Analýza DNA. Co zjišťujeme u DNA

Transkript

1 Analýza DNA Co zjišťujeme u DNA Genetickou podstatu konkrétních proteinů Mutace bodové (sekvenční delece nebo inzerce nukleotidů, záměny), chromosomové aberace (numerické, strukturní) Polymorfismy konkrétní mutace, které se vyskytují v populaci s frekvencí vyšší než 1% Podobnost DNA mezi druhy Vlastnosti - koncentraci, čistotu, chemické vazby s proteiny, funkci ACGGTCGACTGCGATGAACTCCC ACGGTCGACTGCGATCAACTCCC ACGGTCGACTGCGATTTGAACTCCC 1

2 DNA izolace detekce DNA specifické analýzy DNA struktury hlavní metody pro práci s DNA: PCR sekvenace RFLP DNA blotting DNA hybridizace cdna PCR polymerase chain reaction Nobelova cena za její objev v roce 1984 obdoba DNA replikace, která se odehrává v buňkách amplifikace (zmnožení) vybraných úseků DNA u oblasti, kterou se snažíme amplifikovat musíme znát sekvenci koncových částí cyklické střídání těchto teplotních kroků: denaturace dvoušroubovice se oddělí na jednotlivá vlákna (teplota; chemická činidla) annealing (anýlink) ke 3' koncům vybraného úseku denaturované DNA se naváží primery (oligonukleotidy jednovláknové řetězce; cca 20bp ) elongace prodloužení primeru (Taq polymerasa / cca 70 o C) vkládáním jednotlivých dntp (A,G,C,T) na základě komplementarity k templátové DNA primer 2

3 PCR Princip PCR Teplotní denaturace Annealing primerů Elongace Teplotní denaturace Annealing primerů Elongace 3

4 PRINCIP METODY PCR (1 MOLEKULA) DENATURACE 1. CYKLUS PRIMERY Taq POLYMERÁZA (2 MOLEKULY) DENATURACE PRIMERY 2. CYKLUS Taq POLYMERÁZA (4 MOLEKULY) 3. CYKLUS DENATURACE PRIMERY Taq POLYMERÁZA (8 MOLEKUL) 4. CYKLUS (16 MOLEKUL) 5. CYKLUS (32 MOLEKUL) PCR v reakci: templát (DNA), Taqpolymeráza (teplotně stabilní), primery, dntp (jednotlivé nukleotidy) a vhodný pufr (Mn 2+ ) z jednoho cílového lokusu pro dané primery vznikne po 1 cyklu denaturace, annealingu a elongace vždy dvojnásobek DNA fragmentů (velikost fragmentu je dána primery) možno vyjádřit matematicky 2 n kde n je počet cyklů Kolik bude DNA fragmentů po 8 PCR cyklech? 2 8 = 256 4

5 Elektroforéza metoda, která slouží k rozdělení amplifikovaných DNA fragmentů o nestejné délce DNA má celkově slabě negativní náboj a v elektrickém poli putuje ke kladné elektrodě rychlost putování je závislá na její celkové délce gel (agaróza, polyakrylamid) je ponořen do vhodného pufru mezi elektrody v gelu u záporné elektrody jsou jamky, pro vzorky DNA jednosměrný elektrický proud po čase se fragmenty rozdílných délek rozdělí vizualizace fragmentů např. ethidiumbromidem (interkalačního činidla), svítí v UV světle Sekvenace - Sangerova metoda Zjištění konkrétní sekvence vybraného úseku DNA řetězce Sekvenační PCR - řetězce všech možných velikostí Fragmenty (řetězce) mají rozlišení ve své délce i o jeden nukleotid Sangerova metoda - chemicky modifikované dntp (deoxyribonukleosidtrifosfátů) na ddntp (dideoxyribonukleosidtrifosfáty), které postrádají 3'-OH skupinu; za ddntp si při elongaci už nemůže přisednout žádný normální nukleotid a dojde tedy k terminaci elongace Pro sekvenaci (sekvenační PCR reakce): a) zkoumaný fragment DNA, b) primer pro jedno vlákno DNA, c) pufr, d) polymeráza a e) mix normálních dntp a f) odlišně fluorescenčně značených ddntp (detekce laserem) Elektroforetická detekce (rozlišení fragmentů v gelu) - sekvenace ve 4 reakčních směsích (ddatp; ddttp; ddctp; ddgtp); obvykle bývá radioaktivně značený primer, 5

6 3' 5' Analyzovaná DNA (jednovláknová) 5' 3' Značený primer DNA-polymerasa, primer, nukleotidy - rozdělení do čtyř zkumavek. Přidány jednotlivé ddntp: ddatp, ddctp, ddgtp, ddttp PCR syntéza komplementárního vlákna (značeno barevně pro jednotlivé ddntp) ve směru 5' 3' A C G T A C G T A C G T Elektroforéza A C G T - + Výsledná sekvence na syntetizovaném vlákně: 5'- C T A G T A G G T C C A - 3' Sekvence analyzované DNA (komplementarita párování basí): 3'- G A T C A T C C A G G T - 5' Sekvenace - Sanger AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATTGCATGGCAACTGCAGATCGATGCAAGTGCCGATC TTCAGGCTAGCAATCGAAGGCTTAACGTACCGTTGACGTCTAGCTACGTTCACGGCTAG začne probíhat sekvenační PCR s mixem dntp a fluoresčenčně značenými ddntp AAGTCCGATCGTTAGCTTC AAGTCCGATCGTTAGCTTCC AAGTCCGATCGTTAGCTTCCG AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGA AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAA AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAAT AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATT AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATTG AAGTCCGATCGTTAGCTTCCGAATTGC nejkratší fragment ve schématu bude svítit červenou barvou a nejdelší také červenou speciální elektroforéza s laserovou detekcí fluorescenčně barvených ddntp 6

7 Restrikční endonukleázy - restriktázy Enzymy, které štípou dvouvláknovou molekulu DNA uvnitř řetězce a to vždy v konkrétní pozici, charakteristické pro danou restriktázu (restrikční místo) např. Eco R1 restriktáza izolovaná z Escherichia coli, která specificky štípe v sekvenci G^AATTC AATGCTAATGCCTAGTCAAGCTTTCATCGAGAATTCCAGTCGAA TTAGCTTTACGGATCAGTTCGAAAGTAGCTCTTAAGGTCAGCTT AATGCTAATGCCTAGTCAAGCTTTCATCGAG TTAGCTTTACGGATCAGTTCGAAAGTAGCTCTTAA AATTCCAGTCGAA GGTCAGCTT Identifikace restrikčních míst Na uvedeném vlákně najděte restrikční místa pro nabídnuté enzymy restrikční místo Alu I Sau 3AI Msp I AG / CT / GTAC C / CGG G.G.G.C.G.T.A.C.A.T.A.G.C.T.A.A.T.G.G.C.A.A.G.C.T.A.T.G.G.T. 8 7

8 RFLP restriction fragment length polymorphism charakteristické fragmenty pro každého jedince po naštípání celkové DNA restriktázami jednotlivé cílové sekvence vybraných restriktáz mohou být mutovány, nebo v rámci jiných delecí/inzercí posunuty (variabilita restrikčních míst) každý člověk má proto charakterictické rozložení restrikčních míst pro určitou restriktázu (restrikční mapy) Mendelovská dědičnost délky restrikčních fragmentů EcoRI štípání fragmentů 2 jedinců 5' AGAATTCGCCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATTGAGCTCGAATTCC 3' 5' AGAATTCGCCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATTGAGCTCGAATTCC 3' na elektroforéze bude mít druhý jedinec delší fragment RFLP restriction fragment length polymorphism 8

9 Southern-blotting (jméno po objeviteli metody) Umožňuje z velkého množství fragmentů (např. po štěpení celkové DNA restrikčními endonukleázami) specificky detekovat DNA fragment V doslovném překladu pijákování tzn. nasátí PCR produktů z elektroforetického gelu na membránu (nylonovou) a jejich následná analýza Hybridizace = spojení dvou jednovláknových DNA (vzorek + sonda) podle pravidla komplementarity Gel se denaturuje v chemickém činidle tím se denaturuje i dvouvláknová DNA a na membránu jsou blottována jen jednořetězcová vlákna a to v takovém uspořádání, v jakém byla na elektroforetickém gelu Následuje hybridizace s radioaktivně značenou próbou membrána je ponořena do roztoku s jednovláknovým radioaktivně značeným řetězcem DNA Na základě komplementarity basí buď dojde/nedojde k hybridizaci Nenavázaná próba je odmyta V případě úspěšné hybridizace svítí na membráně fragment s navázanou sondou Southern - blotting 9

10 Southern blot hybridizace sondy DNA Sonda Zahřátí (denaturace) Ochlazení (renaturace) 12 PAH gen Fenylketonurie defekt genu pro fenylalaninhydroxylázu (PAH) AR onemocnění PAH 13 exonů mnoho mutací (více než 400 známých v roce 2000) Mutace - např. delece v 2. exonu; detekce systémem restrikční endonukleázy (viz obrázek) Při negativním výsledku vyšetření jednoho exonu vyšetření mutací v dalších exonech 10

11 RFLP metoda Autosomálně recesivní onemocnění (např. cystická fibróza, fenylketonurie) Vyšetření je informativní Druhá dcera má genotyp Aa RFLP prenatální vyšetření Fenylketonurie - AR A) B) Vyšetření je informativní Plod heterozygot - zdravý 11

12 RFLP metoda Polycystická choroba ledvin - AD Vyšetření je informativní Prenatální diagnostika - genotyp aa RFLP metoda GR onemocnění hemofilie (obdobné pro barvoslepost)? Dcera zdravá Genotyp X + X h Přenašečka 12

13 Polymorfismy lidské DNA - vazebná analýza v přímé a nepřímé diagnostice Mikrosatelity (syn. krátké tandemové repetice) STR short tandem repeats, SSR simple sequence repeats TAGCCATCGGTACACACACACACACACAGTGCTTCAGTAGC TAGCCATCGGTACACACACACACAGTGCTTCAGTAGCGTAG Pokud se detekovatelný polymorfismus nachází dostatečně blízko lokusu, ve kterém se vyskytuje kauzální mutace pro sledovanou chorobu, bude možné jej využít i bez znalosti molekulární podstaty daného onemocnění: vazba polymorfismu s mutovanou alelou. V závislosti na frekvenci crossing-overu bude současně s mutací předáván z rodičů na potomky kosegregace markeru s mutovanou alelou. 3 Nondisjunkce u Downova syndromu Tři rodokmeny rodin s dětmi postiženými Downovým syndromem (prostá trisomie). Výsledek analýzy DNA tetranukleotidového polymorfismu na chromozómu 21 - je znázorněn pod rodokmeny. Od kterého z rodičů zdědilo dítě třetí kopii chromozómu 21? V kterém meiotickém dělení došlo k nondisjunkci? 1 13

14 Nondisjunkce u Downova syndromu? Meióza I u otce nebo u matky 2 Nondisjunkce u Downova syndromu? Meióza I u otce nebo u matky Meióza I u matky 3 14

15 Nondisjunkce u Downova syndromu? Meióza I u otce nebo u matky Meióza I u matky Meióza II u matky 4 Polymorfismy lidské DNA využívané v přímé a nepřímé diagnostice Jednonukleotidové polymorfismy (single nucleotide polymorphisms SNP) SNP C / A TAGCCATCGGTA N GTACTCAATGATCAGCT G C T A 1 15

16 Polymorfismy lidské DNA využívané ve vazebné analýze, přímé a nepřímé diagnostice Jednonukleotidové polymorfismy (single nucleotide polymorphisms SNP) V 99.9% sekvence DNA se lidé od sebe vzájemně neliší. Ze zbývajícího 0.1% rozdílu tvoří SNP přes 80%. Projekt lidského genomu nyní pokračuje mj. ve formě identifikace miliónů SNP, které jsou shromažďovány ve veřejně přístupných databázích. Možnost typizace mnoha set tisíc SNP v jednom vzorku pomocí DNA čipů by měla usnadnit identifikaci alel, zodpovědných za řadu onemocnění vyskytujících se v určité populaci. 2 DNA čipy - microarrays Moderní metoda analýzy DNA v několika lokusech současně Měření exprese genů, polymorfismus SNP, mutace atp. Genové čipy obsahují velké množství sond (tisíce), které hybridizují s různými oblastmi genomu Využívá hybridizace Nanotechnologie manipulace se vzorky probíhá převážně roboticky a vyhodnocení je softwarové 16