Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie"

Vladimír Kučera
před 7 lety
Počet zobrazení:

Ondřej Zítka, Ph.D. Datum: 17.5.2013 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.3.00/20.

1 Název: Školitelé: Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie MSc. Miguel Angel Merlos Rodrigo, Mgr. Ondřej Zítka, Ph.D. Datum: Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.3.00/ Název projektu: Mezinárodní spolupráce v oblasti in vivo zobrazovacích technik

2 MALDI - MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization = laserová desorpce/ionizace za účasti matrice - tzv. měkká ionizační technika převážně se tvoří molekulární ionty [A+H] + v pozitivním iontovém módu, kde A je analyt a H je atom vodíku - energii laseru absorbuje převážně matrice (organická kyselina), která je v nadbytku nad analytem a po desorpci mu předává náboj - vhodná ionizační metoda pro analýzu celých molekul peptidů, proteinů, oligonukleotidů a dalších (cit )

3 TOF (TIME-OF-FLIGHT) - průletový hmotnostní analyzátor analyzuje hmotnosti iontů na základě jejich doby letu od iontového zdroje k detektoru m z = 2eU t2 L 2 m je hmotnost, z je náboj, e je elementární náboj, U je vložené napětí, t je doba letu, L je délka driftové zóny - po každém pulsu laseru je vždy zaznamenáno celé hmotnostní spektrum, nemusí se proto dělat sken - analýza molekul o velmi vysoké hodnotě m/z; rozsah je teoreticky neomezený - krátká doba záznamu jednoho spektra to umožňuje měřit několik set spekter z jedné skvrny a tyto spektra pak zprůměrovat - vysoká citlivost díky dobré propustnosti iontů - vysokého rozlišení lze dosáhnout díky použití reflektoru (iontového zrcadla) a zpožděné extrakce - reflektor zvyšuje rozlišení díky zaostřovacímu efektu, kdy ionty s větší kinetickou energií pronikají hlouběji do reflektoru a tím dochází k prodloužení jejich doby letu oproti iontům s menší kinetickou energií, ale se stejným poměrem m/z. - zpožděná extrakce - urychlovací napětí se aplikuje krátce po desorpci a ionizaci molekul analytu, díky tomu dochází v určité míře k vyrovnání rozdílů v počátečních rychlostech iontů vzniklých při desorpci. Schéma TOF analyzátoru z návodu k Bruker ultraflextreme MALDI-TOF/TOF

4 Příprava analytu a matrice - nejčastěji používané matrice: kyselina α-kyano-4-hydroxyskořicová (HCCA), kyselina 2,5-dihydroxybenzoová (gentisová; DHB), kyselina 3,5-dimethoxy-4- hydroxyskořicová (sinapová; SA), 2,4,6 -trihydroxyacetofenon (THAP), kyselina 3-hydroxypikolinová (3-HPA), dithranol (DIT), kyselina trans-3- indolakrylová (IAA) Analyt peptidy (< 10 kda) peptidy, proteiny (> 10 kda) oligonukleotidy (< 3 kda) nukleové kyseliny (> 3 kda) syntetické polární polymery syntetické nepolární polymery sacharidy Používaná matrice HCCA, DHB SA, DHB THAP HPA DHB DIT, IAA DHB, CHCA, THAP Základní aspekty: - matrice musí být v nadbytku nad analytem; c matrice 1000c analytu - roztok matrice by se měl připravit vždy čerstvý pro daný den - ph roztoku matrice musí být kyselé pro analýzu v pozitivním módu; pro okyselení se používá např. kyselina trifluoroctová (TFA) - podíl organického rozpouštědla... rychlejší odpaření rozpouštědla... méně času pro tvorbu krystalků matrice s analytem - analyt se musí kompletně rozpustit a měl by být čirý, případně se provede jeho purifikace (odsolením,...) - MALDI destička musí být čistá

Nanášení na MALDI destičku Mezi hlavní metody nanášení patří: - dried-droplet roztok analytu se smíchá s roztokem matrice v poměru 1:1 a vzniklá směs se nanese na destičku - quick and dirty roztok

5 Nanášení na MALDI destičku Mezi hlavní metody nanášení patří: - dried-droplet roztok analytu se smíchá s roztokem matrice v poměru 1:1 a vzniklá směs se nanese na destičku - quick and dirty roztok analytu se s roztokem matrice smíchá až přímo na destičce; většinou se jako první nanese roztok matrice, poté roztok analytu a nakonec se pomocí špičky mikropipety smíchají - overlayer nejprve se na destičku nanese roztok matrice v koncentrovaném organickém rozpouštědle (nejčastěji acetonu), pak se nanese směs roztoku analytu s roztokem matrice - sandwich jako první se nanese roztok matrice s vysokým obsahem organického rozpouštědla, poté se nanese roztok analytu a nakonec se nanese roztok matrice s menším obsahem organického rozpouštědla - fast evaporation nejprve se nanese roztok matrice s vysokým obsahem organického rozpouštědla, počká se, až se rozpouštědlo vypaří, a poté se nanese roztok analytu - vacuum drying postup je stejný jako u fast evaporation, akorát se rychlost vypařování rozpouštědla urychlí pomocí sníženého tlaku

6 Kalibrace - osa x se kalibruje většinou na směsi standardů peptidů či proteinů; nejčastěji se využívají tyto standardy: Peptid [M+H] +, monoizotopická m/z [Da] [M+H] +, průměrná m/z [Da] Bradykinin Angiotensin II Angiotensin I Substance P Bombesin Renin Substrate ACTH clip ACTH clip Somatostatin Protein [M+H] +,Průměrné m/z [Da] Insulin Ubiquitin I Cytochrom C Myoglobin Trypsinogen Protein A Albumin-hovězí (BSA) přibližně 66.5 kda

přesnost určení hmotnosti je 1 ppm - unikátní metoda samočistění iontového zdroje pomocí infračerveného laseru (jiný laser než

7 Bruker new ultraflextreme MALDI-TOF/TOF - 2 khz smartbeam TM II laser v TOF módu a 1 khz v TOF/TOF módu - umožňuje zaostřit laserový paprsek na do průměru až 10 µm to je vhodné pro MALDI Imaging a jeho vysoké prostorové rozlišení - rozlišení až a přesnost určení hmotnosti je 1 ppm - unikátní metoda samočistění iontového zdroje pomocí infračerveného laseru (jiný laser než je použitý pro ionizaci) zvyšuje životnost a udržuje potřebný výkon přístroje Fotky přístroje ultraflextreme v celku a po otevření krytu

8 Štěpení proteinu v gelu (z 1D nebo 2D gelové elektroforézy) 1) Připraví se 0.02 mg/ml trypsin z 0.1 mg/ml trypsinu k 20 µl 0.1 mg/ml trypsinu se přidá 80 µl 50 mm NH 4 HCO 3. 2) Ke vzorku gelu (gel je odbarvený a vysušený) s ukotveným proteinem se přidá 50 µl 0.02 mg/ml trypsinu, směs se promíchá a nechá se 60 minut inkubovat při pokojové teplotě. Občas se směs lehce promíchá. 3) Mikrozkumavka se vloží do termostatu a nechá se 2 hodiny inkubovat při 45 C. 4) Supernatant se opatrně odsaje mikropipetou do nové mikrozkumavky (I) a sníží se jeho hodnota ph pod 4 pomocí kyseliny octové. 5) Ke kouskům gelu se přidá 50 µl extrakčního roztoku (5% kyselina octová v 75% ACN) a 15 minut se směs nechá jemně třepat. 6) Supernatant se odsaje do nové mikrozkumavky (II) a zopakuje se bod č. 5 s dalším přídavkem 50 µl extrakčního roztoku. 7) Roztoky v mikrozkumavkách (I) a (II) se nechají při sníženém tlaku (nebo v dusíkové odparce) zkoncentrovat na objem přibližně 25 µl. 8) Z každé mikrozkumavky se odebere 10 µl do mikrozkumavek určených pro purifikaci pomocí ZipTip TM. 9) Purifikace pomocí ZipTip TM špiček a následné nanesení purifikovaných vzorků na MALDI destičku.

Peptidové mapování (PMF = peptide mass fingerprinting) - po selektivním štěpení proteinu trypsinem, který štěpí peptidové vazby za lysinem (K) nebo argininem (R), pokud po nich nenásleduje prolin

peptidů uloženými v databázi (SwissProt, NRDB, TrEMBL, aj.) - k porovnání dat slouží různý software (např.

9 Peptidové mapování (PMF = peptide mass fingerprinting) - po selektivním štěpení proteinu trypsinem, který štěpí peptidové vazby za lysinem (K) nebo argininem (R), pokud po nich nenásleduje prolin (P), se získá směs peptidů, jejichž hmotnosti získané pomocí MALDI-TOF poslouží k identifikaci výchozího proteinu - identifikace probíhá na základě srovnání získaných hmotností peptidů s hmotnostmi peptidů uloženými v databázi (SwissProt, NRDB, TrEMBL, aj.) - k porovnání dat slouží různý software (např. Mascot) - pravděpodobnost správné identifikace původního proteinu závisí na několika faktorech, jako např. na poměru nalezených/zadaných peptidů (expectation factor) nebo na procentu pokrytí sekvence v případě Mascotu nám definuje pravděpodobnost určení tzv. log(score), který když je 70, tak poukazuje na to, že daný výsledek je signifikatntní na zvolené hladině pravděpodobnosti Následující obrázek ukazuje identifikaci lysozymu C podle jeho štěpů:

10 Shrnutí - MALDI-TOF MS je metoda vhodná pro analýzu biomolekul; využívá se především pro identifikaci proteinů, bakterií, apod. - Před měřením je důležitá příprava analytu a matrice; musí se zvolit vhodné rozpouštědlo a případně je nutná purifikace/izolace analytu. - Cílem prezentace a navazujícího workshopu bylo seznámení spolupracovníků s metodou MALDI-TOF a s prací na přístroji Bruker ultraflextreme, což bylo splněno.

11 Poděkování Laboratoř metalomiky a nanotechnologií prof. Ing. René Kizek, Ph.D. doc. RNDr. Vojtěch Adam, Ph.D. Podpořeno projektem: NANOLABSYS CZ.1.07/2.3.00/

12 Děkuji za vaší pozornost Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.3.00/ Název projektu: Mezinárodní spolupráce v oblasti in vivo zobrazovacích technik

Podobné dokumenty

Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie část 3 - Provedení štěpení proteinů a následné analýzy,

Laboratoř Metalomiky a Nanotechnologií Hmotnostní detekce biologicky významných sloučenin pro biotechnologie část 3 - Provedení štěpení proteinů a následné analýzy, vyhodnocení výsledků, diskuse Anotace