Apoptóza: metody detekce

Transkript

1 Apoptóza: metody detekce Karel Souček, Alena Vaculová Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i. Královopolská Brno tel.:

2 analýza fragmentace DNA detekce asymetrie lipidové membrány analýza změny mitochondriálního potenciálu detekce kaspázové aktivity

3 Apoptóza

4 Nekróza vs. Apoptóza nekróza apoptóza

5 Apoptóza vs. nekróza Aktivace kaspáz Kondenzace buňky a organel Kondenzace chromatinu Ztráta asymetrie buněčné membrány Zachování integrity buněčné membrány Tvorba bodies a jejich fagocytóza okolními buňkami Prozánětlivé stimuly, produkce cytokinů Nabobtnání buňky a organel Ztráta asymetrie buněčné membrány Rychlá ztráta integrity buněčné membrány Vylití cytosolu do mezibuněčného prostoru (From W. Wood et al., Development 127: , The Company of Biologists.)

6 Morfologie nekróza vs. apoptóza ztráta integrity plazmatické membrány bobtnání cytoplazmy a zvětšení buňky rozbití jádra desintegrace buněčných organel kompletní lyze buňky bobtnání cytoplazmatické membrány, integrita membrány není porušena zmenšení velikosti buňky kondenzace a specifická fragmentace jaderného chromatinu udržení integrity intracelulárních organel formace tzv. apoptotických bodies

7

8 Biochemie nekróza vs. apoptóza Bez účasti specifických molekul Pasívní proces bez dodání energie z ATP Neregulovaná destrukce jaderné DNA Není specifická role mitochondrií Ztráta regulace iontových rovnováh Aktivace specifických molekul Nutné dodání energie ve formě ATP Specifická fragmentace jaderné DNA Uvolnění specifických regulátorů z mitochondrií Změny symetrie membrán

9 Fyziologický význam nekróza vs. apoptóza Postihuje skupiny buněk Indukována nefyziologickými stimuly Poškození okolní tkáně vylití toxických látek Spouští zánět Týká se jednotlivých buněk Indukována fyziologickými stimuly Fagocytóza makrofágy Není zánět

10 Kritické body v detekci buněčné smrti in vitro vs. in vivo normální vs. nádorové populace doba trvání časového okna kdy je možné zachytit určitý znak se liší (!) u jednotlivých buněčných populací v závislosti na induktoru buněčné smrti v závislosti na konkrétním znaku který detekujeme (zvolené metodě) různé buňky ze stejné populace mohou umírat různým způsobem smrti

11

12 Detekce buněčné smrti Analýza fragmentace DNA sub G 0 /G 1 populace TUNEL

13 Normal Cell Cycle G 2 M G 0 DNA Analysis G 1 s C o u n t subg 0 G 1 G 0 G 1 s G 2 M - propidium iodide - DAPI - Hoechst AAD N 4N DNA content Purdue University Cytometry Laboratories

14 Analýza subg 0 /G 1 populace

15 Analýza subg 0 /G 1 populace - extrakce nízkomolekulárních fragmentů pomocí citrátového pufru

16 Analýza subg 0 /G 1 populace výhody rychlá a levná analýza analýza možná zároveň s detekcí buněčného cyklu lze použít jakoukoliv značku vázající se na DNA limitace omezená specificita subg 0 populace je detekovatelná i u mechanicky poškozených buněk extrakce nízkomolekulárních fragmentů DNA závisí na protokolu zpracování buněk buňky umírající apoptózou z G 2 fáze je obtížné detekovat

17 Terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dutp nick end labeling - TUNEL detekce zlomů DNA 3 -OH konec jedno- nebou dvouřetězcových zlomů je označen modifikovaným analogem báze pomocí deoxynukleotidyl transferázy vizualizace přímá (FITC-dUTP) nepřímá (AP, POD, anti-brdu Ab)

18 TUNEL

19 TUNEL výhody citlivost, specificita možnost kombinace s detekcí buněčného cyklu limitace finančně a časově náročný protokol spotřeba velkého množství buněk některé druhy fixace mohou u určitých buněk vést k artefaktům Pozn. Nutnost používat 0.2-1% BSA v oplachovacích pufrech

20 Detekce buněčné smrti detekce asymetrie lipidové membrány

21 Detekce asymetrie lipidové membrány fosfatidylseriny (PS) jsou translokovány na vnější stranu membrány během časné apoptózy PS na vnější straně membrány slouží jako jeden ze signálů pro fagocyty

22 Detekce asymetrie lipidové membrány

23 Detekce asymetrie lipidové membrány pro detekci translokace PS využíváme fluorescenčně značený protein Annexin V Annexin V vytváří Ca 2+ závislou vazbu s PC v normální buňce intracelulárně kotví cytoskeletární proteiny k lipidovým membránám translokace PS je jedním z důsledků změny morfologie a modulace cytoskeletu u apoptických buněk

24 Detekce pomocí annexinu V R1 R2 File: K-ANX-FITC/PI Quad % Total UL 0.21 UR LL LR 8.23 File: CHX_50/5h-ANX-FITC/PI Quad % Total UL 1.42 UR LL LR 11.04

25 Detekce translokace PS výhody časný a specifický znak apoptózy možnost kombinace s detekcí povrchových CD antigenů limitace je nutné během analýzy odlišit mrtvé buňky není možné analyzovat fixované vzorky

26 Detekce buněčné smrti analýza změny mitochondriálního potenciálu

27 Mitochondrie, ΔΨ m a apoptóza Mitochondrie hrají důležitou roli v regulaci apoptózy klíčové regulátory jsou proteiny z Bcl-2 rodiny permeabilita mitochondriální membrány může ovlivnit uvolnění cytochromu c a aktivaci kaspáz některé proteiny z mezimebránového prostoru mitochondrií mohou indukovat apoptózu nezávislou na kaspázách (AIF, endonuclease G)

28 Death signal convergence onto mitochondria Baliga B., Kumar S. (2003) Cell Death Differ. 10: Desagher S., Martinou J. C. (2000) Trends Cell Biol. 10: Van Loo G., et al. (2002) Cell Death Differ. 9:

29 Δp = ΔΨ m - 60 ΔpH Mitochondrie a ΔΨ m Δp ~ elektrochemický protonový gradient (180mV) ΔΨ m ~ mitochondriální membránový potenciál (150mV) ΔpH ~ ph gradient Δp pohání ATP-ADP výměnu, import mitochondriálních proteinů a transport metabolitů Alberts, B., et. al. (2002), Molecular Biol. of the Cell

30 Mitochondrie, ΔΨ m a apoptóza Depolarizace mitochondriální membrány a ztráta ΔΨ m je důsledek otevření permeability transition pores (PTP) nebo narušení integrity vnější mitochondriální membrány Depolarizace mitochondrií je spojena s: ischemií/reperfúzí oxidativním stresem buněčnou smrtí

31 Detekce ΔΨ m elektrody radioaktivně značené próby lipofilní fluorescenční kationty Cossarizza, A. (1998), Purdue Cytometry CD-ROM Volume 3

32 Fluorescenční značky pro analýzu ΔΨm

33 Detekce ΔΨ m JC-1 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'- tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide ex./em. = 514/529 nm, monomer form; 585/590 nm J-aggregate form NIH 3T3 TMRE ex./em. = 551/576 nm tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate

34 NaBt TNF-α CH-11 floating: 4.8% DAPI: 2.1% floating: 12.7% DAPI: 2.6% floating: 5.7% DAPI: 3.5% floating: 16.3% DAPI: 6.0% 4.1% 47.5% 2.6% 42.4% control NaBt TNF-α CH-11 AA floating: 9.9% DAPI: 2.6% floating: 24.7% DAPI: 6.1% floating: 14.6% DAPI: 4.5% floating: 29.6% DAPI: 16.0% 3.8% 25.7% 2.8% 50.3% AA AA/NaBt AA/TNF-α AA/CH-11 DHA floating: 13.4% DAPI: 3.3% floating: 24.9% DAPI: 11.7% floating: 17.3% DAPI: 5.0% floating: 39.3% DAPI: 20.0% 5. 3% 26.3% 1.6% 53.7% DHA DHA/NaBt DHA/TNF-α DHA/CH-11 control AA DHA NaBt AA/NaBt DHA/NaBt TNF-α AA/TNF-α DHA/TNF-α CH-11 AA/CH-11 DHA/CH-11 of

35 HL-60 & NDGA ΔΨm 2 h 4 h 6 h Control NDGA Cytochrome c cytosol Vondracek J., Štika J, Souček et. al., Eur. J. Pharmacol. of

36 ΔΨm (TMRE) čas = min NDGA (HBSS) NDGA/NAC (HBSS) of

37 NDGA (HBSS) ΔΨm (TMRE) 16 h NDGA/NAC (HBSS) 1.1% 4.6% 79.5% 14.8% 4.2% 1.3% 89.9% 4.6% 1.6% 88.6% 5.7% 4.1% 3.3% 35.8% 54.4% 6.5% Hoechst+PI Hoechst+PI

38 NDGA (10%BFS) ΔΨm (TMRE) 16 h NDGA/NAC (10%BFS) 0.4% 0.1% 99.0% 0.5% 0.0% 0.0% 99.9% 0.1% R1 1.2% 10.5% 83.5% 4.8% 0.6% 4.7% 93.3% 1.4% Hoechst+PI Hoechst+PI of

39 Možné důsledky poškození mitochondrií Matthew G. Vander and Craig B. Thompson (1999) Nature Cell Biology. 1: E209-E216

40 Δψm Detekce pomocí TMRE Soucek K. et al. Leuk. Res. 2006

41 Δψm sorting -> cell cycle re-analysis HL60/ATRA/96h ~intact population ~collapsed

42 Δψm sorting -> cell cycle re-analysis HL60/ATRA/TGF-β1/96h HL60/ATRA/TGF/96h ΔΨm ~ ~intact intaktni population populace (89.15%) subg0g1: 0.67% G0G1: 76.06% S: 16.12% G2M: 7.82% R Channels HL60/ATRA/TGF/96h subg0g1: 0.46% G0G1: 76.04% S: 13.38% G2M: 10.58% HL60/ATRA/TGF/96h ΔΨm ~collapsed ~ kolaps (10.17%) subg0g1: 0.00% G0G1: 79.02% S: 16.43% G2M: 4.55% Channels Channels

43 real-time měření ΔΨm

44 Detekce ΔΨ m Human Promyelocytes HL-60 Valinomycin (100 nm / 1 h) NDGA (20 µm /1 h) JC-1 (2.5 µg/ml) R1 TMRE (100 nm) DiOC 6 (3) (40 nm) MitoTracker (50 nm) Rh123 (1 ng/ml)

45 Detekce depolarizace mitochondriální membrány real-time JC-1 Human promyelocytes HL-60 Valinomycin (100 nm) TMRE DiOC 6 (3) MitoTracker Red Rh-123

46 Podmínky pro real-time měření ΔΨm homogenní označení buněk standardizace teploty standardizace experimentálního zásahu Burns, J. M. et.al. (1997). "Improved measurement of calcium mobilization by flow cytometry." Biotechniques 23(6): ,

47 Možnosti kombinace detekce ΔΨ m s dalšími parametry Vitální značení exprese CD antigenů (TMRE, translokace fosfatidyl serin V-FITC FITC) Produkce ROS (TMRE/ TMRE/DHR-123) Ca 2+ (TMRE/ TMRE/Fluo-3 ) viabilit fluorescenční ní proteiny (TMRE/ viabilita (propidium iodide, 7-AAD) (TMRE/GFP) (TMRE, CMXRos/anti-CD Ab-FITC FITC) serinů (TMRE, CMXRos/Annexin

48 Detekce translokace fosfatidyl serinů, ΔΨ m a viability R1 R R R2 TMRE TMRE AAD negative AAD negative Human promyelocytes HL-60 NDGA (20 µm M /12 h) Annexin V-FITC/TMRE/7-AAD

49 Detekce [Ca 2+ ] i a ΔΨ m Fluo-3 AM/TMRE (HL-60/DMSO/120 h)

50 Detekce ROS a ΔΨ m DHR-123/TMRE Human promyelocytes HL-60 Valinomycin (100 µm) NDGA (20 µm)

51 Kritické parametry víceparametrové vitální analýzy kvalita označení próbou kompenzace TMRE+FLUO-3 TMRE parameter - detector amp. FL1-544 FL2-434 compensation FL1-1.1%FL2 FL2-17.5%FL1 autofluorescence FLUO-3

52 ΔΨm výhody rychlá a nenáročná metoda snadné odlišení buněčných populací možné kombinovat s detekcí řady dalších vitálních funkcí limitace specificitu nutno potvrdit další metodou nemožnost fixace a permeabilizace

53 Kaspázy - Cysteinové proteázy, specificky štěpí proteinové substráty v místě kyseliny asparagové - Klíčová úloha v přenosu apoptotického signálu - v inaktivní formě (proenzymy, pro-kaspázy) v cytoplazme, štěpení aktivní kaspáza schopná dále štěpit tzv. death substráty a významně se tak podílet na šíření apoptotického signálu a exekuci apoptózy - struktura: - Prodoména - Katalytické podjednotky velká a malá (heterotetramer)

54

55 Activace pro-kaspáz

56

57 Substráty kaspáz Strukturální proteiny laminy (jádro), aktin, fodrin (cytoskelet), keratin 18 (intermediární filamenta) Signální a regulační proteiny cpla2, PKC, některé proteiny rodiny Bcl-2, MEKK-1 Transkripční faktory MDM2, RB Proteiny v regulaci metabolismu DNA/RNA PARP, CAD inhibitor (inaktivace DNázy závislá na kaspázách)

58 Metody detekce kaspázové aktivity detekce aktivní formy kaspáz detekce aktivity pomocí syntetických selektivních substrátů analýza pomocí značených inhibitorů kaspáz (fluorochrome-labeled inhibitors of caspases (FLICA)) detekce štěpení substrátů kaspáz (PARP, CK18)

59

60 Detekce aktivní formy kaspáz

61 Detekce aktivní formy kaspáz Intracelulární detekce pomocí protilátek specifických pouze pro aktivní formu enzymu fixace PFA + permeabilizace

62 Detekce kaspázové aktivity pomocí syntetických substrátů krátké značené peptidy nepermeabilní detekce v bunečných extraktech pomocí fluorimetru (Alexis, Roche, BD, BioVision) permeabilní detekce pomocí fluorescenční mikroskopie nebo průtokové cytometrie v intaktních buňkách (OncoImmunin, BioVision)

63 Detekce kaspázové aktivity pomocí syntetických substrátů v intaktních buňkách BioVision specifické permeabilní substráty (CaspGLOW) pan-specifický substrát (CASPScreen) (aspartyl)2-rhodamine 110 (D2R)

64 Detekce kaspázové aktivity pomocí syntetických substrátů v živých buňkách PhiPhiLux (OncoImmunin) Permeabilní pár fluorochromů kovalentně spojených linkerem (specifická substrátová sekvence) Po stěpení dochází ke změně konformace a nárůstu fluorescence buňky nelze dodatečne permeabilizovat!!! lze snadno studovat dynamiku aktivace

65 Detekce kaspázové aktivity pomocí syntetických substrátů v intaktních buňkách výhody jednoduchý protokol u některých substrátů možnost kombinace s detekcí povrchových antigenů limity specifita, nízká toxicita a prostupnost substrátu nemožnost fixace a permeabilizace

66 Detekce kaspázových substrátů Poly(ADP)ribose polymerase (PARP) substrát kaspázy -3, -6 rutinní detekce fragmentů pomocí Western blotu analýza na průtokovém cytometru pomocí protilátek proti štěpeným fragmentům PARP (p25; p89)

67 Detekce kaspázových substrátů Cytokeratin 18 intermembránová filamenta epitheliálních buněk Substrát kaspázy-3, -6, -7, -9 detekce specifického fragmentu pomocí M30 Cytodeath protilátky

68 Protilátka M30 Cytodeath

69 Detekce kaspázových substrátů výhody jednoduchý protokol ~ standardní intracelulární imunodetekce na metanol fixovaných buňkách možnost kombinace s detekcí dalších intracelulárních antigenů limity kvalita protilátky buněčná specifita obtížná kombinace analýzy s detekcí povrchových antigenů nemožná kombinace s analýzou vitálních funkcí

70 Jakou metodu použít? více než jednu; principielně odlišnou; v závislosti na buněčném typu; a experimentálním zásahu.