Fusarium jako původce onychomykózy rezistentní k běžné antimykotické terapii

Transkript

1 Fusarium jako původce onychomykózy rezistentní k běžné antimykotické terapii P. LYSKOVÁ 1, V. HUBKA 2,3, K. FAJKOŠOVÁ 4, H. A. MACKOVÁ 5, J. VOJTÍŠKOVÁ 6, M. SKOŘEPOVÁ 7, B. ŠRÁMKOVÁ 1, M. KOLAŘÍK 2,3 1Laboratoř lékařské mykologie, odd. parazitologie, mykologie a mykobakteriologie, Zdravotní ústav se sídlem v Ústí nad Labem, pracoviště Praha; 2 Katedra botaniky, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze; 3Laboratoř genetiky, fyziologie a bioinženýrství hub, Mikrobiologický ústav AV ČR, v. v. i., Praha; 4Dermatovenerologie, Mediconet, s. r. o., Praha; 5 Dermatovenerologická ambulance, Hořovice; 6Dermatovenerologická ambulance, Praha; 7 II. kožní klinika, 1. LF UK a VFN, Praha SOUHRN Lysková P., Hubka V., Fajkošová K., Macková H. A., Vojtíšková J., Skořepová M., Šrámková B., Kolařík M.: Fusarium jako původce onychomykózy rezistentní k běžné antimykotické terapii Úvod: Rod Fusarium zahrnuje půdní saprofyty, ale i patogeny rostlin. Stále častěji jsou zástupci tohoto rodu izolováni jako původci infekcí u člověka a zvířat. Tato práce shrnuje šest případů potvrzené nebo suspektní onychomykózy vyvolané zástupci rodu Fusarium z druhových komplexů F. solani a F. oxysporum. Materiál a metody: Druhová determinace kmenů byla potvrzena na základě sekvenace ITS oblasti rdna. Získané sekvence jsou uloženy v databázi EMBL (European molecular biology laboratory), kde jsou dostupné pod přístupovými čísly HE HE Disková difúzní metoda byla použita pro testování in vitro citlivosti k antimykotikům pomocí disků (ITEST) a tablet Neo-Sensitabs (Rosco) srovnáním na různých médiích při dvou různých kultivačních teplotách (25 a 35 C). Výsledky: Od šesti pacientů s potvrzenou nebo suspektní onychomykózou byly izolovány 4 kmeny F. solani a 2 kmeny F. oxysporum. Pouze natamycin (pimaricin) byl efektivní in vitro u všech testovaných izolátů. Variabilní citlivost v závislosti na testovaném kmenu byla zaznamenána u amfotericinu B, ekonazolu a terbinafinu. K ostatním testovaným preparátům byly izoláty rezistentní. Kultivační médium a teplota měly významný vliv na výsledky testování u disků nystatinu, ekonazolu a tablet amfotericinu B a terbinafinu. Závěr: Při testování antimykotik u vláknitých mikromycetů in vitro je třeba dodržovat předepsanou metodiku. Důležitým faktorem pro získání validních výsledků u tablet amfotericinu B (a pravděpodobně také u tablet terbinafinu) je kultivační teplota 35 C. Nálezy multirezistentních fusárií u onychomykózy ztěžují lékaři volbu terapie. Dobrý klinický efekt byl zaznamenán po provedení ablace nehtové ploténky a lokální aplikaci ekonazolu. Klíčová slova: onychomykóza, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, disková difúzní metoda SUMMARY Lysková P., Hubka V., Fajkošová K., Macková H. A., Vojtíšková J., Skořepová M., Šrámková B., Kolařík M.: Fusarium as a cause of onychomycosis resistant to common antifungal therapy Introduction: Fusarium species are common soil saprophytes and plant pathogens. Members of the genus have been frequently reported as etiologic agents of opportunistic infections in humans and animals. We report six cases of confirmed or suspected onychomycosis caused by members of the genus Fusarium (F. solani and F. oxysporum species complexes). Material and methods: The isolates were identified by rdna ITS sequencing analysis. The EMBL accession numbers for the ITS are HE HE A disk diffusion method was used for in vitro susceptibility testing. Comparison of disks (ITEST) and Neo- Sensitabs tablets (Rosco) on a different media at two different temperatures (25 C and 35 C) was made. Results: Six strains of Fusarium spp. (4 strains of F. solani and 2 strains of F. oxysporum) were isolated from patients with confirmed or suspected onychomycosis. Natamycin (pimaricin) was the only antifungal effective in vitro in all isolates tested. Variable susceptibility of the isolates was detected in amphotericin B, econazole and terbinafine. The remaining antifungals tested were not effective. The results varied depending on the culture medium and temperature for nystatin and econazole disks and amphotericin B and terbinafin tablets. Conclusion: It is important to adhere to recommended methods when testing in vitro susceptibility to antifungals in moulds. An incubation temperature of 35 C is important for obtaining valid results in amphotericin B tablets (and probably also terbinafine ones). Determination of multidrug-resistant Fusarium spp. in onychomycosis make the choice of therapy difficult. Good clinical effect was recorded with nail plate ablation and subsequent local econazole therapy. Keywords: onychomycosis, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, disk diffusion method Klin mikrobiol inf lék 2012;18(6): Adresa: RNDr. Pavlína Lysková, Laboratoř lékařské mykologie, Zdravotní ústav se sídlem v Ústí nad Labem, pracoviště Praha; Sokolovská 60, Praha 8; pavlina.lyskova@zu.cz Došlo do redakce: Přijato k tisku: Klinická mikrobiologie a infekční lékařství

2 Úvod Zástupci rodu Fusarium jsou běžnými půdními saprotrofy a původci onemocnění rostlin. Neustále však přibývá případů různě závažných forem oportunních infekcí u člověka a zvířat. Jako nejčastější původci jsou uváděny druhy Fusarium solani a F. oxysporum [1,2,3]. Při fusáriových onychomykózách bývá téměř vždy postižen nehet palce na noze. Mezi nejvýznamnější predispoziční faktory patří trauma, dystrofické změny anebo předchozí infekce nehtu dermatofytem. Klinicky se onemocnění nehtů způsobené rodem Fusarium nejčastěji projevuje jako bílá superficiální onychomykóza nebo distální subungvální onychomykóza s hyperkeratózou a žluto-hnědou dyskolorací [1,3]. Fusária jsou většinou považována za citlivá k amfotericinu B, posakonazolu a vorikonazolu a naopak jsou rezistentní k flukonazolu, itrakonazolu a echinokandinům [4,5]. Testování citlivostí vláknitých mikromycetů in vitro v rutinní laboratoři může být problematické, zejména pak vyhodnocení výsledků. Podle předepsané metodiky by měly být vláknité mikromycety u diskové difúzní metody kultivovány na Müeller-Hinton agaru (MHA), avšak standardizované vyhodnocení velikostí zón na tomto médiu pro většinu antimykotik chybí [6]. Základní charakteristiky pacientů a izolátů fusárií v námi popsaných případech onychomykózy jsou uvedeny v tabulce 1. Kazuistiky Pacient I. Pacient (muž, 30 let) byl poprvé vyšetřen v listopadu roku 2007, v anamnéze udával úraz palce levé nohy v roce 2002, později i ablaci nehtové ploténky. Subjektivní potíže se u pacienta objevily v roce 2005, popisoval bolestivost a drápovitý tvar nehtu palce levé nohy. Byla provedena další chirurgická ablace nehtu a mykologické vyšetření (kultivačně Trichosporon cutaneum), zároveň byla nasazena celková terapie terbinafinem v dávce 250 mg denně po dobu tří měsíců a lokálně ciklopiroxolamin dvakrát denně. Při kontrolním vyšetření v březnu 2008 nehet odrůstal, byl patrný odrostlý proužek cca 5 6 mm. Na další vyšetření se pacient dostavil v září 2008 pro poranění nehtu palce pravé nohy při fotbalu. Lékařem bylo diagnostikováno paronychium na palci pravé dolní končetiny. Dále byla zjištěna recidiva onychomykózy na nehtu levé nohy u distálního okraje. Byla zahájena lokální terapie antibiotiky a ciklopiroxolaminem dvakrát denně. Při další kontrole v lednu 2009 byla zjištěna dyskolorace nehtu a postižení přibližně 1/3 nehtové ploténky, lokálně byl nasazen naftifin roztok a krém jedenkrát denně po dobu pěti měsíců, a byla provedena chemická ablace nehtu (mast s 40% ureou v syndermanu). V květnu 2009 byla zjištěna onychomykóza také na palci pravé nohy, proto byla zahájena terapie itrakonazolem v dávce 400 mg denně po dobu jednoho týdne, poté již pacient na kontrolu a pro další léky nepřišel. V prosinci 2011 byly onychomykózou postiženy oba palce dolních končetin, byla také patrná onychodystrofie nehtů. Opakovaně bylo provedeno mykologické vyšetření s kultivačním nálezem F. solani, kmen byl in vitro citlivý k natamycinu a ekonazolu. Na základě výsledku kultivace byla znovu provedena chemická ablace nehtů a pacient dostal k lokální aplikaci krém s ekonazolem dvakrát denně. Při poslední kontrole v únoru 2012 bylo patrné výrazné zlepšení, nehty byly prakticky kompletně vypilované a nehtové valy klidné. Na nehtu palce pravé nohy však přetrvává subungvální hyperkeratóza a mírná deformace nehtové ploténky, a na nehtu palce levé nohy jsou v laterálních okrajích patrné zbytky hyperkeratóz. Pacient II. Pacient (muž, 32 let) se v únoru 2012 dostavil k lékaři s postižením palce pravé dolní končetiny (obr. 1). Nehet byl postižen přibližně ze 3/4, byla patrná žlutá dyskolorace, příčné rýhovaní a ztráta lesku. Nehtové valy byly klidné. Také ostatní nehty na končetině vykazovaly podobné postižení na přibližně polovině nehtové ploténky. Pacient uvedl, že obtíže trvají již 10 let a v minulosti byl léčen různými lokálními antimykotickými preparáty (ciklopiroxolamin, bifonazol a terbinafin) bez klinického efektu. V anamnéze pacient uvedl, že hrál řadu let závodně tenis. Po provedení mykologického vyšetření byla mikroskopicky zjištěna jak vlákna upomínající dermatofyta tak zdeformovaná vlákna. Kultivačně vyrostla čistá kultura F. solani, kmen byl in vitro citlivý k natamycinu, ekonazolu a amfotericinu B. Pacient odmítl druhý odběr pro potvrzení fusáriové etiologie. U pacienta byla provedena chemická ablace nehtů, a poté dostal k lokální aplikaci ekonazol krém dvakrát denně. Při posledním kontrolním vyšetření v červenci bylo patrné výrazné zlepšení. Došlo k rozpuštění subungválních hyperkeratóz a v proximální části dorůstalo 6 mm zdravé nehtové ploténky. Pacient III. Pacientka (žena, 32 let) v anamnéze uvádí, že si poslední 3 4 roky v letních měsících (od června do září) nechávala aplikovat na nehty nohou tzv. gelové nehty. Zežloutnutí nehtu palce pravé nohy si poprvé všimla v dubnu V květnu téhož roku se pacientka dostavila k lékaři, kde bylo zjištěno postižení palce pravé nohy se žlutým zbarvením. Byla zahájena lokální terapie roztokem ciklopiroxolaminu dvakrát denně. Ke kontrole se pacientka nedostavila a opět si přes léto nechala aplikovat gelové nehty, i přes upozornění lékařky na možné zhoršení stavu. Pro následné zhoršení a rozšíření postižení se pacientka k lékaři dostavila opět v únoru Palec pravé nohy byl již odchlípený od nehtového lůžka a hnědě pigmentovaný (obr. 2), došlo také k postižení nehtu palce na levé noze, které se manifestovalo žlutým zabarvením. Pacientka uvedla, že po několik měsíců neaplikovala místní léčbu. Pro celkové zhoršení klinického stavu nehtu na pravé noze a rozšíření infekce na nehet levého palce dolní končetiny, bylo indikováno mykologické vyšetření. Mikroskopicky byla prokázána zdeformovaná vlákna, kultivačně rostlo v čisté kultuře F. solani, in vitro byl kmen citlivý na natamycin a intermediárně citlivý k ekonazolu. Stejný nález se potvrdil i po opakovaném mykologickém vyšetření. Z důvodu rozsáhlého postižení nehtů byla indikována chirurgická ablace. K následným kontrolám a pro medikamentózní terapii se pacientka nedostavila. Pacient IV. Pacientka (žena, 57 let) pozorovala postižení nehtové ploténky palce na levé noze od začátku října Uvedla, že onychomykóza měla velmi rychlý průběh, kdy během zhruba tří týdnů došlo k postižení nehtové ploténky v proximální části (obr. 1). Pacientka v létě navštěvova- Klinická mikrobiologie a infekční lékařství

3 la koupaliště, bosa chodí občas na zahradě, jinak chodí v letních měsících v otevřené obuvi. Nehet nebyl v předchorobí poškozen úrazem ani kožní chorobou. Vzhledově byl žluto-hnědavý v celém rozsahu, v proximální části pak bylo možné pozorovat subungvální hyperkeratózu, na povrchu byly patrné příčné rýhy, nehtové valy byly klidné. Před provedením odběru na mykologické vyšetření si pacientka sama aplikovala bifonazol, poté flutrimazol a prováděla koupele v octové vodě, vše bez efektu. Po návštěvě lékaře bylo opakovaně provedeno mykologické vyšetření s nálezem zdeformovaných vláken a čisté kultury F. oxysporum, in vitro byl kmen citlivý k natamycinu, ekonazolu a intermediárně citlivý k terbinafinu. Byla provedena chemická ablace nehtů a poté dostala pacientka k lokální aplikaci ekonazol Tabulka 1 Údaje o pacientech a laboratorní nálezy Pacient Pohlaví Věk Anamnéza Lokalizace Klinický vzhled Datum odběru I/II Nález ve fluorescenční mikroskopii I/II Kultivační nález I/II Číslo izolátu/ no. ITS GenBank (uložené v EMBL) I m úraz place Nehty, palec Postižení 1/3 nehtové ploténky / Zdeformovaná čistá kultura CCF 4358/ LDK; 2008 pravá a levá levé nohy v distální části, větvená Fusarium HE poranění nehtu DK žlutohnědá dyskolorace. Později septovaná vlákna solani PDK při sportu; až onychodystrofie nehtů (kmen I) fotbalista obou palců. II m 32 hrál závodně tenis Nehty, palec Postižení 3/4 nehtové ploténky, / Větvená septovaná čistá kultura CCF 4359/ pravá DK žlutá dyskolorace, příčné neprovedeno vlákna (dermatofyt). Fusarium HE (ale i další rýhovaní a ztráta lesku. Ostatní z důvodu Místy zdeformovaná solani nehty nehty podobné postižení nesouhlasu větvená septovaná (kmen II) pravé DK) na přibližně polovině pacienta vlákna. nehtové ploténky. III ž 32 gelové nehty Nehty, palec Postižení nehtové ploténky / Zdeformovaná čistá kultura CCF 4360/ na DK pravá a levá v distální části na palci větvená Fusarium HE DK pravé nohy. Nehet odfouklý, septovaná vlákna solani hnědá dyskolorace. Nehet (kmen III) palce levé nohy postižen asi z 1/3, žlutá dyskolorace. IV ž 57 Nehty, palec Postižení nehtové ploténky / Zdeformovaná čistá kultura CCF 4362/ levá DK v proximální části. Nehet větvená Fusarium HE ztluštělý, na povrchu příčné septovaná vlákna oxysporum rýhy, subungvální hyperkeratóza, (kmen IV) žluto-hnědá dyskolorace. V m 41 fotbalista Nehty, palec Postižení distální části / Vlákna nenalezena/ čistá kultura SK 1649/ pravá DK nehtové ploténky, onycholýza, Hyalinní vlákna* Fusarium HE (později také podnehtová hyperkeratóza, oxysporum druhý prst) žlutavá dyskolorace nejprve (kmen V) na palci pravé nohy. Postupně rozšíření na druhý prst, podélné žluté proužky. VI ž 43 (nezjištěno) Nehty, (nezjišťováno) / Větvená septovaná Trichophyton palec DK neprovedeno vlákna rubrum rozpadající se + Fusarium v artrospory. solani Pozitivní na dermatofyta. (kmen VI)** Vysvětlivky: m, muž; ž, žena; I/II, 1./2. odběr; DK, dolní končetina * Louhový preparát bez přidání blankoforu ** Původcem infekce nehtu je dermatofyt, fusárium představuje maximálně doprovodnou flóru 186 Klinická mikrobiologie a infekční lékařství

4 krém dvakrát denně. Při posledním kontrolním vyšetření v distální části dorůstal zdravý nehet a v proximální části bylo patrné menší ztluštění. Pacient V. Pacient (muž, 41 let) již od mládí trpěl my - kózou meziprstí a plosek nohou. Od roku 2003 byla u pa - cienta pozorována distální subungvální onychomykóza s onycholýzou, podnehtovou hyperkeratózou a žlutavou dyskolorací nejprve na palci pravé nohy (obr. 1). Postupně se změny rozšířily i na druhý prst, objevily se podélné žluté proužky a změny dosáhly až k zadnímu nehtovému valu. Pacient v anamnéze uvedl, že hraje fotbal. Byl proveden odběr subungvální drtě na mykologické vyšetření. Louhový preparát (bez blankoforu) byl negativní, kultivačně vyrostlo v čisté kultuře F. oxysporum. Za čtyři týdny po prvním odběru byl proveden další odběr z téhož nehtu, louhový preparát tentokrát pozitivní (hyalinní septovaná vlákna), kultivačně opět F. oxysporum v čisté kultuře. Kmen byl in vitro citlivý k natamycinu, ekonazolu a slabě citlivý k terbinafinu. U pacienta byla provedena atraumatická chemická ablace distálních částí nehtů. Zároveň byl nasazen perorálně terbinafin v dávce 250 mg denně po čtyři měsíce. Celková léčba byla doplněna lokálním ošetřováním roztokem 1% ciklopiroxolaminu dvakrát denně. V průběhu léčby nehty odrůstají jen velmi zvolna, distálně přetrvává dyskolorace a deformace nehtových plotének. Materiál a metody Mykologické vyšetření Nehtová drť od šesti pacientů byla vyšetřována mikroskopicky a kultivačně. Část materiálu byla použita ke zhoto vení mikroskopického preparátu (louhový preparát barvený Blanko - forem nebo nebarvený). Zbylá část materiálu byla využita pro kultivaci naočkováním tří zkumavek se Sabou - raudovým dextrózovým agarem (TRIOS) s chloramphenikolem a thiaminem a jedné zkumavky s cykloheximidem (CHM) k potlačení růstu saprotrofních hub. Zkumavky byly inkubovány při teplotě 25 C. Poté co ve zkumavkách bez přídavku CHM vyrostla čistá kultura mikromycetu, byl kmen identifikován na základě přítomnosti typických rozmnožovacích struktur jako Fusarium spp. (obr. 3). Pro potvrzení onychomykózy byl proveden opakovaný časově oddělený odběr nehtů pro mykologické vyšetření [7]. Izoláty byly uloženy do Sbírky kultur hub (CCF) na katedře bota niky Přírodovědecké fakulty UK v Praze ( natur.cuni.cz/cs/sbirkakultur-hub-ccf). Molekulárně-biologické vyšetření Izolace houbové DNA a amplifikace ITS oblasti rdna byla provedena podle Hubka et al. [8]. Identifikace do druhových komplexů byla provedena na základě srovnání podobnosti sekvencí se sekvencemi pocházejících z taxo - nomických monografií za použití programu Blast ( blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi). Získané sekvence byly uloženy do databáze EMBL (European molecular biology laboratory) a jsou dostupné pod přístupovými čísly HE HE (tabulka 1). Testování in vitro antifungální citlivosti Citlivost houbových izolátů k antimykotikům byla testována diskovou difúzní metodou k amfotericinu B (AMB), nystatinu (NYS), natamycinu (PIM); ciklopiroxolaminu (CIC); terbinafinu (TER), posakonazolu (POS), bifonazolu (BIF), flukonazolu (FLU), itrakonazolu (ITR), mikonazolu (MIK), ketokonazolu (KET), klotrimazolu (KLO), ekonazolu (EKO) a vorikonazolu (VOR). Citlivost byla testována pomocí tablet Neo-Sensitabs (Rosco) (TER, POS, AMB, ITR, MIK, KET, VOR) a antimykotických disků (ITEST) (NYS, PIM, CIC, BIF, FLU, KLO, EKO). Antimykotické tablety a disky byly testovány podle instrukcí výrobce; tablety na RPMI 1640 (TRIOS) agaru a disky na Antimycotic Sensi - tivity agaru (AST; TRIOS) a modifikovaném Sabouraudově Obrázek 1 Nehty pacientů II, IV a V Autoři: J. Vojtíšková (pacient II a IV), M. Skořepová (pacient V) Vysvětlivky: Vlevo nahoře pacient II nehet palce pravé dolní končetiny; vpravo nahoře pacient IV nehet palce levé dolní končetiny; dole pacient V vlevo nehet palce pravé nohy, vpravo tentýž nehet po parciální atraumatické ablaci. pacient II pacient V pacient IV Klinická mikrobiologie a infekční lékařství

5 Tabulka 2 1. část Výsledky citlivostí kmenů Fusarium solani a F. oxysporum testovaných diskovou difúzní metodou a Kmen/ATM AMB AMB AMB NYS PIM CIC 10 tbl (25 C) 10 tbl (35 C) Etest (35 C) 50 disk 50 disk 30 disk RPMI/MHA* RPMI/MHA RPMI AST/MHA SAB/MHA SAB/MHA Fusarium solani (kmen I) I R > 32 R R/C** C R Fusarium solani (kmen II) I C 1,0 C R/C** C R Fusarium solani (kmen III) R R R/C** C R Fusarium oxysporum (kmen IV) R R R C R Fusarium oxysporum (kmen V) R R R C R Fusarium solani (kmen VI) R R R/C** C R Tabulka 2 2. část Výsledky citlivostí kmenů Fusarium solani a F. oxysporum testovaných diskovou difúzní metodou a Kmen/ATM TER TER BIF FLU ITR POS 30 tbl (25 C) 30 tbl (35 C) 30 disk 25 disk 10 tbl 5 tbl RPMI/MHA RPMI/MHA AST/MHA AST/MHA RPMI/MHA RPMI/MHA Fusarium solani (kmen I) R R R R R R Fusarium solani (kmen II) R R R R R R Fusarium solani (kmen III) R R R R R R Fusarium oxysporum (kmen IV) R I R R R R Fusarium oxysporum (kmen V) R I R R R R Fusarium solani (kmen VI) R R R R R R Tabulka 2 3. část Výsledky citlivostí kmenů Fusarium solani a F. oxysporum testovaných diskovou difúzní metodou a Kmen/ATM MIK KET KLO EKO VOR 10 tbl 15 tbl 30 disk 30 disk 1 disk RPMI/MHA RPMI/MHA AST/MHA AST/MHA RPMI/MHA Fusarium solani (kmen I) R R R C/R*** R Fusarium solani (kmen II) R R R C/R*** R Fusarium solani (kmen III) R R R I R Fusarium oxysporum (kmen IV) R R R C/R*** R Fusarium oxysporum (kmen V) R R R C/R*** R Fusarium solani (kmen VI) R R R C/R*** R Zkratky: ATM, antimykotikum; AMB, amfotericin B; NYS, nystatin; PIM, natamycin (pimaricin); CIC, ciklopiroxolamin; TER, terbinafin; BIF, bifonazol; FLU, flukonazol; ITR, itrakonazol; POS, posakonazol; MIK, mikonazol; KET, ketokonazol; KLO, klotrimazol; EKO, ekonazol; VOR, vorikonazol; MHA, Müeller-Hinton agar; SAB, modifikovaný Sabouraudův agar; AST, Antimycotic Sensitivity Testing agar; R, rezistentní; C, citlivý; I, intermediární Vysvětlivky: a Všechny kmeny kultivovány při teplotě 25 C a 35 C, není-li uvedeno jinak, výsledky u obou metod byly stejné; odečet po 24 anebo 48hodinách. Výsledek Etestu vyjádřený jako hodnota MIC (mg/l) a její interpretace: * Množství antimykotika v disku/tabletě; testovací médium ** Nystatin tvořil na MHA zóny inhibice oproti AST agaru *** Ekonazol na MHA netvořil zóny inhibice 188 Klinická mikrobiologie a infekční lékařství

6 agaru (SAB; TRIOS). Zároveň byly disky i tablety paralelně testovány podle doporučené metodiky pro vláknité mi - kromycety na Müeller-Hinton agaru (MHA; TRIOS) [6]. Interpretační kritéria na tomto médiu jsou stanovena pro následující antimykotika a jejich koncentrace v disku: amfotericin B (10 μg), caspofungin (5 μg), itrakonazol (10 μg), posakonazol (5 μg) a vorikonazol (1 μg) [6,9]. Zákal suspenze konidií připravených ve fyziologickém roztoku, měřených na spektrofotometru Spekol 11 při 530 nm, měl optickou denzitu 0,15 0,17 (0, cfu/ml). Inokulované plotny s disky byly inkubovány při teplotě 25 C a 35 C. Velikosti zón byly odečítány po 24 anebo 48 hodinách. V případě amfotericinu B (BioMérieux) byla stanovena MIC pomocí Etestu na RPMI 1640 agaru při teplotě 35 C a odečtu po 24 h. Výsledky Vyšetření odebraného materiálu Mikroskopické a kultivační nálezy jsou shrnuty v tabulce 1. Při mikroskopickém vyšetření nehtové drti u pacienta I, III a IV (louhový preparát s blankoforem) byla ve fluorescenčním mikroskopu nalezena pouze zdeformovaná větvená septovaná vlákna, která vedla k úvaze, že by se mohlo jednat o nedermatofytickou etiologii (obr. 4). U pacienta II byla nalezena jak vlákna připomínající dermatofyta, tak zdeformovaná vlákna. Nález opět vedl k úvaze, že by se v etiologii mohl uplatnit, kromě dermatofyta, i saprotrofní původce. U všech pacientů byly po provedení opakovaného odběru obdobné kultivační i mikroskopické nálezy (s výjimkou pacienta II, který opakované vyšetření odmítl). U pacienta V byl proveden klasický louhový preparát a hyalinní vlákna se podařilo prokázat až při opakovaném odběru. Kultivačně pak ve všech vyšetřovaných vzorcích vyrostly opět čisté kultury Fusarium. Kmen VI (F. solani) rostl v čisté kultuře ve zkumavkách bez přidaného CHM, avšak byl izolován spolu s Trichophyton rubrum, který vyrostl ve zkumavce s přídavkem CHM. V tomto případě také nebyla mikroskopicky prokázána přítomnost zdeformovaných vláken. Z tohoto důvodu bylo fusarium vyhodnoceno jako doprovodná flóra a odběr nebyl opakován. Testování in vitro citlivosti k antimykotikům Výsledky diskové difúzní metody u izolátů Fusarium jsou uvedeny v tabulce 2. Většina testovaných antimykotik, ať už ve formě disků nebo tablet, nevykazovala vůbec žádné zóny, s výjimkou natamycinu (pimaricinu), který měl dostatečně velké a téměř shodné zóny na obou testovacích médiích. Některé výsledky se velmi rozcházely v závislosti na použitém kultivačním médiu (NYS, EKO), ale také v závislosti na kultivační teplotě (AMB a TER). Amfotericin B vykazoval u některých kmenů při různých teplotách rozdílné velikosti zón. Při kultivační teplotě 25 C kmeny I a II (F. solani) velikostí zón na obou médiích (RPMI 1640, MHA) spadaly do kategorie intermediární. Při vyšší teplotě (35 C) pak kmen I nevykazoval žádnou zónu, kmen II naopak spadal do kategorie citlivý. Pro ověření těchto výsledků byl použit Etest [6,12]. Proužek byl inkubován standardně při teplotě při 35 C. Výsledky Etestu byly ve shodě s tabletami kultivovanými při teplotě 35 C (kmen I rezistentní, MIC > 32 mg/l; kmen II citlivý, MIC = 1,0 mg/l). U kmenů III VI již nebyla ověřována citlivost (resp. rezistence) amfotericinu B Etestem, neboť tableta nevykazovala při obou teplotách žádné měřitelné zóny. Stejně tak výsledek terbinafinu pro kmeny F. oxysporum (IV, V) se po 48hodinách na obou médiích při teplotě 25 a 35 C velmi lišil (tabulka 2). Při nižší teplotě tablety nevykazovaly žádné zóny a preparát se jevil jako neúčinný. Naproti tomu při vyšší teplotě se na obou médiích utvořila měřitelná zóna, která na RPMI podle kritérií spadala do kategorie intermediární. Při konečném hodnocení jsme se, stejně jako u amfotericinu B, přiklonili k vyhodnocení, které bylo získáno při teplotě 35 C tzn., byl interpretován jako intermediární. Při srovnání obou metod u testovaných kmenů (resp. kultivačních médií) se lišily výsledky naměřených zón antimykotických disků pro NYS a EKO. Ekonazol nevykazoval na MHA antimykotický účinek, nystatin tvořil měřitelné zóny, oproti AST kde EKO vytvářel velké zóny a NYS žádné (tabulka 2), a to nezávisle na kultivační teplotě. Jsme si vědomi, že výsledky získané na MHA (resp. velikosti zón) můžeme těžko vyhodnocovat do kategorií, protože není dostupná standardizovaná metodika. Při konečné interpretaci výsledků byla dodržena interpretační kritéria výrobců. Nystatin byl ve všech případech hodnocen jako rezistentní a ekonazol jako citlivý s výjimkou kmene III, kde byl preparát hodnocen jako intermediární. Molekulární analýza Sekvence ITS oblasti kmenů IV (CCF 4362) a V (SK 1649) byla identická s izolátem NRRL a několika dalšími z komplexu F. oxysporum [10]. ITS sekvence izolátů I, II, III a VI (CCF ) vykazovaly každá unikátní pozice k sobě navzájem a byly shodné nebo obsahovaly jen několik odlišných pozic od sekvencí izolátů z druhového komplexu F. solani [10,11]. Diskuze Nálezy F. solani a F. oxysporum při onychomykózách odpovídají literárním údajům, kdy tyto dva druhy jsou uvádě- Obrázek 2 Nehty pacienta III (palec pravé a levé dolní končetiny) Autor: H. A. Macková Klinická mikrobiologie a infekční lékařství

7 Obrázek 3 Čistá kultura Fusarium solani u pacienta I (čistá zkumavka je s přídavkem cykloheximidu potlačujícího růst fusária) Autor: P. Lysková Obrázek 4 Mikroskopický obraz nalezených zdeformovaných vláken ve fluorescenční mikroskopii u pacienta I (Fusarium solani) Autor: M. Kolařík ny jako nejfrekventovanější fusária izolovaná z infekcí u lidí, včetně infekcí nehtů [1,3,13]. V našem souboru pacientů byla fusária vždy izolována z nehtů palce na noze, což je také v souladu s literárními údaji [1,3]. Fusáriové onychomykózy jsou považovány spíše za sekundární, navazující na předchozí infekci dermatofytem nebo trauma, kdy by se fusária mohla v etiologii uplatnit i samostatně [1,3]. U pa - cienta II se dalo na základě mikroskopie předpokládat, že se jednalo o sekundární etiologii, kdy fusárium nasedlo na ploténku již poškozenou dermatofytem a infekci lze hodnotit jako smíšenou. U dalších pacientů I, III a V je velmi pravděpodobné, že se jako predispoziční faktor uplatnila traumatizace nehtu a fusárium mohlo být od počátku jediným vyvolavatelem infekce. Rizikovým faktorem může být také aplikace gelových nehtů, jak bylo ukázáno na příkladu pacientky III. Poškození (resp. oslabení) nehtové ploténky, které souvisí s postupem opracování před nanášením umělého materiálu, a poté samotná přítomnost cizího tělesa, může hrát významnou roli v traumatizaci nehtu a následně při uplatnění dermatofytů a také oportunních saprotrofních původců. Neobvyklá je anamnéza pacientky IV, která neuvádí žádné predispoziční faktory a zároveň postižení nehtu velmi rychle progredovalo. Mikroskopicky byla nalezena pouze zdeformovaná vlákna a fusárium mohlo být primárním původcem. U pacienta VI vzhledem k mikroskopickému nálezu dermatofytických vláken (a absenci zdeformovaných vláken) odběr již nebyl neopakován i přes kultivační nárůst fusária (avšak spolu s T. rubrum). Citlivost fusárií se liší v závislosti na druhu. Od znalosti druhové příslušnosti by se tedy měla odvíjet volba vhodné terapie. Fusarium solani je v literatuře označováno za nejvíce rezistentní druh ve srovnání s ostatními druhy fusárií, s velmi vysokými hodnotami MIC pro 5-fluorcytosin, ketokonazol, mikonazol, flukonazol, itrakonazol a posakonazol [14 18]. Fusarium oxysporum je také multirezistentní, avšak procento kmenů s vysokými hodnotami MIC je nižší než u F. solani. U obou druhů je variabilní citlivost k amfotericinu B, většinou však při testování různých izolátů převažují kmeny rezistentní nebo se sníženou citlivostí k tomuto preparátu zejména pak u F. solani [14 19]. Oba druhy jsou obvykle rezistentní k posakonazolu a vorikonazolu, citlivé zůstávají k natamycinu [14 20]. Ferrer et al uvádějí, že relativně nízké hodnoty MIC mohou být kromě amfotericinu B a natamycinu také u ekonazolu [20]. Oba multirezistentní druhy F. solani a F. oxysporum se však bohužel řadí mezi nejčastěji izolované z klinického materiálu v našich podmínkách [13]. Nízké hodnoty MIC pro vorikonazol a posakonazol vykazuje F. verticillioides [15]. Výše uvedené literární údaje jsou v souladu s našimi výsledky. Ekonazol byl diskovým testem hodnocen jako citlivý (popř. intermediární). Otázkou samozřejmě zůstává jeho klinický efekt in vivo, i když prozatímní výsledky terapie lékařky pacienta I naznačily, že léčba může být efektivní, protože u pacienta došlo k výraznému klinickému zlepšení. Nadějný je efekt léčby také u pacienta IV. V případě nystatinu je velmi pravděpodobné, že výsledek bude odpovídat interpretaci rezistentní u kmenů I a III, s přihlédnutím k výsledku dalšího polyenového antibiotika amfotericinu B, který se jevil jako neúčinný. U kmene II je možné, že preparát při dosažení dostatečné koncentrace může vykazovat účinnost právě s ohledem na výsledek amfotericinu B. Výsledky citlivosti u amfotericinu B se lišily v závislosti na kultivační teplotě. Tyto by podle doporučení neměly být používány pro testování vláknitých mikromycetů na MHA 190 Klinická mikrobiologie a infekční lékařství

8 s výjimkou zygomycetů [9]. Avšak v našem případě byl získán identický výsledek také při testování na RPMI 1640 při 25 C. Odpovídající výsledek korelující s proužkem Etestu byl na obou médiích získán až při teplotě 35 C [6,12]. Obdobný fenomén byl u F. solani zaznamenán také u dalšího polyenu při testování tablet Neo-Sensitabs nystatinu (kmen IV, NYS 25 C I; 35 C R žádná zóna). Testování antimykotik na MHA je doporučováno při 35 C, avšak nabízí se otázka, jak testovat, resp. vyhodnocovat výsledky u vláknitých mikromycetů, které při 35 C rostou špatně nebo vůbec [9]. Alastruey-Izquierdo et al. u molekulárně určených kmenů stanovovali také citlivost fusárií k terbinafinu a F. solani bylo k tomuto preparátu rezistentní, stejně jako naše izoláty. U F. oxysporum se zjištěné hodnoty MIC pohybovaly v rozmezí 0,5 32 mg/l [18]. Naše kmeny F. oxysporum při te - stování tabletami Neo-Sensitabs vykazovaly (stejně jako u amfotericinu B) při rozdílných teplotách zcela odlišné výsledky (intermediárně citlivé/rezistentní). Vyhodnotili jsme je při teplotě 35 C jako intermediárně citlivé, tím pádem předpokládáme, že alespoň částečná efektivita by mohla být zachována. Tento výsledek podporují výsledky léčby u pacienta V, kde nehty pozvolna odrůstaly i přes přetrvávající nehtové změny. Liang et al. u očních infekcí vyvolaných fusárii porovnávali efektivitu terapie pimaricinem a terbinafinem. Ve studii bylo k terbinafinu in vitro citlivých asi 50 % kmenů a také terapie byla téměř u všech pacientů efektivní [21]. Druhová determinace izolátů nebyla provedena a z dostupných údajů není jasné, do jaké míry může být druhová skladba fusárií (a výskyt rezistence) v Číně odlišná od našich podmínek. Závěr Vzhledem k tomu, že se nám podařilo v poměrně krátké době izolovat nezávisle na sobě od několika pacientů jako vyvolavatele nebo vysoce suspektního původce onychomykózy zástupce rodu Fusarium se sníženou citlivostí k antimykotickým preparátům, chtěli bychom připomenout, že v diferenciální diagnostice onemocnění nehtů je třeba brát v úvahu také nedermatofytické původce. Podezření na nedermatofytickou etiologii by mělo být bráno v úvahu zejména při mikroskopickém nálezu zdeformovaných vláken. Při smíšené infekci dermatofyty a nedermatofytickými houbami může po úspěšném odléčení dermatofytického původce přetrvávat infekce nedermatofytickou houbou z důvodu odlišné citlivosti k antimykotikům. Mnohočetná antifungální rezistence některých druhů lékaři ztěžuje volbu terapie a léčba onychomykózy může představovat nesnadný úkol. Výsledky testování citlivosti in vitro diskovou difúzní metodou by měly lékaři pomoci při rozhodování, jaký nejvhodnější preparát zvolit pro léčbu. Vzhledem k chybějící standardizované metodice pro vyhodnocení většiny antimykotických disků u vláknitých mikromycetů, je v rutinní laboratoři poměrně obtížné získané výsledky správně interpretovat. Ne všechna antimykotika je možné ověřit dalšími metodami (např. Etestem), navíc je takový postup pro laboratoř časově a finančně náročný. Testované kmeny byly in vitro nejlépe citlivé k natamycinu a ekonazolu. Jako vhodný terapeutický zásah u onychomykóz vyvolaných multirezistentními zástupci druhových komplexů F. solani a F. oxysporum se v praxi osvědčilo provedení ablace nehtové ploténky a poté lokální aplikace ekonazolu. Na základě zjištěných diskrepancí ve výsledcích při různých podmínkách testování doporučujeme dodržovat inkubační teplotu 35 C, hlavně u antimykotik ze skupiny polyenů. Literatura: 1. Gugnani HC. Nondermatophytic filamentous keratinophilic fungi and their role in human infection. In: Kushwara RKS, Guarro J (eds). Biology of dermatophytes and other keratinophilic fungi. 1 st ed. Spain: Bilbao pp de Hoog GS, Gené J, Figueras MJ. Atlas of clinical fungi. 2 nd ed. Utrecht: Centraalbureau voor. Schimmelcultures; Godoy P, Nunes F, Tomimori-Yamashita J, et al. Onychomycoses caused by Fusarium solani and Fusarium oxysporum in São Paulo, Brazil. Mycopathologia. 2004;157: Gilbert DN, Moellering RC, Eliopoulos GM, Chambers HF, Saag MS (eds). The Sanford guide to antimicrobial therapy st ed. Sperryville: [s.n.] Sedláček P. Terapie invazivních mykotických infekcí u imunosuprimovaných pacientů. Onkologie. 2008;2(3): Mallátová N, Hamal P, Kocmanová I, et al. Testování citlivosti mikromycet k antimykotikům in vitro u imunosuprimovaných pacientů doporučení odborníků s podporou CELL a SLM ČSL JEP. Postgrad Med. 2011;13: Summerbell RC, Cooper E, Bun U, Jamieson F, Gupta AK. Onychomycosis: A critical study of techniques and criteria for confirming the etiologic significance of nondermatophytes. Med Mycol. 2005;43(1): Hubka V, Kubatova A, Mallatova N, et al. Rare and new aetiological agents revealed among 178 clinical Aspergillus strains obtained from Czech patients and characterised by molecular sequencing. Med Mycol. 2012;50(6): Espinel-Ingroff A, Canton E. Comparison of Neo-Sensitabs tablet diffusion assay with CLSI broth microdilution M38-A and disk diffusion methods for testing susceptibility of filamentous fungi with Amphotericin B, Caspofungin, Itraconazole, Posaconazole, and Voriconazole. J Clin Microbiol. 2008;46(5): O'Donnell K, Sarver BAJ, Brandt M, et al. Phylogenetic diversity and microsphere array-based genotyping of human pathogenic fusaria, including isolates from the multistate contact lens-associated US keratitis outbreaks of 2005 and J Clin Microbiol. 2007;45(7): Debourgogne A, Gueidan C, de Hoog S, Lozniewski A, Machouart M. Comparison of two DNA sequence-based typing schemes for the Fusarium solani species complex and proposal of a new consensus method. J Microbiol Meth. 2012;91(1): Szekely A, Johnson EM, Warnock DW. Comparison of E-test and broth micro - dilution methods for antifungal drug susceptibility testing of molds. J Clin Microbiol. 1999;37(5): Cetkovský P, Kouba M, Buchta V, et al. Diferenciální diagnostika plicních infiltrátů a pokroky v léčbě mykotických infekcí u imunokompromitovaných pacientů. 1. vyd. Praha: Triton; Sabatelli F, Patel R, Mann PA, et al. In vitro activities of posaconazole, fluconazole, itraconazole, voriconazole a amphotericin B against a large collection of clinically important molds and yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 2006;50(6): Tortorano AM, Prigitano A, Dho G, et al. Species distribution in vitro antifungal susceptibility patterns of 75 clinical isolates of Fusarium spp. from Northern Italy. Antimicrob Agents Chemother. 2008;52(7): Muhammed M, Coleman JJ, Carnerio HA, Mylonakis E. The challenge of managing fusariosis. Virulence. 2011;2(2): Espinel-Ingroff A. In vitro fungicidal activities of voriconazole, itraconazole and amphotericin B against opportunistic moniliaceous and dematiceous fungi. J Clin Microbiol. 2001;39(3): Alastruey-Izquierdo A, Cuenca-Estrella M, Monzun, A et al. Antifungal susceptibility profile of clinical Fusarium spp. isolates identified by molecular methods. J Antimicrob Chemother. 2008;61: Espinel-Ingroff A, Johnson E, Hockey H, Troke P. Activities of voriconazole, itraconazole and amphotericin B in vitro against 590 moulds from 323 patients in the voriconazole Phase III clinical studies. J Antimicrob Chemother. 2008; 61: Ferrer C, Alio J, Rodriguez A, et al. Endophthalmitis caused by Fusarium proliferatum. J Clin Microbiol. 2005;43(10): Liang QF, Jin XY, Wang XL, Sun XG. Effect of topical terbinafine on fungal keratitis. Chin Med J. 2009;122(16): Klinická mikrobiologie a infekční lékařství