MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE. Bc. LUDMILA SVOBODOVÁ

Transkript

1 MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2012 Bc. LUDMILA SVOBODOVÁ

2 Mendelova univerzita Brno Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Asociační analýza vybraného polymorfizmu genu IGF2 u souboru prasat České bílé ušlechtilé Diplomová práce Vedoucí práce: Vypracovala: Doc. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D. Bc. Ludmila Svobodová Brno 2012

3 Prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Asociační analýza vybraného polymorfizmu genu IGF2 u souboru prasat České bílé ušlechtilé vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které uvádím a cituji v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MENDELU v Brně. Datum. Podpis diplomanta...

4 Poděkování Zpracovaná diplomová práce byla finančně podpořena z prostředků specifického vysokoškolského výzkumu projektu IGA AF č. TP 6/2011. Ráda bych poděkovala prof. RNDr. Aleši Knollovi, PhD. za odborné vedení práce, paní Mgr. Zuzaně Vykoukalové za odborné rady a trpělivost, kterou se mnou měla a dále děkuji Pavlínce, která mi se vším vždy ochotně pomůže. V neposlední řadě děkuji svým rodičům a svému příteli, kteří mě v mém studiu celou dobu podporovali.

5 Abstrakt Tato práce se zabývá asociační analýzou vybraného polymorfismu genu IGF2 u souboru prasat České bílé ušlechtilé. Zkoumanými vlastnostmi byly barva masa, ph ult, elektrická vodivost, obsah mastných kyselin, tuku, sušiny, cholesterolu a ukazatele jatečného těla. Gen IGF2 (insuline-like growth factor 2) patří do rodiny IGF a je kandidátním genem QTL s velkým vlivem na rozložení tuku a podíl svalové hmoty. U prasat je lokalizován na druhém chromozomu (2p1.7). Testování proběhlo u dvou skupin prasat plemene České bílé ušlechtilé o celkovém počtu 143 ks. Jednonukleotidový polymorfimus byl detekován pomocí metody PRC a RFLP. U vzorků byla vypočítána frekvence alel a genotypů. Výsledky byly zaneseny do databáze a následně byly vyhodnoceny programem SAS. Dle zjištěných dat je zřejmé, že ve sledovaném souboru zvířat se častěji vyskytuje genotyp CC se zastoupením 74.1%, genotyp GC je zastoupen v 25.9%. U prvního souboru prasat byly asociační analýzou zjištěny statisticky průkazné rozdíly mezi genotypy CC x GC u obsahu kyseliny olejové a kyseliny arachové, při hladině významnosti P Tentýž výsledek byl zjištěn i u tloušťky masa. Dále byl zjištěn vysoce statisticky průkazný rozdíl u obsahu kyseliny stearové při hladině významnosti P U druhého souboru prasat byl zjištěn statisticky průkazný rozdíl s hladinou významnosti P 0.05 mezi genotypy CC a GC u vlastností obsahu sušiny a červené barvy masa. KLÍČOVÁ SLOVA IGF2, genotyp, polymorfismus, České bílé ušlechtilé prase

6 ABSTRACT This thesis deals with the association analysis of the selected polymorphism of the IGF2 gene in a group of Czech White Noble pigs. The investigated properties were the colour of meat, meat ph ult, electrical conductivity, contents of fatty acids, fat, dry matter, and cholesterol as well as the carcass characteristics. The IGF2 gene (insulin-like growth factor 2) belongs to the IGF gene family and it is a candidate QTL gene that has a large influence on the distribution of fat and lean body mass. In the case of pigs, it is located on the second chromosome (2p1.7). The testing was carried on two groups of 143 individuals of Czech White Noble. The single nucleotide polymorphism was detected by the RFLP and PRC methods. The frequency of alleles and genotypes in the samples was calculated. The results entered the database and they were subsequently evaluated by the SAS programme. The acquired data have made clear that the CC genotype is prevailing in the observed set of animals, with its representation of 74.1%.The GC genotype is present in 25.9%. The association analysis of the first group of the pigs detected statistically significant differences between the CC and GC genotypes in the content of oleic and arach acids at the significance level of P The same result was also observed in the thickness of meat. Further, the statistically high significant difference in the content of stearic acid at the significance level of P 0.01 was discovered. The second group of the pigs was marked out by the statistically significant difference between the CC and GC genotypes in the content of dry matter and the red colour of meat at the significance level of P KEYWORDS IGF2, genotype, polymorfism, Large white

7

8 Obsah 1 ÚVOD CÍL PRÁCE Dílčí cíle LITERÁRNÍ PŘEHLED Historie chovu prasat Chov prasat v současné době Produkce masa Hodnocení masa SEUROP ph masa Vady masa Mastné kyseliny Barva masa Cholesterol Ztráta vody odkapem Plemeno České bílé ušlechtilé Genetické mapy Genetické rekombinační (vazbové) mapy Cytogenetické (chromozomové) mapy Kombinované mapy QTL Detekce QTL Kandindátní geny Genetické markery Genom prasete IGF Popis genu a jeho funkce Imprinting IGF2...29

9 Polymorfismus IGF Laboratorní metody PCR Složení reakční směsi Podmínky cyklování RFLP (polymorfismus délky restričních fragmentů) PCR - RFLP Elektroforéza Agarózová elektroforéza Vizualizace gelu MATERIÁL A METODIKA Zvířata Ukazatele jatečného těla a masa Izolace DNA PCR Složení reakční směsi Podmínky cyklování Ověření PCR RFLP Elektroforéza Statistické metody Marker VÝSLEDKY Frekvence alel a genotypů Důkaz Hardy - Weinbergrovy rovnováhy Polymorfismus genu IGF Vliv genu IGF2 na jatečné ukazatele masa u prasat DISKUZE Frekvence alel a genotypů Vliv na ukazatele kvality masa (barva masa, phult, EV24, odkap, obsah mastných kyselin, tuku, sušiny, cholesterolu)...47

10 6.3 Vliv na jatečné ukazatele masa ZÁVĚR SEZNAM LITERATURY SEZNAM OBRÁZKŮ A TABULEK SEZNAM ZKRATEK...56

11 1 ÚVOD V současné době je na maso z řad spotřebitelů kladen velký důraz. Jako důležité se jeví především nízký obsah tuku, výborné senzorické i chuťové vlastnosti a poslední dobou se lidé začínají zajímat i o to, odkud maso pochází. V České republice činila v roce 2009 spotřeba masa průměrně 80 kg na osobu. Největší část z tohoto množství tvoří právě maso vepřové ( V produkci kvalitního vepřového masa hrají nejdůležitější úlohu hybridizační programy. Jejich cílem je produkce takových prasat, které budou splňovat nároky jak z hlediska technologického, tak i finančního a užitkového. Proto je nutné znát genetický základ zvířat, abychom byli schopni určit koeficienty dědivosti, jednotlivé geny i interakce mezi nimi. Pomocí moderních genetických metod jsme schopni určit genetické markery, které mohou zlepšit odhad genetického potenciálu zvířat, díky spojení s oblastmi genů na chromozomech, které způsobují genetickou proměnlivost. Zlepší se tak odhad genetické hodnoty zvířat, zvýší se selekční zisk a my tak můžeme provádět dřívější selekci nevhodných jedinců a tím i zkrátit generační interval (JAKUBEC et al., 2002). Mezi takové geny, které ovlivňují právě zmasilost a rozložení tuku u zvířat patří i gen IGF2. Podporuje růst peptidů, které jsou strukturními homology inzulínu s obdobnou funkcí. Je součástí IGF systému a ovlivňuje prenatální i postnatální vývoj jedince. 11

12 2 CÍL PRÁCE Cílem práce bylo provést asociační analýzu jednonukleotidového polymorfismu v genu IGF2 s parametry kvality vepřového masa u souboru prasat České bílé ušlechtilé. 2.1 Dílčí cíle - U vybraného polymorfismu pomocí metody PRC-RFLP určit genotypy studovaného polymorfismu. - Sestavit databázi genotypů a užitkových vlastností a vyhodnotit je pomocí programu SAS. - Stanovit asociace mezi genotypy genu IGF2 a parametry kvality masa pomocí smíšeného lineárního modelu. 12

13 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Historie chovu prasat Chov prasat byl již od pradávna jedním z nejdůležitějších odvětví v celé živočišné výrobě. První zmínky o chovu prasat pochází již z Egypta z dob vlády prvních faraonů. V době kolem 3.tis.př.n.l. se chovala prasata ve velkých stádech, která se pásla na značné části území. Ve středověku pak tvořilo vepřové maso téměř 90% výživy obyvatel. Od 15. stol. až do 18. stol. byl chov prasat mírně na ústupu kvůli značné náročnosti hospodaření, ale tento ústup zkončil zrušením roboty v roce Od tohoto roku se začalo s chovem prasat ve stájovém prostředí a mizí celoroční pastva. Od poloviny 19. stol. byla snaha o import prasat ze zahraničí a o zlepšení životních podmínek prasat ve stájích. V období první světové války pak narůstala několikanásobně potřeba masa. Chov v našich podmíkách tuto potřebu nebyl schopen pokrýt, proto se začala dovážet plemena prasat ze zahraničí a křížit s našimi plemeny. Po první světové válce byl náš chov značně oslaben a došlo k postupnému rušení plemenných stanic. Tento stav se řešil křížením zbylých prasat, které ovšem přineslo devastaci chovu a prasata nesplňovala požadavky ani exteriérově, ani reprodukčně. Pokles oproti roku 1910 činil 60-70%. V období mezi válkami lidé požadovali zvýšení kvality masa, což se řešilo dovozem masa a sádla ze zahraničí a regenerací plemen prasat u nás chovaných. Po roce 1945 došlo ke kvalitativnímu i kvantitativnímu rozvoji chovu prasat a k uplatňování jednoduchého užitkového křížení pro produkci výsekových prasat. V dalších letech jsme se zaměřili na rozvoj kvalitního chovu prasat a složitější typy křížení, produkci jatečných prasat a zvyšování plemenné hodnoty. Po roce 1973 se objevil požadavek libového vepřového masa, což si vyžádalo změnu v organizaci plemenářské práce a ke změně produkce jatečných prasat. Naše plemena prasat tak musela být zušlechťována plemeny importovanými ze zahraničí. Také se v tomto roce změnil systém zpeněžování jatečných prasat napevno v mase. V dalších letech se ve velkém začala využívat inseminace a koncem 80. let byl u nás chov prasat na velmi slušné úrovni 13

14 srovnatelné s jinými státy EU ( 3.2 Chov prasat v současné době Chov prasat je nedílnou součástí chovu hospodářských zvířat. V České republice je vepřové maso oblíbené a patří mezi nejkonzumovanější druhy masa. Vedlejšími produkty při chovu prasat jsou krupon (nejhodnotnější střední část zvířecí kůže), štětiny a krevní žlázy (slouží k výrobě biopreparátů). Toto odvětví chovu zvířat není ovlivněno přímou dotační politikou a proto patří do oblasti, která je plně v rukou tržního hospodářství. Chov prasat je závislý na pěstování obilnin. Celosvětová produkce vepřového masa se pohybuje kolem 88 mil. tun masa ročně, což znamená asi 1,2 miliardy prasat. Největším světovým chovatelem prasat je Čína, která chová přes 50% početních stavů. Evropská unie se na chovu podílí 20%, USA 10%. V Evropě je největším chovatelem Německo, Španělsko, Polsko, Rusko a Francie. V ČR se chov prasat potýká s problémy charakteristickými pro naši zemi: neschopnost producentů se sjednotit a mít společnou produkčně-odbytovou politiku, nevyužití genetického potenciálu, která zvířata nabízejí a někdy i se špatnou hygienou v chovech ( Početní stav prasat v ČR je konci roku 2011 je prasat ( 3.3 Produkce masa V užším slova smyslu se pod pojmem maso rozumí jen kosterní svalovina, a to buď jako samotná svalová tkáň nebo svalová tkáň včetně vmezeřeného tuku, cév, nervů, vazivových a jiných částí, které jsou ve svalovině obsaženy ( Produkce masa úzce souvisí s růstem zvířat, dynamickým procesem probíhajícím v průběhu celého života. Růst je složitým znakem masné užitkovosti, který je propojen se všemi životními pochody a lze ho sledovat jak u jednotlivých zvířat, tak u celých populací. Zvyšování živé hmotnosti zvířat je souhrným vyjádřením přírůstku jednotlivých tělesných 14

15 tkání, z nichž má při hodnocení mastné užitkovosti nejvyšší význam hmotnost svaloviny a tuku. Intenzita růstu těchto tělesných tkání je nejvýznaměji ovlivňována věkem zvířat, plemenem, užitkovým typem a chovatelskými podmínkami, při nejvyšším vlivu výživy, techniky a technologie chovu (Steinhauser, 2000). 3.4 Hodnocení masa SEUROP Hodnocení jatečných těl prasat se provádí podle jednotného systému, který se v ČR uplatňuje od 1. dubna Tento systém hodnotí podíl svaloviny v jatečném těle zvířete dle anatomických rozměrů na těle, které se dosadí do příslušných rovnic. V EU je tento systém platný od roku Legislativa SEUROP systému je zahrnuta v zákonu č. 306/2000 Sb., který mění původní zákon č. 110/1997 Sb., O potravinách a tabákových výrobcích (KULOVANÁ, 2002). Dle % podílu svaloviny se JUT třídí po veterinární prohlídce do jednotlivých obchodních tříd. Kategorie prasat s přejímací hmotností kg se třídí: S - 60% a více E - 55 až 59,9 % U - 50 až 54,9 % R - 45 až 49,9 % O - 40 až 44,9 % P - méně než 40 % JUT s hmotností nižší a vyšší, prasnice, pozdní řezanci, kanci a kryptorchidi se řadí do odlišných obchodních tříd: N - JUT prasat do 59,9 kg Z - JUT nad 120 kg, zmasilých prasnic a pozdních řezanců H - JUT vyhublých prasnic a pozdních řezanců K - JUT kanců a kryptorchidů 15

16 O zařazení do jednotlivých tříd a o patřičné ceně za JUT se vystaví protokol, z něhož musí být patrné, kdo je prodávající a kupující, den porážky zvíeřet, jeho pořadové či identifikační číslo, podíl svaloviny, tloušťka svalstva a sádla v mm, obchodní třída, přejímací hmotnost a jméno klasifikátora. Tento prokol se musí ukládat po dobu nejméně 6 měsíců (STEINHAUSER, 2000) ph masa Je to důležitý znak v charakteristice masa a jeho měření je jednoduché. Měří se pomocí ph papírku, ve výluhu a nebo se měří pomocí speciálních ph sond. V živém organismu se ph svaloviny pohybuje v rozmezí kolem 7,0, po porážce dochází k poklesu ph díky laktátu, který vzniká anaerobním odbouráváním energetických rezerv ve formě glykogenu. Tento proces je u prasat dokončen asi 24 hodin po porážce, kdy ph dosáhne své konečné hodnoty. Proto se měří ph svaloviny po porážce i 24 hodin po porážce. Krátce po vlastní porážce (do jedné hodiny) ph mírně klesá na 6,0 až 6,4 a v průběhu dalších 24 hodin ph klesá na hodnoty kolem 5,6 až 5,6 (ADAMOVÁ, 2003) Vady masa Vady masa jsou způsobeny odchylkami hodnot ph, což má za následek změnu vlastností masa. Jedná se o tzv. DFD a PSE maso. DFD z anglického dark = tmavé, firm = tuhé, dry = suché. Při této poruše jde o malý pokles ph po porážce zvířete (ať už z důvodu vyčerpání zvířete či předporážkového stresu). Takové maso je tmavší než normální, má vysokou vaznost, tkáň je tuhá, maso je suché, bez šťávy. Změna barvy masa je způsobena koloidním stavem bílkovin, jejichž povrch méně rozptyluje dopadající světlo a tím se zdá maso tmavší. Další z důsledku vysokého ph je nedostatečné zrání masa, které je pak příliš tuhé a nemá výraznou chuť ani vůni. Díky absenci sacharidů na počátku posmrtných změn má toto maso i omezenou trvanlivost. DFD maso se dá pro svoje vlastnosti použít například pro výrobu fermentovaných masných výrobků jako jsou salámy či párky 16

17 ( PSE maso se projevuje rychlým nástupem degradace glykogenu a adenosintrifosfátu na kyselinu mléčnou a inositovou ihned po zabití zvířete, ph masa klesá do jedné hodiny až na 5,8 i nižší. Takto rychlá glykogenolýza uvolní mnoho energie a zvýší teplotu svaloviny až na 43 C. Vysoká kyselost masa i jeho teplota způsobí zhoršení vaznosti masa, maso neudrží vodu a všechnu šťávu ztrácí odkapem. Takové maso se nedá použít pro výsek, ani pro výrobu masných výrobků celistvého charakteru, jako je například šunka či debrecínská pečeně. Jediné využití takového masa je opět jen do homogenně zpracovaných masných výrobků, jako jsou například párky (INGR, 2003) Mastné kyseliny Zastoupení mastných kyselin v mase ovlivňuje především množství a vlastnosti tuků. Mastné kyseliny s vyšším bodem tání se označují jako nasycené, mastné kyseliny s nízkým bodem tání pak jako nenasycené. Obsah nenasycených mastných kyselin je pro nás důležitý především kvůli dietetickým vlastnostem masa, obsah nasycených mastných kyselin pak z důvodu technologie zpracování masa. U masa s vyšším množstvím nenasycených mastných kyselin totiž dochází k poklesu konzistence sádla a zvyšuje se možnost oxidace a žluknutí tuku. Samotný nedostatek esenciálních mastných kyselin u prasat způsobuje reprodukční problémy. Tuk ve vepřovém mase obsahuje malé množství polynenasycených mastných kyselin (PUFA). Zásadní vliv na zastoupení a množství mastných kyselin v mase má kvalita a složení krmiva (BEČKOVÁ, VÁCLAVKOVÁ, 2009). Mezi nenasycené z námi sledovaných mastných kyselin patří kyselina olejová, palmitolejová, linolová, linolenová a arachidonová a mezi nasycené mastné kyseliny patří arachová, stearová a palmitová (www. biologie.php5cz) Barva masa Je znakem viditelným na první pohled, a proto je to pro spotřebitele znak důležitý. 17

18 Červená barva masa je způsobena hemovými barvivy myoglobinem a hemoglobinem. Obsah hemových barviv se v mase pohybuje v rozmezí mg/kg a závisí především na intravitálních vlivech. Základem hemu (barevná složka) je porfyrinový skelet se vnitřně zabudovaným železem, které je v mase dvojmocné. Hemoglobin má oproti tomu se své molekule čtyři peptidové řetězce a čtyři hemové skupiny. Podíl hemoglobinu u masa je dán stupněm vykrvení. Ke změnám barvy masa dochází vlivem reakcí na atomu železa. Může docházet buď k vazbě některých molekul na centrální atom, aniž by došlo ke změně valence železa, nebo může docházet k oxidaci, čímž železo ztratí elektron a přijme trojmocnou formu. Poté se na železo může navázat jako ligand molekulární kyslík a vzniká tak rumělkově červený oxymyoglobin (chrání atom železa před oxidací). K této situaci dochází při vysokém parciálním tlaku kyslíku. Naproti tomu při nízkém parciálním tlaku převládne oxidace železa na trojmocné a tím se myoglobin změní na hnědý až šedohnědý metmyoglobin. Ke změně masa může dojít i působením peroxidu vodíku, enzymů a mikroorganismů. Zelená barva masa vzniká v důsledku modrozeleného biliverdinu, který se redukuje na červeně zbarvený bilirubin. Na vzniku zelených barviv se podílí i lactobacily produkující peroxid vodíku, který rozkládá hemová barviva (www. vscht.cz) Cholesterol Cholesterol je látka, která v organismu plní důležitou úlohu ve funkci buněčných membrán, tvorbě žlučových kyselin, steroidních hormonů a vitamínu D. Exogenní cholesterol, který je přijímán s potravou, ovlivňuje obsah a distribuci cholesterolu v lipoproteinech krevní plazmy. Oxidační produkty cholesterolu se nazývají oxysteroly a vykazují toxicitu vůči buňkám cévní stěny. Obsah cholesterolu ovlivňuje živočišný druh, složení krmné dávky, doba výkrmu a také věk zvířete (KOMPRDA, 2006) Ztráta vody odkapem Jako odkap masa se bere procentuální podíl hmotnosti odkapané masové šťávy z 18

19 celkové hmotnosti vzorku za 24 hodin při teplotě 4 a 6 C (KLUZÁKOVÁ et al., 2011). 3.5 Plemeno České bílé ušlechtilé V České republice je to základní a nejrozšířenější plemeno. Vzniklo pomocí převodného křížení na podkladě domácích plemen prasat křížením zejména Anglického yorkshira a Německého bílého ušlechtilého plemene. Je to plemeno masného užitkového typu. U části populace se při jeho zušlechťování podílelo především v 60. letech jednorázovou migrací genů plemeno Landrase, dále se zušlechťovalo selekcí a imigrací genů plemene Velké bílé anglické, bílé ušlechtilé z Holandska, Německa, Francie a Švédska. Charakteristické pro toto plemeno je bílé zbarvení, má kratší vzpřímené uši a mírně prohnutou hlavu v profilu (Čechová, 2003). Mateřská pozice Prasata v mateřské pozici mají výborné reprodukční vlastnosti, velmi dobrou masnou užitkovost a vynikající růstovou schopnost při velmi dobré konverzi živin. Mají dobrou kvalitu masa. Tělesný rámec je střední až větší, kostra je pevná, ale jemnější, hlava lehčí se vzpřímeným uchem. Mají vysokou odolnost vůči stresu. Šlechtitelský standard: živě narozených selat: 13 průměrný denní přírůstek: 1300 g spotřeba směsi na 1 kg přírůstku: 2,6 kg podíl libové svaloviny: 54-56% Otcovská pozice Je otcovskou linií bílého ušlechtilého plemene. V charakteristice plemenného typu se příliš neliší od mateřské pozice. Rozdíl mezi nimi je v tom, že od otcovské pozice je požadováno suché vyjádření masného užitkového typu s mediální rýhou na hřbetě a kýtě. Tělesný rámec je střední až větší. Kostra je pevná, o něco mohutnější než u mateřské 19

20 pozice. Vyznačuje se dobrou růstovou schopností při výborné konverzi živin. Reprodukční vlastnosti jsou přiměřené chovnému cíli a použitému plemeni ( Obr. č. 1, Plemeno české bílé ušlechtilé Genetické mapy Genetické rekombinační (vazbové) mapy Jsou to neúplné mapy, které udávají pořadí a vzdálenost genů nebo polymorfních (anonymních) sekvencí DNA v centimorganech (cm). 1cM odpovídá 1% rekombinací (v klasické hybridologické analýze). Je to vzdálenost určená z pozorovaných frekvencí rekombinací v potomstvu (studium rodin). Mohou také obsahovat lokalizace genů a DNA markerů na chromozomech. Tyto vazbové mapy jsou sestavovány na základě klasické analýzy dvojnásobných nebo vícenásobných testovacích páření či křížení, nebo studiem rodin s tímto charakterem. 20

21 3.6.2 Cytogenetické (chromozomové) mapy Jsou založeny na fyzickém karyotypu. Při identifikaci jsou porovnávány barvené chromozomy se standartními ideogramy. Polohy jednotlivých genů na mapě jsou udávány číslem chromozomu, písmenem, které značí raménko a číslem jednotlivého pruhu chromozomu. Konkrétně u prasat se ke konstrukci cytogenetických map využívá hybridizace in situ. Pomocí značeného úseku DNA s denaturovanou DNA chromozomu je prováděna hybridizace, čímž detekujeme přesnou lokalizaci. Značení je prováděno radioaktivně a nebo častěji fluorescenční metodou FISH. Metoda je založena na principu buněčné fúze dvou živočišných druhů, čímž vznikne linie, která postupně ztrácí chromozomy a nakonec je stabilizována s jedním či několika chromozomy jednoho druhu a kompletní sadou druhého druhu (URBAN, 2008) Kombinované mapy Jsou založeny na kombinovaném sekvenčním a rekombinačním principu. Skládání těchto map se děje na základě znalostí definovaných cílových sekvencí (pro PCR primery). Pokud nemáme sekvenčně definovanou mapu dostatečně nahuštěnou, musíme jednotlivé cílové sekvence konfrontovat s rekombinační analýzou. Sekvečně definovaná, kdykoliv testovatelná a reprodukovatelná místa v genomu představují trvalé markery, které využíváme jednoduchou metodou PCR. Tyto mapy se dělí na STS (sequence tagged site = sekvenčně adresované místo) a EST (expressed sequence tag = exprimovaná sekvenční adresa) (HRUBAN et al., 1999). 3.7 QTL Jako QTL (Quantitative trait loci) jsou označovány lokusy, které obsahují geny 21

22 řídící komplexní kvantitativní vlastnosti. Detekce QTL má hned několik významných důvodů: a) poskytují základní poznatky o působení jednotlivých genů a jejich vzájemné interakci, umožňují tvorbu realističtějšího modelu fenotypové proměnlivosti b) informace získané pomocí polymorfních znaků můžeme použít ke zlepšení odhadu efektu šlechtěnní a plemenné hodnoty c) mapování QTL vytváří předpoklad pro poziční klonování genů, umožňující studium molekulárních příčin variability, případně zlepšení stávajících alel přímou intervencí pomocí rekombinantní DNA technologie d) výsledky mapování mohou být užitečné k objasnění etiologie variability lidské populace Začátky mapování QTL sahají do dvacátých let minulého století a ještě do nedávna byly založeny na detekci několika krevně-skupinových lokusů u hospodářských zvířat a biochemických polymorfních znaků u rostlin, které sloužily jako genetické markery. Počáteční neúspěchy v mapování lze přičítat nedostatečnému počtu genetických polymorfních markerů, které nemohly vystopovat polygenně složitě založené produkční vlastnosti. Další komplikací testování klasických polymorfních lokusů je fakt, že každý systém vyžadoval speciální metodu detekce, případně málo dostupná antiséra. DNA technologie umožnila přípravu velkého množství vysoce polymorfních markerů, které se dají testovat pouze jednou metodou a také rozvoj výpočetní techniky, která umožňuje vývoj matematicko-statistických metod. Tím je umožněna konstrukci relativně dostatečně saturovaných genetických map, které jsou nezbytně nutné pro mapování, tzn. pro detekci a izolaci QTL (HRUBAN et al., 1999). 22

23 3.7.1 Detekce QTL Pro mapování QTL (pro zjišťování vazby mezi polymorfními lokusy (PL) a QTL) je nejlepší využít kontrastní inbrední nebo čisté linie, v nichž jsou alely fixovány. U většiny hospodářských zvířat ale nejsou inbrední linie až na výjimky (kur) dostupné. Populace jsou outbrední, liší se pouze frekvencemi alel PL a QTL. Obecně se udává, že detekovatelné QTL korespondují s lokalizací kandidátních genů, ale množství anonymních sekvencí, které jsou detekovány QTL zatím převyšuje počet známých kandidátních genů. U prasat je mapování a detekce QTL soustředěna v projektech PigMap a Genetpigs (HRUBAN et al., 1999). 3.8 Kandindátní geny Za kandidátní gen je považován takový gen, u kterého předpokládáme potenciální vliv na nějaký fyziologický proces či po určení alely má za následek žádoucí fenotyp. Kvůli tomu musíme znát genetickou úlohu fyziologického procesu. Určení polymorfních míst a následné vyhodnocení rozdílů alel těchto kandidátních genů mezi jedinci s různými fenotypovými hodnotami, umožňuje identifikaci markerového genu asociovaného s danou fenotypovou hodnotou (Urban, 2008). Tab. č. 1, Kandidátní geny znaků masné užitkovosti u prasat Kandidátní gen na chromozomu číslo: Gen citlivosti k halotanu (HAL) ryanodinového receptoru (RYR1) vápníkového kanálu (CRC) na chromozomu č. 6 Gen kyselého masa (RN Rendement Napole) na chromozomu č. 15, specifický výskyt u plemene Efekt na znaky: náchylnost ke stresům, syndrom maligní hypertermie, výskyt masa PSE (světlé, měkké, vodnaté), svalová hypertrofie, procento libového masa, hřbetního tuku atd. Obsah svalového glykogenu, obsah proteinů, hodnota ph, ztráty při vaření a uzení šunky 23

24 Hampshire Protoonkogen c-myc-cm na chromozomu č. 4 Geny MYOD rodiny z nich myogenin (MYF4) na chromozomu č. 9 a MYF3 na chromozomu č. 2 Gen transkripčního faktoru POU1F1 na chromozomu č. 13 Gen proteinu pro transport masných kyselin HFABP na chromozomu č. 6 Gen šokového proteinu HSP70.2 a gen proteinu triazin na chromozomu č. 1 Gen růstového hormonu GH na chromozomu č. 12 a gen receptoru růstového hormonu GHR na chromozomu č. 16 Gen andrestenonu na chromozomu č. 7 Geny IGF rodiny, z nich insulinu podobný růstový faktor 2 IGF2 na chromozomu č. 2 a IGF1 na chromozomu č. 5 Gen colipasy - CLPS na chromozomu č. 7 Gen fosfoglycerátkinázy 1 PGK 1 na chromozomu X Gen leptinu LEP na chromozomu č. 18 a receptoru LEP LEPR na chromozomu č. 6 Spolupůsobí s genem CRC (eustaticky) procento libové svaloviny, podíl tuku v jatečné půlce Přírustek po narození, procento libového masa, produkce masa Hmotnost selat při narození, výška hřbetního tuku Obsah intramuskulárního tuku, přírustek Spolupůsobení s genem CRC, citlivost ke stresu Výška hřbetního tuku, přírůstek Pach masa u poražených kanců Podíl hlavních masitých částí z jatečné půlky Obsah tuku v jatečné půlce Výška hřbetního tuku, plocha kotlety a některé další Podíl masa a tuku v jatečných půlkách, spotřeba krmiva STEINHAUSER et al. 3.9 Genetické markery Genetický marker je snadno a jednoznačně detekovatelný a vykazuje mendelistickou dědičnost. Je známa jeho lokalizace na chromozomu a je vysoce polymorfním znakem. Mezi velké výhody molekulárně - genetických markerů patří to, že jsou relativně početné a snadno identifikovatelné, mohou být identifikovány z malého množství tkáně v jakémkoliv věku zvířete a jsou vysoce informativní. K analýze je možno se vracet i opakovaně, protože DNA lze uchovávat dlouhodobě. 24

25 Dělení markerů: I. typ - kódující exprimované geny, mohou být kandidátními geny pro QTL. Je zde nízká hladina polymorfismu, málo se využívají pro studium rodin a populací, ale významně se využívají ve srovnávacím (komparativním) mapování. II. typ - vysoce variabilní sekvence DNA. Využívají se především mikrosatelity a minisatelity. Vlivem vysokého stupně polymorfismu jsou mikrosatelity vysoce informativní v populačních studiích, v určování rodičovství a pro vazbové mapování genů. Mohou být ve vazbě s QTL, ale nemají přímou vazbu na variabilitu znaku. III. typ - jednonukleotidové polymorfismy (SNP). Mohou ležet jak uvnitř kódujících genů, tak v nekódujících intronech nebo intergenových oblastech, kde se ale nachází častěji. V genomu se vyskytují přibližně každých pb. Mají velký význam v micro array (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002) Genom prasete Genom je definován jako celková genetická informace v organismu. U autonomních životních forem je vždy v DNA. Prokaryotické buňky obsahují DNA v cirkulárním chromozomu a v plazmidech, u eukaryot se nachází v chromozomech v jádře, v mitochondriích a chloroplastech ( Genom prasete obsahuje 2n = 38 chromozomů, z toho 18 autozomů a 1 pár pohlavních chromozomů. Evropská a asijská prasata se mohou lišit ve svém karyotypu. Asijská prasata mají 2n = 38, zatímco Evropská mají 2n = 36 a kříženci těchto dvou mohou mít 2n = 37. Redukce počtu chromozomů je v důsledkut zv. Robertsonovy translokace chromozomů 15 a 17 (T. Urban, 2012). Velikost genomu je podobný jako u člověka a má kolem 2,7 Gb. Prase je z hlediska evoluce podobné jako člověk či hlodavci, a proto je velmi důležitým modelem pro pochopení složitých procesů probíhající v lidském těle a zkoumání nemocí, jako jsou například kardiovaskulární choroby či obezita ( 25

26 Pekingský Ústav genomiky čínské akademie věd a kodaňský Výbor pro šlechtění a chov prasat oznámily zveřejnění prasečího genomu přečteného v rámci společného projektu, jenž byl spuštěn v roce 2001 pod názvem "Čínsko-dánský projekt prasečího genomu". Ke čtení byla použita DNA prasat z plemen Hampshire, Yorkshire, Landrace, Duroc a čínského plemene ErHuaiLan ( Obr. č. 2, Genom prasete IGF Popis genu a jeho funkce Inzulínu podobný růstový faktor 2 (IGF2) = patří do vícečlenné genové rodiny IGF. Jeho lokalizace je u prasete na chromozou 2p1.7. Jeho funkce podporuje růst peptidů, které jsou strukturními homology inzulínu a mají i podobnou funkci. Na rozdíl od inzulínu jsou ale produkovány v řadě tkání celého těla. Gen IGF2 je považován za kandidátní gen pro plodnost a masnou užitkovost (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002). Systém IGF je složen 26

27 z IGF1 a IGF2 (dva inzulínu podobné faktory), dvou receptorů a šesti vazebných proteinů (IGFBP-1 až 6). Inzulín se narozdíl od IGF2 tvoří pouze v Langerhansových ostrůvcích. Komplex růstového faktoru inzulínu IGF hraje důležitou úlohu v růstové regulaci společně s inzulínem, thyroidními hormony, sexuálními steroidy a růstovými hormony. (KOLAŘÍKOVÁ et al., 2003). Gen IGF2 u lidí a u myší vytváří transkripční jednotku, která obsahuje 10 exonů a 4 promotory (P1 - P4), které jsou řazeny před exony 1, 4, 5 a 6. IGF2 je jako polypeptid složen z 67 aminokyselin a strukturou je podobný IGF1 a inzulínu. Zvýšená exprese během prenátálního vývoje embrya a plodu dokazuje, že IGF2 má význam v regulaci jak prenatálního vývoje, tak i postnatálního, což dokládá jeho přítomnost v krevním séru i u dospělého jedince (MEINSMA et al., 1992). Nejnovější výzkumy na referenční rodině ukázaly průkazné rozdíly mezi genotypy IGF2 v ploše kotlety, hmotnosti kýty, výšce hřbetního tuku a v některých dalších ukazatelích. Pro výběr nejvhodnějších prasnic a kanců k produkci jatečných prasat je důležitý poznatek o paternálním imprintingu v projevu alel genu IGF2, což znamená, že "lepší" alela se u jatečného prasete výrazně projeví, jen když jí dostane od kance (Steinhauser, 2000). IGF2-3-G3072A je příčinou mutace pro otcovsky exprimovaný QTL na p raménku u prasečího chromozomu 2 s podstatným vlivem na nárůst svalové hmoty a na tloušťku hřbetního tuku. Byl prokázán výrazný vliv polymorfismů IGF2-3-G3072A a IGF2-7- G162C (IGF2-Ncil) na tloušťku hřbetního tuku a libového masa (Knoll et al., 2006). 27

28 Obr. č. 3, Geny a markery na chromozomu Imprinting IGF2 Imprinting genu (vtiskování) je jev, který je podmíněn methylací. V expresi genu proběhne změna, která se uskutečňuje během přechodu genu přes vajíčko či spermii a způsobí, že samičí a samčí alely mají v rané fázi embrya různé vlastnosti. IGF2 je exprimován jen z paternální alely, takže z alely, která se dědí po matce se neexprimuje. Vysvětluje se to tím, že IGF2 podléhá v oocytech methylaci, zatímco ve spermatocytech tomu tak není, proto se v zygotě obě alely chovají různě (ROSYPAL, 2000). Mechanismus genové exprese (aktivace či inaktivace trasnkripce) je způsoben methylací cytosinu (na 28

29 uhlíku 5 pyrimidinu ) ze vzniku 5 methylcytosinu (5 metc) nebo posttranslační modifikací s chromatinem asociovaných proteinů histonů. Methylace je realizována pomocí DNA methyltransferáz (DNMT). Je to dáno přenosem methylu z S adenosyl methioninu na C5 pozici v dinukleotidovém kontextu CpG (pár cytosin guanin) (MASOPUST, 2010) Polymorfismus IGF2 V genu IGF2 byl zjištěn jednonukleotidový polymorfismus. Ten se nachází v oblasti intronu 2 NciI na základě substituce G -> C v pozici 162 (KNOLL te al., 2000). Dále byla nalezena v intronu 3 kauzální mutace v pozici 3072 z G -> A (Q alela, která nese mutaci a wild - type q alela), jež ovlivňuje svalový růst, uložení tuku a velikost srdce. K mutaci dochází ve vývojově zachovalém ostrůvku CpG, který je hypermethylován v kosterní svalovině. Dle výzkumů prasata, která dědí tuto mutaci paternálně, mají zvýšenou expresi mrna genu IGF2 v postnatálně se vyvíjející svalovině (VAN LEARE et al., 2003) Laboratorní metody PCR PCR je považována za základní molekulárně-genetickou metodu. Slouží k získání dostatečného množství specifické DNA pro další analýzy a v některých svých modifikacích může sloužit i k přímé identifikaci polymorfismů. Kary Mullis dostal za objev polymerázové řetězové reakce v roce 1993 Nobelovu cenu (www. karymullis.com). Tato metoda je založena na extenzi primerů a amplifikaci molekul DNA za cyklického opakování tří kroků lišících se teplotními podmínkami. Syntézu DNA řízenou templátem (matricovou DNA) katalyzuje teplotně rezistentní DNA polymeráza. PCR umožňuje současnou syntézu obou komplementárních vláken extenzí (prodlužováním) 29

30 dvou primerů (jednořetězcových oligonukleotidů) připojených ke komplementárním řetězcům na protilehlých koncích templátu. Umístění obou primerů tak ohraničuje amplifikovaný úsek DNA. Metoda se skládá z cyklického opakování (25x - 40x) tří kroků: denaturace, annealing (nasedání primerů) a elongace (syntéza nových vláken). V každém cyklu se množství DNA zdvojnásobí, tzn. bude vytvořeno 2 n kopií, kde n znamená počet jednotlivých cyklů. Obr. č. 4, Fáze PCR Účinnost amplifikace je obecně 60-85%, ale může být snížena přítomností většího množství templátu. Zvyšuje se tím totiž pravděpodobnost hybridizace templátu s komplementárním řetězcem DNA, místo s primerem. Na účinnosti amplifikace se podílí nespecifická hybridizace primerů s jinými sekvencemi na cílové DNA (www. sumanasinc.com) Složení reakční směsi DNA templát: slouží jako vzor pro syntézu nových vláken DNA 30

31 Primery: jsou to uměle syntetizované oligonukleotidy o velikosti nukleotidů, vymezují amplifikovaný úsek dntp (datp, dgtp, dctp, dttp): základní stavební kameny pro syntézu nové DNA ionty Mg 2+ : spolu s dntp tvoří substrát pro DNA polymerázu, na množství závisí účinnost a specifita připojovaných primerů, vyšší koncentrace snižuje specifitu, u primerů bohatých na GC je vyšší koncentrace lepší, při nedostatku dochází ke snížení výtěžku reakce DNA polymeráza (Taq polymeráza): ve směru 5-3 syntetizuje novou DNA dle sekvence nukleotidů v templátu ph pufr (TAE, TBE): tvoří optimální podmínky pro funkci DNA polymerázy dh 2 O: ultračistá deionizovaná voda Podmínky cyklování Cyklus začíná denaturací, při které je dvouvláknová DNA denaturována zahřátím vzorku na 95 C. Následuje annealing, nebo-li nasedání primerů na své komplementární sekvence při teplotě 64 C. Třetím krokem je elongace, při které se prodlužují připojené primery pomocí Taq polymerázy. Tyto tři kroky se za sebou opakují 30x, aby vzniklo dostatečné množství namnožené DNA (www. sumanasinc.com) RFLP (polymorfismus délky restričních fragmentů) Je to metoda, při které se identifikují alely na základě přítomnosti či nepřítomnosti specifického restrikčního místa. Příslušná genomová DNA je pak štěpena restrikční 31

32 endonukleázou, separována na agarózovém gelu pomocí gelové elektroforézy a následně přenesena na pevnou membránu pomocí tzv. Southernova přenosu. Po proběhlé hybridizaci se značenou sondou je provedena vizualizace, při které je zjištěn daný polymorfismus ve velikosti vzniklých restrikčních fragmentů DNA. Metoda je při použití komplementární DNA (cdna) jako sondy vhodná i pro identifikaci polymorfismu uvnitř markerů typu I. Protože je tato metoda relativně pracná, dává se přednost její modifikaci spojené s PCR ( PCR - RFLP Na základě genomové DNA se amplifikuje specifická sekvence. Tato sekvence DNA se pak štěpí panelem restrikčních endonukleáz. Pokud je v restrikčním místě bodová mutace, pak toto místo buď zaniká nebo vzniká nové. Důsledkem je vznik fragmentů DNA růzmé velikosti, které se pak separují na agarózovém gelu. Vizualizace se provádí pomocí ethidiumbromidu. Metoda je nenáročná a umožňuje určení místa mutace. Nevýhodou je relativně nízká pravděpodobnost detekce mutace, ale závisí hlavně na počtu použitých enzymů. Metoda se využívá u genů s větším polymorfismem a u nekódujících sekvencí. Při kombinaci se sekvenováním PCR produktu lze dosáhnout vysoké účinnosti Elektroforéza Patří mezi nejdůležitější techniku k třídění a separaci nukleových kyselin. Je to fyzikálně - chemická metoda, při které dochází k dělení látek v elektrickém poli. Vlastní zařízení je složeno z: elektroforetické vany, anody, katody, pufru, držáku gelu a externího zdroje stejnosměrného napětí. Připravený gel se nalije buď do vaničky (agarózová ELFO) nebo mezi skla (polyakrylamidová ELFO) a nechá se zatuhnout. Jednotlivé jamky, které jsou nutné pro umístění vzorků, se tvoří pomocí tzv. hřebínků s určitou šířkou a vkládají se do gelu před zatuhnutím. DNA má záporný náboj, proto migruje směrem a anodě (+ náboj). Rychlost průchodu DNA v gelu závisí na velikosti molekul, prostorovém uspořádání, typu 32

33 gelu a pufru a na velikosti elektrického náboje. Větší molekuly procházejí gelem pomaleji, menší molekuly rychleji. Proto musíme vždy zvolit optimální koncentraci gelu ( Agarózová elektroforéza Jako prostředí je zde použito agarózového gelu, který připravujeme rozvařením práškové agarózy v elektroforetickém pufru. Po důkladném povaření ho necháme zatuhnout při pokojové teplotě. Gel je umístěn horizontálně. Koncentrace agarózy určuje velikost pórů a tím propustnost pro DNA určité velikosti. Jako elektroforetické pufry jsou používány TAE (trisacetátový pufr) a TBE (trisborátový pufr). TAE je mnohem více používaný, je vhodnější pro větší fragmenty DNA (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002). Agarózový gel je vhodný pro separaci molekul nukleových kyselin o velikosti od 100 bp až po zhruba 50 kb (ŠMARDA et al., 2005) Vizualizace gelu Nejpoužívanějším barvivem pro vizualizaci elektroforetických pufrů je ethidiumbromid (EtBr). Využívá se zde vlastnosti fluorescenční molekuly EtBr vmezeřovat se do vlákna nukleových kyselin. Dají se tak detekovat jednořetězcové i dvouřetězcové molekuly, ale citlivost k jednořetězcům je výrazně nižší. Ethidiumbromid je silným mutagenem a toxickou látkou, proto při manipulaci s ním musíme dodržovat určitá bezpečnostní opatření. Dále je možné využívat i jiná barviva, jako je např. SYBR Green nebo GoldStar. Ty jsou citlivější a dávají nižšní pozadí. Nevýhodou jsou změny mobility fragmentů DNA při vyšším množství nanesené DNA (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002). 33

34 4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Zvířata Do projektu bylo celkem zahrnuto 143 ks prasat plemene České bílé ušlechtilé. Všechna zvířata pocházela z jednoho šlechtitelského chovu. Vzorky pocházely od prasnic, které byly poraženy v průběhu roku Analýzu kvality masa provedli pracovníci Ústavu technologie potravin Mendelovy univerzity. Jednalo se o vzorky periférní krve, která byla odebírána přímo při porážce zvířat, uchovávané ve zkumavkách s přídavkem EDTA pro možnost následné izolace DNA. K tomu byly odebírány vzorky svaloviny, konkrétně se jednalo o musculus longissimus lumborum et thoracis. Jednotlivé vzorky (cca 350g kotlety s kostí) byly odebírány 48 hodin po porážce zvířat. 4.2 Ukazatele jatečného těla a masa U jatečných prasnic byly sledovány tyto ukazatele: - barva masa - měřeno dle systému CIE L*a*b* pomocí spektofotometru Konica Minolta CM d; tloušťka plátku masa 2 cm, osvětlení přístroje D65 pod úhlem pozorování 8 a 30 mm štěrbiny - ph masa - měřeno za 24 hodin po porážce, při uchovávací teplotě 4-8 C - elektrická vodivost (EV24) - měřena s využitím konduktometru Fleischtester LF 191/F - intramuskulární tuk - kousky masa o velikosti 1 cm lyofilizovány v přístroji Christ Alpha 1-2-LD-plus, zmrazeny na -15 C, poté až na -40 C, lyofilizované vzorky uchovány při -20 C; vzorky následně extrahovány v patroně Soxhletova extraktoru a extrahovány s 280ml petroletheru po dobu 5 hodin při teplotě vody 70 C, zbytky rozpouštědla odstraněny v rotační odparce HB4 basic při 45 C a olejový film byl vysušen proudem dusíku - mastné kyseliny - nejdříve provedena methylace mastných kyselin, navážka 34

35 vzorku 0,05g, detekce na plynovém chromatografu - odkap - vzorek o hmotnosti 150g, uložen v chladničce při 5 C po dobu 24 hodin, poté se filtračním papírem provádělo sušení do konstantní hmotnosti - měření JUT, masa v mm a tuku v mm - provedeno dvoubodovou metodou během klasifikace dle SEUROP - cholesterol 4.3 Izolace DNA DNA byla izolována z krve kolonkovou metodou pomocí izolačního kitu QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN). Vzorky byly uchovány při -20 C. 4.4 PCR Složení reakční směsi Směs o objemu 25 µl byla složena z: 100 ng (2 µl) prasečí genomové DNA, 0.2 µm každý primer (KDR, Praha, ČR), 200 µm dntp (MBI Fermentas, St.Leon-Rot, SRN), 1 U Unis Taq polymerázy ve standartním PCR pufru (5 u/µl) (Top Bio, Praha, ČR). Na jeden vzorek o objemu 25 µl bylo použito 23 µl Master mixu a 2 µl DNA. Tab. 2, Složení Master mixu H2O Pem dntp IGF7A IGF7B Unis Taq pol µl 2.5 µl 0.5 µl 0.5 µl 0.5 µl 0.2 µl Použité primery přímý primer (IGF7A) - 5 CAC AGC AGG TGC TCC ATC GG 3 zpětný primer (IGF7B) - 5 GAC AAG GCT GTC ATC CTG TGG G 3 35

36 4.4.2 Podmínky cyklování PCR byla provedena v termálním cykleru GeneAmp PCR System 2400 (Applied Biosystems), který byl předehřán na 95 C. Obě složky byly smíchány na ledu a ihned poté vpraveny do termálního cykleru. 95 C/5min; (95 C/20s, 64 C/30s, 72 C/60s)30x; 72 C/7 min.; 4/ Ověření PCR Výsledný produkt byl ověřen pomocí agarózové elektroforézy na 3% gelu obsahujícím ethidiumbromid. Po skončení elektroforézy byl gel vyfotografován pod UV světlem. 4.5 RFLP Reakční směs pro metodu RFLP byla připravována v závislosti na výtěžku PCR reakce dle následného schématu: silný výtěžek PCR: 5 µl PRC + 10 µl MM (8.4 µl H 2 O, 1.5 µl pufru µl RE) středně silný výtěžek: 10 µl PCR + 5 µl MM (3.3 µl H 2 O µl pufru µl RE) silný výtěžek: 20 µl PRC + 5 µl MM (3.3 µl H 2 O µl pufru µl RE) Štěpení probíhalo v termostatu předehřátém na 37 C přes noc po dobu asi 16 hodin. Použit byl restrikční enzym BcnI (NciI) od firmy MBI Fermentas. Výsledek byl ověřen na 36

37 3% agarózovém gelu obsahujícím GelStar pro lepší viditelnost. Obr. č. 5, Fotografie gelu 4.6 Elektroforéza Gelová elektroforéza byla použita jak k ověření PCR produktů, tak k ověření RFLP. Použit byl agarózový gel v koncentraci 3%. Agaróza pocházela od firmy Serva Elektroforesis GmbH (Heidelberg, SRN). Před nanesením na gel byly vzorky smíchány s nanášecím pufrem (0.25% bromfenolová modř a 40% sacharóza ve vodě). Elektroforéza probíhala v TAE pufru při napětí 4V/cm. V případě PCR byl do gelu přidán ethidiumbromid (0.5 µg/ml), v případě RFLP byl přidáván GelStar. 4.7 Statistické metody Pro analýzu dat byl použit smíšený lineární model. Analůýza byla provedena pomocí softwaru SAS s metodou REML a procedurou Mixed. Modelová rovnice vypada 37

38 takto: y ijkl = μ + G i + O j + M k + e ijkl, kde y ijkl je sledovaná vlastnost, μ střední hodnota, G i efekt genotypu, O j otce, M k efekt matky a e ijkl jsou náhodné chyby. Jako pevné efekty byly použity jednotlivé geny a jako náhodné efekty efekt matky a efekt otce. 4.8 Marker V celé práci byl použit hmotnostní marker M50. Obr. č. 6, Marker M50 M50 Gene Ruler TM 50 bp DNA Ladder, MBI Fermentas 38

39 5 VÝSLEDKY Testovány byly dva soubory prasat plemene České bílé ušlechtilé o celkovém počtu 143 ks. V těchto dvou skupinách byl zjištěn následující počet genotypů: první soubor genotyp CC u 52 jedinců, genotyp GC u 19 jedinců. U druhého souboru prasat to bylo: genotyp CC u 54 jedinců a genotyp GC u 18 jedinců. 5.1 Frekvence alel a genotypů Pomocí metody PCR - RFLP bylo testováno celkem 143 ks prasat plemene České bílé ušlechtilé. V tomto souboru bylo nalezeno celkem 106 jedinců se genotypem CC a 37 jedinců s genotypem GC. V prvním souboru to bylo 52 zvířat s genotypem CC a 19 zvířat s genotypem GC, ve druhém souboru 54 zvířat s genotypem CC a 18 zvířat s genotypem GC. Tab. 3, Absolutní a relativní frekvence genotypů genotyp CC GC první soubor absolutní frekvence genotypů (ks) relativní frekvence genotypů druhý soubor absolutní frekvence genotypů (ks) relativní frekvence genotypů Z absolutní frekvence genotypů byla spočítána relativní frekvence genotypů, která vyšla u prvního souboru s genotypem CC 0.73, s genotypem GC 0.27, u druhého souboru 39

40 to bylo 0.75 zvířat s genotypem CC a 0.25 zvířat s genotypem GC. Dále byla spočítána absolutní a relativní frekvence alel a směrodatná odchylka. Tab. 4, Absolutní a relativní frekvence alel, směrodatná odchylka alela C G první soubor absolutní frekvence alel (ks) relativní frekvence alel směrodatná odchylka ±0.03 druhý soubor absolutní frekvence alel (ks) relativní frekvence alel směrodatná odchylka ±0.03 Ve sledovaném prvním souboru zvířat byla spočítána absolutní frekvence alely C = 123, alely G = 19, u druhého souboru byla frekvence alel C = 124 a G = 20. U prvního souboru je relativní frekvence alely C 0.87, alely G 0.13, u druhého souboru je frekvence alely C 0.88 a alely G Směrodatná odchylka u prvního souboru činí ±0.03, u druhého souboru ± Důkaz Hardy - Weinbergrovy rovnováhy Porovnáním tabulkové hodnoty a χ 2, která udává rozdíl mezi pozorovanou frekvencí a očekávanou frekvencí genotypů, bylo zjištěno, že obě zkoumané populace se nachází v genetické rovnováze. Tab. 5, Hardy - Weinbergrova rovnováha soubor první soubor druhý χ 2 = (P - O) 2 / O χ2 = chí kvadrát 40

41 P = pozorovaná absolutní frekvence genotypů O = očekávaná relativní frekvence genotypů Tab. 6, Tabulková hodnota χ 2 hladina významnosti stupně volnosti ,05 3,84 5,99 7,81 9,48 11,07 0,01 6,35 9,21 11,34 13,27 15, Polymorfismus genu IGF2 Metodou PCR - RFLP byl nalezen polymorfismus genu. Vzorky byly naneseny na 3% agarózový gel za použití GelStaru pro vizualizaci. PCR produkt o velikosti 336 bp obsahoval dvě restrikční místa, proto se štěpil na tři různě dlouhé fragmenty. Alela G je PCR produkt štěpen na fragmenty o velikosti 308 a 28 bp. Alela C obsahovala štěpné místo pro restrikční enzym BcnI (NciI), proto byla štěpena na fragmenty dlouhé 208, 100 a 28 bp. 5.4 Vliv genu IGF2 na jatečné ukazatele masa u prasat Analýza, ve které byl zkoumán vliv genotypu na kvalitu masa, byla provedena pomocí softwaru SAS s metodou REML a procedurou Mixed. U souboru prasat, který čítal celkem 143 ks ze šlechtitelského chovu, byly zkoumány následující faktory: - barva masa : světlá barva = L, červená = a, žlutá = b - ph ult - EV24 - ztráta vody odkapem - obsah mastných kyselin: myristoolejová, palmitová, palmitolejová, stearová, olejová, 41

42 linolová, linolenová, arachidonová a arachová - EPA - obsah sušiny, tuk v g, tuk v % - hmotnost JOT v kg, tloušťka masa v mm, tloušťka tuku v mm - cholesterol Z těchto vlastností byly vytvořeny tabulky, které ukazují hladiny průkaznosti u každé vlasnosti a genotypu u obou sledovaných souborů prasat. Pro přehlednost je popisován každý soubor prasat vzlášť. V programu SAS byly vypočítány hodnoty u sledovaných vlastností pomocí metody nejmenších čtverců. Vlastnost značená malými písmeny a,b,c,d značí blížící se průkaznost při hladině významnosti P 0.1, značení velkými písmeny A, B, C, D značí průkaznost při hladině významnosti P 0.05 a značená velkými písmeny X, Y, Z značí vysokou průkaznost při hladině významnosti P První soubor Tab. 7, Barva masa, ph, EV24, odkap Vlastnosti CC GC L barva masa ± ± a barva masa ± ± b barva masa 10.56± ± phult ± ± EV ± a ± a odkap ± ± U vlastnosti EV24 (elektrická vodivost) byla zjištěna hodnota blížící se průkaznosti mezi genotypy CC x GC při hladině významnosti P