Laboratorní diagnostika Hereditární sférocytózy

Transkript

1 Laboratorní diagnostika Hereditární sférocytózy Špačková I. 1, Kneiflová M. 2, Pospíšilová J. 3, Sítková R. 3 1 Laboratoř klinické imunologie a alergologie 2 Laboratoř klinické hematologie 3 Laboratoř molekulární biologie

2 Hereditární sférocytóza (HS) Neonkologické onemocnění Klinická závažnost autozomálně dominantního, vzácněji recesivního onemocnění může probíhat od bezpříznakových stavů až po výskyt těžké hemolýzy mutace některých z genů kódující tvorbu strukturálních proteinů membrány erytrocytů dochází k selektivnímu vychytávání krvinek ve slezině a k jejich urychlené destrukci Bolton-Maggs P.H.B., et al: Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis, British Journal of Haematology,2004; 126,

3 Hereditární sférocytóza - historie První popis sférocytů mikrocytů, spojených se splenomegalií a ikterem r stol. Oskar Minkowski popis výskytu hemolytické anémie u více členů rodiny 20. stol. Anatol Chauffard prokázal charakteristický znak této choroby sníženou osmotickou rezistenci a zvýšený počet retikulocytů

4 Patofyziologie HS Mutace spektrinu / ankyrinu nebo band3 Narušení vertikálních interakcí (spektrin-ankyrin-band3) Opakovaná ztráta erytrocytární membrány ve formě mikrovezikul Vzniká malý denzní sférocyt (mikrosférocyt) MCHC deformabilita sférocytu destrukce sférocytů ve slezině osmotická fragilita = osmotická rezistence Chronická extravaskulární hemolytická anémie Klener P.: Hematologie, Anémie III, Polycytémie; Ústav Patol. Fyziologie 1.LF UK v Praze

5 Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377; November 2, 2017

6 Patofyziologie HS Průměrná doba, kterou stráví normální diskocyt ve slezině je cca s. Sférocyt stráví ve slezině min, a pokud není ve slezině zlikvidován, může být dále narušena jeho deformabilita (= splenic conditioning). Další roli v patofyziologii HS hraje patrně zvýšený únik draslíku extracelulárně, čímž dochází k dehydrataci sférocytu. dehydratace snižuje deformabilitu mikrosférocytu Klener P.: Hematologie, Anémie III, Polycytémie; Ústav Patol. Fyziologie 1.LF UK v Praze

7 Patofyziologie HS Splenic conditioning se projeví v testu osmotické fragility jako tzv. ocas hemolýzy (= tailed curve). Ocas hemolýzy mizí po splenektomii. (1) Test osmotické fragility erytrocytů (2) Typical - křivka zvýšené osmotické fragility, nejčastějčím nálezem. Tailed - křivka poukazuje na přítomnost velmi křehkých erytrocytů. Diagonální křivka je pozorována u pacientů s těžkým HS. 1. Klener P.: Hematologie, Anémie III, Polycytémie; Ústav Patol. Fyziologie 1.LF UK v Praze 2. Modified from Dacie J: Hereditary spherocytosis (HS). In The Haemolytic Anaemias, 3rd ed, vol 1. Edinburgh, Churchill Livingstone, 1985, p 134.)

8 Diagnostika a klinické příznaky HS Nejčastěji v dětství nebo pubertě prakticky ale v každém věku Anémie, ikterus, splenomegalie! Znalost zdravotního stavu rodiny! Klasifikace Lehká Mírná Střední Těžká Hemoglobin (g/dl) Normal Počet retikulocytů (%) Normal (<3%) 3-6 >6 >10 Bilirubin (μmol/l) < >34 >51 Spectrin v Ery (% z normálních) Splenektomie Není povinná Není nezbytná během dětství a adolescence Nezbytná - školní věk před pubertou Nezbytná optimálně do dosažení 6let věku Bolton-Maggs P.H.B., et al: Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis, British Journal of Haematology,2004; 126,

9 Diagnostické parametry HS Parametry Klinické vlastnosti Laboratorní vyšetření erytrocytů Hodnocení krevního nátěru Přímý antiglobulinový test Přítomnost hemolýzy Vlastnosti Splenomegalie téměř vždy Hb, MCV, MCHC, % hyperdenzní buňky, RDW, počet retikulocytů Abnormální morfologie - sférocyty negativní Zvýšený bilirubin, retikulocytóza Vzestup měřených parametrů Ery v predikci HS a její závažnosti: Parametry Závažnost u HS Kombinace MCHC a RDW (nebo HDW) Významně zvýšený u HS Kombinace % hyperdenzních buněk a RDW Významný diagnostický ukazatel těžké HS % mikrocytů Nejlepší indikátor závažnosti HS Kombinace MCHC a % hyperdenzních buněk Rozlišující znak fenotypu pro HS Bolton-Maggs P.H.B., et al: Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis, British Journal of Haematology,2004; 126,

10 Využití průtokové cytometrie Disponuje vysokou senzitivitou a specifitou Patří mezi doporučená screeningová vyšetření k testování vad erytrocytárních membrán využívá kyselinu eosin-5-maleimid (EMA) kovalentně se váže s Lys-430 proteinu band 3 Bolton-Maggs P.H.B., et al: Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis, British Journal of Haematology,2004; 126, obr.:

11 Detekce pomocí průtokové cytometrie u přítomnosti defektu membrány dochází ke snížení fluorescence signálu na kanálu FL1 (525 nm), oproti normální (kontrolní) skupině pacientů King M-J., et.al: Rapid flow cytometric test for the diagnosis of membrane cytoskeleton-associated haemolytic anaemia, British Journal of Haematology, 2000; 111,

12 Molekulární genetika HS Protein Mr (kd) Gen Lokalizace na chromozomu α Spektrin 240 SPTA1 1q22-q23 52 β Spektrin 220 SPTB 14q23-q Ankyrin 210 ANK1 8p Band 3 (AE1) AE1 (SLC4A1) 17q21-q22 20 Protein EPB41 1p36.2-p34 22 Protein EPB42 15q15-q21 13 Glycophorin C 32 GYPC 2q14-q21 4 Počet exonů Bolton-Maggs P.H.B., et al: Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis, British Journal of Haematology,2004; 126,

13 Defekty membránových proteinů Nedostatek proteinu (SDS-PAGE) Částečně spektrin a protein 4.2 Částečně ankyrin a spektrin Částečný nedostatek spectrinu výrazný nedostatek spectrinu (rodiče jsou normální) Částečný nedostatek band 3 Částečný nedostatek proteinu 4.2 Primární defekt v proteinu nebo genu Chybí jeden haploidní set k ANK1 Genová mutace ankyrinu Různé molekulární defekty Těžká ndhs způsobená nízkou expresí alely zděděné trans na druhou Sp alelu Band 3 mrna nestabilita Band 3 genetická mutace vedoucí ke ztrátě vazebného místa pro protein 4.2 znalost genové mutace neovlivňuje klinickou léčbu pacienta Bolton-Maggs P.H.B., et al: Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis, British Journal of Haematology,2004; 126,

14 Analýza mutantních genů Identifikace defektu primárních genů; rodinné studie poskytují informace o tom, zda je abnormální protein v probandu kódován mutantním kandidátským genem nebo v důsledku sekundární události způsobené mutací v jiném genovém proteinu Potvrzení recesivní nebo non-dominantní dědičnosti, v případě obou zdravých rodičů Bolton-Maggs P.H.B., et al: Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis, British Journal of Haematology,2004; 126,

15 Přidružené komplikace 1. Bilirubinové žlučníkové kameny (až u 50% pacientů) 2. Hemolytická krize (relativně vzácně, zejm. v souvislosti s infekcemi - zhoršení anémie v průběhu infekce) 3. Megaloblastová krize 4. Aplastická krize 5. Infekční komplikace po splenektomii 6. Dna 7. Ulcerace dolních končetin z poruch mikrocirkulace Klener P.: Hematologie, Anémie III, Polycytémie; Ústav Patol. Fyziologie 1.LF UK v Praze

16 Terapie Metodou volby je splenektomie Klener P.: Hematologie, Anémie III, Polycytémie; Ústav Patol. Fyziologie 1.LF UK v Praze Obr.:

17 Kazuistika žena, 29 let Periferní krev genetické vyšetření se souhlasem Metoda: NGS, Sanger sekvenování Referenční sekvence: ANK1(NM_ ), EPB42 (NM_ ), SPTA1 (NM_ ), SPTB (NM_ ) Výsledek: v genu ANK1 nalezena patogenní varianta v heterozygotním stavu c _2562del. Obr.:

18 Kazuistika žena, 29 let Hematologické laboratorní výsledky: Hb: 124 g/l ( g/l) MCV: 84,6 fl (82-98 fl) MCHC: 338 g/l ( g/l) RDW-SD: 42,4 fl RDW-CV: 13,8% (10-15,2%)

19 Nátěr PK Nátěr PK s imerzí

20 Výsledky z FC žena, 29let Snížení fluorescence signálu po vazbě s EMA na membránu erytrocytů Průkaz hereditární sférocytózy kontrola pacient

21 Dědičnost HS Syn probandky r. nar Periferní krev genetické vyšetření se souhlasem Metoda: NGS, Sanger sekvenování Referenční sekvence: NM_ , NM_ ; hg38 Výsledek: v genu ANK1 nalezena patogenní varianta v heterozygotním stavu c _2562del.

22 Syn probandky Hematologické laboratorní výsledky: Hb: 95 g/l ( g/l) MCV: 78,6 fl (70-86 fl) MCHC: 341 g/l ( g/l) RDW-SD: 56,6 fl RDW-CV: 20,1% (11,5-14,5%)

23 Nátěr PK Nátěr PK s imerzí

24 Výsledky z FC syn probandky Snížení fluorescence signálu po vazbě s EMA na membránu erytrocytů Průkaz hereditární sférocytózy kontrola pacient

25 Dědičnost HS Matka probandky r. nar Ve 14 letech podstoupila splenektomii sledování hematologem poté není uvedeno Od r sledována po Ca prsu

26 Dědičnost HS Periferní krev genetické vyšetření se souhlasem Metoda: NGS, Sanger sekvenování Referenční sekvence: NM_ , NM_ ; hg38 Výsledek: v genu ANK1 nalezena patogenní varianta v heterozygotním stavu c _2562del.

27 Matka probandky Hematologické laboratorní výsledky: Hb: 160 g/l ( g/l) MCV: 88,2 fl (82-98 fl) MCHC: 346 g/l ( g/l) RDW-SD: 43,7 fl RDW-CV: 13,6% (10-15,2%)

28 Nátěr PK Nátěr PK s imerzí

29 Výsledky z FC matka probandky Snížení fluorescence signálu po vazbě s EMA na membránu erytrocytů Průkaz hereditární sférocytózy kontrola pacient

30 Kazuistika II. hledání správné diagnózy Muž, 28 let Pohotovost: bolest břicha, nevolnost, zvracení bolest břicha až 6 týdnů, zhoršení po požití potravy, kdy následoval nekrvavý průjem a zvracení zmírnění bolesti jen po požití antacid bez zvýšené teploty, bez zimnice Nekuřák, alkohol jen příležitostně Obezita I. stupně: BMI 33 Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377; November 2, 2017

31 Kazuistika II. - pohotovost Vyšetření - příjem: TK 145/90 mm Hg; TT 37,1 C; přítomen sklerální ikterus; citlivost v pravém dolním kvadrantu břicha; plicní vyšetření normální počet bílých krvinek bb/μl krve (86% Neu, 5% Lymfo, 8% Mono) Hb 16 g/dl (13,6-17,7 g/dl); bilirubin 115 μmol/l (3-19 μmol/l); ALT 185 U/l (<54); AST 157 U/l (10-42); ALP 101 U/l (40-130) Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377; November 2,

32 Kazuistika II. - pohotovost CT břicha: normální játra s mírnou steatózou a splenomegalií; žádné žlučové kameny nebo průkaz cholecystitidy o 2 roky dříve dostal dg. Gilbertův syndrom, když jeho lékař u něj zaznamenal nepřímou hyperbilirubinémii Hospitalizace v nemocnici Léčba: meropenem Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377; November 2, 2017

33 Kazuistika II. hospitalizace Vyšetření 2.den: abdominální bolest ustoupila Snížení počtu bílých krvinek: bb/μl Zvýšení biochemických testů: bilirubin 334 μmol/l; ALT 519 U/l; AST 188 U/l; ALP 171 U/l anti-hbs: pozitivní; HBsAg: negativní anti-hav IgM: negativní anti-hcv: negativní ANA, AMA: negativní Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377; November 2, 2017

34 A: USG břicha - žlučník naplněný kalem se zhuštěním stěny a pericholecystickou tekutinou Nález odpovídá akutní choledocholitiáze. B: MR břicha nález potvrdila. - infiltrace jater a splenomegalie Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377; November 2, 2017

35 Kazuistika II. propuštění & co dál? Vyšetření 3.den: afebrilní Bilirubin 97 μmol/l; ALT 292 U/l; AST 89 U/l; ALP 174 U/l; ALP 174 U/l Vysazen meropenem Propuštění z nemocnice (naplánovaná operace) 4. den: schůzka na klinice všeobecného lékařství Lékař: prošel výsledky testů provedeny před 2-ma roky Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377; November 2, 2017

36 Kazuistika II. výsledky testů před 2 roky Bilirubin 32 μmol/l; LD 320 U/l ( ) ALT & AST & ALP v normě Hb 15,0 g/dl MCV 83,6 fl MCHC 37g/dl RDW-CV 15,7 % UZ vyšetření: hepatomegalie, splenomegalie, žádné žlučové kameny Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377; November 2, 2017

37 Kazuistika II. výsledky po propuštění Zvýšený počet retikulocytů bb/μl Periferní nátěr: v bb. přítomnost Pappenheimerova tělíska, ale žádné akantocyty, schistocyty nebo sférocyty Info od matky: pacientův otec ve 27 letech podstoupil cholecystektomii pro žlučové kameny Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377; November 2, 2017

38 Kazuistika II. - operace O 4 týdny později laparoskopická cholecystektomie (více pigmentových žlučových kamenů) Perioperační krevní nátěr malá přítomnost sférocytů Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377; November 2, 2017

39 Kazuistika II. - diagnóza Měsíc po cholecystektomii návštěva u hematologa Laboratorní hodnoty: normalizace ALT, AST, bilirubinu Test osmotické fragility: zvýšená křehkost erytrocytů Přímý antiglobulinový test nebyl proveden Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377; November 2, 2017

40 Kazuistika II. - diagnóza Stanovení průtokovou cytometrií pomocí eosin- 5-maleimid: průkaz snížené fluorescence Potvrzení diagnózy dědičné sférocytózy Periferní nátěr získán o 7 měsíců později vykazoval více sférocytů. Rencic J. et.al: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377; November 2, 2017

41 Kazuistika III. známá dg., ale Dívka 6 let sledována pro dědičnou sférocytózu Matka i dědeček se stejným postižením, oba po splenektomii Klinické projevy dosud minimální Nutná návštěva lékaře pro bolesti břicha (objevily se předešlý den), mírné bolesti hlavy a zvracení teplota v normě, močí bez potíží, stolice normální konzistence vyloučení dietní chyby obj.: bledší, unavená, kardiopulmonárně norm., břicho klidné Virový primoinfekt? Trubačík J.: Bolesti břicha aneb všichni to věděli, všichni to viděli, Pediatr. pro Praxi, 2006; 1: 54-55

42 Kazuistika III. různorodá symptomatologie Potíže přetrvávaly s rodiči další den příchod do nemocnice Pediatrická amb.: unavená, apatická, dehydrovaná, subikterus, hrdlo klidné, kardiopulm. norm., břicho měkké, prohmatné doporučeno chirurgické vyšetření Chirurgická amb.: nezvrací, břicho měkké, nebolestivé, bez rezistence či peritoneálního dráždění, bledá, dehydrovaná jako NPB se t.č. nejeví, kontrolní vyšetření odpo téhož dne Trubačík J.: Bolesti břicha aneb všichni to věděli, všichni to viděli, Pediatr. pro Praxi, 2006; 1: 54-55

43 Kazuistika III. hospitalizace Chirurg. amb.: pobledlá, nažloutlý kolorit?, skléry bílé, jazyk povleklý, břicho měkké, lehce dif. citlivé, bez perif. dráždění res.: sledována pro sférocytózu, susp. viróza doporučení: hospitalizace, infuzní terapie, krevní odběry JIP: obj. výrazně bledá, subikterus sklér i kůže, axilární teplota 37,1 C, TK 85/50, počet pulzů 120/min., počet dechů 22/min., zřejmý systolický šelest 2/6 v celém perikordu Trubačík J.: Bolesti břicha aneb všichni to věděli, všichni to viděli, Pediatr. pro Praxi, 2006; 1: 54-55

44 Kazuistika III. vyšetření KO JIP: břicho měkké s mírnou palpační citlivostí, játra nezvětšena, slezina +2cm KO: Hb 44 g/l; RBC 1,55*10 12 /l; WBC 4,3*10 9 /l; MCV 73,2 fl; MCHC 38,9 g/dl bilirubin 50,7 μmol/l; ALT 0,30 μkat/l; AST 0,38 μkat/l; GGT 0,14 μkat/l; ALP 3,24 μkat/l; CRP 1,5 mg/l; Na 138 mmol/l; K 4,47 mmo/l; Cl mmo/l dodatečně nalezena PV infekce (často, jako vyvolavatel potíží) Trubačík J.: Bolesti břicha aneb všichni to věděli, všichni to viděli, Pediatr. pro Praxi, 2006; 1: 54-55

45 Kazuistika III. diagnóza: HS Transfuze erytrocytového koncentrátu Optimalizace parametrů červené krevní řady Uspokojivá kontrola krevního obrazu MUDr. Jan Trubačík: Případ spadá do skupiny příhod, kdy se účastníci nechali svést na falešnou stopu, protože byli limitováni úzkým úhlem pohledu. Z anamnézy bylo všem známo, že pacientka byla sledována kvůli dědičné sférocytóze, každý si všiml některého ze základních symptomů, ale ani jeden nedokázal příhodu správně vyhodnotit. Trubačík J.: Bolesti břicha aneb všichni to věděli, všichni to viděli, Pediatr. pro Praxi, 2006; 1: 54-55

46 DĚKUJI ZA POZORNOST

47 Reference Bolton-Maggs P.H.B., Stevens R.F., Dodd N.J., Lamont G., Tittensor P., King M.-J.: Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis, British Journal of Haematology, 2004; 126, Klener P.: Hematologie, Anémie III, Polycytémie; Ústav Patol. Fyziologie 1.LF UK v Praze Modified from Dacie J: Hereditary spherocytosis (HS). In The Haemolytic Anaemias, 3rd ed, vol 1. Edinburgh, Churchill Livingstone, 1985, p 134.) Rencic J., Zhou M., Hsu G., Dhaliwal G.: Circling Back for the Diagnosis, N ENGL J MED 377; November 2, s_low_hemoglobin_mean Trubačík J.: Bolesti břicha aneb všichni to věděli, všichni to viděli, Pediatr. pro Praxi, 2006; 1: 54-55