Deregulace cytokinetiky (možnosti ovlivnění II) (homeostáza, zdraví a regenerace organismu)

Transkript

1 Deregulace cytokinetiky (možnosti ovlivnění II) (homeostáza, zdraví a regenerace organismu) A. Kozubík Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i., (Oddělení cytokinetiky) Ústav experimentální biologie, PřF MU (Oddělení fyziologie a imunologie živočichů) Brno

2 Deregulace cytokinetiky: Další příklady jejího ovlivnění

3 Biologické cíle" cisplatiny (adukty s DNA) Typy DNA aduktů! (80-90%)!!! a frekvence jejich výskytu Inter- Intra- mono- Fuertes, MA et al.

4 Adamantylaminové Pt(II) a Pt(IV) komplexy Výhoda: lipofilní Dvojmocné Pt(II) (reaktivní s DNA) LA-9 redukce čtyřmocné Pt(IV) (s DNA nereaktivní) LA-12 Cisplatina (II) JM-216 (1. z řady v klinickém zkoušení) Syntetizované F. Žákem a spol., PLIVA Lachema Zak et al., 2004, J Med Chem,

5 [Cl - ] ex 100mM plasma plasma Cisplatin (II) (lipofóbní) LA-12 (IV) reaktivita lipofilicita (capacity factor HPLC) cytoplasma [Cl - ] in 2-30mM cytoplasma (FAAS) Zvýšený influx LA-12 (19.5 u A2780; 29.3 u A2780cis) Snížená reaktita s cílovými biomol. Proteins Proteiny? Peptides Peptidy? Glutathione RNA? Metallothioneins Metallothioneiny Cytoskeletální Cytoskeletal proteins? proteiny? DNA Tvoří speciální typy velkých DNA/protein aduktů nereparabilních excisiní reparací NUCLEUS LA-12 DNA cisplatin LA-12

6 Úloha vybraných proteinů: - Cyklin A, B1, cdk2 (+ regulace b. cyklu); - p21, Gadd45a ( p53 target genes - regulace b. cyklu); - Bax (apoptóza); - Gadd 45a ( DNA repair ); - Mdm2 (regulace stability p53)

7 Science 262, 1644, 1993

8 Molekulární podstata cytotoxického působení cisplatiny iniciované adukty DNA B. smrt závisí na relativní intenzitě Signálů LA-12?

9 U buněk rezistentních k cisplatině je f-ce p53 (dráhy vedoucí k apoptóze) narušena. Přispívají k tomu změny v regulaci proteinů r. Bcl, Fas, Survivinu, Glutathionu

10 Dose-response křivky (MTT test) Nejcitlivější k cis-ddp z panelu senzitivních ovariálních buněk (H134, IGROV-1, OVCAR-3),s najnižším % apoptózy (6-14%) (Kolfschoten, G.M. et al., Gyn. Oncol., 2002) Získaná rezistence udržovaná přídavkem cisplatiny do kultivačního média (výsl. konc. 1 um, každá 2. pasáž) 6x 18x Faktor rezistence (18:6) = 3 Kozubik et al., 2005, Biochem Pharmacol

11 Rozdílný vliv cisplatiny a LA-12 na buněčný cyklus A2780 (single staining) G2/M S Kozubik et al., 2005, Biochem Pharmacol

12 Rozdílný vliv cis-ddp a LA-12 na buněčný cyklus A2780cis S S Kozubik et al., 2005, Biochem Pharmacol

13 Účinky LA-12 a cisplatiny na b. cyklus jsou u ovariárních nádorových linií rozdílné. Detekovány hladiny proteinů: - Cyklin A, B1, cdk2 (+ regulace b. cyklu); - p21, Gadd45a ( p53 target genes - regulace b. cyklu); - Bax (apoptóza); - Gadd 45a ( DNA repair ); - Mdm2 (regulace stability p53)

14 Hladiny proteinů regulujících buněčný cyklus (cyklin A, B1, cdk2) u buněk A2780 a A2780cis po působení LA-12 a cisplatiny Nebyly pozorovány žádné změny

15 Exprese PARP a p53 (Western b.) u A2780 a A2780cis p53 p53 A2780 A2780cis Equitoxické koncentrace cis-ddp indukují vyšší expresi proteinu p53 (teoreticky vyšší poškození DNA, než po apl. LA-12 a tudíž by cis-ddp měla působit efektivněji), Nebylo tomu tak, tzn. že by musí existovat jiné. např. s poškozením DNA nesouvisející mechanismy působení LA-12!!!!!! PARP-substrát kaspázy Kozubik et al., Biochem Pharmacol., 2005

16 Detekce produktů genů activatelných p53 spojovaných se zástavou b. cyklu, DNA repair a apoptózou po působení cisplatiny nebo LA-12 Analýzy potvrzující dřívější data u b. A2780 v časnějších int. Zvýšení exprese Gadd45a u buněk A2780 po působení cisplatiny Žádné změny na úrovni hladin Mdm2 a Bax

17 Tyto naše výsledky, i když plně nevysvětlují působení cisplatiny a LA-12, se zařazují mezi ty přístupy, které výzkum platinových cytostatik posouvají do nových oblastí. Studie z poslední doby ukazují, že cisplatina inhibuje růst nádorových buněk v koncentracích, které jsou významně nižší, než konc. potřebné pro inhibici syntézy DNA. To naznačuje, že mohou existovat i jiné mechanismy působení než ty, které jsou primárně založeny na poškození DNA Platinová cytostatika mohou reagovat s dalšími buněčnými strukturami (komponenty) jako jsou: RNA, proteiny, cytoskeletální filamenta, thioly- obsahující molekuly membranové fosfolipidy. Odvozené mechanismy mohou být významnou součástí signálních kaskád regulujících dělení a smrt buněk

18 Předpoklad: Vzhledem ke své lipopfilicitě, lze očekávat, že alespoň některé příznivé efekty působení LA-12 by mohly být (alespoň částečně), spojeny s interakcemi této látky se složkami b. membrán (anebo by mohly být modulovány ovlivněním membranového složení).

19 SIGNÁL (např. cytokiny) MOLEKULÁRNÍ MECHANISMY působení ω-3 a ω-6 VNMK (mediátory a modulátory buněčné signalizační sítě) lipidové rafty membránová fluidita signální kaskáda vnitrobuněčné funkce sekrece změny metabolismu, membránové fosfolipidy PUFA proteiny jaderné receptory transkripční faktory (NFkB, PPAR, AP-1...) mrna RE genová exprese ROS DNA inserce buněčného růstu diferenciace a apoptózy eikosanoidy lipidová peroxidace LOX P450 COX inhibice (NSAID) n-3 PUFA n-6 PUFA (AA, LA) membránové fosfolipidy kyselina arachidonová Mimobuněčné podněty (cytokiny, hormony, polutanty, záření) (stresory)

20 Předpoklad: Komplexnější mechanismy působení Lze očekávat, že alespoň některé příznivé efekty působení LA-12 by mohly být spojeny s interakcemi této látky se složkami buněčných membrán

21 Výsledky reflektující úvahy o potenciálním zapojení fosfolipidových struktur v mechanismech účinků pt-cytostatik Lze vyslovit předpoklad, že u obou námi studovaných pt - cytostatik, lišících se lipofilicitou dochází k významným rozdílům již v dostupnosti do buňky. Dále, je známo, že k rezistenci buněk k cis-ddp může přispívat i složení a distribuce fosfolipidových komponent v membránách. Významné rozdílnosti v seskupování lipidů (tzv. lipid packing, FCM, merocyanin) jsme prokázali i v našich předběžných pokusech u buněk A2780 a A2870cis.

22 Vznik suspenze vhodných polárních lipidů (např. lecithin) + působením ultrazvuku Naše další předběžné výsledky s využitím kalorimetrie provedené na umělých lipozomálních strukturách naznačily, že:

23 zatímco ani cisddp ani LA-12 samy o sobě nemění vlastnosti lipozómů, přidání AA významně mění charakter termogramu ve smyslu zvýšení membránové fluidity. Kombinace AA s cis-ddp anebo s LA-12 naznačily tendence k fázové separaci (změny nebo objevení se druhého píku). Tyto píky se po kombinaci AA s cis-ddp vs. AA s LA-12 lišily.

24 DPPC + CP DPPC + LA12 DPPC + AA DPPC + DHA EXCESS HEAT CAPACITY 1.5 mj/k DPPC 1 M 10 M 50 M EXCESS HEAT CAPACITY DPPC 1 M 10 M 50 M 1.5 mj/k C EXCESS HEAT CAPACITY 1.5 mj/k DPPC 50 M 100 M 200 M EXCESS HEAT CAPACITY 1.5 mj/k DPPC 50 M 100 M 200 M TEMPERATURE ( o C) TEMPERATURE ( o C) TEMPERATURE ( o C) TEMPERATURE ( o C) Vliv CP na DPPC multilamelární lipozómy Vliv LA 12 na DPPC Rozdíly cisplatina (CP) vs LA-12 Vliv AA Po 50 M AA pozorujeme snížení píku odpovídajcího předpřechodu a zároveň rozšiřování hlavního fázového přechodu - zvýšení fluidity??? přičemž se entalpie přechodu nemění. Vliv DHA je zřejmé, že tendence změny je podobná jako po AA. EXCESS HEAT CAPACITY 1.5 mj/k 1 M 10 M (DPPC M AA) + CP EXCESS HEAT CAPACITY 1.5 mj/k (DPPC M AA) + LA12 1 M 10 M EXCESS HEAT CAPACITY 1.5 mj/k 10 M LA12 (DPPC M DHA) + LA M 50 M 50 M LA TEMPERATURE ( o C) TEMPERATURE ( o C) TEMPERATURE ( o C) 45 50

25 Je dále známo že k rezistenci buněk k cis-ddp může přispívat složení a distribuce fosfolipidových komponent v membránách. Významné rozdílnosti v seskupování lipidů tzv. lipid packing, FCM, merocyanin - váže se na rozvolněnou strukturu lipidů (zvýšení flurescence) cca odráží míru fluidity jsme prokázali i v předběžných pokusech u nádorových buněk ovárií A2780 a A2870cis (se získanou rezistencí).

26 Dynamický charakter biologických membrán (model)

27 Zajištění většiny biologických funkcí se neobejde bez unikátních interakcí lipidových komponent 1) s dalšími biologicky významnými molekulami. Jejich modulace mohou významně měnit intenzitu a také směr sign. transdukce Pietzsch J et al., Nature Reviews, October ) např. tzv. lipidových raftů membránových lipidových mikrodomén obohacených o glykosfingolipidy a cholesterol

28 LA-12 indukuje upregulaci DR5 mrna, celkových povrchových proteinů, a zvyšuje zastoupení DR5 v lipidových raftech Zastoupení DR5 a DR4 v membránách HCT 116 Celkové hladiny DR5 (rafty) Celkové hladiny DR5 DR5 mrna Lokalizace DR5 v lipidových raftech

29 NEZNÁMÉ INTERAKCE cílená regulace cytokinetiky Využití mechanismů působení pt-cytostatik jiných než těch, které přímo souvisí s poškozením DNA Posílení terapeutických efektů? Lipidové výživy vhodného složení EXPERIMENTÁLNÍ OVLIVNĚNÍ PUFAs cisplatina cytostatika nové generace (LA-12) změny fluidity membrán ovlivnění metabolismu PUFAs poškození cytoskeletu, oxidativní stres přenos signálů membrána-cytosol-jádro apoptóza buněčný cyklus a proliferace? ÚČINEK Podstata možných návrhů projektů prozatím neuzavřeno