Infračervená spektroskopie (FTIR) & Fluorescenční mikroskopie

Transkript

1 EVROPSKÝ SOCIÁLNÍ FOND Infračervená spektroskopie (FTIR) & Fluorescenční mikroskopie - aplikace v biochemických oborech PRAHA & EU INVESTUJEME DO VAŠÍ BUDOUCNOSTI Podpořeno CZ.2.17/3.1.00/36021 Implementace nových metod ve výuce biochemie a forenzní analýzy.

2 Obsah přednášky Infračervená spektroskopie (FTIR) Fluorescenční mikroskopie - Principy metod - Instrumentace - Biochemické aplikace

3 Infračervená spektroskopie (FTIR)

4 William Herschel Kolem roku 1800 W. Herschel studoval spektrum slunečního světla pomocí hranolu. Měřil teplotu každé barvy, a zjistil, že nejvyšší teplota je těsně nad červenou barvou. Tuto oblast záření proto dnes nazýváme "infračervenou (infrared, IR). Autor obrázku: John Lewis

5 Infračervené záření (IR, z anglického infrared) je elektromagnetické záření s vlnovou délkou větší než viditelné světlo, ale menší než mikrovlnné záření. Název značí pod červenou (z latiny infra = "pod"). Infračervené záření má vlnovou délku mezi 760 nm a 1 mm. Infračervený snímek psa v tzv. falešných barvách spolu s teplotní škálou ( tepelné záření )

6 Elektromagnetické spektrum Jednotky používané v IR: Vlnočet (cm -1 ) Near-IR: NIR: cm -1 Mid-IR: cm -1 Far-IR: cm -1

7 Princip infračervené spektroskopie Při průchodu infračerveného záření vzorkem dochází k jeho absorpci Dochází ke změnám rotačně vibračních stavů molekuly v závislosti na změně dipólového momentu

8 Princip infračervené spektroskopie Infračervenou spektroskopií se sledují vibrační a rotační přechody v molekulách. Pokud je změna těchto vibračních či rotačních stavů spojena se změnou dipólových momentů, dochází k absorpci záření charakteristického pro danou vazbu v molekule. Největší význam při identifikaci organických sloučenin má oblast spektra v rozmezí vlnočtů cm -1. V této oblasti se organické sloučeniny projevují největším počtem absorpčních pásů a říká se jí molecular finger print. Značnou výhodou infračervené spektroskopie je možnost měření vzorků ve všech skupenských stavech.

9 Co můžeme zjistit pomocí infračervené spektroskopie? Chemická analýza: Shoda spektra se spektrem v databázi - Identifikace neznámé sloučeniny, forenzní aplikace, atd. Monitorování chemické reakce in situ Molekulová struktura: Lze určit, jaké chemické skupiny jsou přítomny ve sloučenině Elektronické informace: Lze změřit optickou vodivost - Zjistit, zda se jedná o kov, izolátor, supravodič či polovodič,

10 Optický systém FTIR Zdroj záření He-Ne laser (keramický) Pohyblivé zrcadlo Beam splitter Vzorek Interferometr Fixní zrcadlo Detektor (DLATGS)

11 Techniky měření Difůzní reflektance (DRIFTS) (Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy) Spekulární (zrcadlová) reflektanční technika Molecular Spectroscopy, Introduction to Sample Handling, Thermo

12 Techniky měření Transmisní měření (měření na průchod) Měření ATR technikou (Attenuated Total Reflection) Molecular Spectroscopy, Introduction to Sample Handling, Thermo

13 Infračervený mikroskop

14 Biochemické aplikace FTIR Rozlišení pathogenních a nepathogenních bakterií v potravinářském průmyslu Lokalizace látek v tkáních/organismech Identifikace/rozlišení jednotlivých typů proteinových struktur Diagnostika rakoviny, sledování Alzheimerovy choroby

15 Klasifikace bakterií pomocí FTIR

16 Další aplikace Identifikace mikroorganismů Klasifikace mikroorganismů Diferenciace Kontrola fermentace Vyšetření metabolitů Studium antibiotik Datové podklady pro identifikaci mikroorganismů byly vytvořeny a ověřeny na Institutu pro mikrobiologii Zentralinstitut für Ernährungs-und Lebensmittelforschung Weihenstephanu ve skupině Prof. S.Scherera. Existují databáze pro následující skupiny mikroorganismů: Kvasinky Bacillus Mikrokoky, stafylokoky Bifido bakterie, Clostridium Pseudomonády Laktobacily a Laktokoky Acetobatereaceae

17 Lokalizace látek v tkáních/organismech Optické a FTIR zobrazení pomalu a rychle dehydratované larvy. Sledováno při vlnočtu 992 cm -1 (trehalóza) a 1540 cm -1 odpovídajícímu amidovému pásu II (proteiny). Teplé barvy znamenají vyšší intenzitou, tj. větší množství molekuly.

18 Sledování průběhu Alzheimerovy choroby FTIR imagging prionového proteinu v mozku. Vlevo jsou výsledky z preklinické fáze 100 dní po infekci a prvních klinických příznaků onemocnění (vpravo). Miller L.M.; Bourassa M.W.; Smith R.J.: FTIR spectroscopic imaging of protein aggregation in living cells, BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA- BIOMEMBRANES, 1828, (2013).

19 Neinvazivní diagnostika rakoviny úst a hrtanu Průměrná spektra z rakoviny (plná čára) a zdravé tkáně (tečkovaná čára). Analýza sputa. Menzies G.E.; Fox,H.R.; Marnane C. et al.: Fourier transform infrared for noninvasive optical diagnosis of oral, oropharyngeal, and laryngeal cancer. TRANSLATIONAL RESEARCH, 163, (2014 ).

20 Fluorescenční mikroskopie

21 Co je to fluorescence? Fluorescence je fyzikálně chemický děj, který je typem luminiscence. Fluorescence patří mezi fotoluminiscenční záření, které je vyvoláno buď účinkem jiného dopadajícího záření, nebo účinkem dopadajících částic.

22 Co je to luminiscence? Luminiscence nastává v případě, že vlastní záření nějakého tělesa výrazně převažuje nad jeho tepelným zářením. Podstatou luminiscence je návrat excitovaných elektronů na základní hladiny a s tím spojené vyzařování přebytečné energie ve formě fotonů. Luminiscenci dělíme na: fluorescenci, fosforescenci, zpožděnou fluorescenci.

23 Jablonského diagram znázorňuje základní fotofyzikální procesy probíhající po absorpci fotonu molekulou

24 a neb jednodušeji: Fluorescence - emise světla pouze v průběhu absorpce excitačního světla interval mezi absorpcí excitačního světla a emisí je extrémně krátký (<1/ s)

25 Fluorescence a její hlavní typy primární fluorescence (autofluorescence) - přirozená fluorescence studovaného materiálu (minerály, krystaly, chlorofyl, vitamíny, některé anorganické sloučeniny) sekundární fluorescence - studovaný materiál je "označen" fluoreskující značkou (např. fluorescenčně značené protilátky) ICC-cytokeratin-Cy2-Hoechst-label.jpg

26 Sekundární fluorescence

27 Fluorescenční mikroskopie

28 Fluorescenční mikroskopie Schematický nákres fluorescenčního mikroskopu Fluorescenční mikroskop Olympus BX61

29 Přirozená fluorescence Vědci zjistili, že červená barva je oblíbená mezi některými rybami a objevili několik druhů, které skutečně fluoreskují. Mnozí badatelé považují červenou barvu za únik z šedé nudy podvodní říše, kde jsou červené vlnové délky slunečního světla okamžitě absorbována mořskou vodou hned u jejího povrchu. Nico Michiels z univerzity v Tübingenu (Německu) vedl tým, který objevil červeně floureskující rybu.

30 Přirozená fluorescence V přirozeném světle mají ryby (Enneapterygius pusillus) nevýraznou šedou barvu. Červenou fluorescenci lze vidět při pohledu přes červený filtr.

31 Nepřímá fluorescence Lokalizace proteinů v nábrusech barevných vrstev Syprem Ruby Fotografie nábrusu vzorku odebraného ze středověkého sousoší Oplakávání Ježíše Krista před barvením (vlevo) a po barvení (vpravo) Syprem Ruby. (autor: I.C.A. Sandu, Š. Hrdličková Kučková)

32 Sekundární fluorescence - immunofluorescence Nejprve se určitý antigen nebo naopak protilátka označí fluorescenčním barvivem, jako je fluorescein nebo rhodamin. Následně se přidají ke svému odpovídajícímu komplementárnímu antigenu nebo protilátce, což se v typickém případě uskutečňuje na podložním skle se vzorkem tkáně. Díky tomu se požadovaná molekula ve vzorku tkáně zbarví pomocí navázaných fluorescenčních látek, je jasně viditelná a může být pozorována např. pod fluorescenčním mikroskopem např. pod UV zářením.

33 Pozorování mitotického dělení (mitózy) Na digitálním fluorescenčním mikrosnímku je zobrazena dělící se epiteliální buňka v pozdních fázích cytokinese. Chromatin je obarven modrou fluorescenční sondou (DAPI), zatímco mikrotubulová síť cytoskeletu (vřeténko) je obarveno zeleně (Alexa Fluor 488), buněčné mitochondrie jsou obarveny červeným barvivem (MitoTracker Red CMXRos). Mitochondrie jsou stále rozptýleny po celé cytoplazmě, dříve kondenzované chromozómy se rozvolňují. Tenký můstek (midbody) mezi buňkami, je vidět pod mikroskopem několik hodin před tím, než zcela zmizí a vytvoří se dvě zcela nezávislé dceřiné buňky.

34 Mitóza micro.magnet.fsu.edu

35 Fluorescenční detekce na Western blotu (kitem WesternBright MCF) Detekce fluorescencí je ekonomičtější, pokud jde o čas i peníze. Může jí být detekováno více proteinů v jednom blotu. Můžeme provádět kvantitativní analýzu fosforylovaných a nefosforylovaných isoforem proteinů.

36 Fluorescenční detekce na Western blotu (kitem WesternBright MCF) Fluorescenční detekce blotu poskytuje spolehlivější diferenční analýzu.

37 DĚKUJI ZA POZORNOST

38 Reference 1) ological_emphasis/chapter 4%3A_Structure_Determination_I/Section_4.2%3A Infrared_spectroscopy 2) 3) 4) FT-IR/LUMOS/AN/AN102_LUMOS_identification_fibers_EN.pdf 5) 6) level-1-theoretical-foundations/ 7) 8)

39 9) 10) 11) micro.magnet.fsu.edu 12) 13) 14) 15) 16) 17) 18) 19) es.jpg

40 20) 21) 22) 23) Molecular Spectroscopy, Introduction to Sample Handling, Thermo 24) 25) Miller L.M.; Bourassa M.W.; Smith R.J.: FTIR spectroscopic imaging of protein aggregation in living cells, BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-BIOMEMBRANES, 1828, (2013). 26) Menzies G.E.; Fox,H.R.; Marnane C. et al.: Fourier transform infrared for noninvasive optical diagnosis of oral, oropharyngeal, and laryngeal cancer. TRANSLATIONAL RESEARCH, 163, (2014 ).