Fluorescenční mikroskopie. principy a použití

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Fluorescenční mikroskopie. principy a použití"

Marek Dvořák
před 7 lety
Počet zobrazení:

1 Fluorescenční mikroskopie principy a použití

2 Luminiscence objekt absorbuje záření určité vlnové délky, které se vnitroatomovým přeskupením změní na záření o delší vlnové délce excitace viditelné světlo, UV, x, α, β, γ

3 Stokesův zákon: λe < λf Stokesův posuv Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii. E = h. c/λ λ Rozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima

4 Luminiscence excitace světlem: fosforescence vyzařování světla trvá i po přerušení excitace fluorescence nemá setrvačnost, záření zaniká po přerušení excitace excitace vyvolaná chemickou reakcí: chemiluminiscence

5 Detekce fluorescence spektrofluorometry a microplate readers měří průměr vlastností vzorků (µl až ml). fluorescenční mikroskopy rozlišují fluorescenci ve dvou nebo třech rozměrech pro mikroskopické objekty (v průměru menší než ~ 0.1 mm). fluorescenční scannery ( microarray readers ) rozlišují fluorescenci ve dvou rozměrech pro makroskopické objekty jako jsou elektroforetické gely, bloty a chromatogramy. průtokové cytometry (Flow cytometers) měří fluorescenci každé buňky v protékajícím proudu, což umožňuje identifikovat a kvantifikovat subpopulace buněk ve velkém vzorku. konfokální mikroskopie

6 Princip fluorescenčního mikroskopu závěrný (bariérový) filtr excitační (budící) filtr vzorek

7 Excitační filtry - Olympus %T λ 500 nm

8 Bariérové filtry - Olympus 500 nm

9 Transmisní fluorescenční mikroskop

10 Dichroické zrcadlo a princip funkce

11 Epifluorescenční mikroskop - Olympus

12 Olympus BX-51 - epifluoescence

13 Kostky = kombinace filtrů a dichroického zrcadla pro epifluorescenci

15 Typy fluorescence primární fluorescence sekundární fluorescence autofluorescence barvení fluorochromy imunofluorescence = fluorochromem značené protilátky indukovaná fluorescence

16 Srovnání fluorescenčních barviv 351 nm UVA 488 nm 568 nm 648 nm

17 Fluorescence primární (autofluorescence) častá u rostlinných pletiv chlorofyl lignin, suberin pryskyřice, sekundární metabolity sekundární fluorochromy specifická vazba na určité struktury (DNA - DAPI, Hoechst 33258) značení GMO fluoreskujícími proteiny (GFP,YFP) fluorescenční imunohistochemie spojuje sekundární fluorescenci s reakcí: antigen x protilátka (detekce určitých proteinů) fluorescenční in situ hybridizace detekce určitých sekvencí vysoká specificita a citlivost

18 Autofluorescence příčný řez kořenem trávy Cynodon dactylon A. Lux

19 Autofluorescence ligninu v xylému a sklerenchymu UV excitace snímek příčného řezu cévním svazkem foto-soutěž Nikon, 2004

20 Kalóza v pylových láčkách fluorochrom: anilínová modř UV excitace pylová zrna pylové láčky

21 Fluorescenční barviva fluorescein a rhodamin fluorescein emituje intenzivní zelenou fluorescenci po excitaci modrým světlem rhodamin emituje červenou fluorescenci po excitaci zelenožlutým světlem Různé složky buněk mohou být barveny oběma barvivy současně

22 Kombinace fluorochromů a filtrů FITC barví se mikrotubuly propidium jodid barví jádra kultura buněk A549 kombinovaný obraz simultánní emise

23 Kombinace fluorochromů a filtrů DAPI + FITC

24 Řez řapíkem listu

25 Stonek jedle v modrofialovém světle fluorochrom: akridinová oranž

26 Sledování životaschopnosti buněk kalus mrkve FDA substrát: FDA esterázy fluorescein + acetát

27 Sledování vývoje kalusu mrkve BF - DIC DAPI

28 Kombinace DAPI a fázového kontrastu DAPI fázový kontrast kombinovaný obraz

29 Historie GFP 1955 první popis luminiscence medůzy Osamu Shimomura (1962) fotoreceptory na okraji klobouku medůzy 2008 Nobelova cena za chemii

30 Modifikace GFP Roger Tsien La Jola, Kalifornie

31 GFP jellyfish Victoria aequorea GFP in cultured tobacco cells, confocal image

32 PtK1 cell with antibody staining for microtubules (green) and DNA (blue) (A. Khodjakov, Ph.D.,Wadsworth LabsAlbany, NY) originální snímek snímek po úpravě

33 Arabidopsis DR5::GFP Auxin Reporter využití GFP pro sledování auxinu J. Friml auxinem aktivovatelný promotor DR5rev kořen 35S min kořen + auxin GFP + DAPI 35S pa embryo

34 Příklady tříbarevné fluorescence Cell infected with poxvirus (630x) Honorable Mention, 2007 Nicon Competition Dr. Daniel Kalman Bovine Endothelial Cell Courtesy Leica Microsystems Imaging Solutions, Ltd., UK.

35 Fotostabilita OG514 1s Oregon Green 514 phalloidin fluorescein phalloidin 10s 20s 30s

36 Chemiluminiscence Excitace elektronů je vyvolána chemickou reakcí Při deexcitaci dochází k vyzáření světla Bioluminiscence světluška Noctiluca scintillans ATP + luciferin + O2 luciferáza Mg 2+ AMP + PPi + CO2 + H2O + oxyluciferin + světlo

37 Využití chemiluminiscence Stanovení NO NO + O3 NO2* + O2 NO2* NO2 + světlo Stanovení H2O2 Luminol + H2O2 peroxidáza 3-aminoftalát + světlo

38 Transformované rostlinky kasavy z embryogenní kultury signální gen = luciferáza rostlinky vizualizace aktivity luciferázy: postříkáno luciferinem světelná emise měřena luminometrem

39 Zajímavé adresy s0076.htm fluorhome.html html

40 Honorable Mention, 2007 Nikon Competition Carmen Laethem Aerie Pharmaceuticals Research Triangle Park, North Carolina, USA Primary porcine trabecular meshwork cells (20x)

Podobné dokumenty

F l u o r e s c e n c e

F l u o r e s c e n c e Fluorescenční mikroskopie Luminiscence jev, kdy látka vysílá do prostoru světlo chemická reakce chemiluminiscence světlo fotoluminiscence Vyvolávající záření exitační fluorescence