2. PROTEINOVÉ TECHNIKY

Transkript

1

2 OBSAH 1. DNA TECHNIKY (P. Kotrba, Z. Knejzlík) Polymerasová řetězová reakce - klonování DNA in vitro Polymorfismus DNA a jeho analýza VNTR sekvence, jejich význam v kriminalistice a diagnostice některých onemocnění Lokus D1S Praktické úlohy Analýza polymorfismu lokusu D1S Izolace genomové DNA z buněk ústní sliznice Amplifikace lokusu D1S80 pomocí PCR Analýza výsledku PCR a anticipované výsledky Izolace DNA z buněk Izolace většího množství DNA z epiteliálních buněk Příprava genomové DNA z cibule kuchyňské Analýza DNA a proteinů pomocí elektroforesy v agarosovém gelu Standardní badatelská elektroforesa DNA v agarosovém gelu Agarosová elektroforesa DNA v krabičce Proteinová nativní elektroforesa v krabičce Papírový model DNA PROTEINOVÉ TECHNIKY (J. Lipov, P. Ulbrich) Enzymy Sacharidy α-amylasa, stanovení její aktivity ve slinách a vliv reakčních podmínek na enzymovou aktivitu Tajemné chování strukturních virových proteinů - jak přinutit stovky molekul proteinu aby se poskládaly do sférické částice? Retrovirové strukturní proteiny Praktická úloha aneb složte si částice podobné virům ve zkumavce a podívejte se na ně BAREVNÁ OBRAZOVÁ PŘÍLOHA

3 1.. DNA TECHNIIKY POLYMERASSOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE -- KLONOVÁNÍÍ DNA IIN VIITRO PCR (z angl. Polymerase chain reaction) umožňuje rychlé, velice citlivé a specifické pomnožení (amplifikaci) konkrétní nukleotidové sekvence obsažené v jakékoliv molekule deoxyribonukleové kyseliny (DNA) a případně i ribonukleové kyseliny (RNA). Jak bude popsáno v následujícím textu, tato technika je prováděna zcela v podmínkách in vitro. Vedle využití v molekulárně biologickém výzkumu nalezla PCR řadu praktických aplikací - je dnes široce využívána v genovém inženýrství pro namnožení (klonování) genu z malého vzorku nukleové kyseliny a jeho případné pozměnění (mutaci), pro detekci geneticky modifikovaných organismů (např. plodin pro výrobu potravin), v diagnostice při analýze genetických chorob, detekci virových infekcí, při určování genetického polymorfismu (např. při cíleném šlechtěných rostlin) nebo v soudním lékařství k identifikaci osob. V molekule DNA se deoxyribonukleotidy spojují prostřednictvím kovalentní fosfodiesterové vazby mezi fosfátem na hydroxylu uhlíku C5 (5 ) deoxyribosy jednoho nukleotidu a hydroxylem na C3 (3 ) následujícího nukleotidu do dlouhých polynukleotidových řetězců vlákna DNA. Tímto uspořádáním je také určena polarita lineární molekuly, která má na jednom konci volný fosfát na C5 deoxyribosy (označován jako 5 konec) a na druhém hydroxyl na C3 deoxyribosy (označován jako 3 konec). Protože oba řetězce dvojřetězcové DNA obsahují sekvence nukleotidů, které jsou navzájem přesně komplementární, mohou obě vlákna sloužit jako templát (matrice, předloha) pro syntézu nového komplementárního vlákna za vzniku dvou identických dvojřetězcových DNA kopírování (klonování) DNA. Jinými slovy, pokud si jeden řetězec označíme jako plus a druhý minus, může plus řetězec sloužit jako templát pro syntézu nového minus vlákna, zatímco původní minus vlákno je předlohou pro nové vlákno plus (Obr. 1.1 A, viz příloha). Tvorba nového vlákna je katalyzována enzymem DNA polymerasou. Tento enzym katalyzuje syntézu vlákna DNA z monomerních deoxyribonukleotidů (C, T, G, A) ve formě trifosfátů, z nichž odštěpuje dvě fosfátové skupiny a fosfodiesterovou vazbou spojuje vzniklé nukleotidové monofosfáty do polynukleotidového řetězce. Polymerasa připojuje jednotlivé nukleotidy komplementární k matrici tak, že napojuje nový deoxyribonukleotid prostřednictvím jeho fosfátu na hydroxylové skupině uhlíku 5 ribosy na volný hydroxyl na uhlíku 3 z koncového deoxyribonukleotidu rostoucího řetězce DNA. Důležitou vlastností DNA polymeras je, že neumí iniciovat polymeraci vlákna DNA de novo, ale vyžadují přítomnost jednořetězcového úseku DNA (primeru) již připojeného vodíkovými můstky na templátový řetězec DNA. Tento primer, který poskytuje koncový 3 hydroxyl ribosy, pak prodlužují (Obr. 1.1 A, viz příloha). Z uvedeného je patrné, že před tím, než dojde k syntéze nového řetězce musí být přerušeny vodíkové vazby mezi komplementárními bazemi dvojřetězcové templátové DNA a jednotlivé řetězce odseparovány. Za podmínek in vitro lze přerušit vodíkové můstky (denaturovat dvojřetězcovou DNA) dodáním tepelné energie. Jinými slovy, při zvyšování teploty roztoku DNA dvojšroubovice postupně taje až do úplného oddělení obou řetězců (Obr. 1.1 B, viz příloha). Křivka tání dvojšroubovice DNA má sigmoidní charakter a teplotu při níž došlo k přerušení 50% vodíkových můstků (inflexní bod) označujeme jako bod tání, T m (z angl. melting). Při zpětném ochlazování se komplementární řetězce DNA opět spojují vodíkovými vazbami hybridizují za vzniku dvojřetězcové molekuly

4 Představme si nyní situaci, kdy jsou ve vhodném reakčním roztoku dvojřetězcová templátová DNA, směs deoxyribonukleotidů, pár primerů a DNA polymerasa. Primer je krátkým jednořetězcovým oligonukleotidem, nejčastěji o délce nukleotidů. Každý primer je komplementární k sekvenci jednoho řetězce templátové DNA na opačných koncích úseku, jehož amplifikace pomocí PCR má být provedena (Obr. 1.1 A a Obr. 1.2, viz příloha). Sekvenci množeného úseku DNA tedy nemusíme nutně znát, ale musí ležet mezi dvěmi krátkými úseky známé sekvence. Po tepelné denaturaci templátové DNA je reakční směs ochlazena na teplotu při níž se mohou tvořit vodíkové můstky mezi komplementárními úseky řetězců DNA (hybridizace). Může tak dojít jednak k rekonstituci původní dvojřetězcové molekuly, ale především dochází k hybridizaci primerů (angl. také annealing), které jsou ve významném molárním přebytku oproti templátové DNA, na cílové sekvence na jednotlivých řetězcích templátu k nimž jsou komplementární. Následně je teplota reakční směsi upravena na teplotu vhodnou pro enzymovou reakci a DNA polymerasa prodlužuje jednotlivé primery napojováním odpovídajících deoxyribonukleotidů (extenze primerů). Vzniká tak nová molekula dvojřetězcové DNA (Obr. 1.2, viz příloha). Každé opakování denaturace, hybridizace primerů a syntézy nového řetězce DNA (extenze primerů) označujeme jako amplifikační cyklus. Každý nově syntetizovaný řetězec se stává templátem pro amplifikaci v následujících cyklech a dochází tak k selektivnímu pomnožení úseku DNA definovaného na koncích jednotlivými primery. Jak je patrné z Obr. 1.2, dvojřetězcová DNA vznikající v prvním a druhém cyklu nemá přesně definovanou délku, protože DNA polymerasa může v prvním cyklu pokračovat v polymeraci na kontinuálním řetězci templátové DNA do doby než dojde k teplotní denaturaci v následujícím amplifikačním cyklu. Od třetího cyklu se však vznikají molekuly DNA (ampliony v rámečku) definované délky, jejichž počet roste od čtvrtého cyklu exponenciálně. Počet amplikonů m vzniklých z x templátových molekul bude po n proběhlých cyklech teoreticky m = (2 n 2n)x kdy člen 2n odpovídá produktům nedefinované délky vznikajím v 1. a 2. cyklu. Např. po 30 cyklech by měl být teoretický výtěžek z 1 templátové molekuly při 100%-ní účinnosti ve všech cyklech prakticky Znamená to tedy že z jediné templátové dvojřetězcové DNA o délce 1000 párů nukleotidů, jejíž hmotnost je 1 ag (10-18 g) bychom po 30 cyklech mohli získat 1 ng (10-9 g) amplionů stejné délky, což je množství dostatečné pro většinu dalších aplikací. Ačkoliv je PCR extrémně efektivní metodou, akumulace produktů exponenciální řadou není neomezený proces a v praxi je po 30 cyklech standardně dosahováno výtěžku asi 10 6 amplikonů což odpovídá asi Pro dosažení potřebného výtěžku je tedy nutno úměrně volit počet cyklů nebo templátových molekul DNA. Snížení efektivity amplifikace je výrazné především v pozdějších cyklech, kdy se snižuje koncentrace volných primerů i volných nukleotidů a po denaturaci hybridizují stále častěji jednotlivé řetězce amplikonů mezi sebou a brání tak hybridizaci primerů. Limitujícím faktorem se stává i množství aktivní DNA polymerasy. Princip PCR byl objeven v roce 1985 Kary Mulinsem, který pracoval pro firmu Cetus Corporation (Kalifornie) a byla mu za něj v roce 1993 udělena Nobelova cena. Původní technika PCR využívala pro polymeraci nukleotidů enzymu DNA polymerasy I z bakterie Escherichia coli, která je běžnou součástí střevní mikroflóry a žije při teplotách okolo 37º C. Vzhledem k tomu, že i enzymová výbava této bakterie je uzpůsobena těmto teplotám, dochází při teplotách používaných pro denaturaci DNA (okolo 95º C, Obr. 1.1 B, viz příloha) k teplotní inaktivaci jejích enzymů včetně DNA polymeras. Proto bylo nutno po každé denaturaci templátu přidat do reakce nový podíl DNA polymerasy I, což výrazně komplikovalo celý proces. Podíl manuální práce navíc zvyšovala skutečnost, že změny teploty byly realizovány přenášením zkumavek s reakční směsí do lázní s odpovídající teplotou. Obrat nastal s objevem termostabilních DNA polymeras a vývojem automatických zařízení, - 3 -

5 v nichž lze realizovat kroky denaturace, hybridizace a enzymové polymerace, tzv. termocyklérů. První termostabilní DNA polymeráza, Taq polymerasa, byla získána z bakterie Thermus aquaticus a její teplotní optimum je 72 º C. Termostabilní DNA polymerasy si zachovávají aktivitu i po několika desítkách až stovkách minut inkubace při 95º C a postačí tak jejich přídavek do reakční směsi na počátku PCR. V současné době jsou nejpoužívanější termocykléry vybaveny jedním temperovaným blokem, který umožňuje měnit teplotu rychlostí 1º C.s -1. Termocyléry jsou dále vybaveny mikroprocesorem a jednoduchý software umožňuje nastavit jednotlivé kroky teplotního profilu PCR POLYMORFFIISSMUSS DNA A JJEHO ANALÝZA Polymorfními úseky DNA nazýváme takové oblasti (regiony) v genomu, které vykazují významnou sekvenční variabilitu mezi jedinci uvnitř populace. V případě analýzy několika těchto regionů v genomu jedince dostáváme unikátní otisk palce DNA (dále jen DNA fingerprint). DNA fingerprint je rutinně využíván mimo jiné k identifikaci osob v důkazních řízeních při soudních procesech, při určovaní rodičovství nebo příbuzenských vztahů. Polymorfismus DNA je také využíván v lékařské praxi při diagnostice chorob s genetickým základem. Nejčastěji používaným DNA fingerprintem je analýza polymorfismu fragmentů DNA lišící se v délce, tato metoda je známa pod označením FLP (z angl. Fragment Length Polymorphism). Takový polymorfismus DNA lze určovat více způsoby. Všem metodám je společná analytická koncovka spočívající v určení délky fragmentů, nejčastěji pomocí elektroforézy v agarosovém nebo polyakrylamidovém gelu. Jednou z poměrně specifických metod je AFLP (z angl. Amplified Fragment Length Polymorphism). Při této metodě je vzorek DNA nejprve štěpen restrikční endonukleasou, která rozpoznává specifickou sekvenci 4 až 8 nukleotidů na molekule DNA, kde štěpí. Společným rysem těchto sekvencí je, že je můžeme číst u dvouřetězcové molekuly zprava doleva na jednom řetězci stejně jako zleva doprava na řetězci druhém, hovoříme o palindromních sekvencích (Obr. 1.3 A, viz příloha). Na konce těchto fragmentů jsou připojeny krátké adaptorové fragmenty DNA známé sekvence (Obr. 1.3 B, viz příloha). Směs takto upravených fragmentů pak slouží jako templát v PCR v níž je použit primer, jehož sekvence plně komplementární k adaptoru (specifické PCR) je 3 konci zakončena jedním ze 4 nukleotidů, který již neodpovídají sekvenci adaptoru (Obr. 1.3 C, viz příloha). Takový primer bude v PCR extendován pouze za předpokladu, že 5 konec úseku DNA vyštěpeného v 1. kroku obsahuje komplementární nukleotid(y). V zásadě je tímto přístupem detekován i) odlišnosti v sekvenci DNA jako rozdílu v rozložení cílových míst pro restrikční endonukleasy při záměně jedné báze cílového místa restrikční endonukleasy nedochází ke štěpení ii) odlišnosti v sekvenci následující po cílovém místu pro restrikční endonukleasu vznikem nebo absencí amplikonu. iii) inzerce nebo delece v oblastech mezi dvěmi konzervovanými regiony obsahujícími cílové místo pro danou restrikční endonukleasu. Často je primer navržen tak, že je na 3 konci zakončen ne jedním nukleotidem, ale kombinací více (obvykle 3) nukleotidů, čímž je omezen počet vznikajících produktů a výsledná analýza je přehlednější. Adaptory a primery s různými extenzemi kombinací nukleotidů na 3 koncích jsou dostupné jako součást komerčních souprav pro analýzu polymorfismu

6 Další metodou je ARFLP (z angl. Amplified Restriction Fragment Length Polymorphism). Principem této metody je amplifikace požadovaného úseku DNA z kompletní (tedy neštěpené) genomové DNA pomocí PCR a vzniklý amplikon je podroben restrikční analýze a je tak detekována přítomnost a rozmístnění palindromních sekvencí rozpoznávaných vybranou restrikční endonukleasou. Jinou metodou, která na rozdíl od předchozích nevyužívá PCR technologii, je RFLP (z angl. Restriction Fragment Length Polymorphisms). Analyzovaná genomová DNA je nejprve štěpena vybranými restrikčními enzymy a vzniká směs fragmentů různých délek. Fragmenty DNA se poté elektroforeticky rozdělí podle velikosti v agarosovém gelu a po denaturaci dvojřetězcové DNA při vysokém ph se oddělená vlákna přenesou na vhodnou membránu, kde jsou vlákna DNA zafixována (tzv. Southernův přenos). Následně se přidá tzv. značená sonda komplementární k jednomu vláknu hledané sekvence a dochází k hybridizaci. Sondou bývá jednořetězcová DNA o délce 10 až 1000 bazí, která je modifikovaná radioaktivním prvkem nebo chemickou molekulou, jež umožní její detekci. Po odmytí přebytku sondy se detekuje velikost fragmentu, na kterém došlo k jejímu navázání, tj. kde se nalézá hledaná sekvence. Přestože tato technika vyžaduje relativně vysoké množství DNA (mikrogramy) a časově náročné techniky, její použití je stále velmi rozšířeno v medicíně pro průkaz geneticky podmíněných chorob VNTR SSEKVENCE,, JJEJJIICH VÝZNAM V KRIIMIINALIISSTIICE A DIIAGNOSSTIICE NĚKTERÝCH ONEMOCNĚNÍÍ Velmi častým DNA fingerprintem je průkaz tzv. VNTR sekvencí (Variable Number of Tandem Repeats). Nachází se v různých místech lidského genomu (tzv. lokusy) obsahující krátká opakování shodných motivů, jako např GAATGAATGAAT (tzv. repetitivní sekvence). Počet opakování těchto repeticí se u různých jedinců v populaci liší (obvykle 4 40). Díky variabilitě těchto sekvencí v populaci získá každý jedinec s vysokou pravděpodobností různé VNTR-sekvence od matky a od otce a tak dvě nepříbuzné osoby obvykle nemají tyto lokusy stejné. Tyto oblasti mají proto využití v kriminalistice při identifikaci osob. Na Obr. 1.4 (viz příloha) je demonstrován zjednodušený modelový příklad, kdy jsou zatčeny tři osoby (A,B,C) podezřelé ze spáchání trestného činu. Genetický materiál těchto osob byl použit pro amplifikaci lokusů VNTR-sekvencí pomocí PCR. Analýza délek amplikonů a porovnání se soudním vzorkem z místa činu prokázala, že osoba B má shodnou délku testovaných lokusů, a je tedy pravděpodobné, že biologický materiál z místa činu patří právě jí. VNTR sekvence se mohou v genomu nacházet v kódujících genových oblastech tak i v oblastech nekódujících. V současné době jsou popsány některé geneticky podmíněné choroby, které jsou způsobeny přítomností nadměrného množství trinukleotidových repeticí (také se jedná o VNTR) v některých genech. Příkladem těchto chorob mohou být syndrom Fra-X (Fragile X syndrome), Kennedyho choroba, myotonická dystrofie a Huntingtonova choroba (Obr. 1.5) Syndrom Fra-X je po Downově syndromu druhou nejčastější příčinou mentální retardace. Onemocnění je způsobeno nadměrným počtem trinukleotidových repeticí CGG v genu FMR-1, které jsou lokalizovány před kódující sekvencí. Počet těchto repeticí se u zdravé populace pohybuje v rozmezí 6 53 a k onemocnění dochází vzroste-li počet těchto repeticí nad 200. Toto nadměrné množství repeticí způsobí methylaci DNA což následně vede k potlačení exprese genu FMR-1. Podobným případem je i Kennedyho choroba - 5 -

7 (spinobulbární svalová atrofie). Jedná se o neléčitelnou nervo-svalovou chorobu, která je způsobena mutacemi v genu pro androgenový receptor (AR receptor). Tento gen je lokalizován pouze na chromosomu X (pozice Xq11-q12), takže nejčastěji jsou postiženi muži, kdežto ženy jsou pouze přenašečky. Má-li žena mutantní obě alely genu pro androgenový recptor (dva X chromosomy) je u nich onemocnění mnohem méně závažné než u mužů. Podstatou tohoto onemocnění je inzerce nadměrného počtu repeticí CAG ve čtecím rámci AR receptoru. Ve vzniklé molekule AR receptoru je výsledně vysoký počet glutaminových zbytků (angl. tzv. polyglutamine tract), takže tento receptor není plně funkční. Se zvyšujícím počtem repeticí CAG roste i závažnost onemocnění. Choroba propuká v adolescenci až do pozdního věku, nejčastěji však ve středním věku, a projevuje se ochabnutím jazyka a obličejových svalů. Někdy je také patrný úbytek svalstva na končetinách. Pro syndrom jsou také charakteristické endokrinní změny, které mohou vést k nedokonalému vývinu vnitřních nebo vnějších genitálií (gynekomastie). Mnoho postižených mužů má mírně zvýšené hladiny testosteronu a estradiolu, což je charakteristické pro syndrom necitlivosti k androgenům. Shodnou inzercí repetice (tj. CAG), ale v jiném genu (gen huntington) je způsobena Huntingtonova choroba. Jedná se o onemocnění provázené poruchou mozkové činnosti způsobené odumíráním mozkových buněk. Většinou se tato choroba projevuje mezi 35 a 45 rokem života (existuje však i juvenilní forma) s četností 5 10 případů na obyvatel. Manifestací choroby je výskyt mimovolních pohybů, zhoršování intelektu a změny chování s následnými problémy jako je polykání a žvýkání (ztráta kontroly nad krčními a ústními svaly). Molekulární podstatou choroby je produkce defektního proteinu Huntingtin v mozkových buňkách právě v důsledku vysokého množství inzercí sekvencí CAG v jeho genu. Tento defektní protein potom způsobuje odumírání mozkových buněk ve kterých se vyskytuje. Příčinou myotonické dystrofie (typ DM1) je přítomnost vysokého počtu repetic CTG v 3 netranslatovaném regionu genu pro myotonin kinasu. Choroba může propuknout kdykoli v průběhu života jedince.v tabulce I je srovnána korelace mezi počtem repeticí a závažností syndromu. Charakteristické pro tuto chorobu je, že její průběh je těžší u potomků. Důvodem je, že v průběhu gametogeneze dochází ke zvyšování počtu těchto CTG repeticí (tzv. dynamické mutace). Dispozice k výše zmíněným a dalším podobně způsobeným chorobám lze u osob diagnostikovat pomocí PCR s použitím specifických primerů hybridizujících v okolí repeticí. Délka produktu PCR (amplikonu) je úměrná počtu repeticí

8 Tabulka I: Korelace mezi počtem repeticí CTG v genu pro myotonin kinasu. Zdroj: Zdeněk Ambler, Neurologie pro praxi, 3, (2004) Tabulka 1. Korelace fenotypu a velikosti CTG repetic u myotonické dystrofie (DM1) fenotyp klinické příznaky CTG repetice věk začátku (roky) průměrný věk úmrtí (roky) premutace žádné 38 až ~49 normální stav normální mírný katarakta 50 až ~ normální mírná myotonie klasický slabost ~100 až ~ myotonie katarakta čelní pleš srdeční arytmie ostatní 1500 kongenitální infantilní hypotonie respirační poruchy mentální retardace ~1000 až >2000 narození až Obr. 1.5: Schematické znázornění inzercí trinukleotidových repeticí v některých genech (zde znázorněné jako mrna). Uveden je počet repeticí, který nezpůsobuje uvedené onemocnění. Podrobněji viz text. Tlustá čára kodující region genu (cds; překládá se do sekvence proteinu); tenká čára netranslatovaná část genu (UTR; může mít vliv na průběh translace, transkripce nebo lokalizaci mrna); (AAA)n polyadenylace (zvyšuje stabilitu mrna)

9 1..4 LOKUSS D1S80 Klasickým typem VNTR je lokus D1S80 nacházející se na chromosomu 1 (největší lidský chromosom), jedná se o nekodující oblast DNA, která není spojována s žádným lidským onemocněním. Tento lokus obsahuje repetitivní sekvence o délce 16 pb (Obr. 1.6) a je společně s dalšími typy VNTR hojně využíván v kriminalistice k identifikaci osob. Do dnešní doby bylo zjištěno 29 různých alel D1S80 v rozsahu délek 200 až 700 pb lišící se množstvím repeticí (14 40). Lidský genom je diploidní a každá z kopií je děděna po jednom z rodičů Mendelovským způsobem. Z pohledu kombinatoriky tedy existuje 435 možných alelických kombinací. Bylo zjištěno, že 86 % populace jsou heterozygoti. Jestliže si zvolíme více typů VNTR je vysoce nepravděpodobné, že na světě nalezneme dva jedince se shodnými alelami ve všech lokusech VNTR. Cílem následující praktické úlohy je amplifikace lokusů D1S80 z DNA izolované z buněk ústní sliznice a určení jeho délky. Obr. 1.6: Nukleotidová sekvence p lokusu D1S80 obsahující 19 repeticí o délce 16 pb, které jsou seřazeny pod sebou. Podtržené sekvence znázorňují oblasti se kterými hybridizují specifické primery použité pro analýzu délky různých alel D1S80 pomocí PCR v následující úloze

10 1..5 PRAKTIICKÉ ÚLOHY ANALÝZA PPOLYMORFFIISSMU LOKUSSU D1S80 Následující protokoly popisují postup izolace DNA z buněk ústní sliznice, amplifikaci vybrané VNTR a její analýzu. První krok představuje izolaci suspenze stovek až tisíců buněk obsahujících vaši genomovou DNA prostým opláchnutím bukání sliznice isotonickým roztokem NaCl. Z malého množství suspenze bude následně ostředěním izolována část buněk, které budou resuspendovány v malém množství isotonického roztoku NaCl (dojde tak k jejich zkoncentrování). K této suspenzi bude přidán komerční produkt Chelex (kyselina iminodioctová imobilizovaná na částečky polystyrenu) vyvazující kovovové ionty (především Mg 2+ ), které by mohly napomáhat degradaci DNA. Mg 2+ a ostatní kovové ionty totiž mohou sloužit jako kofaktory enzymů DNas obsažených ve slinách, které štěpí molekuly DNA na krátké fragmenty. Vzorek poté bude zahřát na 99 C, čímž dojde jednak k rozpadu buněk a uvolnění DNA do roztoku, a dále k tepelné dentaturaci a precipitaci většiny buněčných proteinů. Precipitát a Chelex budou následně odděleny od buněčného lyzátu obsahujícího DNA odstředěním. Takto získaná DNA bude použita jako templát pro PCR se specifickými primery pomocí nichž budou amplifikovány lokusy D1S80. Jejichž délka bude analyzována elektroforézou v agarosovém gelu. Cílem následujících úloh je: 1. izolace genomové DNA popsaná v tomto protokolu (protokol ) 2. amplifikace D1S80 VNTR pomocí PCR (protokol ) 3. analýza produktů PCR pomocí 1,5% agarosové elektroforesy a vyhodnocení Elektroforeogramu (protokol ) Materiál a chemikálie pro následující úlohy: kelímek 1,5 ml centrifugační mikrozkumavky ( eppendorfky ) 0,2 ml mikrozkumavky pro PCR automatické pipety (P-20, P-200, P-1000) termocykér centrifuga elektroforetická aparatura 10 ml sterilního 0,9% roztoku NaCl Chelex (Sigma) komponenty pro PCR směs deoxyribonukleotidů Taq DNA polyemrasa primery (specifické pro lokusy D1S80) pufr pro Taq polyemerasu DMSO voda bez nukleas agarosa TBE pufr ethidium bromid vzorkový pufr pro elektroforézu - 9 -

11 Provedení: IIZOLACE GENOMOVÉ DNA Z BUNĚK ÚSSTNÍÍ SSLIIZNIICE 1. Převeďte z kelímku 10 ml 0,9% vodného roztoku NaCl do vašich úst. Solný roztok v ústech intenzivně převracejte a pomocí zubů seškrabujte bukání sliznici po dobu 1-2 min. 2. Převeďte výplach z úst zpět do kelímku a zamíchejte jej. 3. Pipetujte 1 ml ústního výplachu do předem označené 1,5 ml centrifugační mikrozkumavky. 4. Odstřeďte vzorek při x g po dobu 2 min (vzorky musí být v rotoru centrifugy uspořádány symetricky, aby byl rotor vyvážený)

12 5. Vyjměte mikrozkumavku z rotoru a přesvědčte se, zda-li se na dně vytvořila buněčná peleta. Opatrně odstraňte supernatant (zpět do kelímku). Poznámka: ve zkumavce může zůstat malé množství kapaliny 6. Resuspendujte buněčnou peletu ve 30 µl 0,9% roztoku NaCl. Intenzivně peletu resuspendujte pomocí propipetování (způsobem nasátvytlačit ) nebo uzavřenou mikrozkumavkou přejíždějte po stojánku na mikrozkumavky. 7. Přepipetujte 30 µl suspenze do 0,2 ml mikrozkumavky pro PCR obsahující 200 µl 5%ního Chelexu. Mikrozkumavka musí být na víčku označena. 8. Vložte 0,2 ml mikrozkumavku do termocykléru a inkubujte ji při teplotě 99 C po dobu 10 minut. Poznámka: Zapamatujte si vaše umístění vzorku 9. Přepipetujte obsah do nové 1,5 ml mikrozkumavky a centrifugujte ji při x g po dobu 2 min

13 10. Odpipetujte 60 µl supernatantu (nesmí obsahovat částice Chelexu!) do nové 1,5 ml mikrozkumavky označené vaším kódem. Poznámka: tento vzorek představuje vaši DNA. 11. Vložte mikrozkumavku do stojánku a vyčkejte na další instrukce AMPPLIIFFIIKACE LOKUSSU D1SS80 PPOMOCÍÍ PPCR 1. Označte si vlastní 200 µl mikrozkumavku pro PCR jejím víčku. 2. Do této mikrozkumavky napipetujte čistou špičkou 20 µl tzv. Master mixu (složení viz poznámka pod protokolem). 3. Vyměnte špičku, a dále napipetujte 20 µl tzv. Primer Mixu (složení viz poznámka pod protokolem)

14 4. Pomocí pipety P-20 přidejte ke směsi v mikrozkumavce 10 µl DNA připravené podle předchozího protokolu ( ) Poznámka: homogenizujte směs několikerým pomalým pipetováním pipetou P-200 s objemem nastaveným na 30 µl. Vhodné: pro snížení nespecifických interakcí primerů s templátovou DNA lze do reakční směsi přidat navíc 2,5 µl DMSO 5. Vložte vaši mikrozkumavku se směsí pro PCR reakci do termocykléru a zapamatujte si její pozici. 6. Spustťe následující teplotní program optimalizovaný pro VNTR D1S80: 95 C, 10 minut 1cyklus 95 C, 15 sekund; 65 C, 30 sekund; 32 cyklů 72 C, 40 sekund; 72 C, 10 minut 1cyklus PCR reakce lze běžně připravit smícháním jednotlivých komponent (viz následující tabulka), ale pipetované objemy jsou příliš malé (desetiny až jednotky µl), což klade větší nároky na laboratorní praxi. Z toho důvodu se v této úloze používají Master a Primer mix obsahující předmíchané komponenty pro PCR. Tuto strategii je vhodné použít i v případech, kdy se jednotlivé PCR liší pouze v jedné komponentě (nejčastěji v templátu nebo primerech), která je pipetována samostatně a ostatní složky jsou přidány ve společném roztoku master mixu. V našem případě: Master mix obsahuje Taq DNA polymerasu, pufr pro Taq polymerasu, směs deoxynukleotidů Primer mix obsahuje ekvimolární směs primeru +D1S80 (dopředný primer) a -D1S80 (zpětný primer). Po vzájemném smísení těchto mixů, chromozomální DNA a DMSO vznikne PCR směs o následujícím složení: Složka PCR Finální koncentrace poznámka (množství) Genomová DNA ng Slouží jako templátová DNA a její množství závisí na úspěšnosti izolace. Primer +D1S80 0,2 µm Dopředný primer Primer -D1S80 0,2 µm Zpětný primer Směs deoxynukleotidů (datp, dgtp, dctp, dttp) 200 µm (každý) Složky důležité pro polymeraci DNA. Je nutné aby všechny

15 DMSO 5 % Pufr pro Taq polymerasu 1.5 mm MgCl 2, 50 mm KCl, 10 mm Tris-HCl ph 8,4 deoxynukleotidy byly ve stejném molárním poměru. Potlačuje nespecifické interakce primerů s templátem (chromozomální DNA) Mg 2+ ionty jsou nutné pro aktivitu (funkci) Taq polymerasy. KCl vytváří vhodné iontové prostředí. Složka Tris-HCl pufruje PCR směs v průběhu reakce na hodnotě ph 8.4 (ph optimum Taq pol.) Taq polymerasa 1 jednotka Enzym katalyzující elongaci řetězce DNA. Sekvence použitých primerů: Primer sekvence _ +D1S80 5 -GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3 -D1S80 5 -GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC ANALÝZA VÝSSLEDKU PCR A ANTIICIIPPOVANÉ VÝSSLEDKY Po skončení teplotního programu přidejte do reakční směsi obsahující produkty 10 µl vzorkového pufru a celou směs dobře promíchejte pomocí pipety. Pomocí elektroforesy v 1,5%ní agarosovém gelu analyzujte 6-8 µl směsi a fragmenty DNA (ampliony) vizualizujte pomocí ethidium bromidu (kap ). Pořiďte snímek výsledku elektroforézy (elektroforeogram). Na Obr. 1.7 je záznam elektroforeogramu z analýzy D1S80 VNTR tří nepříbuzných osob (A, B, C). V dráze C se nachází dva proužky o rozdílné délce. Tato osoba je tedy prokazatelně heterozygot. Každý proužek představuje amplikon (PCR produkt) vzniklý z rozdílných alel ležících na homologních chromozomech. V drahách A a B se nachází jeden silný proužek. Tento výsledek znamená, že dané osoby jsou buď homozygoti nebo heterozygoti jejichž alely se liší v obsahu 1 repetice (rozdíl 16 pb). K jejich rozlišení však za použitých podmínek nedošlo. Vyššího rozlišení lze dosáhnout např. volbou jiné koncentrace agarosy, použitím jiného molekulárního síta (polyakrylamid) nebo je možno analyzovat menší množství vzorku

16 Obr. 1.7: Elektroforeogram PCR analýzy lokusů D1S80 u tří osob (A, B, C). M- DNA marker, 1,5% agarosová elektroforesa. Počet repeticí v příslušné alele lze určit odečtem z kalibrační křivky závislosti mobility fragmentů DNA v agarosovém gelu na jejich délce. Pro sestrojení kalibrační křivky je třeba odečíst vzdálenosti jednotlivých proužků markeru od startu (nanášecího místa, jamek) a tyto hodnoty vynést do grafu proti známým délkám příslušných proužků (Obr. 1.8). Obr. 1.8: Závislost mezi vzdáleností pružku na agarosové elektroforese od nanášecího místa a délkou DNA. Pro sestrojení této křivky byl použit DNA marker na Obr

17 Výsledná závislost je logaritmická a rovnici kalibrační křivky lze získat např. pomocí programu MS Excel s proložením bodů logaritmickou funkcí. Z této rovnice lze vypočíst neznámou délku fragmentu na základě jeho mobility v gelu. Vzorek vzdálenost proužku od startu [mm] vypočtená délka AMPLIKONU [pb] A B 31,5 540 C 35,4; 32,8 410; 495 Použité primery ovšem nehybridizují bezprostředně před první respektive poslední repeticí, ale dále v oblastech s konzervovanou sekvencí (Obr 1.6). Tyto vzdálenosti je tedy nutné odečíst od vypočtené délky amplikonu. 5 konec dopředného primeru (+D1S80) je vzdálen 115 pb a zpětného primeru ( D1S80) 31 pb od VNTR celkem tedy 146 pb. Počet repeticí lze pak určit vydělením vypočtené délky VNTR sekvence v pb číslem 16 (repetice je 16 pb dlouhá). Vzorek vypočtená délka AMPLIKONU [pb] vypočtená délka REPETICÍ [pb] Počet REPETICÍ A B C 410; ; ; IIZOLACE DNA Z BUNĚK Příprava DNA je prvním krokem mnoha diagnostických metod a pro celou řadu biotechnologických aplikací. Metody pro izolaci DNA z mikroorganizmů, tkání a pletiv se liší především podle charakteru buněčných stěn, velikosti izolované DNA a její požadované kvality (čistota, intaktnost). Obecný sled kroků je: 1. desintegrace a lyze buněk, tj. rozrušení biologických membrán a případně buněčných stěn mechanicky, enzymovou hydrolýzou, alkalickou hydrolýzou, detergenty, osmotickým šokem nebo kombinací uvedených (u eukaryotních buněk případně i izolaci jader např. gradientovou centrifugací a jejich následnou lyzi). 2. odstranění kontaminujících biomolekul (především proteinů, polysacharidů a RNA), které lze realizovat enzymaticky proteasami a RNasami, gradientovou centrifugací, iontoměničovou chromatografií nebo precipitací. 3. separace DNA, kterou lze provést precipitací (ethanolem), iontoměničovou chromatografií, případně elektroforeticky IIZOLACE VĚTŠŠÍÍHO MNOŽSSTVÍÍ DNA Z EPPIITELIIÁLNÍÍCH BUNĚK V následující úloze si má každý možnost připravit vlastní genomovou DNA z epiteliálních buněk bukální sliznice. Tyto buňky se dělí 1-2krát denně, lze je získat velice jednoduchým a bezbolestným způsobem a DNA izolovat během 45 minut

18 Materiál a chemikálie: 15ml zkumavka s 3 ml pitné nebo destilované vody Lyzovací pufr (50 mm Tris.Cl, 1% SDS, ph 8,0) Roztok SE : 4M NaCl, 0,1M EDTA Roztok proteinasy K o koncentraci 10 mg/ml 96% velejemný ethanol nebo 91% isopropanol TE pufr (10 mm Tris.Cl, 1 mm EDTA, ph 8,0 v destilované vodě) Vodní lázeň nebo inkubátor nastavené na 50º C Ledová tříšť Pipeta (nastavitelná 1000µl automatická, nebo kalibrovaná Pasteurova pipeta) Provedení: Pro náš experiment s výhodou použijeme suspenzi epiteliálních buněk připravenou pro analýzu VNTR (kap ), proto přeskakujeme kroky Připravte si 15 ml zkumavku obsahující 3 ml vody a označte ji vhodným způsobem lihovým fixem. V našem případě použijeme 2. Jemně žvýkejte bukální sliznici po dobu 30 sekund Dochází ke stírání buněk epitelu podobně jako při žvýkání potravy. 3. Vypláchujte ústa 3 ml vody ze zkumavky po dobu 30 sekund (nepolkněte) a poté opatrně vraťte výplach do zkumavky. Získali jste suspenzi několik tisíc epiteliálních buněk. 4. Pomocí pipety přidejte k suspenzi buněk 2 ml lyzovacího pufru, zkumavku uzavřete a jemně promíchejte obsah překlápěním zkumavky (asi 5krát). V této fázi začíná docházet k rozpouštění membránových struktur jako jsou cytoplazmatická a jaderná membrána účinkem detergentu (dodecylsíran sodný; SDS). Pufrující složka (Tris.Cl, ph 8,0), udržuje hodnotu ph v oblasti fyziologických hodnot mezi ph 6-8. To je důležité, protože v kyselých roztocích DNA hydrolyzuje, může být depurinována, zatímco v zásaditém prostředí dochází k denaturaci molekuly DNA, tj. k oddělení jednotlivých rětězců a vzniku jednořetězcových molekul. 5. K suspenzi lyzujících buněk přidejte pomocí pipety 500 µl roztoku SE a 100 µl roztoku proteinasy K. Uzavřete zkumavku a obsah jemně promíchejte překlápěním zkumavky (asi 5krát). Přídavek proteinasy K není pro získání DNA nutný, ale snižuje množství proteinů kontaminujících výsledný preparát. 6. Umístěte zkumavku do vodní lázně vyhřáté na 50 ºC a inkubujte po dobu 10 min. V tomto kroku dochází k hydrolýze kontaminujících proteinů přidanou Proteinasou K (enzym je aktivní při 50 ºC a není denaturován při použité koncentraci SDS). Zvýšená teplota urychluje proces rozpouštění membrán. NaCl a EDTA, vytváří v tomto kroku vhodné reakční prostředí pro proteinasu (iontová síla) a chrání molekulu DNA před DNasami (všudypřítomnými enzymy, které štěpí DNA na krátké fragmenty. Aktivita DNas je závislá na přítomnosti dvoumocných kationtů kovů, především Mg 2+. Tyto kovy jsou z roztoku vyvazovány chelatačními činidly jako je EDTA a dochází tak k inaktivaci DNas. 7. Ponechte obsah zkumavky po předchozí inkubaci zchladnout na pokojovou teplotu. Otevřete zkumavku, držte ji nakloněnou pod úhlem 45º a opatrně po stěně zkumavky

19 přidejte 10 ml 95% ethanolu nebo 91% isopropanolu vychlazeného v ledové tříšti na 0 ºC. Alkohol, přidávejte několikrát pomocí pipety. NEMÍCHEJTE. 8. Pečlivě uzavřete zkumavku a ponechte ji ve stojánku při pokojové teplotě po dobu 5 min. Na vytvořené mezifázi pozorujte precipitující genomovou DNA. NaCl napomáhá při precipitaci DNA třemi způsoby. Jednak Na + neutralizuje negativní náboj, který DNA díky fosfátovým skupinám nese a umožňuje tak blízký kontakt molekul DNA. Zánik záporného náboje molekuly také znesnadňuje její solvataci molekulami vody, které jsou vlastně dipólem. Dále díky tomu, že NaCl je v roztoku takřka 100 %-ně disociován, se sám velmi silně solvatuje a tím odnímá DNA další molekuly vody (tzv. vysolovací efekt). Ethanol váže další molekuly vody a konečně způsobí precipitaci DNA, jež ztratila svůj hydratační obal. 9. Opatrně promíchejte obsah zkumavky překlápěním (asi 5krát). Pozorujte bílá nebo transparentní vlákna precipitované DNA. 10. Pomocí pipety skleněné tyčinky nebo špejle ze zkumavky vyjměte precipitovanou DNA do mikrozkumavky, kde ji lze po přídavku malého množství ethanolu nebo isopropanolu uchovávat. Pokud chcete precipitát převést do roztoku, obraťte mikrozkumavku dnem vzhůru, tak aby roztok alkoholu přenesený spolu s precipitátem mohl vytéct (DNA musí být přilepena ke stěně!) a nechte DNA vyschnout při pokojové teplotě. Dehydratovaná vysušená DNA je většinou transparentní (nahnědlá barva indikuje přítomnost RNA), avšak preparát získaný touto metodou bude díky proteinům, které se nepodařilo zcela odstranit, bílý. Vysušenou DNA rozpouštějte alespoň 1 hod v 0,1 0,5 ml destilované vody nebo lépe TE pufru Rozpouštění lze podpořit zvýšenou telotou (60º C). DNA se může hydratovat obtížně a nemusí dojít k úplnému rozpuštění precipitátu. Po přiměřeně dlouhé době však do formy koloidního roztoku přechází dostatečné množství DNA, které lze analyzovat elektroforesou v agarosovém gelu PŘÍÍPPRAVA GENOMOVÉ DNA Z CIIBULE KUCHYŇSSKÉ Pomocí této metody lze připravit surovou chromozomální DNA, která může být znečištěna proteiny a RNA, další nukleovou kyselinou přítomnou v buňce. Materiál a chemikálie: Asi 6 g cibule kuchyňské (Allium cepa) Třecí miska s tloučkem Gáza na přípravu filtru Vhodná nádoba na jímání filtrátů ze skla nebo polypropylenu 15 ml extrakčního roztoku (50 mm Tris.Cl, 250 mm NaCl, 10 mm EDTA, ph 8,0 v destilované vodě) 1 ml TE pufru (10 mm Tris.Cl, 1 mm EDTA, ph 8,0 v destilované vodě) 1 ml 10% roztoku dodecylsulfátu sodného (SDS) 8 ml 96% velejemného ethanolu Vodní lázeň nebo inkubátor nastavené na 55-65º C Ledová tříšť Provedení: 1. Pokrojte asi 6 g cibule na co možná nejmenší kousky. Lepších výsledků bývá dosaženo pokud je pokrojená cibule zmražena, neboť dojde k potrhání buněčných stěn

20 2. Přeneste pokrojenou cibuli do třecí misky, přidejte 15 ml extrakčního pufru a tloučkem roztírejte vzorek cibule asi 5 minut. Dojde tak k dezintegraci buněčných stěn. Role složek extrakčního pufru (Tris.Cl, EDTA a NaCl) při purifikaci DNA je popsána v předchozím protokolu. 3. Přefiltrujte vzniklou suspenzi přes filtr z gázy do vhodné nádoby a jemně např. lžící vytlačte zadrženou kapalinu. 4. K filtrátu přidejte 1 ml 10% dodecyl sulfátu sodného (SDS). Jemně promíchejte obsah kroužením nebo převracením a inkubujte jej s občasným promícháním při 55º- 65 ºC po 20 minut. 5. Poté roztok opět přefiltrujte do nové nádoby. Odpipetujte 4 ml filtrátu do 15 ml zkumavky a chlaďte obsah na ledové tříšti 2-5 minut. 6. Pomalu převrstvujte obsah 8 ml 96% ledového ethanolu nebo 91% isopropanolu. Na mezifázi pozorujte precipitující genomovou DNA. DNA lze pomocí pipety, skleněné tyčinky nebo špejle vyjmout a přenést do (mikro)zkumavky. 7. Pokud jste odseparovali precipitovanou DNA ponechte ji vyschnout při pokojové teplotě. Dehydratovaná DNA je bezbarvá, avšak DNA izolovaná touto metodou obsahuje proteiny, které zbarvují peletu bíle. 8. Vysušenou DNA rozpouštějte alespoň 1 hod v 0,5 1 ml TE pufru. Rozpouštění lze podpořit zvýšenou telotou (60 ºC). DNA se může hydratovat obtížně a nemusí dojít k rozpuštění celé pelety. Po přiměřeně dlouhé době však do formy koloidního roztoku přechází dostatečné množství DNA, které lze analyzovat elektroforesou v agarosovém gelu ANALÝZA DNA A PPROTEIINŮ PPOMOCÍÍ ELEKTROFFORESSY V AGAROSSOVÉM GELU Elektroforesa v agarosovém gelu se používá k identifikaci, separaci a purifikaci molekul DNA a v některých případech i proteinů. Tyto molekuly jsou v gelu děleny podle jejich náboje (migrace k anodě nebo katodě, přičemž velikost náboje určuje rychlost) a velikosti (gel vlastně působí jako síto). Komerční agarosa je lineární polysacharid v podstatě tvořený z asi 800 galaktosových jednotek. Zgelovatěním agarosy vzniká v závislosti na její koncentraci trojrozměrná síť s póry o velikosti 50 až > 200 nm. Při elektroforéze DNA se využívá skutečnosti, že DNA je díky fosfátovým skupinám nabita záporně a ve stejnosměrném elektrickém poli se při ph 8 bude pohybovat ke kladné elektrodě. Vzhledem k tomu, že jsou fosfátové skupiny spojující jednotlivé nukleosidy distribuovány rovnoměrně, mají molekuly DNA konstantní hodnotu náboje na jednotku délky a budou se v gelu dělit podle jejich velikosti delší molekuly se budou proplétat gelovou matricí obtížněji než molekuly menší. Rychlost migrace dvouřetězcové DNA agarosovým gelem je nepřímo úměrná logaritmu jejich délky (počtu párů bází; bp). Velikost pórů samozřejmě určuje použitelný frakcionační rozsah gelu pro lineární molekuly dvouřetězcové DNA, získané např. štěpením DNA restrikčními endonukleasami nebo jako výsledek PCR. Tak v gelu s 0,5 % agarosy lze účinně rozdělit fragmenty velikosti 700 až bp, v 1% gelu fragmenty o 250 až bp, v 3% gelu fragmenty dlouhé 100 až bp a ve speciálních 6% gelech i fragmenty o 10 až 100 bp. Jednotlivé fragmenty putují

21 v gelu ve jako zóny (proužky). Velikost fragmentu lze určit po elektroforese na základě porovnání jeho polohy na gelu s migrací směsi fragmentů známých délek (tzv. standardů velikostí neboli markerů). DNA v gelu je třeba nejprve vizualizovat, k čemuž se nejčastěji používá fluorescenčních barviv. Nejběžnějším je ethidiumbromid (EtBr), který viditelně fluoreskuje po ozáření ultrafialovým světlem o vlnové délce okolo 300 nm. Využívá se toho, že po vazbě EtBr mezi dva řetězce dvoušroubovice fluoreskuje komplex DNA/ EtBr více než samotný EtBr a tímto způsobem lze na gelu rozsvítit proužky obsahující alespoň 0,5 ng DNA. V současné době jsou dostupná fluorescenční barviva dosahující citlivosti až <20 pg (např. SYBR Gold). Na základě intenzity fluorescence proužku lze semikvantitativně vyhodnotit množství DNA porovnáním se standardy obsahující známá množství DNA. V následujícím textu uvádíme dva postupy pro provedení elektroforesy v agarosovém gelu. První popisuje profesionální elektroforesu, která bude použita pro analýzu výsledků PCR. Druhý protokol popisuje jednoduchou aparaturu a provedení elektroforesy v amatérských podmínkách s minimálními náklady a tuto sestavu lze použít jak pro analýzu DNA tak proteinů STANDARDNÍÍ BADATELSSKÁ ELEKTROFFORESSA DNA V AGAROSSOVÉM GELU Materiál a chemikálie: elektroforetická aparatura a zdroj stejnosměrného proudu UV transluminátor s dokumentačním zařízením latexové ochrané rukavice elektroforetický pufr (10 koncentrovaný TBE pufr o složení na 1 litr: 54 g Tris, 27,5 g kyseliny borité, 20 ml 0,5M EDTA a ph upraveným na hodnotu ph 8, 0) destilovaná voda agarosa pro molekulární biologii ethidiumbromid - EtBr (10 mg/ml ve vodě) marker ve vzorkovém pufru (1 µg/5 µl) vzorky DNA ve vzorkovém pufru. Provedení: (!) Pracujte v ochranných rukavicích! Použité plastové pomůcky vyhazujte do určených odpadních nádob. 1. Podle instrukcí výrobce elektroforetické aparatury připravte podnos pro nalití agarosového gelu tak, aby vznikla těsnící nádoba. Aparatury jsou vyrobeny nejčastěji z akrylátu a sestávají z elektroforetické vany opatřené na koncích platinovými elektrodami, podnosu pro gel a víka pevně zamčeného po připojení kabelů. Některé podnosy jsou propustné pro UV záření. To umožňuje osvítit gel na transluminátoru přímo na podnosu a usnadňuje tak manipulaci s gelem. 2. Připravte 1 TBE pufr naředěním 10 koncentrovaného zásobního roztoku destilovanou vodou v množství dostatečném pro přípravu gelu a použití jako elektrolyt při elektroforese. EDTA přítomná v pufru vyvazuje ionty Mg 2+ z molekuly DNA, což přispívá k uniformitě náboje

22 3. Podle velikosti očekávaných fragmentů DNA připravte v Erlenmeyerově baňce suspenzi obsahující 1 % hmotn. nebo 2 % hmotn. agarosy v TBE pufru. Uvažujeme, že 1 ml pufru má hmotnost 1 g a vážená a měřená množství nemusí být analyticky přesná. 4. Agarovou suspenzi přiveďte do krátkého varu (5-10s) v mikrovlné troubě. POZOR: vroucí agar pění a může překypět. Krátké záhřevy k varu opakujte po zamíchání obsahu baňky krouživým pohybem do rozpuštění agaru. Případně rozpusťte agar zahřátím a povařením na plynovém kahanu. Výhodné je vsadit do hrdla baňky malou nálevku, která zabrání překypění gelu. 5. Roztok agaru ponechte ochladit na cca 60 ºC (udržíte v holé ruce) a přidejte takové množství EtBr pro vizualizaci, aby výsledná koncentrace byla 0,5 µg/ml. POZOR: EtBr je toxický karcinogen. 6. Nalejte gel do utěsněného podnosu a ihned do agaru ponořte hřeben ve vyznačeném místě. Baňku předejte lektorovi k dekontaminaci. Gel musí být stále dobře tekutý. Případné vzduchové bubliny můžete před zatuhnutím přesunout ke stěně kolmé na hřeben pomocí pipetovací špičky. Hřeben vytvoří v gelu jamky, do kterých se nanáší vzorek. 7. Ponechte gel ztuhnout při pokojové teplotě. Ztuhlý gel je lehce matný. 8. Přelijte gel správně umístěný ve vaně aparatury takovým množstvím elektroforetického TBE pufru, aby byla jeho hladina několik mm nad povrchem gelu (3 5 mm) a opatrně vyjměte z gelu hřeben (nesmí dojít k protržení dna jamek). Správně umístěný gel v aparatuře má hřeben blíže k záporné elektrodě. 9. Napipetujte do TBE pufru v prostoru kladné elektrody takové množství zásobního roztoku EtBr, aby byla výsledná koncentrace asi 0,5 µg/ml a špičkou obsah prostoru promíchejte. Kladně nabité ethidium bude v průběhu elektroforesy putovat proti směru migrace DNA a takto přidaný EtBr bude doplňovat EtBr v gelu. Jinou možností je použít gel a pufr bez EtBr a obarvit gel po elektroforese min inkubací v TBE s 0,5 µg EtBr / ml nebo vyšší. 10. Do krajních jamek naneste mikropipetou 5 µl markeru a do dalších vhodný objem (10 20 µl) vzorků ve vzorkovém pufru. Pořadí nanášení markeru a vzorků zapište. Vzorkový pufr obsahuje Ficoll, který má vyšší hustotu než voda a udrží tak roztok DNA v jamce. 11. Uzavřete aparaturu, připojte ji ke zdroji (DNA putuje ke kladné elektrodě) stejnosměrného proudu a nastavte napětí na hodnotu U = [1 až 5 V] [vzdálenosti mezi elektrodami v cm]. Zapněte proud a sledujte průběh elektroforesy podle migrace barviv přítomných ve vzorkovém pufru. Elektroforesa trvá podle aplikovaného napětí a požadovaného rozdělení asi min. V použitém vzorkovém pufru jsou tři barviva: xylene cyanol, bromfenolová modř a OrangeG, která migrují v 1% gelu stejně rychle jako fragmenty DNA o délce asi 4000 bp, 300 bp a 50 bp, v uvedeném pořadí. 12. Po skončení elektroforesy vypněte zdroj napětí a gel přeneste bezpečně (stále obsahuje EtBr) na plochu transluminátoru a vizualizujte DNA v UV světle. Pořiďte elektronický (pomocí CCD kamery) nebo fotografický záznam gelu a ten vyhodnoťte. POZOR: Pokud budete pozorovat gel pod UV pouhým okem používejte speciální

23 ochraný štít s vysoce účinným UV filtrem a minimalizujte dobu pozorování. Dioptrické nebo sluneční brýle s UV filtrem nejsou dostatečnou ochranou! 13. Použitý gel a elektrodový pufr předejte lektorovi k dekontaminaci AGAROSSOVÁ ELEKTROFFORESSA DNA V KRABIIČCE Materiál a chemikálie: nevodivá nádobka na gel nejlépe bílá nebo bezbarvá (např. plastová krabička na mýdlo, krabička na potraviny) materiál, který poslouží na vystřižení hřebene (např. polystyrenový tácek, cca 2mm silný kus plastu) materiál na elektrody: silný alobal, svazek uhlíkových vláken nebo ocelový drát 2 kabely různých barev s krokosvorkami baterie R9 (9 V) na 1 gel 4 baterie spojené do serie něco co poslouží jako pipeta (tenká slámka, dutá tyčka od lízátka, kapátko, inzulínová stříkačka) mikrovlnná trouba nebo plynový kahan + síťka agarosa (nebo potravinářský agar-agar) elektroforetický pufr (10 koncentrovaný TBE pufr o složení na 1 litr: 54 g Tris, 27,5 g kyseliny borité, 20 ml 0,5M EDTA a ph upraveným na hodnotu ph 8, 0) nebo jedlá soda destilovaná voda sacharosa vzorky DNA z cibule, epiteliálních buněk nebo z jiného zdroje, případně vzorky potravinářských barviv methylenová modř Provedení: A) Elektroforesa 1. Připravte 1 TBE pufr naředěním 10 koncentrovaného zásobního roztoku destilovanou vodou v množství dostatečném pro přípravu gelu a použití jako elektrolyt při elektroforese. Případně použijte jako elektroforetický pufr 1g jedlé sody rozpuštěný v 1,2 litrech vody. 2. Z polystyrenového tácku nebo plastu vystřihněte hřeben, který bude rozměrem odpovídat nádobce na gel. Délku zubů hřebenu je třeba upravit tak, aby končily asi 2 až 5 mm nad dnem nádobky. Hřeben bude použit na vytvoření jamek v gelu, do kterých bude nanesen analyzovaný vzorek. 3. V (Erlenmeyerově) baňce připravte suspenzi obsahující přibližně 1 % hmotn. agarosy v TBE pufru. Objem závisí na velikosti nádobky na gel a výška gelu by měla být asi 1,5 cm. Uvažujeme, že 1 ml pufru má hmotnost 1 g a vážená a měřená množství nemusí být analyticky přesná. Místo agarosy lze použít i agar-agar z něhož se agarosa vyrábí. Agar-agar je potravinářská surovina používaná pro zahušťování, podobně jako karageenan nebo želatina. Jeho chemické složení i vlastnosti jsou podobné jako u agarosy avšak polysacharid agaru-agaru je modifikován sulfátovými skupinami a znečištěn i pektinovými látkami a solemi což negativně ovlivní rozlišení

24 4. Agarovou suspenzi přiveďte do krátkého varu (5-10s) v mikrovlné troubě. POZOR: vroucí agar pění a může překypět. Krátké záhřevy k varu opakujte po zamíchání obsahu baňky krouživým pohybem do rozpuštění agaru. Případně rozpusťte agar zahřátím a povařením na plynovém kahanu. Výhodné je vsadit do hrdla baňky malou nálevku, která zabrání překypění gelu. 5. Roztok agaru nalejte do nádobky na gel na vodorovné ploše. Ihned do agaru ponořte hřeben 2-3 cm od kraje nádobky (konce zubů hřebenu musí být 2-3 mm nad dnem nádobky jamky nesmí být skrz gel!). V případě, že neznáme směr migrace analyzované látky (barviva, proteiny) umístíme hřeben v polovině nádobky. Případné vzduchové bubliny můžete před zatuhnutím gelu přesunout ke stěně kolmé na hřeben např. pomocí párátka. 6. Zatímco gel tuhne (ztuhlý gel je lehce matný), připravte 50-70% roztok cukru v elektroforetickém pufru nebo ve vodě, který bude sloužit jako nanášecí medium (vzorkový pufr). Nanášecí medium má hustotu, která postačuje k zatížení vzorku v jamce v gelu před jeho vputování do gelu a usnadňuje vnášení vzorků do jamek. Rozpouštění cukru lze podpořit zahřátím vznikajícího roztoku. 7. Připravte aparaturu pro elektroforesu: odřízněte a odstraňte konce gelu (1-2 cm od okraje nádobky) aby se vytvořily elektrodové prostory (viz Obr. 1.9). 8. Zalijte gel pufrem pro elektroforesu tak, aby byla hladina 2-5 mm nad povrchem gelu. Opatrně vyjměte hřeben (nesmí dojít k protržení dna jamek!). 9. Na okrajích nádobky umístěte elektrody tak, aby byly částečně ponořené v pufru po celé šířce nádobky. Ke spojeným bateriím připojte kabely (viz Obr. 1.9). 10. Připravte vzorky DNA (např. část DNA izolované z cibule) nebo např. potravinářská barviva smísením kapky roztoku DNA s kapkou nanášecího media a naneste vzorky do jamek. Vzorky je možno nanášet slámkou, kapátkem nebo inzulinovou stříkačkou. 11. Vytvořte elektrický obvod podle Obr. 1.9 připojením soustavy baterií na elektrody elektroforetické aparatury (upozornění: za daných podmínek migruje DNA a většina barviv ke kladně nabité elektrodě). V případě, že by se gel přehříval, lze snížit protékající proud snížením napětí, tj. vyřazením jedné baterie. Průběh dělení lze vyhodnocovat podle rychlosti migrace jednotlivých barviv. Při použití 4 baterií lze první výsledky dělení pozorovat po 20 minutách. Rozdělení velkých fragmentů DNA vyžaduje minimálně 90 minut. 12. Pokud byla při elektroforese analyzována barviva, lze náboj (směr migrace) a složení barviva vyhodnotit ihned pouhým okem z gelu položeného na bílé podložce. Pokud byla analyzována DNA, je ji třeba vizualizovat vybarvením v gelu. B) Vizualizace DNA v gelu Pro obarvení DNA v agarosovém gelu lze použít dvou jednoduchých metod: Pomalejší způsob: 1. Připravte takové množství barvícího roztoku 0,002% methylenové modři ve vodě, které postačí k zalití celého gelu