Využití DNA sekvencování v

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Využití DNA sekvencování v"

Jan Bláha
před 7 lety
Počet zobrazení:

1 Využití DNA sekvencování v taxonomii prokaryot Mgr. Pavla Holochová, doc. RNDr. Ivo Sedláček, CSc. Česká sbírka mikroorganismů Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita, Brno

2 Molekulárně-biologické metody v taxonomii prokaryot analýza genotypu - DNA, RNA, proteinů DNA: RFLP, PFGE, DNA-DNA hybridizace PCR metody, ribotypizace, DNA sekvencování SEKVENCOVÁNÍ EKVENCOVÁNÍ přímá metoda pro detekci sekvenčních polymorfismů nejvyšší rozlišovací schopnost sledování evolučního vývoje organismů tvorba fylogenetických stromů

3 DNA sekvencování využití geneticky stabilních genů (housekeeping gene) - nepodléhají přestavbám (delece, inzerce, inverze) - nízká pravděpodobnost bodových mutací v průběhu času Geny vhodné pro sekvencování: 16S rrna 23S rrna gen pro elongační faktor Tu geny pro RNA polymerázu (rpod, rpob) reca hsp60 gyrb

4 Konstrukce fylogenetického stromu PCR amlpifikace sekvence sekvence uloženy v databázích: GenBank, Ridom databáze, cpn60 databáze,... srovnání sekvencí počítačovými programy: srovnání sekvencí počítačovými programy: ClustalW, PHYLIP, MEGA4, MUSCLE konstrukce dendogramu - neighbor-joining (Saitou a Nei, 1987), - maximum likelihood (Felsenstein, 1981) - minimum evolution - ověření správnosti větví bootstrap analýza evoluční vzdálenost vyjádřena procentem podobnosti výsledky nutno potvrdit dalšími metodami polyfázový přístup

5 NEVÝHODY DNA SEKVENCOVÁNÍ nekvalitní, chybné sekvence problém databází řešení: kontrola sekvencí, využití specializovaných databází chyby při tvorbě fylogenetických stromů řešení: konstrukce více typů stromů srovnání výsledků finanční náročnost

6 Rod Aeromonas gram-negativní tyčky, fakultativně anaerobní a chemoorganotrofní 16 validně popsaných druhů výskyt ve vodách, infekce studenokrevných živočichů, průjmovitá onemocnění u lidí řazení některých druhů do komplexů (A. caviae, sobria, hydrophila) 16S rrna - nízká rozlišovací schopnost další geny: gyrb, rpod, cpn60 (hsp60/groel) Phylogenetic analysis and identification of Aeromonas species based on sequencing of the cpn60 universal target. David Miñana-Galbis, Aintzane Urbizu-Serrano, Maribel Farfán, M. Carmen Fusté and J. Gaspar Loren. Int J Syst Evol Microbiol (2009)

7 Sekvencování u rodu Aeromonas: cpn60 zpracováno 47 kmenů rodu Aeromonas sekvence dostupné v databázi chaperoninů cpndb ( sekvenace firmou Eurofins MWG Operon, Německo počítačové programy: ClustalW, MEGA4 fylogenetický strom neighbor-joining ověření správnosti větví bootstrap analýza příslušnost k druhu: 3,5 % příslušnost k rodu: 3,7-16,9 %

8 A. caviae komplex druhy: encheleia eucrenophila media caviae zdroj: říční voda / krasová voda / klinický materiál Výsledek: 3 potvrzení druhu 5 zařazení do druhu v komplexu A. caviae 2 zařazení do jiného druhu

9 A. hydrophila komplex druhy: hydrophila popoffii bestiarum salmonicida poddruhy A. hydrophila: hydrophila ranae dhakensis zdroj: říční voda / krasová voda / klinický materiál Výsledek: 8 potvrzení druhu a upřesnění poddruhu 4 zařazení do druhu v komplexu A. hydrophila 2 zařazení do jiného druhu identifikace A. hydrophila subsp. dhakensis (P1097) z klinického materiálu

10 A. salmonicida poddruhy A. salmonicida: pectinolytica achromogenes salmonicida masoucida smithia nelze odlišit zdroj: říční voda / krasová voda / izoláty z ryb Výsledek: 9 potvrzení druhu 2 zařazení do jiného druhu

11 A. sobria komplex druhy: sobria jandaei veronii biovar Sobria veronii biovar Veronii enterpelogenes shubertii zdroj: říční voda / krasová voda / izoláty z ryb / klinický materiál Výsledek: 3 potvrzení druhu 3 zařazení do druhu v komplexu A. sobria 4 zařazení do jiného druhu - druh A. diversa - CCM 7325 (klinický materiál) - nový druh CCM 7641 (krasová voda)

12 Vyhodnocení výsledků 47 kmenů: 23 vzorků - potvrzení druhu a upřesnění poddruhu (49 %) 12 vzorků - zařazení do druhu v rámci v komplexu (26 %) 10 vzorků - zařazení do jiného druhu (21 %) 2 kmeny potvrzení nových druhů

13 Závěr pro taxonomii rodu Aeromonas - sekvence genu cpn60 vhodnější než sekvence 16S rrna vysoká rozlišovací schopnost potvrzení zařazení kmenů do druhu identifikace druhu uvnitř komplexu identifikace poddruhů aplikovatelnost na kmeny klinické i kmeny z prostředí odlišení nových druhů

14 Děkuji za pozornost

Podobné dokumenty

Polyfázová identifikace kmenů Aeromonas encheleia

Polyfázová identifikace kmenů Aeromonas encheleia D. Nováková, A. Vávrová, P. Švec a I. Sedláček Česká sbírka mikroorganismů Charakterizace aeromonád G-, pohyblivé tyčky, kokotyčky, čeleď Aeromonadaceae