OPTICKÉ METODY. NESPEKTRÁLNÍ při interakci nedochází k výměně energie

Transkript

1 OPTICKÉ METODY

2 OM OPTICKÉ METODY Identifikace a kvantifikace sloučenin (organických i anorganických) na základě interakce elektromagnetického záření a hmoty Základní rozdělení optických metod: NESPEKTRÁLNÍ při interakci nedochází k výměně energie dochází pouze ke změnám určitých vlastností záření např. změna rychlosti záření, otáčení roviny polarizovaného světla, rozptyl záření SPEKTRÁLNÍ při interakci dochází k výměně energie např. změna absorpce či emise záření

3 OM PŘEHLED ZÁKLADNÍCH OM NESPEKTRÁLNÍ refraktometrie (index lomu) polarimetrie a cirkulární dichroismus (polarizace) turbidimetrie a nefelometrie (rozptyl) SPEKTRÁLNÍ atomová spektrometrie absorpční s atomizací v plameni (FA-AAS) s elektrotermickou atomizací (ETA-AAS) s generování par (VG-AAS) emisní s ionizací v plameni (FES) s ionizací v plazmatu (ICP-OES) fluorescenční (AFS) molekulová spektrometrie absorpční v ultrafialové a viditelné oblasti (UV/VIS) v infračervené oblasti (IR) Ramanova spektrometrie v UV/VIS a IR oblasti luminiscenční fluorescence fosforescence

4 OM ELEKTROMAGNETICKÉ ZÁŘENÍ = postupné vlnění elektromagnetického pole složeného z kombinace příčného magnetického a elektrického vlnění má vlnově-korpuskulární charakter je nositelem energie E char. - vlnová délka λ nejčastěji v nm = délka 1 vlny - vlnočet ṽ nějčastěji v reciprokých cm = počet vln na 1 cm

5 OM ELEKTROMAGNETICKÉ ZÁŘENÍ

6 OM ELEKTROMAGNETICKÉ ZÁŘENÍ Formy interakce elektromagnetického záření s hmotou závisí na jeho energii Čím kratší vlnová délka (tím vyšší vlnočet i frekvence), tím vyšší energie

7 OM Rozšíření spektrálních čar spektrální čára by měla být teoreticky nekonečně úzká ve skutečnosti však je čára rozšířená s určitým profilem minimální hodnota šířky spektrální čáry je dána přirozenou šířkou, která odpovídá intervalu λ = 10-5 nm dáno Heisenbergerovým principem neurčitosti energetické stavy s krátkou dobou života (excitované stavy) budou emitovat či absorbovat s větší přirozenou šířkou než stavy s dlouhou dobou života přirozená šířky čáry má však téměř zanedbatelný vliv významný vliv na šířku spektrální čáry: - Dopplerovo rozšíření (neuspořádaný termický pohyb atomů) - Lorentzovo rozšíření (srážky excitovaných a neexcitovaných atomů)

8 OM Rozšíření spektrálních čar skutečný profil spektrální čáry je tedy kombinací těchto vlivů: - Heisenbergerův princip neurčitosti (přirozená šířka čáry, zanedb.) - Doplerovo rozšíření závisí na teplotě (čím vyšší, tím vyšší vliv) - Lorentzovo rozšíření a nazývá se Voigtův profil a je charakterizován parametrem pološířka čáry (šířka spektrální čáry v polovině výšky jejího maxima) A - Doplerovo rozšíření (nehomogenní) B - Lorentzovo rozšíření (homogenní) A B λ[nm]

9 OM NESPEKTRÁLNÍ OPTICKÉ METODY NESPEKTRÁLNÍ refraktometrie (index lomu) polarimetrie a cirkulární dichroismus (polarizace) turbidimetrie a nefelometrie (rozptyl)

10 OM NESPEKTRÁLNÍ REFRAKTOMETRIE Refraktometrie využívá lomu světla na rozhraní dvou homogenních prostředí odlišné optické hustoty, ve kterých se šíří různou rychlostí čím vyšší je optická hustota prostředí, tím nižší je rychlost světla zpomalení světla v určitém prostředí je charakterizuje: (ABSOLUTNÍ) INDEX LOMU n = c / v c rychlost světla ve vakuu ( m/s) v rychlost světla v daném prostředí - je vztažen k vakuu vakuum vzduch - hodnota udává kolikrát je světlo ve vakuu rychlejší než v daném prostředí

11 OM NESPEKTRÁLNÍ REFRAKTOMETRIE SNELLŮV ZÁKON: popisuje lom elektromagnetického záření na rozhraní dvou homogenních prostředí s odlišnou optickou hustotou n 1 sinθ 1 = n 2 sinθ 2 n 2 / n 1 = sinα 1 / sinα 2 = v 1 / v 2 RELATIVNÍ INDEX LOMU: Popisuje kolikrát se paprsek zrychlí či zpomalí při přechodu z jednoho prostředí do druhého n 21 = n 2 /n 1

12 OM NESPEKTRÁLNÍ REFRAKTOMETRIE Při šíření záření z prostředí opticky řidšího do opticky hustšího prostředí se paprsky lámou směrem ke kolmici. Při šíření záření z prostředí opticky hustšího do opticky řidšího prostředí se paprsky lámou směrem od kolmice.

13 OM NESPEKTRÁLNÍ REFRAKTOMETRIE Některé důsledky lomu světla Mozek lovce předpokládá, že světlo se šíří přímočaře, takže vidí rybu v místě modrého obrysu. Ve skutečnosti je ale ryba blíže, protože světlo se šíří po plné čáře. Předměty ve vodě se zdají dál než ve skutečnosti jsou!

14 OM NESPEKTRÁLNÍ REFRAKTOMETRIE Refraktometrie v analytické praxi hodnota indexu lomu závisí na vlnové délce teplotě tlaku (významné pouze u plynů) u každé hodnoty indexu lomu nutné uvést i hodnoty výše uvedených parametrů! uplatnění v praxi: - hodnocení čistoty chemikálií - v potravinářství pro měření obsahu cukru v ovoci, džusech, vínu, v pivovarnictví, cukrovarnictví - rychlá a levná orientační analýza

15 OM NESPEKTRÁLNÍ REFRAKTOMETRIE Totální odraz (reflexe) Při přechodu paprsku z opticky hustšího prostředí do prostředí opticky řidšího dochází od určitého úhlu (mezní úhel) k totálnímu odrazu θ 2 = 90 o -> tedy -> sinθ 2 = 1 sinθ 1 = n 2 / n 1 = v 1 / v 2

16 OM NESPEKTRÁLNÍ REFRAKTOMETRIE Totální odraz (reflexe)

17 OM NESPEKTRÁLNÍ REFRAKTOMETRIE Totální odraz (reflexe) Princip totální reflexe se využívá například v konstrukci světlovodičů

18 OM NESPEKTRÁLNÍ REFRAKTOMETRIE Totální odraz (reflexe) EVANESCENTNÍ VLNA - šíří se podél rozhraní (max. do vzdálenosti 100 nm) - kolmo na rozhraní ubývá exponenciálně se vzdáleností od rozhraní - využívá ji metoda zeslabené totální reflexe (ATR) - uplatnění při analýze vysoce absorbujících viskózních roztoků, gelů, past, polymerních past i práškových materiálů - kontakt vzorku s plochou (ATR krystal) musí být velmi těsný

19 OM NESPEKTRÁLNÍ POLARIMETRIE Polarimetrie využívá schopnosti opticky aktivních látek (tzv. chirálních sloučenin) stáčet rovinu polarizovaného světla molekuly opticky aktivních látek: - nelze otáčením ztotožnit s jejich zrcadlovým obrazem - nemají střed nebo rodinu symetrie nejčastější příčinou asymetrie je přítomnost asymetrického uhlíku (např. glukóza, sacharóza) opticky aktivní jsou i některé anorg. sloučeniny (vápenec, křemen)

20 OM NESPEKTRÁLNÍ POLARIMETRIE Polarizované světlo

21 OM NESPEKTRÁLNÍ POLARIMETRIE Princip měření Optická otáčivost α optická otáčivost [ ] [α] λ specifická otáčivost při vlnové délce λ (zpravidla 589,3 nm sodíkový dublet) a teplotě t (zpravidla při 20 C) vyjádřena ve [ ] l délka kyvety [dm] c koncentrace [g/ml] Optická otáčivost je aditivní veličina!

22 OM NESPEKTRÁLNÍ POLARIMETRIE Polarimetrie v analytické praxi hodnota optické otáčivosti závisí na: asymetrii molekuly vlnové délce teplotě počtu molekul (tj. koncentraci a délce kyvety) rozpouštědle stáří roztoku (vliv mutarotace u redukujících sacharidů) u každé hodnoty optické otáčivosti nutné uvést i hodnoty vlnové délky a teploty! uplatnění v praxi: - hodnocení čistoty chemikálií - v potravinářství pro měření obsahu cukrů - rychlá a levná orientační analýza

23 OM NESPEKTRÁLNÍ POLARIMETRIE CIRKULÁRNÍ DICHROISMUS Cirkulární dichroismum (CD) CD molekul je způsoben asymetrií molekulárních struktur součástí biopolymerů jsou také opticky aktivní cukry a aminokyseliny optická aktivita biopolymerů se používá k popisu její struktury a strukturních změn Struktura α-helix Struktura β -sheet

24 OM NESPEKTRÁLNÍ POLARIMETRIE CIRKULÁRNÍ DICHROISMUS Princip CD - rovinně polarizované světlo lze rozložit na pravotočivou a levotočivou složku kruhově polarizovaného světla - levotočivá složka prochází prostředím jinou rychlostí než pravotočivá složka, tzn. každá složka má v daném prostředí jiný index lomu a tím dojde ke stočení roviny polarizovaného světla - levotočivá složka je absorbována jinak než pravotočivá složka, tj. každá složka má v daném prostředí jiný extinkční koeficient a tím dojde ke změně z rovinně polarizovaného světla na elipticky polarizované světlo - CD je definován jako rozdíl extinkčních koeficientů levotočivé a pravotočivé složky kruhově polarizovaného spektra CD = ε = ε L ε P - v praxi se měří jako MOLÁRNÍ ELIPTICITA = θ = 3298,2 ε

25 OM NESPEKTRÁLNÍ POLARIMETRIE CIRKULÁRNÍ DICHROISMUS Kruhově polarizované složky Pravotočivá složka Levotočivá složka

26 OM NESPEKTRÁLNÍ POLARIMETRIE CIRKULÁRNÍ DICHROISMUS Zjednodušené schéma CD

27 OM NESPEKTRÁLNÍ POLARIMETRIE CIRKULÁRNÍ DICHROISMUS Určování sekundární struktury bílkovin β - sheet random coil α - helix

28 OM NESPEKTRÁLNÍ POLARIMETRIE CIRKULÁRNÍ DICHROISMUS CD v analytické praxi hodnota molární elipticity závisí na vlnové délce elektromagnetického záření nutno uvádět! metodu lze používat při různých ph, teplotách i roztocích uplatnění v praxi: - sekundární struktura bílkovin (ale není tak specifická jako NMR či RTG) - struktura DNA - studium strukturních změn biopolymerů (např. tepelná či chemická denaturace) - excitonová interakce mezi molekulami

29 OM NESPEKTRÁLNÍ TURBIDIMETRIE A NEFELOMETRIE Turbidimetrie a nefelometrie založené na měření rozptylu světla o určité vlnové délce na jemných nerozpuštěných částicích suspendovaných v tekutině, tj. v (l) i (g) Turbidimetrie sledování rozptylu ve směru paprsku měřená veličina TURBIDANCE [T], bezrozměrná Nefelometrie sledování rozptylu kolmo na směr paprsku měřená veličina FNU, bezrozměrná Tyndalův efekt = difuzní rozptyl světla na pevných částečkách

30 OM NESPEKTRÁLNÍ TURBIDIMETRIE A NEFELOMETRIE Tyndallův efekt v přítomnosti nerozpuštěných částic dochází k rozptylu světla paprsek se stává v přítomnosti nerozpuštěných částic viditelným Rozpouštědlo Rozpouštědlo + částice

31 OM NESPEKTRÁLNÍ TURBIDIMETRIE A NEFELOMETRIE Turbidimetrie a nefelometrie v analytické praxi rozptyl světla závisí na: - koncentraci částic v tekutině (měřený parametr) - úhlu rozptylu - vlnové délce záření (čím kratší vlnová délka, tím vyšší rozptyl) - vlastnostech částic (velikost, tvar, barva, index lomu ) problém s reprodukovatelností nutno zabránit sedimentaci (PEG) velice citlivé lze stanovit koncentrace až 10-5 obj. % uplatnění v praxi: - potravinářství (výroba piva, vína, džusů) - životní prostředí (znečištění vod a vzduchu) - biotechnologická výroba (koncentrace biomasy) - imunochemické metody (zákal po imunoprecipitační reakci)

32 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE OPTICKÉ METODY SPEKTRÁLNÍ část 1. atomová spektrometrie

33 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE Metody atomové spektrometrie absorpční s atomizací v plameni (FA-AAS) s elektrotermickou atomizací (ETA-AAS) s generování par (VG-AAS) emisní s ionizací v plameni (FES) s ionizací v plazmatu (ICP-OES) fluorescenční (AFS)

34 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE AAS Atomová absorpční spektrometrie (AAS) založené na měření absorbce záření rezonanční spektrální čáry volnými atomy prvku v základním energetickém stavu absorbováno může být záření pouze o určité energii přechody pouze valenčních elektronů zdrojem záření jsou výbojky s dutou katodou (HCL lampy) Kirchhoffův zákon: Volné atomy v plynném stavu absorbují záření těch vlnových délek, které by samy vyzařovaly, kdyby byly excitovány

35 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE AAS Atomová absorpční spektrometrie (AAS) míra absorpce záření se vyjadřuje pomocí: ABSORBANCE A bezrozměrná veličina; tj. [1] v praxi se používají jednotky AU (absorbance unit) I log 0 I TRANSMITANCE T bezrozměrná veličina; tj. [1] v praxi vyjádřená po vynásobení 100 v % A A log T Bouguer Lambert Beerův zákon l c

36 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE AAS FA AAS AAS s atomizací v plameni (FA-AAS)

37 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE AAS FA AAS AAS s atomizací v plameni (FA-AAS)

38 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE AAS ETA AAS AAS s elektrotermickou atomizací (ETA-AAS) princip stejná jako AAS hlavní rozdíl je v atomizátoru (není plamen)

39 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE AAS ETA AAS AAS s elektrotermickou atomizací (ETA-AAS) princip stejná jako AAS hlavní rozdíl je v atomizátoru (není plamen) Elektrotermický atomizátor Teplotní gradient Vzorek v kyvetě Absorbance

40 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE AAS VG AAS AAS s generováním par (VG-AAS) speciální techniky AAS určené pro ultrastopovou analýzu problematických prvků Generování těkavých sloučenin (HG AAS) - převedení analytu na těkavou formu, její oddělení od zbytku vzorku ve formě par - pro As, Se, Sb, Te, Sn, Ge, Bi - o 2 3 řády vyšší citlivost a odstranění rušivých vlivů matrice Metoda studených par (CV AAS) - vyredukování elementární rtuti z kyselého roztoku Hg 2+ pomocí SnCl 2 vzniklé páry Hg se převedou inertním plynem do křemenné kyvety a měří se A při 253,7 nm - citlivost cca desetiny µg/l Termooxidační stanovení rtuti (přístroje TMA-254 a AMA-254) - vzorek je spálen v proudu O 2 na lodičce při C, plyn jde přes katalyzátory do amalgamátoru, kde se postupně Hg zachytává a poté je teplotním šokem vypuzena do tandemových kyvet, kde měří se A při 253,7 nm - citlivost setiny ng, linearita až 4 řády, mikroobjemy vzorku (250 µl, 250 mg)

41 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE AAS AAS v analytické praxi (hlavně FA a ETA) absorpce záření závisí na: - koncentraci měřeného prvku (měřený parametr) - vlnové délce záření (různé λ pro různé prvky) - výšce pozorování záření (různá výška pro různé prvky) - na spektrálních a nespektrálních interferencích reprodukovatelnost FA AAS cca 1%, ETA AAS jednotky % citlivost FA AAS cca jednotky mg/l, ETA AAS cca 1000 x nižší linearita cca 2 3 řády (téměř) vždy lze měřit pouze 1 prvek v čase velká nevýhoda! uplatnění v praxi: - stanovení téměř všech kovů, polokovů (B, Si) a někt. nekovů (P) - životní prostředí - klinické analýzy

42 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE AES Atomová emisní spektrometrie (AES) synonymum je optická emisní spektrometrie (OES) není zde zdroj záření, zdrojem záření jsou samotné excitované prvky emitováno může být záření pouze o určité energii, tj. určité λ přechody pouze valenčních elektronů prvky obsažené ve vzorku se přivádí do budícího (excitačního) zdroje, v němž jim je předána energie k atomizaci (někdy i ionizaci) a excitaci do vyšších energetických stavů. Při návratu do nižších energetických stavů je pak tato energie vyzářena ve formě emisního záření, které je registrováno jako čárové spektrum. hodnoty emitovaných vlnových délek kvalitativní údaj (jaký prvek) hodnoty intenzit vlnových délek kvantitativní údaj (jaké množství)

43 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE AES Emisní čárová spektra prvků S rostoucím počtem valenčních e - vzrůstá počet přechodů spektra jsou bohatší

44 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE AES FES Plamenová fotometrie (FES) emisní spektrum izolovaná emisní čára

45 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE AES FES Plamenová fotometrie (FES) nejjednodušší metoda v AES budícím zdrojem je plamen o teplotě C v závislosti na palivu (propan-butan, acetylen) a oxidovadlu (vzduch, oxid dusný) vhodné pro analýzu snadno excitovatelných prvků (alkalické kovy a kovy alkalických zemin) plamenový AAS spektrometr lze použít i jako AES spektrometr

46 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE AES ICP OES AES s buzením indukčně vázaném plazmatu (ICP-OES) nejpoužívanější metoda v AES (možná i v celé AS) budícím zdrojem je argonová plazma o teplotě až C vhodné pro analýzu téměř všech prvků plazmová hlavice

47 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE AES ICP OES AES s buzením indukčně vázaném plazmatu (ICP-OES) Plazma plamen! Plazma = výboj ICP = inductively coupled plasma = indukčně vázaná plazma Plazma - ionizovaný plyn (Ar), který obsahuje dostatečnou koncentraci elektricky nabitých částic, přičemž počet kladných a záporných iontů je stejný - celá soustava je elektricky vodivá, ale nevykazuje náboj = quazineutrální 1 Analytický kanál 2 Předehřívací zóna 3 Počáteční zářivá zóna 4 Analytická zóna 5 Chvost výboje 6 Indukční zóna 7 Vstup aerosol 8 Základna výboje

48 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE AES ICP OES ICP-OES v analytické praxi Emise záření závisí na: - koncentraci analytu (měřený parametr) - výšce pozorování (zpravidla 5 15 mm) - průtoku argonu (10 18 l/min) - příkonu ( W) Umožňuje simultánní multiprvkovou analýzu Nutno měřit jeden prvek při více vlnových délkách ověření správ. Vynikající reprodukovatelnost a minimální vliv matrice Velice rychlé všechny prvky v 1 vzorku za cca 1 minutu Dražší provoz ale nižší DL (jednotky µg/l) a lineární rozsah až 6 řádů! Využití v praxi životní prostředí vodohospodářské laboratoře klinické laboratoře

49 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE AFS Atomová fluorescenční spektrometrie (AFS) spojuje výhody AES (linearita až 5 řádů) a ETA AAS (vysoká citlivost) atom. fluorescenční sp. (AFS) atom. rentgenfluorescenční sp. (XRF) týká se valenčních elektronů týká se subvalenčních elektronů princip vlivem záření dojde k excitaci e - do vyšších energ. stavů poté dojde k zářivé deexcitaci měří se intenzita emitovaného fluorescenčního záření a to pod úhlem 90 vzhledem k budícímu záření! zdroj záření - výbojka s dutou katodou (HCL lampa) - laser (LIF), je výkonější = vyšší citlivost atomizace - plameni (jako v FA-AAS) - v grafitové kyvetě (jako v ETA-AAS) použití velice málo rozšířené na speciální ultrastopovou analýzu (AFS s ETA a LIF)

50 OM SPEKTRÁLNÍ ATOMOVÁ SPEKTROMETRIE Souhrn základních rozdílů mezi AAS, AES a AFS

51 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE OPTICKÉ METODY SPEKTRÁLNÍ část 2. molekulová spektrometrie

52 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE Metody molekulové spektrometrie absorpční v ultrafialové a viditelné oblasti (UV/VIS) v infračervené oblasti (IR) Ramanova spektrometrie v UV/VIS a IR oblasti luminiscenční fluorescence fosforescence

53 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE Úvod do molekulové spektrometrie princip na základě interakce molekul látky s elektromagnetickým zářením při níž dochází k výměně kvantovaného, přesně vymezeného množství energie uplatnění hlavně v organické analýze - identifikace (shoda spektra se standardem či tab. hodnotami) - strukturní analýza (nejsou nutné standardy, náročnější) - kvantitativní analýza (určení obsahu analytu ve vzorku) typ interakce molekuly látky s elektromagnetickým zářením je dán energií tohoto záření, tj. hodnotou vlnové délky Planckův zákon E2 E1 = E = h ν = h (c/λ) = h c ṽ Čím kratší je vlnová délka λ (nm), tím vyšší je vlnočet ṽ (cm -1 ) nebo frekvence ν (Hz) a tím větší je i energie E (ev) elektromag. záření

54 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE Metody molekulové spektrometrie

55 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE Energetické změny vybraných metod Společné pravidlo absorpční molekulové sp. Projevují se pouze přechody při nichž dochází ke změně dipólmomentu molekuly!

56 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE Energetické přechody V (ν n ) elektronové pásy V rozšířené o vibrační hladiny ν ν(j n ) vibrační pásy ν rozšířené o rotační hladiny J

57 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE ABSORPČNÍ UV/VIS UV/VIS spektrometrie molekulová absorpční spektrometrie v blízké ultrafialové oblasti ( nm) a viditelné oblasti ( nm) každá molekula má specifickou absorpci, tzn. že absorbuje v určitých oblastech frekvencí záření, někde více a jinde méně vlivem absorpce energie fotonu (elektromagnetického záření) dochází k přechodům valenčních elektronů = elektronické přechody absorpce energie fotonu (elektromagnetického záření) se projeví sníženým zářivým tokem, jehož úbytek se měřen proč jsou v UV/VIS spektrometrii pásová spektra a nikoliv čárová? Každý elektronický přechod je doprovázen řadou vibračních a rotačních přechodů, jejichž energie se liší o velmi malé hodnoty

58 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE ABSORPČNÍ UV/VIS Typy elektronických přechodů σ σ* - nutná vysoká energie (vzdálená UV oblast; < 150 nm) - jednoduché vazby, nemá téměř význam n σ* - nutná menší energie (blízká UV oblast; nm) - molekuly s heteroatomy (O, S, N, X) s volnými e - páry π π* a n π* - nutná nejmenší energie (blízká UV oblast a VIS) - molekuly s dvoj. a troj. vazbami a funkčními skup.

59 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE ABSORPČNÍ UV/VIS Absorpce záření intenzita absorpce záření se vyjadřuje pomocí: ABSORBANCE A bezrozměrná veličina; tj. [1] v praxi se používají jednotky AU (absorbance unit) A I log 0 I log T TRANSMITANCE T bezrozměrná veličina; tj. [1] v praxi se vyjadřuje zpravidla T % T [%] 0

60 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE ABSORPČNÍ UV/VIS Absorpce záření intenzita absorpce se řídí Bouguer Lambert Beerovým zákonem A l c A λ absorbance při dané λ λ absorpční koeficient při dané λ l optická dráha c koncentrace absorbující látky Molární absorpční (extinkční) koeficient λ jakou absorbanci při dané vlnové délce má látka o koncentraci 1 mol/l v kyvetě o délce 1 cm Specifický absorpční (extinkční) koeficient A λ 1% jakou absorbanci při dané vlnové délce má látka o koncentraci 1 % v kyvetě o délce 1 cm

61 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE ABSORPČNÍ UV/VIS absorbance je aditivní veličina Absorpce záření A n i 1 A n i, 1, l c1 2, l c2 n, l cn l i i 1 A λ absorbance při dané λ λ absorpční koeficient při dané λ l optická dráha c koncentrace absorbující látky c i Podmínky použití pro výpočet při analýze více látek změřit absorbanci při takovém počtu vlnových délek jako je počet stan. látek vlnové délky volit tak, aby se absorpční koeficienty složek co nejvíce lišily výpočet pomocí soustavy rovnic (analýza 2 látek = 2 rovnice o 2 neznámých)

62 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE ABSORPČNÍ UV/VIS Typická spektra přírodních barviv

63 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE ABSORPČNÍ UV/VIS Jednoduchý fotometr Měření absorbance při jedné vlnové délce Obsahuje 4 základní části: zdroj záření deuteriová nebo vodíková výbojka (UV) wolframová žárovka (VIS) monochromátor optická mřížka kyveta se vzorkem křemenná (UV) skleněná (VIS) detektor fotonásobič

64 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE ABSORPČNÍ UV/VIS Spektrofotometr (s PDA) Měření absorbance při více vlnových délkách současně Obsahuje 4 základní části zdroj záření deuteriová nebo vodíková výbojka (UV) wolframová žárovka (VIS) kyveta se vzorkem křemenná (UV) skleněná (VIS) disperzní prvek hranol nebo holografická mřížka detektor diodové pole (photodiode-array = PDA) Nyní téměř vždy ve dvoupaprskovém uspořádání - 2 kyvety - pro slepý a měř. vz.

65 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE ABSORPČNÍ UV/VIS UV/VIS spektrometrie v analytické praxi Absorpce záření závisí na: - koncentraci analytu (měřený parametr) - vlnové délce ( nm) - optické dráze (0,2 5 cm) Pozor na negativní vlivy rozptylu a luminiscence! Optimální interval měřených hodnot absorbance je cca 0,4-1 Důležitý je výběr vhodné vlnové délky! Využití v praxi velmi široké využití v analytické chemii, biochemii... Měření absorpčních spekter - určování struktury (omezené mož.) Sledování chem. rovnováh a kinetiky reakcí, stan. fyz. konstant Kvantitativní organická i anorganická analýza Detektory u separačních (LC a ELFO) a diagnostických metod

66 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE ABSORPČNÍ INFRAČERVENÁ SP. (IR) Infračervená spektrometrie molekulová absorpční rotačně vibrační spektrometrie v infračervené oblasti ( cm -1 ) každá molekula má specifickou absorpci, tzn. že absorbuje v určitých oblastech frekvencí záření, někde více a jinde méně molekula může absorbovat pouze určité kvantum záření: frekvence záření se musí shodovat s frekvencí vibrace vlivem absorpce energie elektromagnetického záření dochází ke změně molekulových vibrací (a rotací) = rotačně vibrační přechody S rostoucím počtem atomů v molekulách značně vzrůstá počet základních vibrací a také počet absorpčních pásů IR spektra jsou podstatně složitější než UV/VIS spektra, ale poskytují mnohem více informací o struktuře látky

67 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE ABSORPČNÍ INFRAČERVENÁ SP. (IR) Vibrace v IR spektrometrii valenční (změna délky vazeb) deformační (změna úhlu vazby) Frekvence valenčních vibrací jsou vždy vyšší než frekvence deformačních vibrací dané funkční skupiny

68 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE ABSORPČNÍ INFRAČERVENÁ SP. (IR) Vibrace v IR spektrometrii

69 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE ABSORPČNÍ INFRAČERVENÁ SP. (IR) Absorpce IR záření

70 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE ABSORPČNÍ INFRAČERVENÁ SP. (IR) Identifikace látek v IR spektrometrii

71 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE ABSORPČNÍ INFRAČERVENÁ SP. (IR) měření transmitance nebo absorbance obsahuje 4 základní části: IR spektrometr zdroj záření elektricky vyhřívaná keramická tyčinka nebo tyčinka z kovů vzácných zemin vyhřívaná až na 1500 C) monochromátor optická mřížka nebo hranol (z NaCl a/nebo KBR) kyveta se vzorkem z NaCl nebo KBr detektor využívají tepelných účinků záření (termočlánek)

72 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE ABSORPČNÍ INFRAČERVENÁ SP. (IR) měření transmitance nebo absorbance FTIR spektrometr nemá monochromátor k rozlišení λ používá princip Michelsonova interferometru paprsek ze zdroje polychromatického záření vstupuje na polopropustné zrcadlo, kde se 50 % odráží na fixní zrcadlo a 50 % propouští na pohyblivé zrcadlo vzorkem prochází najednou oba paprsky s dráhovým posunem: - ve fázi (sčítají se = zesílení signálu) - mimo fázi (odečítají se = zeslabení signálu) Získaný interferogram (funkce času) se převádí pomocí fourierovy transformace na spektrum (funkce λ)

73 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE RAMANOVA SPEKTROMETRIE Ramanova spektrometrie molekulová rotačně vibrační spektrometrie v ultrafialové (UV), ve viditelné (VIS) a infračervené oblasti vlivem výměny energie elektromagnetického záření a molekuly dochází ke změně molekulových rotací nebo rotací a vibrací = rotačně vibrační přechody nevyužívá přímé absorpce záření ale molekulárního kombinačního rozptylu vysoce monochromatického záření na molekulách látek rozptyl světla - na částečkách - Tyndallův efekt (bez změny λ) - na molekulách - Rayleighův efekt (bez změny λ) - Ramanův efekt (změna λ)

74 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE RAMANOVA SPEKTROMETRIE Ramanova spektrometrie po srážce fotonů s molekulami se převážná část záření (cca 99 %) odrazí beze změny λ (pružná srážka) malá část záření (cca 1 %) se odrazí s jinou λ (nepružná srážka) spektrum tohoto záření je tvořeno čárami nebo pásy s λ posunutými oběma směry oproti délce původního záření (Ramanův posun) měří se závislost intenzity rozptýleného záření na jeho vlnové délce rozptýlené (Rayleigh) - pružná srážka - stejná frekvence budící záření rozptýlené (Raman) - nepružná srážka - různá frekvence

75 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE RAMANOVA SPEKTROMETRIE téměř 1% cca 99 % téměř 0% Antistokesovy linie jsou zrcadlovým obrazem stokesových linií

76 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE RAMANOVA SPEKTROMETRIE Základní podmínka v Ramanově sp. při nepružných srážkách dochází ke změně E vnitřní a nikoliv E kinetická při srážce s fotonem nedochází k jeho pohlcení (absorpci) molekulou, ale jen ke změně rozložení náboje (elektronové hustoty) v molekule dochází tedy k polarizaci molekuly podmínkou aktivity vibrace a/nebo rotace a výskytu odpovídajícího pásu v Ramanově spektru je nenulová změna polarizovatelnosti při vibračním a/nebo rotačním přechodu Rozdíl podmínky IR spektrometrie od podmínky Ramanovy spektrometrie: podmínkou aktivity vibrace a/nebo rotace a výskytu odpovídajícího pásu v infračerveném spektru je nenulová změna dipólmomentu při vibračním a/nebo rotačním přechodu

77 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE RAMANOVA SPEKTROMETRIE Význam pro identifikaci a strukturní analýzu RAMANŮV POSUN (rozdíl frekvencí mezi rozptýleným a budícím z.) - nezávisí na frekvenci budícího záření, ale odpovídá energii rotačně vibračních stavům mezi nimiž dochází k přechodu - tato energie je kvantována (pouze určité hodnoty energií, tj. určité frekvence) - shoduje se s frekvencí odpovídajícího absorpčního pásu v IR nebo MW spektru - odpovídá určitým vazbám v molekule RAMANOVO SPEKTRUM - velmi podobné IR spektru - některé pásy se objevují - pouze v Ramanově spektru - pouze v IR spektru - v obou spektrech - žádném spektru - u molekul se středem symetrie nenalezneme pro žádnou z Ramanových linií odpovídající pás v infračerveném spektru - výrazně se projevují symetrické vibrace V závislosti na změně dipólmomentu a/nebo polarizace molekuly

78 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE RAMANOVA SPEKTROMETRIE Ramanovo spektrum

79 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE RAMANOVA SPEKTROMETRIE Ramanovo spektrum vs. IR spektrum

80 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE RAMANOVA SPEKTROMETRIE 4 základní části Ramanův spektrometr - zdroj budícího záření plynový laser nebo laditelný barviový laser - kyveta se vzorkem skleněná nebo křemenná - monochromátor vysoce kvalitní, 2 mřížky - detektor Budící záření musí být: - vysoce monochromatické - co nejvíce intenzivní Lze i v provedení s Fourierovou transformací = FTRS spektrometry

81 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE RAMANOVA SPEKTROMETRIE Ramanova spektrometrie v analytické praxi zprac. a interpretace spekter i aplikace metody je stejné jako u IR Ramanova a IR spektrometrie se vzájemně doplňují! Výhody oproti IR spektrometrii: - přehlednější spektra (méně pásů) - práce ve VIS oblasti stačí skleněné nebo křemenné kyvety - celé spektrum v jednom rozpouštědle (voda, CCl 4, CHCl 3 ) - stačí i méně než 1 mg vzorku - přesnější kvantitativní analýza identifikace organických látek pomocí knihoven spekter strukturní analýza organických látek pro pevné, kapalné i plynné vzorky pozor na negativní vlivy fluorescence a rozptylu na pevných částicích

82 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE LUMINISCENČNÍ Luminiscenční spektrometrie molekulová luminiscenční (emisní) spektrometrie v blízké ultrafialové oblasti ( nm) a viditelné oblasti ( nm) každá molekula má specifickou absorpci, tzn. že absorbuje v určitých oblastech frekvencí záření, někde více a jinde méně vlivem absorpce energie fotonu (elektromagnetického záření) dochází k přechodům valenčních elektronů = elektronické přechody po přechodu do excitovaného stavu dochází ihned k deexcitaci, při níž se látka zbavuje energie vyzářením (emisí) záření o jiných, zpravidla delších, vlnových délkách vyšší hodnoty vlnových délek emitovaného záření jsou důsledkem nezářivých přechodů, které v molekule probíhají a na které je část absorbované energie spotřebována

83 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE LUMINISCENČNÍ Luminiscenční spektrometrie využívá jevu FOTOLUMINISCENCE = sekundární záření, které molekuly látky vyzařují (emitují) po absorpci primárního (budícího) záření z UV/VIS oblasti Fotoluminiscence se dělí podle doby trvání emise záření (dosvitu): FLUORESCENCE ( s) FOSFORESCENCE ( s) Měření fluorescence či fosforescence téměř vždy pod úhlem 90 ve směru paprsku budícího záření!

84 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE LUMINISCENČNÍ Jablonského diagram

85 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE LUMINISCENČNÍ Excitační a emisní spektrum Stokesův posun: maximum absorpčního a fluorescenčního spektra látky je posunuto díky vnitřní konverzi a vibrační relaxaci

86 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE LUMINISCENČNÍ FLUORESC. SP. Fluorescenční spektrometrie Excitace molekuly absorpce UV/VIS záření o energii odpovídající elektronovému přechodu Emise záření vyzáření energie ve formě fotonů při deexcitaci do základního stavu S 1 S 0 doba emise: s

87 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE LUMINISCENČNÍ FLUORESC. SP. Fluorescenční spektrometrie vysoká rychlost vnitřní konverze vždy na nulovou hladinu excitovaného singletového stavu S 1 k fluorescenci dochází vždy ze stejné hladiny (exc. singletového stavu S 1 ) bez ohledu na to, na jakou hladinu byla molekula vybuzena S 1 S 0 λ max fluorescenčního pásu a tvar pásu nezávisí na λ budícího UV/VIS záření λ budícího UV/VIS záření ovlivňuje pouze intenzitu fluorescence

88 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE LUMINISCENČNÍ FLUORESC. SP. Fluorescenční spektrometr 5 základních částí - zdroj - dříve Hg výbojka - poté deuteriová výbojka nebo wolframová lampa - nejnověji pulsní zdroje (Xe výbojka, lasery) - excitační monochromátor - kyveta se vzorkem - emisní monochromátor - detektor

89 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE LUMINISCENČNÍ FLUORESC. SP. Měření emisních spekter při konstantní λ excitačního (budícího) záření Excitační monochromátor nastaven na fixní vlnovou délku (většinou maximum absorpce) Emisní monochromátor skenuje spektrum emitovaného záření

90 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE LUMINISCENČNÍ FLUORESC. SP. Emisní monochromátor nastaven na fixní vlnovou délku (většinou dál za maximem emise fluorescence) Měření excitačních spekter při konstantní λ emitovaného (fluorescenčního) záření Excitační monochromátor skenuje spektrum ukazující, které vlnové délky jsou schopné excitovat zkoumanou látku

91 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE LUMINISCENČNÍ FLUORESC. SP. Fluorescence v analytické praxi Intenzita fluorescence závisí na: - koncentraci analytu (měřený parametr) - vlnové délce excitačního a emisního záření ( nm) - teplotě (roste s klesající teplotou) - viskozitě (roste s rostoucí viskozitou) Pozor na negativní vliv látek zhášejících fluorescenci (O 2, karb. skup.) až 1000x citlivější než UV/VIS spektrometrie (LOD až g = 1 pg) Využití v praxi ultrastopová organická analýza v ŽP (PAU ve vodách a půdách), v potravinářském průmyslu (aflatoxiny v oříškách aj.), klinická an. detektory v kapalinové chromatografii (LC) studium reakční kinetiky, čistota látek (shoda exc. a em. spektra) anorganická analýza Al, Be, Ga, Lu aj. jako fluoreskující komplexy po reakci s der. salicylaldehydu či 8-hydroxychinolinu (LOD až 10-7 g/l)

92 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE LUMINISCENČNÍ FOSFORESC. SP. Fosforescenční spektrometrie přechod z nulové hladiny excitovaného singletového stavu S 1 do nulové hladiny excitovaného stavu T 1 nezářivým mezisystémovým přechodem a následná zářivá deexcitace do různých hladin základního singletového stavu S 0

93 OM SPEKTRÁLNÍ MOLEKULOVÁ SPEKTROMETRIE LUMINISCENČNÍ FOSFORESC. SP. Fosforescenční spektrometrie velice podobné fluorescenční spektrometrii: - měření emitovaného (fosforescenčního záření) kolmo na směr budícího záření - spektra (pásové, vibrační struktura) - zákonitosti (tvar ani λ max emisního spektra nezávisí na λ budícího záření) - vliv teploty (s klesající teplotou roste intenzita fosforescence) - kombinované přístroje pro měření fluorescence i fosforescence hlavní rozdíl od fluorescence je v delší době trvání emise záření! lin. závislost I FOSF na koncentraci jen v úzkém rozsahu nízkých konc. uplatnění v analytické praxi: - podstatně méně rozšířené než fluorescenční spektrometrie - organická analýza: léčiva, polyaromatické uhlovodíky (PAU) - anorganická analýza: prvky vzácných zemin, sloučeniny uranu

94 Děkuji za pozornost