi se rozpustí 75 mg molybdenanu amonného. 14. Octanový pufr ph 4,5: Smíchají se roztoky octanu sodného (0,1 mol.dm -3 ) a kyseliny octové (0,1 mol.dm -3 ) v objemovém poměru 3 : Fosfátový pufr ph 7,5: Smíchají se roztoky Na 2 HPO 4 a NaH 2 PO 4 o koncentraci 0,1 mol.dm -3 v objemovém poměru 2 : 1. 6

7 BIOGENNÍ PRVKY Prvkům potřebným pro stavbu a životní činnost organismů se říkají biogenní prvky. Rozlišují se: I. Makroprvky podílí se na celkové hmotnosti organismu > 0,005 % C, H, N, O, P základní biogenní prvky (tvoří 98 %) S, Ca, Mg, Na, Cl, K, Fe II. Mikroprvky podílí se na celkové hmotnosti organismu < 0,005 % Zn, Mn, Cu, Mo, I, Co, B, F, Br, Se, As, Si, Al, Ti, V V organismech se vyskytují jen ve stopových množstvích. Jsou však pro něj nepostradatelné. Úloha 1: Důkaz přítomnosti uhlíku, síry, halogenů, fosforu, sodíku a draslíku Váhy, filtrační aparatura, kádinky, 10% roztok kyseliny dusičné, 5% roztok dusičnanu stříbrného, 10% roztok molybdenanu amonného, 5% roztok hydroxidu barnatého anebo dusičnanu barnatého. 3 g rostlinného nebo živočišného popela nasypte do kádinky a přidejte 30 cm 3 destilované vody. Směs mírně zahřejte za stálého míchání, zfiltrujte a nerozpuštěnou část na filtru promyjte malým množstvím teplé destilované vody. Získaný filtrát použijte k následujícím důkazům a rozdělte jej do tří zkumavek a), b), c). Zbytek na filtračním papíru uchovejte k dalšímu zpracování. a) Filtrát okyselte 5 cm 3 roztoku kyseliny dusičné. Vývin oxidu uhličitého dokazuje přítomnost uhličitanů (uhlíku). Z tohoto roztoku odeberte asi 3 cm 3 do zkumavky a k tomuto množství přidejte 0,5 cm 3 roztoku dusičnanu barnatého. b) Další část původního filtrátu okyselte 3 cm 3 kyseliny dusičné a přidejte 0,5 cm 3 roztoku dusičnanu stříbrného. c) K 5 cm 3 původního filtrátu okyseleného 3 cm 3 kyseliny dusičné přidejte 1 cm 3 molybdenanu amonného a povařte. 1. Co se dokazuje: a) dusičnanem barnatým b) dusičnanem stříbrným c) molybdenanem amonným Napište rovnice výše uvedených důkazů. 2. Které kovy lze běžně dokázat zkouškou v plameni? 7

8 Úloha 2: Důkaz přítomnosti Fe, Cu, Ca, Mg Nálevka, kádinky, sada zkumavek, filtrační papír. 10% Roztok kyseliny chlorovodíkové, 1% roztok amoniaku, 1% ethanolový roztok salicylaldoximu, 10% roztok octanu amonného, 5% roztok thiokyanatanu amonného, 5% roztok chloridu amonného, 5% roztok uhličitanu amonného, 5% roztok hydrogenfosforečnanu sodného. a) Zbytek na filtračním papíře z předchozího postupu promyjte několika cm 3 roztoku kyseliny chlorovodíkové až do mírně kyselé reakce. Filtrát rozdělte do dvou zkumavek. b) Do jedné zkumavky s filtrátem z pokusu (a) přidejte asi 3 cm 3 roztok amoniaku až do slabě kyselé reakce (kontrola ph papírkem), nesmí přitom vzniknout sraženina. Objem 3 cm 3 tohoto roztoku smíchejte s 1 cm 3 ethanolového roztoku salicylaldoximu. Vznik nazelenalé sraženiny nebo zákalu měďnaté chelátové sloučeniny dokazuje měďnaté kationty Cu 2+. c) Ke zbývající části filtrátu přidejte 2 cm 3 roztoku octanu amonného. Povařením se vyloučí bílá sraženina železité soli. Roztok nad sraženinou musí být bezbarvý. V opačném případě je zapotřebí postup opakovat přidáním dalšího množství octanu amonného. Obsah zfiltrujte, filtrát uchovejte na pokus (d). Ke sraženině na filtru přidejte několik kapek kyseliny chlorovodíkové. Po převedení sraženiny do roztoku přidejte roztok thiokyanatanu amonného. d) Filtrát z pokusu (c) zahřejte a po kapkách přidejte asi 0,5 cm 3 roztoku chloridu amonného. Poté přidávejte roztok uhličitanu amonného, dokud vzniká bílá sraženina. Ta dokazuje přítomnost Ca 2+. e) Reakční směs z pokusu (d) zfiltrujte a do filtrátu přidejte několik kapek roztoku amoniaku a dále cca 0,5 cm 3 roztoku hydrogenfosforečnanu sodného. Vznik bílé sraženiny dokazuje přítomnost Mg Napište rovnice reakcí probíhajících v pokusech c, d, e. 2. Které prvky patří do skupiny biogenních makroprvků? Úloha 3: Důkaz dusíku a síry v organických sloučeninách Lassaigneovou zkouškou Skleněná kapilára, nůž na sklo, kahan, odpařovací miska, odměrný válec, filtrační aparatura, zkumavky, indikátorové papírky, přírodní materiál (vlasy, nehty). 8

9 sodík, síran železnatý, 30% H 2 SO 4, 1% roztok nitroprussidu sodného Na 2 [Fe(CN) 5 NO]. Do trubičky ze snadno tavitelného skla o vnitřním průměru 5-8 mm a asi 12 cm dlouhé, která je na jednom konci zatavena a zúžena, vpravte asi 0,02 g zkoumané látky (vlasy, nehty), smíchané s nadrobno nakrájeným sodíkem (krychlička sodíku o hraně asi 3 mm).!!! Používejte ochranný štít, rukavice a pracujte v digestoři!!!. Mírně zahřívejte 1-2 minuty. Žhavou trubičku opatrně ponořte do odpařovací misky s 10 cm 3 vody.!!! Nezreagovaný sodík totiž může explodovat!!! Roztok zfiltrujte. Filtrát má být čirý. Je-li tmavě zbarven, bylo spálení nedokonalé a je nutné postup od začátku opakovat. a) Důkaz dusíku: Objem 2-3 cm 3 filtrátu vpravte do zkumavky s 0,1 g práškového síranu železnatého, směs mírně zahřejte k varu za stálého třepání a pak bez ochlazení přidejte několik kapek zředěné kyseliny sírové do kyselé reakce. Tvorba modré sraženiny je důkazem přítomnosti dusíku. b) Důkaz síry: Ke 2 cm 3 filtrátu přidejte 2-3 kapky čerstvě připraveného roztoku nitroprussidu sodného. Vznik purpurového zbarvení roztoku je důkazem přítomnosti síry. 1. Uveďte chemické rovnice dějů, které slouží k důkazu dusíku. 2. Kterým činidlem je možno ve filtrátu dokázat přítomnost síry? Chemickou rovnicí postihněte podstatu tohoto důkazu. 9

10 LIPIDY Úloha 4: Stanovení čísla kyselosti tuku Číslo kyselosti tuku N: je udáno hmotností hydroxidu draselného v mg, jež se spotřebuje k neutralizaci volných mastných kyselin v 1 g tuku. N m m KOH [ mg] Analytické váhy, titrační aparatura, kádinky, alkoholový roztok hydroxidu draselného (0,5 mol.dm -3 ), fenolftalein, tuk, ethanol, ether. Příprava alkoholového roztoku KOH: 2,8 g KOH se rozpustí ve 40 cm 3 vody a doplní ethanolem na 100 cm 3. Spotřeba tohoto roztoku na stanovení bývá přibližně do 10 cm 3 v závislosti na druhu použitého tuku. V titrační baňce s 40 cm 3 směsi ethanolu a etheru (poměr 1 : 1) rozpusťte 2 g tuku nebo oleje, který jste předem ponechali 2-3 dny na vzduchu při pokojové teplotě. Pokud se tuk rozpouští pomalu, zahřejte baňku se směsí na vodní lázni. K ochlazené směsi přidejte 6 kapek fenolftaleinu. Potom titrujte alkoholovým roztokem hydroxidu draselného do trvale růžového zbarvení. Proveďte slepý pokus. Rozdíl spotřeb hydroxidu draselného použijte pro výpočet čísla kyselosti tuku. 1. Stanovte číslo kyselosti použitého tuku. 2. Uveďte mastné kyseliny, které mohou být obsaženy v másle. Napište jejich chemické vzorce a názvy. 3. Vysvětlete, proč je číslo kyselosti vyšší u tuku, který je vystaven světlu a teplu. tuk [ g] Úloha 5: Stanovení jódového čísla Princip metody: Jodové číslo udává stupeň nenasycenosti vazeb mezi atomy uhlíku v organických sloučeninách. Je udáváno poměrem množství vázaného jódu v gramech na 100 gramů zkoumané látky. m jodu.100 jodové číslo = m zkoumané látky 10

11 Při tomto experimentálním stanovení reaguje kyselina olejová s bromem v ethanolickém roztoku, který se aduje na dvojnou vazbu mastné kyseliny: CH CH + Br 2 CH CH Nadbytek bromu reaguje s jodidem draselným za vzniku jódu: Br 2 KI + Br 2 2 KBr + I 2 I 2 se následně stanovuje titrací s thiosíranem sodným 2 Na 2 S 2 O 3 + I 2 2 NaI + Na 2 S 4 O 6 Dvě 250ml Erlenmayerovy baňky se zátkou, tři pipety 1ml, 5ml, 20ml, jedna 100ml odměrná baňka, jeden 50ml odměrný válec, jedna 50ml byreta. Kyselina olejová C 18 H 34 O 2, (M r 282,47, 0,8939 g.cm -3 ), brom Br 2 (M r 159,82, 3,119 g.cm -3 ), ethanol, 10% roztok jodidu draselného, roztok thiosíranu sodného (0,1 mol.dm -3 ), 0,5% roztok škrobu. Příprava roztoku bromu v ethanolu:!!! Roztok bromu v ethanolu je nutné připravovat v digestoři za použití ochranných brýlí a rukavic!!! Do 100ml odměrné baňky zpola naplněné ethanolem se přidá 1 cm 3 bromu a doplní po rysku ethanolem. a) Objem 1 cm 3 kyseliny olejové rozpusťte v Erlenmayerově baňce ve 20 cm 3 ethanolu. K tomuto roztoku napipetujte 25 cm 3 roztoku bromu v ethanolu. Baňku zazátkujte a postavte na cca 10 minut do temna. Poté přidávejte pomocí pipety 20 cm 3 roztoku KI spolu s 50 cm 3 destilované vody. Přidejte několik kapek čerstvě připraveného roztoku škrobu. Vzniklý roztok titrujte připraveným roztokem thiosíranu sodného až do odbarvení. b) Souběžně provádějte slepý pokus se stejným množstvím látek (20 cm 3 ethanolu, 25 cm 3 roztoku bromu, 20 cm 3 roztoku KI, 50 cm 3 destilované vody). Nepřidává se kyselina olejová. Takto připravenou směs titrujte roztokem thiosíranu sodného do odbarvení. Pro kontrolu přidejte posléze ještě několik kapek roztoku škrobu. V případě modrého zabarvení titrujte dále roztokem thiosíranu do odbarvení. 1. Zdůvodněte průběh reakcí a zaznamenejte hlavní probíhající děje rovnicemi. 2. Vypočítejte jódové číslo dané kyseliny olejové. Br 11

12 Úloha 6: Ověření žluklosti tuku stanovením peroxidového čísla Princip metody: Obsah peroxidů a hydroperoxidů se stanovuje pomocí peroxidového čísla. Uvedené oxidační produkty reagují s nasyceným roztokem jodidu draselného za vzniku jódu, který se titruje roztokem thiosíranu sodného. Peroxidové číslo udává množství aktivního kyslíku na 1 kilogram tuku. Vyloučený jód je možno stanovit i elektrochemickými metodami. Kolorimetrické stanovení peroxidového čísla je založené na oxidaci železnatých iontů na železité, které se stanovují jako barevný thiokyanatan železitý. Baňky se zátkami, odměrný válec, pipeta, byreta, mikrotenové fólie, váhy 50% roztok jodidu draselného, roztok thiosíranu sodného (0,001 mol.dm -3 ), kyselina octová, chloroform, vzorek tuku. Do Erlenmayerovy baňky se zábrusem odvážte 1 g vzorku tuku nebo oleje s přesností na 1 mg. Do baňky přidejte 10 cm 3 chloroformu, ihned baňku uzavřete a tuk protřepáním rozpusťte. K roztoku přidejte 10 cm 3 koncentrované kyseliny octové, směs promíchejte a dále přidejte 1 cm 3 roztoku jodidu draselného. Dejte pozor, aby nevznikaly páry. Baňku zazátkujte, směs v ní 1 minutu protřepávejte a potom ji uložte na temné místo. Za 5 minut do baňky přidejte 75 cm 3 destilované vody a za intenzivního protřepávání titrujte roztok vyloučeného jódu odměrným roztokem thiosíranu sodného. Průběh reakce indikuje červenofialové zabarvení jódu rozpuštěného v chloroformu. Vždy po protřepání reakční směsi počkejte, až dojde k rozdělení vrstev. Titrujte až do odbarvení chloroformové vrstvy. Spotřebu thiosíranu označte V 1. Toto stanovení se provede u každého vzorku dvakrát. Proveďte slepý pokus. Postupujte při něm stejně, ale bez použití vzorku tuku. Spotřebu zaznamenejte jako V 2. Poznámky: a) Roztok KI musí být bezbarvý, nebo jen nepatrně nažloutlý. b) Spotřeba Na 2 S 2 O 3 (0,001 mol.dm -3 ) u slepého vzorku nesmí být vyšší než 1 cm Z naměřených hodnot vypočítejte objem thiosíranu V, který reagoval s jódem vzniklým reakcí vzorku m 1 a roztoku KI (V = V 1 - V 2 ). 2. Vypočítejte hmotnost jódu, který vznikl reakcí vzorku o hmotnosti m 1 (g) a roztoku KI. 3. Peroxidové číslo vyjádřete jako hmotnost jódu v mg, který se uvolní reakcí 1 g vzorku. 4. Který děj označujeme termínem žluknutí tuku? Lze jej vyjádřit jednou rovnicí? 12

13 5. Napište obecnou rovnici reakce hydroperoxidů z nenasycených kyselin a jodidu draselného. 6. Napište rovnici titrace jódu roztokem thiosíranu sodného Na 2 S 2 O 3. Který indikátor je vhodné použít při stanovení bodu ekvivalence? Úloha 7: Extrakce tuků z máku petroletherem v Soxhletově extraktoru Soxhletův extraktor - metoda kontinuální extrakce: Tato metoda se používá zejména k dělení organických látek. Do střední části (3) přístroje se vkládá papírová extrakční patrona (1) válcového tvaru s kulatým dnem naplněná vzorkem. Baňka (2) se naplní vhodným rozpouštědlem, v němž se dobře rozpouští složka, kterou chceme oddělit. Baňka se zahřívá k varu rozpouštědla. Jeho páry stoupají postranní trubičkou kolem střední části extraktoru do chladiče (5), kde kondenzují. Rozpouštědlo kape na vzorek obsažený v papírové patroně. Střední část extraktoru se postupně plní zkondenzovaným rozpouštědlem, jehož hladina stoupá i v tenké přepadové trubičce (4). Stoupne-li hladina rozpouštědla ve střední části extraktoru k nejvyšší části přepadové trubičky, přeteče roztok do destilační baňky, z níž se těkavé rozpouštědlo znovu destiluje. Čisté rozpouštědlo stále destiluje a zakapává extrahovaný materiál. Tím se vyluhování stále opakuje. V destilační baňce se přitom hromadí vyextrahovaná látka. Nakonec se získá roztok jedné nebo více složek v destilační baňce, z níž po ukončené extrakci se rozpouštědlo vydestiluje. V baňce tak zůstane jen izolovaná složka, popř. směs několika složek. Soxhletův extraktor, topné hnízdo, váhy, třecí miska s tloučkem, destilační baňka, frakční baňka, hexan, mák. Asi g máku roztlučte v třecí misce, vložte do papírové patrony a překryjte kouskem vaty. Naplněnou patronu zvažte a vložte do extraktoru. Do baňky přidejte maximálně do dvou třetin jejího objemu hexan a varné kamínky. Obsah baňky zahřívejte v topném hnízdě. Extrakce trvá asi dvě hodiny. Po jejím ukončení vypněte topné hnízdo a nechte aparaturu vychladnout. Poté Soxhletův extraktor rozeberte, patronu s obsahem nechte v digestoři usušit a znovu zvažte. Na baňku nasaďte destilační nástavec a sestupný chladič, přidejte nové varné kamínky a rozpouštědlo oddestilujte. Získaný olej zvažte s baňkou a olej slijte do zásobníku. Baňku znovu zvažte. 13

14 1. Vypočítejte množství tuku v máku v procentech. 2. Charakterizujte chemické složení tuků. 3. Napište obecný vzorec tuků. Úloha 8: Důkaz cholesterolu v tuku Váhy, zkumavka, pipeta, 50 cm 3 baňka, Čistý cholesterol, rybí tuk, vepřové sádlo, kyselina sírová, acetanhydrid a) Do dvou zkumavek dejte malé množství čistého cholesterolu (0,05 g). Do první zkumavky přidejte 4 cm 3 chloroformu a opatrně 2 cm 3 kyseliny sírové. Pozorujte barevné změny (z oranžové na červenou a fluorescenci spodní vrstvy). b) Do druhé zkumavky přidejte 5 cm 3 chloroformu a 1 cm 3 acetanhydridu. Po důkladném protřepání opatrně přidejte 1 cm 3 kyseliny sírové. Změna barvy z modré na zelenou indikuje cholesterol. c) Obě výše popsané zkoušky proveďte rovněž s rybím tukem, vepřovým sádlem a extrahovaným makovým olejem. 1. Mezi které sloučeniny se řadí cholesterol? 2. Napište jeho vzorec. 3. Kde vzniká v organismu a na co odbourává? 4. Ve které zkoumané látce je nejvíce cholesterolu? Úloha 9: Adsorpční chromatografie barviv papriky na sloupci oxidu hlinitého Chromatografická kolona, vata, nálevka, Erlenmayerova baňka. Suchá červená paprika, benzín nebo petrolether, Al 2 O 3 pro chromatografii (aktivovaný vyžíháním) Do Erlenmayerovy baňky vneste asi 1 g práškové suché červené papriky a 5 cm 3 benzínu. Za občasného protřepání vzorek extrahujte asi 15 minut. Upevněte ve stojanu suchou chromatografickou kolonu. Do zúžené výtokové části vmáčkněte tyčinkou malý smotek vaty a trubici plňte směsi 5 g aktivovaného oxidu hlinitého v 10 cm 3 benzinu. Při plnění sloupce je nutné dbát na pravidelné uložení adsorbentu, aby sloupec neobsahoval trhliny nebo vzduchové bubliny a nedocházelo tak k 14

15 nepravidelnostem v toku rozpouštědla. Adsorbent nechte v trubici usadit a na jeho povrch vložte kolečko filtračního papíru, které brání víření nosiče při dolévání rozpouštědel. Až hladina klesne k povrchu adsorbentu, opatrně navrstvěte asi 2 cm 3 extraktu papriky přefiltrovaného přes smotek vaty. Ihned po vsáknutí doplňte benzín tak, aby se povrch adsorbentu nezvířil. Po dostatečném rozdělení zón výpusť uzavřete a zhodnoťte výsledek. 1. Zakreslete schéma kolony se zónami barviv! 2. Která barviva jsou v paprice obsažena? 3. Mezi jakou skupinu organických látek se řadí? 4. Na základě výsledků adsorbce rozhodněte, které z barviv je nejvíce polární a které má polaritu nejmenší, když víte, že oxid hlinitý jako polární adsorbens poutá z dělené směsi její polárnější složky. 15

16 SACHARIDY Úloha 10: Kvalitativní důkazy sacharidů Princip metody: Kvalitativní důkazy využívají reaktivity hydroxylových a karbonylových skupin a schopnosti tvořit dehydratací deriváty 2-furaldehydu (furan-2-karbaldehydu). HO H O H H H OH OH OH O 2-furaldehyd O H H OH HO H OH H OH O H OH HO O O 5--hydroxymethyl-2-furaldehyd Tyto aldehydy snadno kondenzují s aromatickými fenoly a aminy za vzniku barevných produktů: Thymolová reakce, Molischova reakce, Selivanova reakce, Schiffova reakce. CH 3 H 3 C CH 3 H 3 C CH 3 O R H + 2 OH [O] konc. H 2 SO 4 HO O H 3 C CH thymol 3 CH 3 R CH 3 Zkumavky, pipety, vodní lázeň, dvě porcelánové misky, kádinky. Molischovo činidlo, Selivanovo činidlo, Fehlingovo činidlo, Tollensovo činidlo, koncentrovaná kyselina sírová, koncentrovaná kyselina chlorovodíková, koncentrovaná kyselina chlorovodíková, 45% kyselina dusičná, 5% roztok chromanu draselného, vzorky sacharidů, jablečná šťáva, močovina. 1. Důkaz přítomnosti sacharidů ve vodě: a) Reakce Molischova: Ke čtyřem zkumavkám se vzorky sacharidů v pořadí: roztok glukosy, sacharosy, škrobového mazu a kousky filtračního papíru (celulosy) přidejte tři kapky Molischova činidla a směs opatrně podvrstvěte kyselinou sírovou. Důkazem sacharidů je fialový proužek na rozhraní vrstev. b) Thymolová reakce: Ke stejným vzorkům sacharidů jako v pokuse a) tentokrát přidejte tři kapky ethanolového roztoku thymolu a 10 cm 3 koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Vzorky zahřívejte 5 minut ve vroucí lázni. Důkazem je karmínově červené zbarvení. 16

17 2. Rozlišení mono- a disacharidů od polysacharidů nitrochromovou reakcí: Připravte si tři zkumavky se vzorky sacharidů: roztokem glukosy, sacharosy a 2 cm 3 zředěného škrobového mazu. Ke každému vzorku přidejte opatrně 3 cm 3 roztoku HNO 3 a pět kapek roztoku K 2 CrO 4. Modré zbarvení se projeví pouze u sacharosy a glukosy. 3. Odlišné reakce D-fruktosy a D-glukosy: a) Připravte si tři zkumavky s roztoky D-fruktosy, D-glukosy a sacharosy (po 1 cm 3 ). Do roztoku sacharosy přidejte 0,5 cm 3 kyseliny chlorovodíkové. Do všech vzorků přidejte 4 cm 3 Selivanova činidla. Zkumavky zahřívejte ve vroucí vodní lázni a měřte čas, za který se jednotlivé reakční směsi zbarví červeně. Nejrychleji reaguje D-fruktosa, potom sacharosa a nejpomaleji D-glukosa. Pokus trvá asi 10 min. b) Do každé ze dvou porcelánových misek odvažte 0,01g močoviny a přidejte 6 kapek HCl. Do první misky přidejte dvě kapky roztoku D-glukosy a do druhé stejný objem roztoku D-fruktosy. Reakční směsi promíchejte, aby se močovina rozpustila a zahřejte 15 min. na vroucí vodní lázni. Reakční směs s D-glukosou se zbarví červeně, s D-fruktosou zelenomodře. 4. Oxidačně-redukční reakce sacharidů: a) Do pěti očíslovaných zkumavek nalijte 2 cm 3 roztoky sacharidů v pořadí: D- glukosa, D-fruktosa, sacharosa, jablečná šťáva. Do každého roztoku přidejte 4 cm 3 Fehlingova činidla, které připravíte těsně před použitím smícháním roztoků Fehling I a Fehling II v poměru 1:1. Všechny zkumavky zahřívejte ve vroucí vodní lázni tři minuty a pozorujte, které sacharidy reagují za vzniku hnědočervené sraženiny. b) Opět si připravte vzorky sacharidů jako v předcházejícím pokusu. K jednotlivým vzorkům přidejte čerstvě připravené Tollensovo činidlo (2 cm 3 ). Všechny zkumavky zahřívejte 3 min. v teplé vodní lázni a pozorujte vznik stříbrného zrcátka v jednotlivých zkumavkách. Činidlo D-glukosa D-fruktosa sacharosa jablečná šťáva Fehlingovo Tollensovo Výsledky obou pokusů zapište do tabulky. Pozitivní výsledek zapište znaménkem +, negativní Napište strukturní vzorec glukosy! 2. Z jakých monosacharidů je složena sacharosa? Napište vzorce! 3. Co je monomerní jednotkou celulosy? Napište vzorec! 4. Vysvětlete podstatu zbarvení u reakce a)! 17

18 5. Sledujte dobu vzniku zbarvení u pokusů b) a c)! 6. Vysvětlete, proč reakce sacharosy se Selivanovým činidlem probíhá rychleji než reakce D glukosy. Uvažujte i s přítomností HCl v reakční směsi sacharosy! 7. Pomocí chemické rovnice vysvětlete podstatu reakce s Fehlingovým a Tollensovým činidlem! 8. Myslíte si, že v jablečné šťávě jsou přítomny i jiné látky s redukčními účinky? Pokud ano, uveďte které? Použijte odbornou literaturu. Úloha 11: Separace sacharidů chromatografií na tenké vrstvě Chromatografie na tenké vrstvě: Tato metoda slouží jak k analytickým, tak i k preparativním účelům. Pro analytické účely jsou zvláště vhodné hotové analytické desky označené Silufol nebo Alufol. Desky Silufol jsou hliníkové folie rozměru 15 x 15 eventuálně 20 x 20 cm 2, na kterých je nanesena vrstva silikagelu pojeného škrobem. Chromatografické desky s označením Silufol 254 obsahují fluorescenční indikátor. Lze na nich v UV světle detekovat bezbarvé látky. Jednotlivé skvrny se ve světle UV lampy projeví fluorescencí nebo zhášením. Druhý typ desek, označený Alufol obsahuje jako adsorbent oxid hlinitý s pojidlem. Silufolové desky, mikropipety, rozprašovač, sušárna, kyvety s deskou na vyvíjení. Vyvíjecí soustava, detekční činidlo, standardní roztoky cukrů (2-3 g.dm -3 ), neznámý vzorek. Vyvíjecí soustava: Směs butan-1-olu, kyseliny octové a vody v poměru 4 : 1 : 5. Tuto směs protřepejte a použijte vrchní fázi. Detekční činidlo: 1 cm 3 anilinu, 1 g difenylaminu, 10 cm 3 85% kyseliny fosforečné a 100 cm 3 acetonu Vytvořte si nejprve standardy těchto látek: D-glukosy, laktosy, maltosy, D- fruktosy a D-arabinosy. Při nanášení je lépe používat koncentrovaný roztok, aby skvrna dělené směsi byla co možná nejmenší. Ustřihněte silufolovou desku o rozměru 10 x 10 cm 2. Vzorky a standardy naneste na startovní čáru vzdálenou asi 15 mm od spodního okraje a od bočních okrajů. Skvrny nemají mít větší průměr než 2 mm. Desku vložte do chromatografické komory s vyvíjecí soustavou. Provádějte vyvíjení tak dlouho, až se čelo přiblíží na 1 cm k hornímu okraji. Po usušení v digestoři vytvořený chromatogram postříkejte detekčním činidlem a vložte do sušárny vyhřáté na 100 o C. Po chvíli se objeví barevné skvrny pro jednotlivé cukry.!!! POZOR: desky nezahřívejte delší dobu v sušárně!!! 18

19 1. Porovnáním určete složení směsného vzorku. 2. Spočítejte R f glukosy a fruktosy. 3. Uveďte barvu skvrn jednotlivých standardů. 4. Který z uvedených cukrů nevykazuje pozitivní reakci s Fehlingovým roztokem? Úloha 12: Kvantitativní stanovení sacharidů podle Schoorla Princip metody: Nejčastěji klinicky stanovovaným sacharidem je D-glukosa. Její zvýšená hladina v krvi indikuje poruchu metabolismu tzv. diabetes mellitus. Mezi četné metody ke stanovování sacharidů patří metoda titrační, fotometrická s použitím Somogyi- Nelsonova činidla. Specifické stanovení koncentrace glukosy využívá enzymové reakce katalyzované glukosaoxidasou. Redukující cukry se nejčastěji stanovují podle Schoorlovy metody. Redukující cukry vylučují za varu z alkalického roztoku měďnaté soli oxid měďný. Nezreagované množství měďnaté soli se stanoví jodometricky. 2 Cu 2+ + C 6 H 12 O 6 Cu 2 O + C 6 H 12 O 7 2 Cu I - 2 CuI + I 2 2 Na 2 S 2 O 3 + I 2 2 NaI + Na 2 S 4 O 6 Reakce neprobíhá v přesných stechiometrických poměrech a její průběh je ovlivněn dobou varu, složením činidla, druhem cukru atd. Při přesném dodržování podmínek reakce je možno dosáhnout reprodukovatelných hodnot, přičemž pro kvantitativní vyhodnocení výsledků měření se používají tabulky s empiricky získanými hodnotami. Odměrná baňka (100 cm 3 ), Erlenmayerova baňka (250 cm 3 ), skleněná pipeta (10 cm 3 ), kapátko. Fehlingův roztok I, Fehlingův roztok II, roztok Na 2 S 2 O 3 (0,1 mol.dm -3 ), jodid draselný, kyselina sírová (2,5 mol.dm -3 ), indikátor (škrobový roztok), vzorek obsahující redukující cukry. Odměrnou baňku obsahující 1 g vzorku doplňte po rysku destilovanou vodou. Do Erlenmayerovy baňky odpipetujte vždy 10 cm 3 Fehlingova roztoku I a II a 10 cm 3 roztok vzorku. Obsah upravte destilovanou vodou na výsledný objem 50 cm 3. Baňku se směsí zakryjte skleněnou nálevkou a uveďte do varu a 2 min. povařte. Potom baňku rychle ochlaďte studenou vodou na teplotu laboratoře. K ochlazenému roztoku přidejte 3 g KI rozpuštěného v 10 cm 3 destilované vody, okyselte ho 10 cm 3 roztoku 19

20 H 2 SO 4 a ihned za intenzívního míchání titrujte odměrným roztokem Na 2 S 2 O 3, až roztok zežloutne. Potom přidejte pět kapek roztoku škrobu a pomalu dotitrujte do odbarvení roztoku. Vzniklá směs zakalená vyloučeným bělavým jodidem měďným musí zůstat při dosažení bodu ekvivalence několik minut beze změny. Současně proveďte slepý pokus. Rozdíl spotřeby odměrného roztoku Na 2 S 2 O 3 při slepém pokusu a při vlastním stanovení cukru odpovídá množství mědi cukrem zredukované. 1. V tabulce vyhledejte množství příslušného cukru v titrovaném roztoku! Tabulka 1: Stanovení cukrů thiosíranem Objem Na 2 S 2 O 3 0, 1 mol.dm -3 [ml] Glukosa C 6 H 12 O 6 [mg] Fruktosa C 6 H 12 O 6 [mg] Invertovaná Sacharosa C 6 H 12 O 6 [mg] Maltosa C 12 H 22 O 11 [mg] Laktosa C 12 H 22 O 11 [mg] 1 3,2 3,2 3,1 5,0 4,6 2 6,3 6,4 6,2 10,5 9,2 3 9,4 9,7 9,3 16,0 13,9 4 12,6 13,0 12,4 21,5 18,6 5 15,9 16,4 15,6 27,0 23,3 6 19,2 20,0 18,8 32,5 28,1 7 22,4 23,7 22,0 38,0 33,0 8 25,6 27,4 25,2 43,5 38,0 9 28,9 31,1 28,4 49,0 43, ,3 34,9 31,7 55,0 48, ,7 38,7 35,0 60,5 53, ,0 42,4 38,3 66,0 58, ,4 46,2 41,6 72,0 63, ,8 50,0 44,9 78,0 68, ,3 53,7 48,2 83,5 73, ,8 57,5 51,6 89,0 78, ,3 61,2 55,1 95,0 83, ,8 65,0 58,7 101,0 88, ,3 68,7 62,3 107,0 93, ,9 72,4 65,9 112,5 98, ,7 76,2 69,6 118,5 103, ,5 80,1 73,3 124,5 108, ,5 84,0 77,1 130,5 113, ,6 87,8 80,9 136,5 118, ,6 91,7 84,7 142,5 123,0 20

21 Úloha 13: Polarimetrické ověření inverze sacharosy Monosacharidy a oligosacharidy jsou látkami chirálními, tzn. jejich molekuly nejsou ztotožnitelné se svým zrcadlovým obrazem. Tyto látky stáčejí rovinu polarizovaného světla. Tato vlastnost se nazývá optická aktivita. Specifickou rotaci čisté kapalné látky vypočteme podle vztahu: [ ] t = l kde je naměřený úhel stočení při teplotě t a použité vlnové délce, l je délka polarimetrické trubice (v dm) a je hustota látky v g.cm -3. Pro roztoky pak používáme vztah: [ ] t 100 =, kde cg je počet gramů měřené látky ve 100 cm 3 roztoku. Platí [ ] t = l c 100 = l cg l w g, kde je hustota roztoku v g.cm -3 a w je hmotnostní koncentrace roztoku. Hodnota specifické rotace závisí na povaze rozpouštědla a u mnohých látek se mění i s koncentrací. Rovněž vlnová délka polarizovaného světla a teplota, při kterých se měří, mají na specifickou rotaci velký vliv. Tabelují se hodnoty [ ] 20 D, tj. specifické rotace při obvyklé teplotě 20 C a obvyklé vlnové délce 589,0 a 589,6 nm (sodíkový dublet D). Pro měření při jiné teplotě je nutno provést korekci. Stupnice polarimetru: kruhové stupně <, mezinárodní sacharimetrické stupně S, Ventzkeho stupně V 1 < = 2,8885 S = 2,8854 V 1 V = 0,3466 < = 1,001 S 1 S = 0,3462 < = 0,999 V Pro směs opticky aktivních látek platí pravidlo o aditivitě: optická otáčivost je dána součtem příspěvků opticky aktivních složek např. pro dvě složky: = l. ([ ] 20 D (A). c w (A) + [ ] 20 D (B). c w (B) ). Pro stanovení sacharosy vedle jiné opticky aktivní látky se využívá dvojí měření (před a po hydrolýze sacharosy, která je doprovázena změnou optické otáčivosti inverzí). Tabulka 2: Specifické rotace některých sacharidů (ve stupních kruhových) Dextrin + 194,8 Maltosa - 137,5 D-fruktosa - 93,78 Rafinosa + 123,01 D-galaktosa + 80,47 Sacharosa + 66,53 D-glukosa + 52,74 Škrob + 196,4 Invertní cukr - 20,59 Xylosa + 196,4 Laktosa + 55,3 21

22 Váhy, odměrný válec, hodinové sklo, dvě kádinky, polarimetr se světelným zdrojem, stopky. 10% roztok sacharosy, 10% roztok kyseliny chlorovodíkové. I. nastavení nulové polohy polarimetru a) Připravte polarimetr k měření. Světelný zdroj nastavte tak, aby světlo směřovalo k polarizátoru polarimetru. b) Kyvetu naplňte destilovanou vodou tak pod okraj kyvety. Sklíčko přiložte k hornímu okraji kyvety a jeho posunem odstraňte nadbytečnou kapalinu tak, aby v kyvetě nebyla vzduchová bublina. Sklíčko na kyvetě lehce dotáhněte šroubovým uzávěrem. c) Kyvetu s vodou vložte do pouzdra přístroje a otočením analyzátoru nastavte nulovou polohu. Při ní musí být celé zorné pole stejně osvětleno (u polostínového polarimetru jsou obě poloviny zorného pole rozděleny svislou čarou). d) Kyvetu naplňte roztokem vzorku a vložte ji do pouzdra přístroje. e) Pozorujte změnu osvětlení zorného pole polarimetru. Analyzátorem otáčejte tak dlouho, až je celé zorné pole stejně osvětleno. Pokud byla opticky aktivní látka pravotočivá (+) museli jste otáčet analyzátorem a tím i kruhovou úhlovou stupnicí ve směru hodinových ručiček. Byla-li opticky aktivní látka levotočivá (-), otáčeli jste úhlovou stupnicí opačně. f) V takto nastavené poloze odečtěte na stupnici úhel otáčení. II. inverze sacharosy a) Polarimetrem změřte úhel otočení roviny polarizovaného světla procházejícího roztokem sacharosy. Změřený úhel zaznamenejte jako 1 a vypočítejte jemu odpovídající specifickou rotaci roztoku sacharosy: [ ] t. Potřebnou hodnotu složení roztoku vypočítejte na základě údaje, že hustota 10% roztoku sacharosy má hodnotu 1,038 g.cm -3. Na kterou stranu otáčí roztok sacharosy rovinu polarizovaného světla? b) Do varné baňky s 50 cm 3 roztoku sacharosy přidejte 5 cm 3 HCl a směs zahřejte 10 minut pod zpětným chladičem ve vodní lázni na 100 C. Po ukončení zahřívání ochlaďte roztok v kádince na teplotu laboratoře. c) Polarimetrem změřte úhel otočení polarizovaného světla procházejícího roztokem produktů. Změřený úhel zaznamenejte jako 2 a vypočtěte specifickou rotaci roztoku [ ] t. K výpočtu použijte hodnotu složení roztoku, kterou jste vypočítali v bodě a) pracovního postupu. Na kterou stranu otáčejí rovinu polarizovaného světla produkty kyselé hydrolýzy sacharosy? 22

23 1. Vysvětlete pojem mutarotace? 2. Vypočtěte specifickou rotaci [ ] t sacharosy! 1. Vysvětlete inverzi sacharosy! 2. Napište cyklický Haworthův vzorec glukosy a sacharosy! Úloha 14: Stanovení obsahu vitaminu C v potravinách Princip metody: Kyselinu askorbovou neboli vitamin C (C 6 H 8 O 6 ) lze v kyselém prostředí stechiometricky oxidovat sodnou solí 2,6-dichlorfenolindolfenolu (DCPIP) na kyselinu dehydroaskorbovou (C 6 H 6 O 6 ). V této reakci reaguje jedna molekula kyseliny askorbové s jednou molekulou CDPIP. HO OH H HO O OH O + O N Cl Cl ONa HO OH H O O O O + HO NH Cl Cl ONa Vzorek kyseliny askorbové lze přímo titrovat v kyselém prostředí odměrným roztokem CDPIP. Před koncem titrace může tato redoxní reakce probíhat relativně pomalu, a proto je nutné v okolí bodu ekvivalence titrovaný roztok opatrně a důkladně promíchávat, a tím podpořit reakci. Bod ekvivalence je indikován změnou tmavě modrofialového CDPIP na bezbarvou redukovanou formu. Kádinky, zkumavky, byreta, kahan, odměrný válec, titrační baňka, pipeta na 1 cm 3, odměrné baňky na 100 cm 3. Tableta celaskonu, citron, 5% roztok dusičnanu stříbrného, amoniak, kyselina askorbová (M r 176,12), sodná sůl 2,6-dichlorfenolindolfenol monohydrátu (DCPIP) o M r 308,09. A) Důkaz redukčních účinků kyseliny askorbové K roztoku celaskonu v destilované vodě (1 tableta ve 3 cm 3 ) přidejte 1 cm 3 roztoku AgNO 3 a několik kapek amoniaku. B) Stanovení hmotnostního podílu vitamínu C v potravinách a) Příprava roztoků: Roztok vitamínu C (0,01 mol.dm -3 ): v odměrné baňce rozpusťte 0,176 g kyseliny askorbové a doplňte vodou na 100 cm 3. 23

24 Roztok DCPIP asi 0,001 mol.dm -3 : 30 mg DCPIP rozpusťte v 100ml odměrné baňce a doplňte vodou k rysce. b) Určení přesné látkové koncentrace roztoku DCPIP: Toto stanovení provedete pomocí roztoku analyticky čisté kyseliny askorbové. Směs 10 cm 3 vody, dvou kapek ledové kyseliny octové a 1 cm 3 roztoku kyseliny askorbové titrujte roztokem DCPIP do trvale růžového zabarvení. c) Stanovení vitamínu C v citronové šťávě: V titrační baňce odvažte přesně 4 g citronové šťávy, přidejte 10 cm 3 vody a dvě kapky ledové kyseliny octové. Poté titrujte roztokem DCPIP do trvale růžového zabarvení. 1. Vypočtěte množství kyseliny askorbové v citronové šťávě! 2. Uveďte význam kyseliny askorbové v lidském organismu! 24

25 NUKLEOVÉ KYSELINY Nukleové kyselina se v buňce vyskytují ve formě asociátů a bazickými proteiny histony. RNA a DNA se vzájemně liší lokalizací v buňce, funkcí, strukturou i složením. Fosfodiesterové vazby RNA se snadno štěpí zředěnými alkáliemi, ale N-glykosidická vazba přitom zůstává zachována. DNA je vůči alkalické hydrolýze stabilnější. Příčinou je nepřítomnost hydroxylové skupiny v poloze 2, která u RNA vytváří meziprodukt s kyselinou fosforečnou a tak napomáhá hydrolýze. Mírná kyselá hydrolýza nukleových kyselin poskytuje směs nukleotidů, nukleosidů a bází. Purinové báze se obecně odštěpují snáze než pyrimidinové, takže hydrolyzát obsahuje převahu purinových bází a pyrimidinových nukleotidů. Purinové báze poskytují bělavé ve vodě nerozpustné stříbrné soli. Pentosy poskytují charakteristické barevné reakce sacharidů. Fosfát lze prokázat kondenzační reakcí s molybdenanovým aniontem za vzniku žlutého iontu tetrakis(trimolybdato)fosforečnanového P(Mo 3 O 10 ) 3 4. Úloha 15: Izolace ribonukleových kyselin z kvasnic Vhodným materiálem pro izolaci RNA jsou kvasnice, které obsahují až 4% RNA. Buněčné membrány se rozruší hydroxidem s přídavkem diethyletheru. Pro získání nativní, nedegradované RNA se pracuje při teplotách kolem 0 C. Nerozpustný podíl, polysacharidy a denaturované bílkoviny, se oddělí centrifugací. RNA se vysráží ethanolem při ph blízkém jejímu isoelektrickému bodu. Třecí miska, kádinky, centrifugační zkumavky, odměrný válec, odstředivka, ph papírky. Pekařské kvasnice, pravý mořský písek, diethylether, 50% kyselina octová, 10% roztok hydroxidu sodného, 96 % ethanol, koncentrovaná kyselina chlorovodíková V třecí misce rozetřete s trochou mořského písku 10 g čerstvých pekařských kvasnic, které je nutné předem zvlhčit 1 cm 3 destilované vody. Rozrušení buněčných membrán podpoří přídavek asi 10 cm 3 diethyletheru. Postupně přidávejte 10 cm 3 vychlazeného roztoku NaOH a po dobu 10 minut důkladně roztírejte. Poté vložte misku na minut do lednice. Po vyjmutí směs důkladně zneutralizujte vychlazenou kyselinou octovou na ph 6-6,5 za kontroly indikátorovým papírkem. Suspenzi rozdělte do centrifugačních zkumavek, pečlivě vyvažte a odstřeďte po dobu 5 minut při 3000 otáček/min. Supernatant slijte do širšího odměrného válce, okyselte koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na ph 3,5 a změřte celkový objem. Za 25

26 stálého míchání tyčinkou přilívejte čtyřnásobné objemové množství ethanolu. Vzniklou sraženinu opět odstřeďte. Sediment, obsahující preparované ribonukleové kyseliny, uschovejte. 1. Z jakých složek se skládají nukleové kyseliny? 2. Vysvětlete význam přidávání alkoholu v poslední fázi separace nukleových kyselin! Úloha 16: Izolace deoxyribonukleoproteinu ze sleziny Kyselina deoxyribonukleová je v buňce vázána s bílkovinou ve formě deoxyribonukleoproteinu (DNP). Při jeho izolaci se vychází z tkání obsahujících buňky s velkými jádry (brzlík, slezina, mlíčí ryb aj.). Extrakce se provádí roztokem chloridu sodného. Po zředění roztoku se vyloučí DNP jako vláknitý produkt. Během preparace může dojít ke změnám struktury (např. v koncentrovaných roztocích soli k disocioaci bílkovinné složky, při extrakci zředěným roztokem k depolymeraci vlivem katalýzy nukleasami). Třecí miska, kádinky, centrifugační zkumavky, odměrný válec, odstředivka, ph papírky. Pekařské kvasnice, pravý mořský písek, roztok chloridu sodného (1 mol.dm -3 ), slezina, čerstvé difenylaminové činidlo. Izolace DNP: Množství 2-3 g sleziny dobře rozetřete v třecí misce s trochou mořského písku. Za stálého míchání přidejte do směsi cm 3 NaCl (1 mol.dm -3 ) a důkladně roztírejte min, až vznikne viskosní roztok. Suspenzi rozdělte do centrifugačních zkumavek, pečlivě vyvažte a odstřeďte po dobu 10 minut při 5000 otáček/min. Supernatant slijte do odměrného válce a přilévejte velmi pomalu do šestinásobného množství destilované vody DNP se sráží ve formě vláken. Vzniklou sraženinu opět odstřeďte. Sediment, obsahující preparované ribonukleové kyseliny používejte ke kvalitativním reakcím. Důkaz DNA: Ve dvou zkumavkách rozpusťte cca 1 mg DNP (získané v této úloze) a 1 mg RNA (získané v předchozí úloze) v 1 cm 3 vody. Přidejte 2 cm 3 difenylaminového činidla a zahřívejte 10 minut na vroucí vodní lázni. Po ochlazení pozorujte u vzorku s DNP vznik modrého zbarvení. 26

27 1. Jak se liší složení DNA a RNA? 2. Vysvětlete vznik modrého zbarvení! Úloha 17: Hydrolytické štěpení nukleových kyselin a důkazy jejich složek Pipeta, vodní lázeň, filtrační aparatura, kádinky, zkumavky. 20% roztok H 2 SO 4, 10% roztok amoniaku, 5% roztok dusičnanu stříbrného, difenylaminové činidlo, molybdenová soluce. K izolovaným nukleovým kyselinám přidejte 10 cm 3 zředěné H 2 SO 4, vařte v baničce na vodní lázni po dobu 20 až 30 minut. Po hydrolýze obsah baničky ochlaďte, zfiltrujte a s malými podíly získaného filtrátu proveďte následující reakce: a) Důkaz purinových bází: Vzorek filtrátu (2-3 cm 3 ) ve zkumavce zalkalizujte roztokem NH 3 za kontroly lakmusovým papírkem, posléze přidávejte po kapkách roztok dusičnanu stříbrného. Vzniká řídká, bělavá sraženina solí adeninu a guaninu. b) Důkaz pentos: Důkaz ribosy: K 1 cm 3 filtrátu přidejte stejný objem koncentrované HCl, malé množství fluoroglucinu a zahřejte. Důkazem je vznik fialového zabarvení, které lze vytřepat do amylalkoholu. Důkaz deoxyribosy: K 1 cm 3 filtrátu se přidejte 2 cm 3 difenylaminového činidla. Zkumavku se směsí vložte na 10 minut do vroucí vodní lázně. Důkazem je vznikající modrozelené až modré zabarvení. d) Důkaz kyseliny fosforečné: K 1 cm 3 filtrátu přidejte molybdenovou soluci a krátce zkumavku se směsí povařte ve vodní lázni. Žluté zabarvení dokazuje přítomnost fosforečnanových iontů. 1. Vysvětlete, proč je třeba pro štěpení nukleových kyselin použít kyselé hydrolýzy. 2. Co je konečným produktem kyselé hydrolýzy nukleových kyselin? 3. Co je podstatou žluté sraženiny při důkazu fosforečnanových iontů? 27

28 AMINOKYSELINY A BÍLKOVINY Úloha 18: Izolace L-glutamové kyseliny NH 2.HCl NH 2 Pšenicný gluten HO 2 C CO 2 H PhNH 2, H 2 O HO2 C CO 2 H Kádinka (100 cm 3 ), varná baňka (50cm 3 ), větší mísa, pipeta, zpětný chladič, filtrační nálevka, gáza, filtrační papír, vodní lázeň. Polohrubá lepková mouka, koncentrovaná kyselina chlorovodíková, anilin, ethanol. A) Hydrochlorid L-glutamové kyseliny. 50 g polohrubé lepkové mouky smíchejte s minimálním množstvím vody a zadělejte těsto. Z těsta vytvarujte malé kuličky a ve velké míse s vodou jejich máčením odstraňte škrob. Ke zbylé lepkavé hmotě přidejte 150 cm 3 koncentrované kyseliny chlorovodíkové a směs zahřívejte ve varné baňce pod zpětným chladičem po dobu šesti hodin. Po vychlazení na laboratorní teplotu přidejte do baňky 10 g aktivního uhlí a směs zfiltrujte přes složenou gázu. Filtrační zbytek zachycený na gáze promyjte 8 cm 3 koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Vzniklý světle žlutý filtrát v destilační aparatuře zahusťte na objem 85 cm 3 a zbytek nechte stát přes noc v chladu při -8 C. Vzniklé krystaly zfiltrujte přes filtrační papír. Surový produkt žluté barvy rozpusťte v 10 cm 3 horké vody a odbarvěte 0,3 g aktivního uhlí. Do vzniklé směsi přidejte 10 cm 3 koncentrované kyseliny chlorovodíkové a nechte stát přes noc v ledničce. Tím získáte asi 5-6 g hydrochloridu L-glutamové kyseliny (b.t C). B) Glutamová kyselina: K roztoku připraveném rozpuštěním 3,7 g (0.02 mol) čistého hydrochloridu L-glutamové kyseliny v 20 cm 3 horké vody přidejte 1,9 g (0.02 mol) anilinu. Směs zahřívejte několik minut na vodní lázni, po vychlazení přidejte 20 cm 3 ethanolu a nechte stát přes noc v ledničce. Získanou krystalickou L- glutamovou kyselinu zfiltrujte a promyjte ethanolem do negativní reakce na chloridový anion. Poznámky: 1. Je nutno koncentrovat hydrolyzát, jinak nevzniknou žádné krystaly ani po dlouhodobém zchlazení hydrolyzátu. 2. Výtěžek bude ve velké míře závislý na kvalitě lepkové mouky. 3. Glutamovou kyselinu lze získat v prachové formě z japonského potravinářského výrobku "Ajinomoto", který obsahuje hlavně monosodíkovou sůl kyseliny glutamové. 28

29 Úloha 19: Separace aminokyselin chromatografií na tenké vrstvě Silufol, nůžky, chromatografická komora s víkem, tužka, kapilára, pinzeta, fén, infralampa, vzorky jednotlivých aminokyselin, 2% roztok ninhydrinu v ethanolu, vyvíjecí soustava (1-butanol : kyselina octová : voda) v poměru 4 : 1 : 1 a) Ustřihněte chromatografickou desku Silufol o rozměru 10x10 cm 2. Ve vzdálenosti 15 mm od jedné strany lehce označte tužkou start. b) Kapilárou naneste postupně na start standardní roztoky pěti aminokyselin a neznámý vzorek. Průměry skvrn po nanesení vzorků nesmí být větší než 2 mm. Vrstvu s naneseným vzorkem vysušte fénem. c) Do chromatografické komory nalijte vyvíjecí soustavu o takovém objemu, aby kapalina vytvořila sloupec 5-6 mm vysoký. Připravenou chromatografickou desku vložte pinzetou do komory a nádobu zakryjte. d) Jakmile rozpouštědlo dosáhne označeného čela, vyjměte chromatogram a v digestoři jej vysušte fénem. e) Suchý chromatogram rovnoměrně postříkejte roztokem ninhydrinu. Pozor, ninhydrin nesmí přijít do styku s pokožkou! a přidržujte pinzetou u infralampy, až dojde zahřatím k vyvolání chromatogramu. Jednotlivé barevné skvrny aminokyselin obtáhněte rychle tužkou, neboť při chladnutí postupně blednou. f) Získaný chromatogram zakreslete a nalepte do protokolu. Vypočítejte příslušné hodnoty R F pro jednotlivé aminokyseliny. Určete složení neznámého vzorku. 1. Jak se spočítá retenční faktor R F? 2. Co je podstatou reakce ninhydrinu s aminokyselinami? 3. Která aminokyselina se ninhydrinem barví žlutě? Proč? 4. Napište vzorce tripeptidů, jež obsahují Gly, Ala, Phe! 5. Vypočítejte retenční faktory pro standardy stanovovaných aminokyselin! Úloha 20: Titrace aminokyselin podle Sörensena Pipeta, byrety, odměrné válce, titrační baňky. Roztok hydroxidu sodného (0,1 mol.dm -3 ), roztok kyseliny sírové (0,05 mol.dm -3 ), neutrální roztok formaldehydu, roztok aminokyseliny, ethanol, alkoholický roztok fenolftaleinu. 29

30 a) K 20 ml roztoku aminokyseliny (0,1 mol.dm -3 ) přidejte 10 ml neutrálního formaldehydu a titrujte roztokem hydroxidu sodného do trvalého světle červeného zbarvení. Spotřebu louhu zaznamenejte. b) Příprava kontrolního roztoku: K 20 cm 3 převařené a ochlazené destilované vody přidejte 10 cm 3 neutrálního formaldehydu a poté polovina množství odměrného roztoku louhu spotřebovaného při titraci. Po kapkách pak přidávejte roztok kyseliny sírové, až je slabounce růžový. Následně přidejte tři kapky roztoku hydroxidu sodného, čímž přejde roztok do jasně červeného zabarvení, které slouží jako standard k dosažení správného tónu při titraci. Zbarvení roztoku titrované aminokyseliny se pak upraví titrací buď odměrným roztokem hydroxidu sodného nebo odměrným roztokem kyseliny sírové do dosažení stejného odstínu, jako má kontrolní pokus. Spotřeba při této titraci se pak připočítává (NaOH) nebo odečítá (H 2 SO 4 ) od spotřeby první titrace. Titraci proveďte třikrát! 1. Vypočtěte množství a procentuální podíl dusíku aminokyseliny ve vzorku! 2. Napište reakci mezi formaldehydem a aminovou skupinou aminokyseliny! 3. Co je principem formolové titrace dle Sörensena? Úloha 21: Stanovení izoelektrického bodu želatiny Princip metody: Vzhledem k obsahu kyselých a bazických skupin jsou bílkoviny amfolyty, jejichž iontová forma závisí na ph. Hodnota ph prostředí, v němž je celkový náboj nulový (amfolyt ve formě amfiontu), nazýváme isolektrický bod. U globulárních bílkovin se elektrochemicky uplatňují pouze funkční skupiny na povrchu globule, proto elektrochemické vlastnosti bílkovin závisejí na její konformaci a velmi silně se mění denaturací. V izoelektrickém bodě některé veličiny dosahují extrémních hodnot např. nejnižší rozpustnost ve vodě a nulová pohyblivost v elektrickém poli. Tuto skutečnost lze využívat k jeho stanovení. Omezení rozpustnosti lze dosáhnout také přidáním polárních s vodou neomezeně mísitelných organických rozpouštědel jako např. ethanolu. Zkumavky, pipety, 95% ethanol, kyselina octová, octan sodný, 5% roztok želatiny Připravte si šest zkumavek s obsahem podle následující tabulky: 30

31 Tabulka 3: Stanovení izoelektrického bodu roztoku želatiny Roztok Čísla zkumavek a množství látky v cm CH 3 COONa (0,1 mol. dm -3 ) CH 3 COOH (0,1 mol. dm -3 ) 0,25 0, CH 3 COOH (1 mol. dm -3 ) ,8 Destilovaná voda 3,75 3, ,2 10% roztok želatiny ph 5,6 5,3 5 4,7 4,4 4,1 Obsah zkumavek řádně promíchejte a za míchání přidejte do zkumavky č. 4 tolik 95% alkoholu až vznikne slabý zákal. Obvykle je k tomu třeba 7 cm 3. Stejné množství alkoholu přidejte do každé zkumavky a promíchejte. Po 30 minutách pozorujte množství sraženiny v jednotlivých zkumavkách a ph s maximálním zákalem udává izoelektrický bod. 1. Čím se vyznačuje izoelektrický bod bílkovin? 2. Napište schéma vystihující změnu amfiontu v kyselém a v zásaditém prostředí! 3. Jak se vypočítává izoelektrický bod aminokyselin? 4. Proč vzniká v izoelektrickém bodě nejintenzivnější sraženina? 5. Jaký účinek má 96 % ethanol? 6. Při jakém ph byl zjištěn izoelektrický bod želatiny? Úloha 22: Vlastnosti močoviny Močovina je produkt detoxikace amoniaku vzniklého odbouráním aminokyselin u placentárních savců. Je rozpustná ve vodě a její roztoky reagují neutrálně, pouze v silně kyselém prostředí se chová jako velmi slabá jednosytná báze. Hodinové sklíčko, lžička, váhy, pipeta, filtrační aparatura. Močovina, roztok dusitanu sodného (0,5 mol.dm -3 ), bromová voda, hydroxid sodný, 10% roztok hydroxidu barnatého, 5% roztok modré skalice, koncentrovaná kyselina dusičná. a) Soli močoviny: Na hodinové sklíčko se dá lžička močoviny a několika kapkami se připraví téměř nasycený roztok. Kapkou koncentrované kyseliny dusičné se vylučují krystaly dusičnanu močoviny. Pozorujte rozpustnost po přídavcích vody. 31

32 b) Hydrolytické štěpení: Roztok močoviny se vaří s 1 cm 3 10% roztoku hydroxidu barnatého. Sráží se BaCO 3 a v ústí zkumavky se dokáže unikající amoniak přiložením navlhčeného ph papírku. c) Oxidační štěpení močoviny: Roztok močoviny s přídavkem stejného množství NaNO 2 ve zkumavce se okyselí a zahřeje. Podobný průběh reakce lze pozorovat, zalkalizuje-li se roztok močoviny NaOH a přidá-li se několik kapek bromové vody. Reakci lze urychlit zahřátím. d) Vznik biuretu a jeho cheláty s Cu 2+ : V suché zkumavce se zahřívá močovina. Taje, při dalším zahřívání se uvolňuje amoniak a tavenina tuhne. Do zchladlé zkumavky se přidá asi 1 cm 3 vody, 1 cm 3 roztoku NaOH a po protřepání (případně zahřátí) se vzniklá suspenze zfiltruje. Přídavkem silně zředěného roztoku síranu měďnatého k filtrátu, vzniká fialové zabarvení chelátového komplexu. 1. Uveďte rovnice všech probíhajících reakcí! 2. Jaký objem dusíku se uvolní oxidačním štěpením 1 mmol močoviny za normálních podmínek? 32

33 JINÉ PŘÍRODNÍ A BIOAKTIVNÍ LÁTKY Úloha 23: Izolace alkaloidu z kávy a čaje Třecí miska s tloučkem, dvě podložní mikroskopická sklíčka, stojan s kruhem, mikrokahan, mikroskop, střička, filtrační papír. Zrnko kávy nebo čaj (0,5 g) Sestavte aparaturu podle obrázku: a) ovlhčený filtrační papír b) mikroskopická sklíčka c) rozetřený čaj nebo káva d) skleněná tyčinka e) mikrokahan Na spodní sklíčko umístěte 0,5 g jemně rozetřené kávy nebo rozetřeného čaje. Látku na skle pozvolna zahřívejte mikrokahanem tak, aby neuhelnatěla. Pokus ukončete v momentě, kdy je na horním skle patrný výskyt krystalků vysublimované látky. Krystalky pozorujte pod mikroskopem a nakreslete jejich tvar. Pokud máte mikroskop vybavený polarizačním filtrem, pozorujte je v polarizovaném světle. Krystaly na podložním skle rozdělte na dvě části. K první části přidejte asi dvě až tři kapky studené vody a k druhé části přidejte asi dvě až tři kapky vody zahřáté k varu. Pozorujte rozdíl v rozpustnosti krystalů alkaloidu v závislosti na teplotě rozpouštědla. 1. Do které skupiny přírodních látek patří alkaloidy? 2. Napište konstituční vzorce a) purin, b) xanthin (2,6-dihydroxypurin), c) kofein (1,3,7- trimethylxanthin), d) theofylin (1,3- dimethylxanthin)! 3. Jaké účinky na lidský organismus má kofein a theofylin? 4. Nakreslete tvar krystalů alkaloidů pozorovaných pod mikroskopem! 5. Uveďte, zda je rozdílná rozpustnost alkaloidů v horké vodě či studené vodě! Úloha 24: Titrační stanovení kyseliny acetylsalicylové Analytické váhy, váženka, lžička, titrační aparatura, dvě baňky, vzdušný zpětný chladič, pipeta nedělená (30 cm 3 ), odměrný válec, topné hnízdo. 33