IZOLACE BIOMAKROMOLEKUL

Transkript

1 IZOLACE BIOMAKROMOLEKUL Rozsah: 3/1 Zk/Z Vyučující: Ing. Petra Lipovová, PhD. Předmět navazuje na: Biochemie, Enzymologie Doporučená literatura: Dr. Ing. K. Bílková, Prof. Ing. B. Králová, Csc.: Izolace biomakromolekul, Vydavatelství VŠCHT, Obsah předmětu: Úvod - zdroje enzymů, dezintegrace, membránové procesy (prednaska1.pdf 1.21MB) Srážení, extrakce a centrifugace (prednaska2.pdf 742 KB) Základní rozdělení a instrumentace (prednaska3.pdf 793 KB) Gelová permeační chromatografie (prednaska4.pdf 978 KB) Ionexová chromatografie (prednaska5.pdf 1,51 MB) Hydrofobní chromatografie a chromatografie na reversní fázi (prednaska6.pdf 670 KB) Afinitní chromatogrefie (prednaska7.pdf 1,21MB) Tenkovrstvá chromatografie, sledování průběhu chromatografie a stanovení koncentrace bílkovin (prednaska8.pdf 228 KB) Úvod do elektroforetických metod (prednaska9_10.pdf 3,07MB) Typy elektroforetických metod (prednaska9_10.pdf 3,07MB) PCR metody, biočipy, imobilizace enzymu a buněk

2 Úvod zdroje enzymů, dezintegrace, membránové procesy

3 Základní izolační kroky 1. výběr vhodného producenta 2. homogenizace a separace buněk 3. dezintegrace buněk 4. odstranění buněčných zbytků + koncentrování 5. purifikace

4 Zdroje enzymů Mikroorganismy, živočišné tkáně, rostlinná pletiva, tělní tekutiny Selekce optimálních producentů maximální produkce enzymu optimální vlastnosti enzymu snadné získání producenta snadnost purifikačního postupu...

5 Výhody: Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy lze je snadno získat v dostatečném množství (kultivace ve fermentoru...) selekce mutantů s požadovanými vlastnostmi genetické inženýrství thermofilní organismy (produkce enzymů s vyšší teplotní stabilitou) psychrofilní organismy

6 Živočišné zdroje Laboratorní zvířata myši, krysy, králíci Jateční zvířata orgány, krev Člověk tělní tekutiny (krev plasmin, thrombin ; moč urokinasa...) Bezobratlí - hmyz, plži, mlži málo se využívají Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách, Arabidopsis thaliana, tabák Nevýhoda: problematický růst za definovaných podmínek

7 Kde získat informace o možných zdrojích? ATCC (American Type Culture Collection) CCM (Czech Collection of Microorganisms) FDA (Food and Drug Administration) (2001), Partial list of microorganisms and microbial-derived ingredients that are used in foods. AMFEP (The Association of Manufacturers and Formulators of Enzyme Products)

8 ATCC (American Type Culture Collection) dotaz: Listeria monocytogenes 63 kmenů Bacteria ATCC Number: Organism: Designations: Depositor: Biosafety Level: Growth Conditions: Permits/Forms: BAA-679 Listeriamonocytogenes (Murray et al.) Pirie EGDe C Buchrieser 2 ATCC medium 44: Brain heart infusion agar or brain heart infusion Alternate medium 260: Trypticase soy agar with defibrinated sheep blood Growth conditions: aerobic Temperature: 37.0C Price: Isolation: Shipped: ; tissue, animal (rabbit, Cambridge, England) 1924 United Kingdom freeze-dried In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the permits. Please click here for information regarding the specific requirements for shipment to your location.

9 CCM (Česká sbírka mikroorganismů ) dotaz: Listeria monocytogenes 3 kmeny CCM 4699 = ATCC = CAPM 5883 = CCUG = CIP = NCTC = SLCC 2377 = J. Donker-Voet 21 = H.P.R. Seeliger Li 2108 < CCUG < CIP < H.P.R. Seeliger < J. Donker-Voet < A. Nyfeldt < Junghern. Serovar 4d. Sheep. Media testing. Biohazard group 2.. Medium 2, 37 C. CCM 5576 = ATCC = ATCC = CCTM La 2280 = CIP = CIP = CNCTC Li 14/57 = NCAIM B = NCTC 7973 = SLCC 2371 = H.P.R. Seeliger Li 20 = S. Paterson LS/2 = strain 58 XXIII < H.P.R. Seeliger < J. S. Paterson. Serovar 1/2a. Guinea pig mesenteric lymph node. Contains two phenotypes: hemolytic, virulent colonies and nonvirulent, nonhemolytic colonies on brain heart infusion agar with 5% rabbit blood (5641). Biohazard group 2.. Medium 2 or 31, 37 C. CCM 7202 = ATCC = CIP = LMG = NCTC = SLCC 1071/53 < CIP < H. Seeliger. Serovar 4b. Spinal fluid, child, meningitis; Germany. Biohazard group 2.. Medium 2 or 31, 37 C.

10 Plant Seed ATCC Number: Organism: Designations: Depositors: Biosafety Level: Permits/Forms: Arabidopsis thaliana Heinhold S8-1-2A D Dennis, Y Poirier, CR Somerville 1 Price: Shipped: ; dried, package of 25 seeds each order In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the permits. Please click here for information regarding the specific requirements for shipment to your location

11 Optimalizace kultivace Teplota Složení media Aktivátor Aerace

12 Optimalizace kultivace

13 Homogenizace a solubilizace materiálu Mechanicky: mletí (kulový mlýnek, masový strojek), mixování (výkonný mixer), krájení, třecí miska s pískem Separace buněk odstřeďování (6000 g, 10 min, 4 C) filtrace

14 Distribuce enzymů Intracelulární V periplasmatickém prostoru Extracelulární extracelulární cytoplasma periplasma BUŇKA

15 Membránově vázané bílkoviny Membránové bílkoviny interagující integrální elektrostaticky hydrofobně zanořené transmembránové

16 Dezintegrace buněk Způsoby fyzikální chemické enzymové

17 Rostlinné a živočišné buňky Rostlinné buňky rostlinné buňky mohou být větší rostlinné buňky mají silnější a robusnější buněčnou stěnu tvořenou hlavně celulosou rostlinné buňky se obtížně rozbíjejí kultivované rostlinné buňky jsou méně robustní než buňky isolované z živých rostlin

18 Živočišné buňky nemají buněčnou stěnu jsou velmi křehké kultivované živočišné buňky jsou velké několik mikronů sférické nebo elipsoidní

19 Bakterie Mikroorganismy G - G +

20 Kvasinky

21 Fyzikální způsoby dezintegrace Třecí miska + balotina, křemenný písek... Střídavé zmrazování a rozmrazování X-press (protlačování zmražené suspenze malým otvorem pod velkým tlakem) zarážky píst štěrbina X-press

22 Douncerův homogenizátor Mini-BeatBeater pomocí balotin různé rozměry

23 French press - protlačování tekuté suspenze malým otvorem pod velkým tlakem (136 MPa) Ultrazvuk - intezita - nad 50 W/cm 2 kavitace G - bakterie k3

24 Snímek 23 k3 UZ - působením uz vln na kapaliny vzniká jev KAVITACE. V kapalině se tvoří oblasti stlačení a zředění. V místech zředění vznikají dutiny určitých velikostí, které v oblasti stlačení opět zaniknou. Zánik dutin je pak doprovázen tlakovou vlno, která se považuje za destrukční prvek využívaný u této metody. Kavitace je množina jevů spojená se vznikem, výskytem a působením dutin ( bublin ) v kapalině. Jestliže má ultrazvukové vlnění dostetečnou intezitu - nad 50 W/cm2 dochází ke vzniku kavitace, to jest ke vzniku a zániku množství malých bublinek v kapalině s frekvencí ultrazvukového vlnění. Tvorba a zánik těchto bublinek, způsobené rázy ultrazvukových vln jsou vlastní příčinou dějů v mnohých známých procesech jako je např. čištění povchů, dispergace, eroze povrchů a pod. V nejbližším okolí těchto bublinek dochází k pozoruhodnému uvolnění energie, lokální růst teploty spojený s tímto dejem se odhaduje až na 3000 C a tlaky v oblastech stovek MPa v nanosekundových časových úsecích. Kavitace je vlastně studeným varem v kapalině. Průvodním dějem akustických kavitačních dějů je sonoluminiscence. V důsledku kavitace dochází také ke kavitačnímu narušení konců vlnovodů a tím k jejich opotřebení a k postupnému snižování přeneseného výkonu. Dále je pro srovnání uvedeno kavitační narušení konce sonifikátoru z duralu a titanu a snímek tohoto narušení z elektronového scanovacího mikroskopu karasovp;

25 Chemické způsoby dezintegrace acetonová sušina -homogenizace buněk ve vychlazeném acetonu osmotická lyse (erythrocyty)-suspenze v hypotonickém prostředí osmotický šok 20 % sacharosa, glycerol změna tlaku plynu přídavek org. rozpouštědla - toluen, diethyleter, chloroform - (toluen extrahuje při o C fosfolipidy buněčné stěny osmotický šok + enzymová autolýza způsobí uvolnění buněčného obsahu) Wikipedia

26 přídavek kyseliny či zásady přídavkem detergentů anionické iono genní n e i o n o g e n n í Y-PER Reagent significantly disrupts yeast cell wall and plasma membrane. Cells of Saccharomyces cerevisiae stain DY150 after lysis with Y-PER Yeast Protein Extraction Reagent. Arrows indicate disruption of cell wall, resulting in cell lysis. k at CMC kritická micelární koncentrace C koncentrace detergentu

27 Detergent CMC MMW koncentrace odstranění aplikace mm Da ANIOGENNÍ SDS(dodecylsulfát sodný) 8,3 288,4 > 10 mg/mg prot. denaturace proteinů, použití pro DNA, PAGE DOC(deoxycholát sodný) ,6 0,1-10 mg membr. lipidů solubilizace membránových proteinů N-lauroylsarkosin ,1-1,5 % solubilizace membr. prot., příprava antigenů KATIOGENNÍ CTAB (hexadecyltrimethyl amonium bromide) ,1 1 %??? rozpouští membrány, tvoří komplex s DNA, odstranění polysacharidů NEIONOGENNÍ Triton X-100 [octylphenolpoly(ethylenglyco lether) n ] 0,2 647 n= mm solubilizace proteinů Tween 20 [poly(oxyethylene) n sorbitanmonolaurate] 0,06 > 10 mg/mg membr. lipid; imunobloty, ELISA AMFOTERNÍ CHAPS (3-[(3- cholamidopropyl)dimethylam monio]-1-propanesulfonate) 4 614,9 6,5-13 mm solubilizace membránových proteinů

28 Extrakce membránových proteinů sonikace chelátová činidla alkalické podmínky (ph 8 11) plus nízká iontová síla neionogenní detergenty (Triton X-114) částečně vodoumísitelná organická rozpouštědla (n-butanol) vysoká iontová síla (1M NaCl) fosfolipasy

29 Odstranění detergentů vliv: fyzikální vlastnosti detergentu charakter proteinu (hydrofobní/hydrofilní) složení pufru ionogenní močovina, ionex gelová chromatografie Sephadex G-25 naředění vzorku dialýza neionogenní gelová chromatografie Sephadex G-200 afinitní chromatografie

30 Bakterie Enzymové způsoby dezintegrace Lysozym nejčastěji z vaječných bílků, T4 fága hydrolysa 1,4-β-glykosidické vazby mezi NAG a NAM u G - v kombinaci s chelatačnímčinidlem např. EDTA nebo polykationty, Tris ph 6,7-8,6 (4-10) Kvasinky zymolyasa, lytikasa β-1,3-glukanasová aktivita

31 Inhibitory proteas

32 Solubilizace proteinových agregátů 1. lyse buněk 2. isolace inkluzních tělísek 3. solubilizace proteinů z inkluzí (Guanidin-HCl 5-8 M, močovina 6-8 M) 4. renaturace proteinu dialysa

33 Stabilizace proteinů soli stabilizují proteiny v roztoku Hofmeisterova řada (CH 3 ) 4 N + > NH 4+ > K + > Na + > Mg 2+ > Ca 2+ > Ba 2+ SO 4 2- > Cl - > Br - > NO 3- > ClO 4- > SCN - proteiny např.bsa redukční činidla β-merkaptoethanol (5-20 mm), DTT (0,5-1 mm) osmolyty polyalkoholy, mono- a polysacharidy, neutrální polymery % aminokyseliny nenabité (Gly, Ala) mm polymery (PEG) 1-15 % zvyšuje viskozitu a tak zabraňuje agregaci

34 Membránové procesy - filtrace rozdělení molekul z roztoku na základě jejich velikosti, definovaná velikost pórů = cut off (µm, Da), gravitace, inertní plyn retentát permeát mikroporesní anizotropní

35 Produkt polyvinylidenfluorid PVDF polyethersulfon PES estery cellulosy MCE polykarbonáty nylon a síťovina skleněná a křemenná vlákna teflon použití nízká vazba proteinů rychlý průtok a nízká vazba proteinů filtrace pufrů a částic hladký povrch široká chemická kompatibilita, rozsahu 3-10 ph hrubá filtrace, roztoky s vysokým počtem částic hydrofobní,org.rozpouštědla, chemicky agresivní roztoky PVDF 0,1-5 µm estery cellulosy skleněná a křemenná vlákna 0,025-8 µm 0,7 3 µm nylon 0, µm

36 charakteristika membrán dělící rozsah NMWL, MWCO, NCO průtočnost membrány rozsah povolených pracovních teplot, tlaků a ph odolnost membrán životnost Membrane: Durapore Membrane Filters - PVDF (Polyvinylidene fluoride) Features: Low Protein Binding Specifications: Pore sizes: Color: Surface: Wettability: Thickness: Sterilization: Operating temperature: Gravimetric extractables: Protein binding capacity: 0.1, 0.22, 0.45, 0.65, 5 µm White Plain Hydrophilic, hydrophobic 125 µm by autoclave (121 C at 1 bar), EO or gamma 85 C max. <0.5% 4 µg/cm²

37 nízký tlak Mikrofiltrace separace koloidních a nerozpustných částic 0,05-10 µm

38

39 Ultrafiltrace tlak > 10 bar (145 psi, 1 MPa) frakcionace proteinů N 2 pojistný ventil míchadlo membrána retentát permeát

40 Nanofiltrace prochází monovalentní ionty a voda nižší tlak než u reversní osmózy Použití odsolování potravin odsolování syrovátky zakoncentrovávání

41 Reverzní osmóza

42 Mikrofiltrace Ultrafiltrace Nanofiltrace Reverzní osmóza

43

44 zygota - Cryptosporidium

45 Jaký osmotický tlak vykazuje jednomolární roztok sacharosy při 25 C? (R=8,314 J K -1 mol -1 ) π = RT c i π = crt= 1. 8, ,15 = 2478,8??? kpa J / dm 3 = N.m /dm 3 = 10 3 N/m 2 = Pa

46 * Roztok obsahující 0,5 g ribonukleasy v 0,1 dm 3 0,2 M NaCl má při 298 K osmotický tlak 0,0097 atmosfér. Membrána je propustná pro všechny částice kromě bílkoviny; osmoticky tlak byl měřen proti 0,2 M NaCI Určete molární hmotnost ribonukleasy (R = 0,082 dm 3. atm. mol -1. K -1 ). π = RT c i

47 Dialýza - difuze nízkomolekulárních látek membránou

48 dialysa 100 ml 5 M NaCl proti 1 litru

49 Příklady: 2 1 Na Na M c c ln F RT = ϕ 1 2 Cl Cl M c c ln F RT = ϕ Na + Cl Cl Cl Na Na c c ln F RT c c ln F RT = Cl Na Cl Na c c c c =

50 * Do jednoho prostoru dialysační nádoby je umístěn roztok albuminu o koncentraci 0,1 mmol/l, který při ph 7 nese volný náboj -7; je tedy ve formě soli, v našem případě např. sodné. Do druhého prostoru o stejném objemu je umístěn roztok NaCl o koncentraci 10 mmol/l. Jaké bude rozložení iontů po ustanovení rovnováhy? c c = Na1 Cl1 Na2 Cl2 ( 0, x ).x = ( 10 x) 0, 7x + x 2 c = x + 20, 7x = 100 x = 4, 83mmol/l c c c c Na1 Cl1 Na2 Cl 2 = 5,53mmol / l = 4,83mmol / l = 5,17 mmol / l = 5,17 mmol / l c 2 x 2

51 * Zásobní roztok sodné soli albuminu (c= mol/l) měl takové ph, že jeho volný náboj činil -5. Roztok dále obsahoval 0,1 M NaCl. Proti jakému objemu vody je nutno dialyzovat 0,1 l tohoto roztoku, aby po ustanovení rovnováhy klesla koncentrace iontu Na + v roztoku bílkoviny na 0,02 mol/l? c 0, 02. Na2 = n c c = 3 ( 0, ) c n Cl2 Cl2 n V n Cl2 2 = Cl2 Cl2 = = V 0, 0001 = n V.c 2 1 = 0 0 c Na1 Cl1 Na2 Cl2 = 0, 1. 0, 1 n c 0, , 01 n c V.c 0, 1. 0, 005 Cl2 Cl2 = Cl1 = 0, 0095mol 1 c Na2 Cl1 = 0, 95l.c Cl2 = 0, 01mol/l

52 Elektrodialysa vzorek anionaktivní iontově selektivní membrána kationaktivní iontově selektivní membrána

53 odsolování syrovátky odsolování mořské vody odstraňování nitrátů z pitné vody odstraňování kyselin z organických produktů odstranění kyselosti džusu

54 další způsoby odsolování a zahušťování: gelová chromatodrafie - Sephadex G-25, BioGel P-30 vakuové odpařování použití polyethylenglykolu lyofilizace precipitace chromatografie na reversní fázi (C4) ionexová chromatografie