Helena Langhansová. 30. listopadu 2011

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Helena Langhansová. 30. listopadu 2011"

Miroslav Janda
před 6 lety
Počet zobrazení:

1 VYUŽIT ITÍ PRŮTOKOV TOKOVÉ CYTOMETRIE V IMUNOLOGII Helena Langhansová 30. listopadu 2011 Projekt Vytvoření a rozvoj týmu zaměřeného na výzkum a výuku v oblasti medicínské biologie, reg. č. CZ.1.07/2.2.00/ , je spolufinancován z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu České republiky.

2 Schéma přednášky I. část: Základní principy průtokové cytometrie II. část: Aplikace v imunologickém výzkumu Flow Cytometry Course Department of Biology, University of York 12 th 16 th September 2011

3 Průtokov toková cytometrie Měření a analýza fyzikálních a chemických vlastností jednotlivých buněk v proudu kapaliny během jejich průchodu laserovým paprskem Přímý rozptyl (forward scatter) velikost Boční rozptyl (side scatter) granularita Fluorescence

4 Výhody: velké množství buněk během krátkého času, subpopulace, třídění (sorting) Nevýhody: jednotlivé buňky, lokalizace proteinu (x konfokální mikroskop)

5 Průtokový cytometr Fluidika Zdroj(e) světla Optika Detektory Zpracování dat BD FACS CantoII

6 FLUIDIKA pohyb buněk cytometrem hydrodynamická fokusace low - medium - high (tlak vzorku určuje průměr jádra)

7 ZDROJ SVĚTLA Laser - stejná vlnová délka i fáze (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation) 488 nm, 633 nm, (405 nm)

8 OPTIKA Sběr emitovaného světla pomocí systému filtrů Filtry dichroické, selektivně propouští 1 vlnovou délku a odrážejí ostatní SP, LP, BP

DETEKTORY sběr světla a konverze na měřitelný signál (analogový, digitální) Fotodioda (forward scatter), fotonásobič (fluorescence) konverze světla na napětí Poměr

9 DETEKTORY sběr světla a konverze na měřitelný signál (analogový, digitální) Fotodioda (forward scatter), fotonásobič (fluorescence) konverze světla na napětí Poměr signálu k šumu šum biologický, elektronický Dynamický rozsah poměr mezi největší a nejmenší měřitelnou hodnotou Digitální systémy zvyšují rychlost a přesnost měření

ZPRACOVÁNÍ DAT komunikace mezi přístrojem a uživatelem zisk použitelných dat (počet buněk exprimujících daný antigen, počet buněk v určité fázi cyklu, odpověď

10 ZPRACOVÁNÍ DAT komunikace mezi přístrojem a uživatelem zisk použitelných dat (počet buněk exprimujících daný antigen, počet buněk v určité fázi cyklu, odpověď populace na stimul, síla exprese antigenu, absolutní množství buněk, ) Analytický software Vyčíslení subpopulace (% pozitivních) Intenzita fluorescence (medián)

11 Fluorescence Emise fotonu při přechodu elektronu z S1 do S0 Absorpce světla (λ A ) excitovaný stav emise světla (λ B ) základní stav Fluorofory přírodní, syntetické Použití filtrů Závislá na prostředí (ph, vazebné vlastnosti, bleaching)

12 Proč fluorescence? Mnoho buněk má stejnou/podobnou morfologii Značení specifických částic/komponent Identifikace a charakterizace subpopulací Kvantifikace znaku Specifická diskriminace (např. živé/mrtvé buňky, buněčný cyklus)

14 II. Průtokov toková cytometrie v imunologii Povrchové značení (fenotypizace) Intracelulární značení Buněčný cyklus a proliferace Apoptóza Funkční parametry

15 Plánování experimentu Účel, hypotézy, literatura, důvod použití průtokové cytometrie (x mikroskopie, RT-PCR) Technické specifikace cytometru a fluorochromů (lasery, počet barev, absorpční a emisní spektra, kompenzace) Finanční náklady a personální možnosti

16 Optimalizace experimentu Silné/slabé fluorochromy Hustota antigenu CD4PE CD38FITC Tandemové fluorochromy FRET nestabilní

17 Optimalizace vzorků! dublety, shluky (filtrace, Dnáza), mrtvé buňky Suspenzní x adherentní buňky, tkáně nebo řezy Fixace buněk + prevence infekce, stabilita vzorku, pohodlí - vyloučení mrtvých buněk, změna rozptylu, autofluorescence Titrace protilátek

18 Použití kontrol V KAŽDÉM EXPERIMENTU Nastavení cytometru (nebarvené buňky) Kompenzační kontroly (jednobarevné) FMO (gating při mnohobarevné analýze) Isotypové kontroly (vazba protilátek) Experimentální (naivní buňky)

19 POVRCHOVÉ ZNAČEN ENÍ Fenotypizace Povrchové molekuly aktivační molekuly, receptory pro cytokiny a chemokiny, mediátory zánětu Monoklonální protilátky, přímé x nepřímé značení Leukémie, HIV dg, efekt léčby, zbytková nemoc

20 Diwan et al. PNAS 2007, 104: Pecora et al. JI 2006, 177:

21 Kombinace rozptylu a fluorescence progrese nádoru

22 PerCP=CD45, FITC=CD3, APC=NK1.1, Alexa700=CD4, PE-Cy7=CD8

23 Důležité: Stimulace (restimulace buněk) Receptor shedding (inhibitory, 4 C) Kvalita protilátek (nespecifická vazba blok, iso kontroly (FcR)) Citlivost mlk/b Přímé x nepřímé značení

24 INTRACELULÁRN RNÍ ZNAČEN ENÍ Cytokiny, transkripční faktory Inhibice transportu ven z buňky (brefeldin A) Fixace a permeabilizace buněk (! změna scatteru, vyloučení mrtvol Často v kombinaci s povrchovým značením Sadanaga et al. Clin Cancer Res 2001, 7: 2277

25 APOPTÓZA = programovaná buněčná smrt fyziologická - normální vývoj a obnova tkání, negativní selekce, CTL patologická - autoimunitní a neurodegenerativní onemocnění, rakovina expozice různým podmínkám (léky, jedy ) rychlý a dynamický proces, kombinace s mikroskopií

26 Scatter, změny v buněčné membráně, mitochondriích, aktivace specifických enzymů, rozpad DNA

27 Změna velikosti a tvaru Zvýšená propustnost pro DNA barviva (PI, DAPI, Sytox Green atd.)

28 Depolarizace mitochondriální membrány akumulace v aktivních mitochondriích (membránový potenciál zachován) - CMXRos, LDS-751, JC-1, TMRE Uvolňování cytochromu c Nonyl Acridine Orange (NAO), protilátky

29 Aktivace enzymů kaspáza 3 FLICA (fluorochrome-labelled inhibitors of caspase activity) Protilátky proti aktivní formě enzymu Fixace a permeabilizace nelze užít live/dead diskriminaci

30 Změny v buněčné membráně expozice fosfatidylserinu na vnější straně Annexin V, YO-PRO-1

31 Degradace DNA Sub-G1 populace TUNEL assay řetězcové zlomy

32 BUNĚČ ĚČNÁ PROLIFERACE CFSE, SNARF-1, PKH-26 Carboxy-fluorescein-diacetate-succinimidal ester

33 Odpověď na stimulaci mitogenem, superantigenem nebo specifickým antigenem Cytostatika Dělení všech buněk x dělení subpopulace

34 FUNKČNÍ PARAMETRY Buněčné interakce, změny Ca 2+, fagocytóza, oxidační vzplanutí Indo-1, Fluo-3 vazba na vápenaté ionty a změna fluorescence

37 BUNĚČ ĚČNÝ CYKLUS G0 na G1- lymfocyt po stimulaci, růst buňky, syntéza RNA a proteinů, exprese CD69 DNA-vázající látky

38 BromdeoxyUridin (BrdU) - Analog thyminu S fáze Anti-BrdU protilátky Odlišení aktivně se dělících buněčných frakcí, kinetika Kombinace s PI, event. povrchovým značením In vivo i.p., pitná voda CFSE

39 Většina postupů je aplikovatelných i na subcelulární struktury (jádra, mitochondrie), kuličky a prokaryotní buňky (s ohledem na velikost a tvar)

40 singlety 2 populace? F4/80 mrtvé živé fagocytující

41 Užitečné odkazy ISAC - International Society for Advancement of Cytometry Česká společnost pro analytickou cytologii

42 Projekt Vytvoření a rozvoj týmu zaměřeného na výzkum a výuku v oblasti medicínské biologie, reg. č. CZ.1.07/2.2.00/ , je spolufinancován z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu České republiky. DĚKUJI ZA POZORNOST

Podobné dokumenty

Principy a instrumentace

Průtoková cytometrie Principy a instrumentace Ing. Antonín Hlaváček Úvod Průtoková cytometrie je moderní laboratorní metoda měření a analýza fyzikálních -chemických vlastností buňky během průchodu laserovým