Laboratorní medicína Minulost, přítomnost a budoucnost

Transkript

1 Laboratorní medicína Minulost, přítomnost a budoucnost

2 Vzdálená minulost! První laboratorní testy Starověk Moč se rozlije na podlahu. Pokud moč obsahuje cukr, je přilákán hmyz (mravenci). Tento test byl používán ještě před 20 lety v některých částech Afriky. Hippocrates (300 př. n.l.) první diagnostické protokoly smyslové sledování chuť a vzhled moči (sedimenty, bubliny), krve

3 Odběry krve Zavedeny až ve 20. století jako diagnostický nástroj Předtím byl odběr většího množství krve považován za léčivý pouštění žilou (16. století pijavice) George Washington denní odběry krve zemřel zřejmě na následky velkých ztrát krve Stále se používá cyanotická kongenitální srdeční vada (tvoří se přemíra červ. Krvinek, pravidelně se odstraňují z krevního oběhu)

4 Vybavení v medicínské laboratoři: 1920 Moderní lůžková nemocnice by byla velmi dobře vybavená, kdyby měla: váhy mikroskop centrifuga Bunsenův hořák kolorimetr (předchůdce spetrofotometru)

5 Klinická biochemie v nemocniční laboratoři 1970 Váhy Spektrofotometr Plamenový fotometr (stanovení K, Na, Ca) Van Slykův aparát (měření plynů v krvi) Klettův kolorimeter (měření hemoglobinu) Centrifuga

6 V roce 1970 Nepoužívaly se počítače ani počítačky. Používaly se posuvné stupnice! Bez automatizace Bez propracované kontroly kvality Bez laboratorního informačního systému Informační technika pouze telefon (ne FAX, , internet)

7 Stav na počátku sedmdesátých let

8 Současnost Point-of-Care testování Molekulární diagnostika Sofistikované přístroje, analyzátory (tandemová hmotnostní spektrometrie, mnohobarevná průtoková cytometrie) Testování mnoha parametrů na jediném analyzátoru (konsolidace testování) Konsolidace laboratoří

9 Lékařské vyšet etření Lékař potřebuje výsledek Odběr vzorku Provedení testu Zadání výsledku do zprávy Příjem a zpracování vzorku Laboratorní informační systém

10 MIKROBIOLOG ROBIOLOGIEIE Identifikace mikroorganismu (bakterie, plísn sně,, viry, parazité), který způsobil infekci. Testování efektivních antibiotik. Bakteriáln lní kultury

11 MIKROBIOLOGIE Odpovědi na otázky typu: jsou zdravotní obtíže pacienta infekčního původu? Průkaz infekčního agens Je přímá souvislost mezi výsledky z laboratorního vyšetření a určitými obtížemi pacienta? Jaká bude terapie? Jaký je epidemiologický význam získaných údajů? rizika infekce, hrozí nebezpečí šíření, jak zabránit šíření

12 VIROLOGIE Přímý (antigen, nukl.. kyselina) vs. nepřímý průkaz viru (protilátky) tky) Monitoring průběhu onemocnění dle DNA viru dle protilátek tek v sérus Běžné infekce Akutní průjmy Akutní respirační onemocnění Hepatitidy, HIV Klíš íšťová encefalitida Herpesviry, cytomegalovirus,, EBV

13 Trichomonas vaginalis Trypanasoma PARAZITOLOGIE Jednobuněč ěčné vs. složit ité mnohobuněč ěčné organismy Gastrointestináln lní trakt, močov ové,, pohlavní cesty a krev (vzorky stolice, moč,, stěry sliznic) Přímý důkaz d identifikace patogenního agens (nukleové kys., mikroskopie, kultivace) Nepřímý důkaz d protilátky tky v séru s (Borrelie( Borrelie, Toxoplazmy)

14 HEMATOLOGIE Pracuje s čerstvou nesraženou enou krví Počet a charakterizace krevních buněk - krevní obraz a diferenciáln lní rozpočet (analyzátor), krevní nátěr mikroskop (barvení morfologie buněk) Diagnostika onemocnění (anemie) Detekce malignit (leukemie( leukemie) Sledování stavu nemoci, efektivity léčbyl Rozlišen ení typů infekce Srpkovítá anémie Testy srážlivosti krve

15 Abnormáln LEUKEMIE lní nekontrolovatelný růst r krevních buněk Buňky nejsou schopny maturovat do konečných ných stádi dií Následkem nádorovn dorového bujení se nedostatečne vyvíjej její i ostatní krevní řady (destičky, červené krvinky) Diagnóza na základě vyšetření různých vzorků tkání na několika odděleních Hematologie: krevní obraz Imunologie, Patologie: buněč ěčné markery (krev, kostní dřeň) Cytogenetika: : chromozomáln lní přestavby

16 Transfúzn zní oddělen lení Krev poskytovaná bezplatně dobrovolnými dárcid Výroba krevních přípravkp pravků a derivátů Testování krevních skupin Provádí se zkoušky, ky, kterými se určuje uje kompatibillita příjemce a dárce: d Velká křížová zkouška ka sérum příjemce p se mísím s erytrocyty dárced Testy na vyloučen ení infekčnosti nosti darované krve vyloučen ení přenosu infekčních onemocnění (AIDS, hepatitidy)

17 Transfuzní přípravky pravky a deriváty Transfuzní přípravky: pravky: připravované separací darované krve přímo p na transfuzním m oddělen lení Plná krev, erytrocytový koncentrát, t, krevní destičky, plazma Výroba krevních derivátů farmaceutické firmy: obvykle mix od několika n dárců lidský albumin, imunoglobiliny,, faktory srážen ení

18 Testování tkání HISTOPATOLOGIE OLOGIE Odběr r vzorku (operace, biopsie) Transport a zpracování Řezy a barvení (značen ení) Mikroskopické vyhodnocení Diagnóza Používání klasických technik, nutné získat zkušenost v přípravě i odečítání vzorků Automatizace nepostupuje tak rychle Čeká se dlouho na výsledek

19 Histologie rozmanité techniky značen ení Klasické barvení hematoxylin, eosin struktura tkáně Enzymová histochemie (průkaz přítomnosti p a aktivity enzymů ve tkáni) Imunohistochemie (detekce navázaných protilátek) tek) Fluorescenční značen ení Zdokonalují se přístroje p na přípravupravu řezů,, elektronový mikroskop Automatizace nepostupuje tak rychle Karcinom prsu H/E barvení Karcinom prsu imunohisto barvení (tumor marker)

20 CYTOLOGIE mikroskopické vyšet etření jednotlivých buněk k rozetřených ených na podložním m skle - chybí kontinuita vyšet etřované tkáně v histologickém řezu Metoda dle Papanicolaua (Pap screen): detekce časných stádi dií karcinomu dělod ložního čípku. Příprava prepátu tu,, značen ení, odečítání a vyhodnocení (% abnormáln lních buněk) Vyšet etření výpotků,cytologie štítné žlázy, plicní cytologie (laváž), cytologie lymfatických uzlin Pap screen pod mikroskopem

21 Klinická biochemie Zpracování sražen eného krevního vzorku - sérum Stanovení množstv ství specifických elementů přítomných v krevním m oběhu Proteiny, Cukry, Tuky Meziprodukty metabolismu Hormony Toxiny Onkologické markery

22 KLINICKÁ BiOCHEMIE Vysoký stupeň automatizace: analyzátory Multidisciplináln lní Buněč ěčný metabolismus (buněč ěčná biologie) Hormonáln lní interakce (endokrinologie) Imunitní odpověď (imunologie) anatomie

23 IMUNOLOGIE Infekční imunita onemocnění - bakteriáln lní,, virová,, plísňov ová Sledování imunitní odpovědi di (imunitní stav organizmu, imunopatologie) Hypersensitivní reakce (alergie) Imunodeficity Autoimunitní onemocnění Onkologická hemagologická onemocnění Protinádorov dorová imunita Základní přístupy: Automatizace: Analyzátory protilátky, tky, antigeny Sofistikované metody: průtokov toková cytometrie Funkční testy lymfocytů: : laboratorní zkušenost, nelze automatizovat

24 TOXIKOLOGIE Detekce a monitorování toxických látek l (alkohol, drogy, jedy, léky): l Studium rozdělen lení,, příznakp znaků a projevů,, průběhu, klinických nálezů,, možnost ností prevence a léčby l otrav (intoxikací) Diferenciáln lní diagnostika intoxikace a její závažnosti ve vztahu ke zdravotnímu stavu a nebo chování pacienta Monitorování optimáln lního účinku a příp. p p. možných interferenc ncí látek při p i medikamentosní terapii Sledování dodržov ování léčebného režimu Soudní (forezní)) toxikologie

25 CHROMATOGRAFIE AFIE Separační technika Nutná úprava vzorku, časově náročnější,, odborně personáln lně náročnější HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Látky se dělíd dle molekulové hmotnosti Nejúčinn innější detekce: tandemová plynová chromatografie s hmotnostní detekcí GC-MS Screening neznámé noxy (jedu)

26 GENETIKA DNA technologie Dokončena kompletní sekvence lidského genomu Studium dědid dičných onemocnění Studium geneticky dané náchylnosti k onemocněním Techniky analýzy DNA prolínaj nají do ostatních laboratorních oborů (patologie, mikrobiologie) PCR polymerázov zová řetězová reakce Rozvíjej jející se obor: čipové technologie

27 Ochrana veřejn ejného zdraví Mikrobiologické zkoušky ky potravin, vody Fyzikáln lní zkoušky ky pracovního prostřed edí normy pro osvětlen tlení hluk proudění vzduchu Radiace

28 Konsolidace laboratoří+ Automatizace Vzniknou centrální laboratoře konsolidace mikrobiologie, imunologie a klinické chemie nemocnice střední velikosti má asi 80 % testů automatizovaných centrální laboratoře mohou přeřazovat pracovníky mezi různými technologiemi vyšetření se provádí na poměrně malé ploše centrální laboratoře mají silnou pozici při vyjednávání nízkých cen činidel

29 Výhody konsolidace laboratoří redukce možných zdrojů chyb redukce nákladů eliminace potřeby alikvotování zvýšení bezpečnosti maximální využití mikrovzorků technická dokonalost

30 Blízká budoucnost Snížení nároků na laboratorní síly Dramatický nárůst POCT a domácího testování Neinvazivní testování Zavádění složitých metod (tandemová hmotnostní spektrometrie) Molekulární diagnostika (Čipy a SNP), single cell analýzy Automatizace, robotika

31 Neinvazivní testování Bez nutnosti odebírání vzorků tkání Kontinuální testování hladiny glukózy bez nutnosti odběru krve detekce analytů voku (změny koncentrace odpovídají změnám v detekci emitovaného IR záření) GLUCOWATCH Pokroky v zobrazovacích metodách vysoce citlivé ultrazvukové skenery střírozměrným zobrazovacím softwarem zobrazovací zařízení vybraných oblastí srdce na principu resonanční spektroskopie

32 MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA

33 Význam molekulární diagnostiky Laboratorní výsledky určují ze 70%, jak jsou vynaloženy prostředky na léčbu Nejrychleji rostoucí laboratorní obor 1953 struktura DNA 1985 objev PCR techniky Molekulární diagnostika zpřesňuje diagnozu oněmocnění, umožňuje lépe léčit a předcházet onemocněním

34 Personalizovaná medicína výběr léku na míru Molekulární diagnostika: Lepší péče o pacienta Infekční onemocnění (kvantifikace virové nálože) & testování rezistence Revoluční zejména v oblasti onkologie: Zpřesnění diagnózy výběr efektivní léčby Zpřesnění prognózy onemocnění Sledování průběhu onemocnění (citlivá detekce metastáz, relapsu onemocnění) Výběr vhodného dárce pro transplantaci kostní dřeně HLA typizace

35 Molekulární diagnostika: 3 základní přístupy Cytogenetika na úrovni chromozomů chromozomální abnormality (abnormality v počtu, přestavby chromozomů u onkologických onemocnění) Molekulární genetika na úrovni DNA, metoda polymerázové řetězové reakce = PCR, čipové technologie Průtoková cytometrie na úrovni buněk: detekce buněčných znaků

36 Downův syndrom Zdravý jedinec Cytogenetika metoda FISH (fluorescence in situ hybridization) Strukturální změny na chromozomech - přestavby Genové přestavby (translokace) Pracuje se speciálními fluorescenčně značenými sondami Dědičná onemocnění Onkologická onemocnění

37 Průtoková cytometrie Technika pro počítání, analýzu a třídění buněk suspendovaných v proudu tekutiny. Analýza znaků na buňkách Detailní analýza krevních buněk onemocnění imunitního systému, Leukémie (diagnostika, sledování)

38 Molekulární genetika PCR = polymerázová řetězová reakce -umožňuje namnožit libovolný úsek DNA a tak ho zpřístupnit analýze Analýza mutací dědičná onemocnění, nádory Analýza polymorfismů predikce onemocnění HLA typizace Otcovství Kriminalistika

39 Molekulární diagnostika: Single cell analysis = analýza z jedné buňky Preimplantační genetická diagnostika Alternativní metoda k tradičním invazivním metodám prenatální diagnostiky (odebírání vzorků choriových klků nebo amniocentéza) Genetická analýza a selekce embrya před implantací při IVF (in vitro fertilizace) umožňuje vybrat embrya, která nenesou genetický materiál, způsobující onemocnění: Downův syndrom (trizomie 21. chromozomu) Cystická fibróza (mutace v genu pro chlor. Receptor)

40 Postup při preimplantační genetické diagnostice Příprava embrya při klasickém IVF cyklu Růst embrya do velikosti cca 8 buněk (den3) Biopsie (odstranění) embryonálních buněk (blastomer) pro testování Testování DNA (pro testy PCR) nebo celých jader (pro testy FISH)

41 Biopsie Embrya

42 Biopsie embrya

43 MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA: Čipové technologie Výhody Úskalí Všechny potřebné testy (všech genů, co nás zajímají) jsou provedeny naráz Snížení ceny jednoho testu cenově efektivní Laboratoř může vyhovět zvyšujícím se požadavkům Snížení času zpracování - časově efektivní Snížení nároků na počet laboratorních pracovníků a laboratorní prostor Nutná pečlivá optimalizace metod Někdy se produkuje příliš mnoho zbytečných výsledků Náročné počítačové zpracování výsledků

44 Farmakogenetika : Farmakogenetické testy mohou předpovědět, který lék bude u daného jedince efektivní a který způsobí nežádoucí účinky Použito u psychofarmak a léků při onemocnění srdce. Hledají se interindividuální rozdíly na úrovni DNA, které jsou spojeny s různou odpovídavostí na léčbu Bylo identifikováno přibližně 70 léčiv, které jsou katabolizovány enzymem cytochromem P450. Gen pro tento enzym se vyskytuje ve více než 50 variantách. poor (PM), intermediate (IM), normal (EM) or rapid metabolizers (UM)

45 Pharmakogenetika příliš mnoho enzymu - lék je katabolizován příliš rychle a ztrácí účinnost. Málo enzymu - mohou se začít projevovat účinky předávkování. Např. 30% lidí afrického původu, 20% lidí z blízkého východu, ale pouze 2% Kavkazské populace nesou 3 nebo více kopií genu CYP2D6, což způsobuje příliš rychlý rozklad některých léků Pomocí čipu lze určit typ metabolismu léků

46 NUTRIGENOMIKA Vztah genotypu a zpracování živin Identifikace jedinců se sníženým metabolismem folátů Gen pro 5,10-methylenehydrofolate reduktázu (MTHFR). Mutace v tomto genu: rizikový faktor pro vrozené vady (riziko u těhotných žen). Tělo není schopno dostatečně zpracovat kyselinu listovou.

47 Vzdálená budoucnost PERSONALIZOVANÁ MEDICÍNA PREVENTIVNÍ MEDICÍNA Výrazně lepší výsledky léčby onemocnění v nižším stádiu (karcinom tl. střeva 90 vs 8%) Stojí méně než léčba pokročilého onemocnění UŽ NE jedna velikost pastuje všem!