ostrý gradient (falešný M-gradient). Pøi bìžné elektroforéze na agaróze (napø. od firmy SEBIA) je gradient elektroforetické metody, tedy pøi vysokých

Transkript

1 Creaktivní protein Doc. RNDr. Miloš Tichý, CSc., Doc. MUDr. Jaroslav Gregor, CSc., PharmDr. Magdaléna Holeèková, MUDr. Radek Pudil, Ph.D. II. interní klinika a ÚKBD, Fakultní nemocnice Hradec Králové Creaktivní protein (CRP) byl prokázán v roce 1930 na Rockefellerovì univerzitì v USA v plazmì nemocných pneumokokovou pneumonií, jako protein reagující s Cpolysacharidem bunìèné stìny pneumokokových bunìk. Èasná fáze systémové zánìtlivé reakce byla pozdìji nazvána odpovìdí akutní fáze, i když zvýšené koncentrace CRP jsou prokazovány nejen pøi akutních, ale i chronických zánìtech a u øady dalších onemocnìní. K rozvoji odpovìdi akutní fáze vedou nejèastìji infekce, úrazy, operace, popáleniny, infarkty, imunologicky i neimunologicky podmínìné zánìtlivé procesy a pokroèilá nádorová onemocnìní. Pøi odpovìdi akutní fáze dochází nejen ke zmìnám koncentrace CRP, ale i øady dalších bílkovin, vìtšinou syntetizovaných v játrech. Proteiny akutní fáze mùžeme definovat jako proteiny, které zvyšují svoji koncentraci o 25% a více v prùbìhu prvních 7 dní po poškození tkánì (tab. 1). Proteiny akutní fáze mùžeme rozdìlit podle rychlosti syntézy a odbourávání na: proteiny, které jsou rychleji syntetizovány, než jsou odbourávány (zvýšená koncentrace), mezi nì patøí CRP, serum amyloid A protein (SAA), kyselý alfa1 glykoprotein, alfa1 antitrypsin, haptoglobin, ceruloplazmin a fibrinogen. Dále bílkoviny, které jsou produkovány stejnou rychlostí, jako jsou odbourávány (žádná nebo malá zmìna koncentrace) alfa2 makroglobulin, C3 složka komplementu, a koneènì bílkoviny, které jsou rychleji odbourávány než produkovány (koncentrace snížená), jako je transferin, transthyretin a albumin. Pøi elektroforéze CRP migruje podle typu použité elektroforézy mezi rychlými gama a pomalými beta globuliny, nebo v oblasti pomalých gama globulinù, a mùže vytváøet Funkce Inhibitory proteázs Koagulace Komplement Transportní proteiny Rùzné Protein akutní fáze α1antitrypsin α1antitrypsinogen fibrinogen prothrombin faktor VIII plasminogen C1s C2, B C3, C4, C5 C9 C5b haptoglobin hemopexin ceruloplasmin ferritin Creaktivní protein Sérum amyloid protein A ostrý gradient (falešný Mgradient). Pøi bìžné elektroforéze na agaróze (napø. od firmy SEBIA) je gradient zøetelný pøi koncentracích CRP korespondujících s citlivostí použité elektroforetické metody, tedy pøi vysokých koncentracích kolem 500 mg/l a více. CRP má molekulovou hmotnost kolem 120 kda. Jeho molekula se skládá z pìti identických, neglykolyzovaných polypeptidických podjednotek (protomerù) o mol. hm. 24 kda. CRP patøí mezi tzv. pentraxiny, což jsou multimericky organizované proteiny s variabilním poètem podjednotek (obr. 1). Název celé skupiny je odvozen od typického, pentagonálního tvaru molekuly CRP, daného nekovalentní vazbou pìti globulárních podjednotek. Klasické pentraxiny, tj. CRP a SAP (sé Tab.1: Podle: Ritchie, R.F., Navolotskaia, O.: Maine Printing Comp., USA 1996 Zvýšení 24 x 24 x 02 x 24 x x 8

2 Obr. 1: Prostorové zobrazení protomeru CRP (typ I) (CRP tvoøí 5 tìchto protomerù, každý o 206 aminokyselinách, protomery jsou uspoøádány cyklicky a symetricky) Podle: Szalai, A.J. a spol.: Clin. Chem. Lab. Med, 37, 1999, 3: Hepatocyt ZÁNÌTLIVÝ PODNÌT Makrofág rum amyloid P protein), jsou reaktanty akutní fáze. CRP je syntetizován játry (obr. 2). Tvorba CRP je v hepatocytech stimulována pøedevším interleukinem 6 (IL6). Biologický poloèas cirkulujícího CRP je 19 h. CRP má schopnost aktivovat komplementový systém jak klasickou, tak i alternativní cestou. Váže se na rùzné ligandy, napø. významnou funkcí CRP je kalcium dependentní vazba na fosfatidylcholin bakteriální stìny a na bunìèné membrány. Vazba dvou volných iontù Ca 2 na každou podjednotku podmiòuje zmìnu alosterické konfigurace CRP do podoby vhodné k vazbì na cílové struktury. CRP se pøitom váže na nukleární chromatin a membránové struktury nekrotických a poškozených bunìk, nikoliv bunìk zdravých. Vazba a následná eliminace makromolekul z rozpadajících se bunìèných jader v nekrotické tkáni pøedstavuje dùležitou preventivní funkci, která zabraòuje autoimunní reakci proti vlastním nukleárním antigenùm. Ne zcela prozkoumané jsou úèinky CRP na funkci trombocytù a lymfocytù. Diskutována je schopnost CRP zamezit rùstu nìkterých nádorù a jeho pøímá antioxidaèní aktivita. CRP je dominujícím proteinem akutní fáze a jeho koncentrace se mùže za patologických stavù zýšit až VAZBA phosphorylcholin, chromatin, fibronectin, laminin, bacteria, fungi, parasites, cells AKTIVACE complement modulation of phagocytosis Obr. 2: Podle: Ritchie, R.F., Navolotskaia, O.: Maine Printing Comp., USA 1996 Graf 1: Muž, 59 let, Dg: dilataèní kardiomyopatie, srdeèní selhávání LK 1000x. U bakteriálních infekcí dosahuje hodnot mg/l a více, na rozdíl od virových, mykobakteriálních a parazitárních infekcí, kdy dochází jen k mírnému vzestupu CRP (2050 mg/l). Vzestup CRP je velmi rychlý, bìhem 610 h, maxima dosahuje za 2448 h, a k normálním hodnotám se vrací bìhem asi 4 dnù. U zdravých jedincù je sérová koncentrace CRP obvykle nižší než 1 mg/l (90% má CRP pod 3 mg/l). Obecnì používaná hranice normálních hodnot CRP je 5 mg/l. Užiteèné je prùbìžné sledování koncentrace CRP bìhem léèby. Úspìšná terapie antibiotiky se projeví rychlým poklesem, pøi neúspìšné léèbì zvýšené koncentrace CRP pøetrvávají (graf 1). Skuteèný comeback zažívá CRP v souèasnosti, zejména se zjištìním, že hodnoty nad 23 mg/l lze pokládat za prediktivní ukazatele pozdìjší koronární pøíhody u nemocných anginou pectoris, a dokonce toto ohrožení bylo prokázáno i na velkých souborech zdravých jedincù (graf 2, tab. 2). Zvýšení koncentrace CRP mùže svìdèit pro pøítomnost zánìtu v koronárních tepnách (napø. u vulnerabilního ateromového plátu) a zvyšuje riziko koronární pøíhody (tab. 3). Zvýšení CRP se tak 9

3 Graf 2.: Rifai, N., Ridker, P.M.: Clinical Chemistry, 47, 2001, 3: NCPM = náhlá cévní pøíhoda mozková; OPT = onemocnìní periferních tepen Nìkteré studie analyzující vztah mezi CRP a kardiovaskulárními onemocnìními Autor / studie MONICA (1999) Ridker (1998) ECAT APS (1997) Pirro (2001) možná vysvìtlení: Typ studie randomisovaná prospektivní studie 936 prospektivní, 122 kard. 244 kontrol prospekt. studie u SAP a, 1797 m., 324 ž. prospektivní studie 2037 zdr. m., stø. vìk Délka CRP jako nepøímý kardiovaskulární rizikový faktor 1. CRP odráží zánìt koronárních tepen zpùsobený patogenním agens 2. CRP odráží zánìt ve vztahu k rozsahu a závažnosti aterosklerózy. 3. CRP odráží zánìt ve vztahu k rozsahu ischemie myokardu (angina). 4. CRP odráží zánìt ve vztahu k rozsahu nekrózy myokardu (AIM). 5. CRP odráží množství a aktivitu cirkulujících prozánìtlivých cytokinù (TNF, IL1, IL6). 8 let 3 roky 2 roky 5 let Tab 2.: SAP = stabilní angína pectoris; = nestabilní angína pectoris; KVP = kardiovaskulární pøíhoda Tab 3: Podle: Lagrand,W.K. a spol: Circulation, 100, 1999, 1: Výsledek studie 2,6x vyšší riziko koronární pøíhody 5x vyšší riziko KVP 7x vyšší riziko IM 2x vyšší relat. riziko koronární pøíhody 1,8x vyšší riziko ICHS, nad 55 let stává spolu s vyšším cholesterolem a dalšími rizikovými faktory jedním ze základních ukazatelù rizika komplikace aterosklerózy (graf 3). Protože se pro tyto úèely pohybujeme v hodnotách CRP pod hranicí normálních hodnot, je nezbytné použít soupravy na vysoce citlivé (ultrasenzitivní) stanovení CRP, v rozsahu hodnot 0,120 mg/l. Zánìt hraje dùležitou roli pøi aterotrombóze a zjiš ování markeru zánìtu, jako je vysoce citlivé (high sensitivity) CRP (HSCRP), nás mùže informovat o riziku ruptury ateromového plátu (tab. 4). V praxi se èasto používá rozdìlení hodnot CRP na tercily: < 4 mg/l nízké riziko, 49 mg/l støední riziko a >9 mg/l vysoké riziko. Bìžnì používané soupravy na stanovení CRP mají detekèní limit od 3 mg/l do 8 mg/l a rozsah mìøení do 250 mg/l. Tyto klasické soupravy nejsou použitelné pro predikci rizika kardiovaskulárními onemocnìními. Kromì turbidimetrických a nefelometrických mìøení se používají i metody latexové nebo luminometrické. Vlastní zkušenosti se stanovením HSCRP Ke stanovení HSCRP jsme použili soupravy CRP (Latex) US, firmy Roche Diagnostic. Souprava obsahuje latexové èástice s monoklonálními protilátkami proti lidskému CRP v glycinovém pufru. Mìøí se aglutinace antigenprotilátkových komplexù turbidimetricky. Zkoumanou sestavu tvoøilo 12 nemocných s nestabilní anginou pectoris a akutním nonq infarktem myokardu a 4 nemocní s vertebrogenním algickým syndromem (). U všech nemocných jsme hodnotili, zda užívají statiny pro zvýšené hladiny lipidù, stanovili jsme koncentraci troponinu T v séru, dále u vádíme v tabulce výsledek koronarografie, ekg a koneènou diagnózu. Jako patologické jsme hodnotili koncentrace HSCRP vyšší než 2 mg/l. V tab. 5 jsou výsledky u našeho sou 10

4 Graf 3: Rifai, N., Ridker, P.M.,: Clinical Chemistry, 47, 2001, 3: boru nemocných nestabilní anginou pectoris (). Vyšší hodnota HSCRP je u první nemocné, jednalo se o polymorbiditu hypertenzi, diabetes mellitus, koxartrózu, chronickou renální insuficienci. U nemocných è. 3 a 9 šlo o nonq AIM. Tito nemocní mìli pozitivní jak HSCRP, tak i troponin T. Nemocná è. 4 polymorbidita hypertenze, cukrovka, flebotrombóza, ICHS, hyperlipidémie. Nemocný è. 10 mìl diagnózu hyperlipidémie, ICHS, obezita. Mìl také pozitivní ctnt. Nemocná è. 11 herpes zoster, prùduškové astma, alergie, hypertenze. V tab. 6 jsou 4 naši nemocní s vertebrogenním algickým syndromem. Nemocná è. 13 mìla v dg. hypertenzi, Basedowovu chorobu, obezitu, spondylózu. Nemocná è. 14 mìla mírnì zvýšený celkový cholesterol 5,2 mmol/l a nebyla léèena statiny. Zjištìní zvýšených hodnot HSCRP, jako pozitivního druhého rizikového markeru, vedlo k úpravì léèby o podávání statinù. Nemocná è. 15 hypertenze, diabetes, hyperlipidémie, stav po pankreatitidì. Obì nemocné s nejvyššími hodnotami HSCRP vykázaly v pøíštích mìsících výrazné zhoršení stavu. Nemocná è. 1 byla za dva mìsíce znovu hospitalizována a byla u ní provedena chirurgická revaskularizace. Nemocná è. 4 byla za 5 mìsícù také znovu hospitalizována a byla provedena chirurgická revaskularizace. Diskuse Hlavním úskalím hodnocení zvýšených hodnot HSCRP je nespecifiènost tohoto stanovení. Na oddìleních pro vnitøní choroby se setká HSCRP u více jak 5000 osob bez známek kardiovaskulárního onemocnìní Quintily Rozpìtí mg/l 0,10,7 0,71,1 1,21,9 2,03,8 3,815,0 Tab 4: Podle: Ridker, P.M.: Circulation, 103, 2001, 13: Riziko nízké mírné støední vysoké velmi vysoké váme vìtšinou se staršími nemocnými, kteøí trpí nìkolika onemocnìními. Právì tyto multimorbidity zpùsobují znaèné potíže pøi interpretaci výsledkù HSCRP. Proto zvýšené hodnoty CRP stanovené ultrasenzitivními metodami musí být hodnoceny individuálnì u každého nemocného. Èím vyšší jsou hodnoty HSCRP, tím je vyšší riziko, jak jsme také pozorovali u dvou našich nemocných. Pøínosem je také využití HSCRP v kombinaci s ostatními markery rizika kardiovaskulárních onemocnìní a pøi pozitivitì indikují zahájení intenzívnìjší terapie, napø. statiny. CRP je relativnì stabilní bílkovina, preanalytická pøíprava vzorku je jednoduchá, mùže se urèovat jak v séru, tak v plazmì. Analytické postupy jsou dobøe standardizované. Asi polovina všech AIM je zjiš ována u osob s normální hladinou lipidù. Proto se hledají další potenciální markery rizika kardiovaskulárních onemocnìní, vèetnì homocysteinu, fibrinogenu, apoa, apob a lipoproteinu (a). Ateroskleróza je multifaktoriální proces a je evidentní, že zánìt je dùležitou komponentou v její patogenezi. HSCRP je další rizikový faktor, který pøedevším v kombinaci s celkovým cholesterolem a HDL cholesterolem mùže predikovat budoucí AIM. Závìr Výsledky prospektivních studií zdravých jedincù, jakož i výsledky studií u nemocných s ICHS, prokazují vztah mezi CRP a budoucí koronární pøíhodou. Bylo prokázáno tìsné spojení mezi zvýšenými hodnotami CRP v plazmì a dysfunkcí endotelu. HSCRP je pøedevším marker zánìtu indukovaného cytokiny. CRP mùže pùsobit také jako prokoagulaèní faktor, protože indukuje expresi tkáòového faktoru v monocytech. CRP je nalézán ve stìnì cévní ve velmi èasné fázi formace ateromového plátu. Pøes všechny tyto závažné poznatky o úloze 11

5 HSCRP v predikci rizika budoucí koronární pøíhody má stanovení HSCRP pro klinickou interpretaci nìkterá závažná omezení. Jde o nespecifický zánìtlivý marker, který nejèastìji indikuje akutní infekci nebo trauma. I když velké prospektivní studie demonstrují, že HSCRP je silným, nezávislým prediktorem budoucího AIM a že HSCRP koreluje s dysfunkcí endotelu, je zapotøebí HSCRP vyhodnocovat v èase mimo období infekcí. U osob se známým chronickým, zánìtlivým (systémovým) onemocnìním má použití HSCRP jen omezený význam. Èas zatím nedozrál pro populaèní testování HSCRP, protože výsledky nejsou univerzálnì aplikovatelné a vyžadují více poznatkù získaných z celkové populace. Zatím není indikována specifická terapie pro nemocné s pozitivním HSCRP, protože v souèasnosti není známo, zda snížení hodnot HSCRP snižuje riziko kardiovaskulárních onemocnìní. Pøesto randomizované klinické studie naznaèují, že pøi podávání aspirinu a statinù ke snížení rizika u tìchto nemocných dochází. Stanovení HSCRP má nesporný klinický význam zejména pøi individuálním hodnocení rizika u jednotlivých nemocných nestabilní anginou pectoris, jak jsme také prokázali v našem malém souboru nemocných s. n Tab 5: n Tab 6: pohl. pohl. vìk vìk statiny statiny? Obr: Elektroforéza bílkovin séra HSCRP u ctnt 0,069 0,97 0,53 0,053 HSCRP 9,45 1,29 2,02 12,56 1,96 0,64 0,87 0,68 2,56 4,13 2,21 0,66 HSCRP u ctnt HSCRP Literatura 1. DUCLOS, T. W. Function of Creactive protein. Ann. Med., 32, 2000, è. 4, s KOENIG, W. Creactive protein and cardiovascular risc: Has the time come for screening the general population? Clin. Chem., 47, 2001, è. 1, s LAGRAND, W. K. ET AL. Creactive protein as a cardiovascular risk factor. More than an epiphenomenon? Circulation, 100, 1999, è. 1, s PIRRO, M. ET AL. Age and duration of followup as modulators of the risk for ischemic heart disease associated with high plasma Creactive protein levels in men. Arch. Intern. Med., 161, 2001, è. 20, s RID KER, P. M. Highsensitivy Creactive protein. Circulation, 103, 2001, è. 13, s RIDKER, P. M., STAMPFER, M. J., RIFAI, N. Netradièní rizikové faktory systémové aterosklerózy. JAMACS, 9, 2001, è. 10, s RIFAI, N., RIDKER, P. M. Highsensitivity Creactive protein: a novel and promising marker of coronary heart disease. Clin. Chem., 47, 2001, è. 3, s RITCHIE, R. F., NA VOLOTSKAIA, O. Serum proteins in clinical medicine. Maine Printing Comp: USA, st Edition. 9. WESTHUY ZEN, J., HEALY, H. Review: Biology and relevance of Creactive protein in cardiovascular and renal disease. Ann. Clin. Lab. Sci., 30, 2000, è. 2, s YU, 3,68 4,46 5,99 0,65 KG odmítá KG norm. odmítá norm. slow flow EKG T AVI. T T LBBB T EKG T LBBB HLK Dg nonqim nonqim nonqim Dg Elektroforéza bílkovin séra šipkou oznaèeny gradienty CRP 1. Normál 3. CRP = 147 mg/l 4. CRP = 160 mg/l 5. CRP = 219 mg/l 6. CRP = 314 mg/l 7. CRP = 367 mg/l 8. CRP = 419 mg/l H., RIFAI, N. Highsensitivity Creactive protein and atherosclerosis: from theory to therapy. Clin. Biochem., 33, 2000, è. 8, s Rossi, E. Biasucci, L.M., Citterio, F. a spoluprac.: Risk of Myocardial Infarction and Angina in Patients With Severe Peripheral Vascular Disease. Predictive Role of CReactive Protein. Circulation, 105, 2002, è. 7, s Campbell, B., Badrick, T., Flatman, R., Kanowski, D.: Limited clinical utility of highsensitivity plasma Creactive protein assays. Ann. Clin. Bioechem., 39, 2002, s