HYDRAGEL 15 ISO-PAL. Ref Ref /10

Transkript

1 HYDRAGEL 7 ISO-PAL Ref HYDRAGEL 15 ISO-PAL Ref /10

2 POUŽITÍ KITU HYDRAGEL 7 ISO-PAL a HYDRAGEL 15 ISO-PAL kity jsou určeny k identifikaci i kvantitativnímu stanovení izoenzymů ALP v lidském séru elektroforézou na agaróze o ph 9.1. Používají se ve spojení s poloautomatizovaným elektroforetickým systémem HYDRASYS. Výsledkem jsou gely připravené k interpretaci. Separované izoenzymy ALP jsou vizualizovány pomocí specifického chromogenního substrá-tu. Osušené gely lze vyhodnotit vizuálně a denzitometricky stanovit jejich procentuální zastoupení. Každý agarózový gel je určen pro analýzu : 3 vzorků (HYDRAGEL 7 ISO-PAL kit). 7-mi vzorků (HYDRAGEL 15 ISO-PAL kit). Určeno pro diagnostické použití in vitro. PRINCIP TESTU Alkalická fosfatáza je metaloglykoprotein s monofosfoesterázovou aktivitou, který katalyzuje hydrolýzu řady monofosforečných esterů. Reakce je aktivována hořečnatými ionty v alkalickém prostředí. Vyskytuje se v mnoha tkáních a orgánech lidského těla např.v játrech, kostech, střevech a v placentě. Enzymy ALP jsou kódovány třemi strukturálními geny. Dva kódují střevní a placentární frakce, třetí, "nespecifický tkáňový gen", se projevuje v nejrůznějších tkáních v kostech, játrech a ledvinách. Izoenzymy jsou separovány dle rozdílnosti nábojů vznikajících glykosylací. Výsledkem elektroforetické migrace vzorků lidského séra na gelech HYDRAGEL 7/15 ISO-PAL je rozlišení téměř všech izoenzymů ALP s výjimkou jaterní frakce (L1), kostní frakce (B) a placentární frakce (P1), jež jsou seskupeny v jednu společnou širokou frakci. Od anody ke katodě následují jednotlivé frakce v pořadí skupina L1 + B (+ P1), dále 2. frakce jaterního izoenzymu (L2), střevní izoenzymy (I1, I2, I3). Placentární izoenzym (P2), pokud je přítomen, je lokalizován mezi I1 a I2. U některých velmi ikterických vzorků lze detekovat komplex ALP a lipoproteinů těsně za startem zde nazývaný lipo ISO-PAL nebo UF (ultrafast). K odstranění potíží se separací L1 a B izoenzymů byly rutinně používány různé způsoby úpravy séra např. : inaktivace teplem, ureou nebo aminokyselinami, precipitací specifickým antisérem, využití rozdílné citlivosti k enzymatické desializaci neuraminidázou atd. SEBIA využívá k oddělení izoenzymů L1 a B různého stupně jejich sializace. Lektin pšeničných klíčků (WGA-Wheat Germ Aglutinin) vykazuje silnou afinitu pro část molekuly izoenzymů s navázanou kyselinou sialovou. Sialovou skupinu ve větším či menším množství obsahují všechny izoenzymy - nejvíce kostní - s výjimkou střevních frakcí a reagují s lektinem. Vzorky jsou nanášeny v duplikátu. V průběhu elektroforetické migrace isoenzymy ALP (s výjimkou komplexu lipo ISO-PAL) v jednom z duplikátů procházejí zónou s aplikovaným lektinem. Lektin sám se nepatrně posouvá ke katodické straně. Nastává interakce mezi skupinami kyseliny sialové jednotlivých izoenzymů a lektinem. 1 Sialyl- Isoenzym + WGA Sialyl- Isoenzym / WGA komplex 2 Pro L1, L2, P1, P2 je interakce slabá díky stanoveným podmínkám reakce. To vysvětluje zpomalení těchto izoenzymů ve srovnání se vzorkem naneseným ve stopě bez lektinu. Kostní frakce, která obsahuje více sialových skupin, při interakci s lektinem dostatečně precipituje a zůstává blíže aplikačnímu bodu lektinu. V některých případech se však může stát, že vazebná kapacita lektinu je překročena (např. při silně zvýšeném kostním izoenzymu jako např. při rakovině kostí nebo při aktivním kostním metabolizmu při růstu) a kostní frakce pak není kompletně precipitována a v některých případech komlex pak migruje dále anodickým směrem až pod frakci L2. Ve stopě s lektinem jsou tedy frakce L1 a P1 úplně odděleny od kostní frakce a mohou být lehce kvantifikovány. Separované izoenzymy ALP jsou vizualizovány pomocí specifického chromogenního substrátu 5-Bromo-4-Chloro-3- Indolyl-Fosfátu / Nitro Blue Tetrazol (NBT) v Aminometyl Propanolovém (AMP) pufru, ph REAGENCIE A MATERIÁL OBSAŽENÝ V KITECH HYDRAGEL 7 ISO-PAL A HYDRAGEL 15 ISO-PAL POLOŽKY KAT. Č. 4112* KAT. Č. 4132* Agarózové gely (připraveno k použití) 10 ks 10 ks Houbičky s pufrem (připraveno k použití) 10 bal. po 2 ks 10 bal. po 2 ks Lektin (lyofilizát) 1 lahv. 2 lahv. Substrát ISO-PAL (připraveno k použití) 1 lahv. 20 ml 2 lahv. po 20 ml Chromogen (zásobní roztok) 1 lahv. 10 ml 1 lahv. po 10 ml Aplikátory (připraveno k použití) 2 bal. po 10 ks (7 zubů) 2 bal. po 10 ks (15 zubů) Tenké filtrační papíry 1 bal. po 10 ks 1 bal. po 10 ks Tlusté filtrační papíry 1 bal. po 10 ks 1 bal. po 10 ks Plastikové masky 1 bal. po 10 ks 1 bal. po 10 ks * Oba kity obsahují aplikátory se 7 nebo 15 zuby. Protože každý vzorek je nanášen v duplikátu, lze na každém gelu dělit 3 nebo 7 vzorků. Zbývající stopu lze využít k aplikaci kontrolního vzorku. Během přepravy může být souprava uchována bez zmražení (15 až 30 C) až po dobu 15 dní bez nepříznivého vlivu na vlastnosti. PRO OPTIMÁLNÍ VÝSLEDKY : Všechny reagenty ze stejné sady musí být vždy používány společně a podle pokynů v příbalovém letáku. PROSÍME, ČTĚTE PEČLIVĚ PŘÍBALOVÝ LETÁK. 1. AGARÓZOVÉ GELY Připraveny k použití, každý gel obsahuje agarózu 1 g/dl, alkalický pufr - ph 9.1 ± 0.05 a přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. POZOR : Gely obsahují 0.10 % azid sodný. Nepolykat! V případě polknutí kontaktujte ihned lékaře SEBIA NÁVOD - Czech

3 Nosné medium pro elektroforézu izoenzymů ALP. Skladujte v horizontální poloze v originálních obalech - šipkou na přední straně krabice směrem nahoru. Teplota 2-8 C. Zamezit prudkým změnám teploty neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. Stabilní do doby exspirace vyznačené na krabici či na obalech gelů. NEMRAZIT! Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). 2. PUFROVANÉ STRIPY Stripy jsou připraveny k použití. Každý obsahuje : zásaditý pufr o ph 9.3 ± 0.2, aditiva nezbytná pro zajištění optimálního provedení testu. POZOR : Pufr ve stripech obsahuje azid sodný 0.5 %. Nepolykat! Při požití konzultovat s lékařem. Azid sodný, pokud se dostane do kontaktu s mědí, olovem a kyselinami, může vést k tvorbě explozívních nebo toxických sloučenin. Proto při likvidaci roztoku vyplachovat velikým množstvím vody! Stripy slouží jako rezervoár pufru pro elektroforézu a zajišťuje kontakt mezi gelem a elektrodami. Skladujte při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu kitu, resp. na štítcích jednotlivých balení se stripy. NEMRAZIT! Vyschlé stripy z otevřených a poškozených balení nepoužívejte! 3 LEKTIN* Lahvička s lektinem obsahuje WGA-aglutinin pšeničných klíčků ve stabilizované lyofilizované formě. Do lahvičky s lektinem napipetujte přesně 0.5 ml fyziologického roztoku. Lahvičku uzavřete. Zlehka promíchejte a ponechte stát 5 minut při pokojové teplotě. Poté znovu zlehka promíchejte. Vzniklý čirý roztok lektinu je hotov a připraven k použití. K reakci migrujících vzorků séra během elektroforetické separace. Lyofilizovaný lektin skladujte při 2-8 C. Je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu kitu nebo na štítku lahvičky. Po rozpuštění se lektin musí skladovat při - 20 C. Roztok lze 10x zmrazit a rozmrazit bez nepříznivého účinku na provedení testu - nesmí však být v rozpuštěném stavu vystaven pokojové teplotě déle než 15 min. Proto se doporučuje roztok rozpuštěného lektinu rozdělit na poměrné díly, po 50 µl pro HYDRAGEL 7 ISO-PAL a 100 µl díly pro HYDRAGEL 15 ISO-PAL zmrazit a ponechat do použití při - 20 C. Známky znehodnocení roztoku : změna vzhledu, zákal, precipitáty. Zmrazený roztok lectinu je stabilní maximálně 6 měsíců při - 20 C. 4. SUBSTRÁT Lze okamžitě použít. Obsahuje BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Fosfát) v AMP pufru o ph 10.0 a aditiva pro optimální provedení testu. Roztok k vizualizaci se připravuje těsně před použitím ze : - 2 ml substrátu a 0.5 ml chromogenu pro HYDRAGEL 7 ISO-PAL, - 4 ml substrátu a 1 ml chromogenu pro HYDRAGEL 15 ISO-PAL. Promíchat. Vyvarovat se působení přímého světla. K přípravě roztoku pro vizualizaci. Při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilita : do doby exspirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. Substrát může jevit mírnou krystalizaci bez nepříznivých efektů na provedení testu. 5. CHROMOGEN Chromogen je připraven k použití. Obsahuje NBT (Nitro Blue Tetrazolium) ve vodném roztoku. K přípravě vyvolávacího roztoku viz bod 4. Při pokojové teplotě nebo zchlazené 2-8 C. Stabilita : do data exspirace. 6. APLIKÁTORY K nanesení vzorků a roztoku lektinu na gel. Připraveny pro jedno použití. Na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 7. TENKÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY K jednorázovému odsání přebytečné vlhkosti z povrchu gelu před aplikací vzorků. Skladování Na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce

4 8. TLUSTÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY K odsávání vlhkého gelu po enzymatické vizualizaci. Skladování Na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 9. PLASTIKOVÉ MASKY Bílé plastové folie na jedno použití, určené k ochraně gelů před vypařováním v průběhu elektroforetické migrace. *POZN. : Během transportu vydrží gely a lektin 15 dnů bez chlazení při teplotě C bez nepříznivých efektů na provedení testu. POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ 1. FYZIOLOGICKÝ ROZTOK Připravte 0.9 g/dl NaCl (0.15 M) roztok v destilované nebo deionizované vodě. Potřebný k naředění lektinu. Skladuje se při teplotě místnosti nebo v chladničce. Přestaňte používat po 3 měsících nebo při změně vzhledu roztoku v důsledku mikrobiální kontaminace. Pro delší skladování lze konzervovat 0.1 g/dl azidem sodným. 2. ODBARVOVACÍ ROZTOK Každá lahvička zásobního Odbarvovacího Roztoku (SEBIA, kat. č. 4540, 10 lahviček po 100 ml) je určena k přípravě 100 litrů pracovního odbarvovacího roztoku. Je výhodné připravovat jen 5 litrů pracovního roztoku doplněním 5 ml zásobního roztoku do 5-ti litrů destilovanou nebo deionizovanou vodou. Pracovní roztok obsahuje 0.05 g/dl kyseliny citronové. Roztokem se odstraňuje přebytečné množství barvičky a odbarvuje se pozadí agarózové plotny. Dále k vyplachování barvícího prostoru po promývacím kroku. K neutralizaci kyselého odbarvovacího roztoku nalij 15 ml 50 % roztoku NaOH do prázdného kontejneru na odpad. Skladování, stabilita, známky znehodnocení Skladování při pokojové teplotě nebo v chladničce. Je stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní 1 týden při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Nepřidávejte azid sodný! Nepoužívat při změně vzhledu, vzniku zákalu nebo precipitátu v roztoku. K zabránění mikrobiálního růstu v pracovním roztoku skladovaném déle než 1 týden lze přidat 5 µl/dl ProClin 300. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem ProClinu je stabilní v uzavřené nádobě do doby exspirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. 3. PROMÝVACÍ ROZTOK PRO HYDRASYS Každá lahvička Promývací roztok pro HYDRASYS (SEBIA, kat. č. 4541, 10 lahviček po 80 ml) se ředí do 5-ti litrů destilovanou nebo deionizovanou vodou. Takto připravený pracovní promývací roztok obsahuje alkalický pufr ph 8.8 ± 0.3 a azid sodný. POZOR : Zásobní promývací roztok obsahuje % azid sodný. Nepolykat! Při požití konzultovat s lékařem. Azid sodný, pokud se dostane do kontaktu s mědí, olovem a kyselinami, může vést k tvorbě explozivních nebo toxických sloučenin. Proto při likvidaci roztoku vyplachovat vždy velkým množstvím vody! Slouží k čištění oddílu HYDRASYSu určeného k barvení. Při denním používání přístroje se doporučuje promývat barvící prostor jednou za týden. Viz příbalový leták. Skladujte zásobní i pracovní promývací roztok v uzavřených nádobách při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilní do data exspirace uvedeného na štítcích lahviček s promývacím roztokem. Při známkách změny vzhledu pracovního promývacího roztoku, výskytu zákalu v důsledku mikrobiální kontaminace, roztok vyřaďte z používání. NUTNÉ VYBAVENÍ 1. HYDRASYS Systém SEBIA, kat. č. 1200, kat. č. 1201, kat. č. 1202, kat. č. 1203, kat. č nebo kat. č Manuální nebo automatizovaný mikropipetor (SEBIA HYDRAPLUS, kat. č nebo SEBIA HYDRAPLUS 2, kat. č. 1217) jako alternativu k aplikátorům vzorků. 3. Vlhká Zásobní Komora dodávaná s HYDRASYS systémem, PN Vodící Tyčka Šablony dodávaná s HYDRASYS systémem. 5. HYDRASYS Accessory kit ISO-LDH, ISO-PAL, CHOL, SEBIA, kat. č Pipety 10 µl, 200 µl, 1 ml, 5 ml. 7. Denzitometr / skener skenování gelů 82 x 51 mm nebo 82 x 102 mm při 570 nm (žlutý filtr), např. HYRYS SEBIA, GELSCAN SEBIA, DVSE SEBIA nebo PHORESIS software pro plošný skener. Provozní postupy a kalibrace naleznete v pokynech výrobce. 8. Materiály ke kontrole kvality

5 ANALYZOVANÉ VZORKY Odběr vzorků a skladování Přednost má analýza čerstvých sér, odběr musí být proveden lege artis dle ustanovených postupů příslušné laboratoře. Při okamžitém uložení vzorku do chladničky lze skladovat až 1 týden. vzorků Používejte čisté sérum. Zřeďte vzorky séra fyziologickým roztokem pro dosažení celkové aktivity zásadité fosfatasy okolo 600 IU/l. Pokud je aktivita > 600 IU/l, viz poznámka v části "DATA O VÝKONU/linearita". Nepoužívat Nepoužívejte hemolyzované vzorky interferují erytrocytární enzymy. Vzorky obsahující inhibitory ALP jako jsou EDTA, citrát a oxalát rovněž nepoužívat. PRACOVNÍ POSTUP HYDRASYS je multiparametrický, poloautomatizovaný systém. Automatizované kroky zahrnují postupně nanesení vzorku, elektroforetickou migraci, inkubaci se substrátem, odsávání, oplach a osušení gelové plotny. Manipulace se vzorky, gely, vkládání reagencií a nastavení přístroje k uvedení do chodu se provádí ručně. Teplota migračního modulu je řízena na principu peltierova efektu. DODRŽUJTE PEČLIVĚ POKYNY UVEDENÉ V MANUÁLU HYDRASYS / HYDRASYS 2 SYSTÉMU. I. NASTAVENÍ MIGRACE 1. Zapněte HYDRASYS. 2. K aplikaci vzorků séra a roztoku lektinu je nezbytné použít dva aplikátory na každý gel. Umístěte aplikátory dva pro každý HYDRAGEL 7 ISO-PAL (7 zubů pro 3 vzorky) nebo HYDRAGEL 15 ISOPAL (15 zubů pro 7 vzorků) na rovnou plochu, čísly jamek směrem vzhůru (viz Obr. 1). - První aplikátor : naneste 10 µl z každého vzorku séra do 2 sousedních jamek. - Druhý aplikátor : naneste 10 µl roztoku lektinu do každé sudě očíslované jamky. - Každý aplikátor musí být napipetován ve 2 minutách. Do poslední jamky každého aplikátoru lze nanést kontrolní sérum. - Vložte aplikátory do vlhké komůrky zoubky směrem nahoru (při vkládání je uchopte za ochranný plastový rámeček). - Nechejte vzorky difundovat do zoubků po dobu 5 minut po nanesení posledního vzorku. Detaily viz v příbalovém letáku vlhké skladovací komůrky. 3. Otevřete víko migračního modulu a zvedněte migrační rámeček s elektrodami a nosičem aplikátorů nahoru. POZOR : Nikdy nezavírejte víko pokud je migrační rámeček nahoře! 4. Z menu na přístroji zvolte program migrace "7 ISO-PAL" nebo "15 ISO-PAL" dle použitých gelů. 5. Vyjměte z ochranného obalu pufrované stripy uchopením za plastikové konce. Děrovanými konci plastikového vyztužení je upevněte na kovové výstupky elektrodového nosiče. Plastikové vyztužení stripů musí směřovat k nosiči (viz Obr. 2). 6. Vybalte agarózovou plotnu HYDRAGEL. - Plotnu rychle osušte tenkým filtračním papírem tak, že jej po povrchu gelu narolujete, aby přilnul k celé ploše a odsál přebytek tekutiny. Papír ihned odstraňte. POZOR : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu hrozí dehydratace gelu! - Naneste 120 µl destilované nebo deionizované vody při použití HYDRAGEL 7 ISO-PAL nebo 200 µl pro HYDRAGEL 15 ISO-PAL na dolní třetinu rámečku vyznačeného na migrační ploše. - Opřete gelovou plotnu (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku na migrační ploše (viz Obr. 3). - Nyní gel ohněte a pokládejte do kontaktu s kapkou vody tak, aby se voda rozprostřela rovnoměrně pod celým gelem bez vzduchových bublin. Gel musí být zarovnán s vyznačeným rámečkem (viz Obr. 3). 7. Umístěte na gel bílou plastikovou folii : - Vezměte jednu bílou plastikovou folii. - Vyrovnejte horní okraj plastikové folie s horizontální linií vyznačené na gelové plotně. - Uložte folii na povrch gelu tak, aby mezi gelem a folií nezůstaly žádné vzduchové bubliny. POZNÁMKA : Velikost plastové masky je nastavena na šířku gelu. Plastová maska musí být při umisťování perfektně vyrovnaná s vodorovnou linkou vytištěnou na plastové opěrce a vycentrovaná, aby pokrývala celou šířku gelu, abyste zabránili zdeformování. - Jedním prstem přidržte folii na jedné straně a lehce vytlačte vzduchové bubliny z povrchu gelu. - Při této manipulaci nesmíte pohnout gelovou plotnou na migrační desce. POZOR : Bílá plastiková folie musí pokrývat horní část gelu, nesmí ale přesahovat kontaktní zónu mezi gelem a pufrovaným stripem. 8. Snižte migrační rámeček dolů. V této pozici se pufrované stripy nedotýkají gelu. NA MIGRAČNÍ RÁMEČEK NETLAČTE DOLŮ SILOU! 9. Aplikátory nyní vyjměte z vlhké skladovací komůrky. Manipulujte s nimi za pomoci ochranného rámečku. - Odlomte ochranný rámeček chránící zuby aplikátoru. - Aplikátor se vzorky umístěte na nosič aplikátoru do pozice č Aplikátor s lektinem umístěte na nosič do pozice č Osazené aplikátory odsuňte na levou stranu. DŮLEŽITÉ : Čísla vyznačená na aplikátoru musí směřovat k operátorovi (viz Obr. 4). 10. Uzavřete víko migračního modulu. 11. Stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou (levá strana klávesnice) je procedura ihned zahájena. DŮLEŽITÉ : Přesvědčte se, zda není blokován otvor vzduchové ventilace na pravé straně přístroje. MIGRACE POPIS AUTOMATIZOVANÝCH ČINNOSTÍ Všechny části migračního rámečku jsou sníženy stripy s pufrem i aplikátory jsou v kontaktu s povrchem gelu probíhá aplikace vzorků do gelu. Nosič aplikátorů vzorků se zvedne, části s elektrodami nesoucí stripy s pufrem zůstávají v kontaktu s povrchem gelu. Proběhne migrace při konstantních 10 W (HYDRAGEL 7 ISO-PAL) nebo 20 W (HYDRAGEL 15 ISO-PAL) při 35 C a posléze při 30 C až do 80 Vh (pro asi 18 minut). Po zvednutí nosiče elektrod se elektrody odpojí. Ozve se pípnutí a odjistí se víko. Signál trvá do zásahu operátora. Na displeji se objeví blikající zpráva : "e SUBST." / "e SUBSTRATE". POZN. : Víko migračního modulu zůstává uzavřeno během všech migračních kroků

6 II. PŘÍPRAVA INKUBACE SE SUBSTRÁTEM 1. Po ukončení migrace otevřete víko na displeji přestane blikat "e SUBST." / "e SUBSTRATE". 2. Vyjměte aplikátory vzorků a odstraňte je. 3. Zvedněte migrační rámeček a vyjměte jej : - Odstraňte proužky s pufrem. - Pečlivě podélně otřete elektrody měkkým zvlhčeným hadříkem nebo gázou. - Gel ponechejte na místě v migračním modulu. 4. Bílou plastikovou folii uchopte za rožek, vyjměte ji a odstraňte. 5. Připravte reagenční, žlutou aplikační šablonu č. 4 následujícím postupem (viz Obr. 5) : - Umístěte vodič aplikační šablony na ukotvující svorky (může být ponechán). - Podržte šablonu za ouško a vložte ji vruby na značky vodiče. - Přiložte tuto šablonu na gel. 6. Po smíchání chromogenu a substrátu (viz bod 4) ihned aplikujte 2.5 ml roztoku substrátu pro HYDRAGEL 7 ISO-PAL anebo 5 ml roztoku pro HYDRAGEL 15 ISO-PAL dle následujícího schématu (viz Obr. 6) : - Držte vertikálně pipetu. - Lehce vtiskněte její špičku do otvoru v šabloně. - Postupně pečlivě pipetujte substrátovou směs bez napipetování bublin pod šablonou. 7. Uzavřete víko HYDRASYSu. 8. Stisknutím klávesy se zelenou šipkou "START" na levé straně klávesnice proces nastartujete. Na displeji se zobrazí nápis : "[INCUBATION]". INKUBACE POPIS AUTOMATIZOVANÝCH KROKŮ Inkubace při 37 C po dobu 45 minut a při 50 C po dobu 15 minut Zazní pípnutí a víko se odjistí. Signál trvá až do zásahu obsluhy. Na displeji se objeví následující blikající zpráva : "a SUBST. + e PAP." / "a SUBSTRATE, e THICK FILTER PAPER". POZN. : Během inkubace zůstává víko migračního modulu uzamčeno. III. ODSTRANĚNÍ SUBSTRÁTU A APLIKACE FILTR. PAPÍRU 1. Otevřete víko. Zpráva "a SUBST. + e PAP." / "a SUBSTRATE, e THICK FILTER PAPER" přestane blikat. 2. Odstraň zbývající roztok substrátu : - Držte pipetu vertikálně a lehce vtlač její špičku do jamky (viz Obr. 6). - Pečlivě odsajte zreagovanou substrátovou směs. 3. Vyjměte šablonu : - Uchopte šablonu za úchytku. - Šablonu zvedněte a odstraňte. 4. Položte jeden silný filtrační papír na gel : - Filtrační papír držte v úhlu Jeho dolní část zarovnejte s okrajem gelu. - Položte ho na gel. - Jemným tlakem přitiskněte filtrační papír tak, aby přilnul celý k povrchu gelu. 5. Zavřete víko HYDRASYSu. 6. Odsávací procedura se nastartuje po stisknutí tlačítka "START" (zelená šipka na levé straně klávesnice). Na displeji se zobrazí nápis "[BLOTTING]". 7. Opláchněte šablonu destilovanou vodou nebo alkoholem a důkladně osušte savým papírem. Před opakovaným použitím musí být šablona vždy dokonale suchá. ODSÁVÁNÍ POPIS AUTOMATIZOVANÝCH KROKŮ Odsávání při 45 C po dobu 3 minut Do zásahu obsluhy zní pípání. Na displeji se zobrazí nápis "a PAP." / "a THICK FILTER PAPER". POZN. : Během Odsávání zůstává víko migračního modulu uzamčeno. IV. SUŠENÍ GELU 1. Otevřete víko. 2. Odstraňte filtrační papír a gel ponechte na místě. 3. Zavřete víko. 4. Sušení nastartujete stiskem klávesy "START" (zelená šipka vlevo na klávesnici). Na displeji se objeví nápis "[DRYING]". SUŠENÍ POPIS AUTOMATIZOVANÝCH KROKŮ Suší se 2 minuty při 60 C. Zazní pípnutí a víko se odjistí. Teplota plotny zůstává až do otevření 50 C. POZN. : V průběhu sušení zůstává víko migračního modulu zajištěno. V. PROMÝVÁNÍ A KONEČNÉ ZPRACOVÁNÍ GELU 1. Otevřete víko. 2. Vyjměte osušený gel. 3. Vyjměte držák gelu z barvící komory, otevřete jej, umístěte usušenou gelovou plotnu (gelovou stranou dopředu) do žlábků obou jeho tyček a držák uzavřete. Ujistěte se, že plotna je umístěna správně uvnitř držáku (viz Obr. 7). 4. Vložte držák gelu do modulu na zpracování a barvení gelu. DŮLEŽITÉ : Před nastartováním programu pro zpracování a barvení zkontrolujte : - Zda kontejner pro odbarvování obsahuje nejméně 400 ml odbarvovacího roztoku. - Zda kontejner na odpad není plný. Pro připojení přívodů reagencií se řiďte pokyny zobrazovanými na obrazovce přístroje (zvolte klávesu : REAGENT LINES). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte zablokovat nepoužité přívody

7 5. Zvolte mycí program "WASH ISOENZ/GEL" z menu přístroje a nastartujte proceduru stiskem klávesy "START" (zelená šipka na pravé straně klávesnice). POZN. : Během mycích a sušících kroků tato část zůstává zajištěna. Odjištění je signalizováno slyšitelným pípnutím ventilace je udržovaná až do vynětí držáku s gelem. 6. Vyjměte držák s gelem, otevřete jej a vyjměte usušený gel. 7. Je-li třeba, očistěte zadní plastikovou podpůrnou část gelové plotny vlhkým měkkým hadříkem nebo buničinou. Gel je nyní možno vyhodnotit. 8. Umístěte migrační rámeček zpět na své místo. 9. Otřete migrační plochu vlhkým měkkým hadříkem nebo gázou. VI. VYHODNOCENÍ Vizuálně nebo denzitometricky / skenerem žlutým filtrem nebo při 570 nm. VÝSLEDKY Kontrola kvality Doporučuje se postavit ke každé analyzované sérii 7 (nebo 3) vzorků 1 dostupnou komerční kontrolu nebo známý vzorek. Hodnoty Enzymatickou aktivitu každé frakce lze vypočíst z procentuálních hodnot zjištěných denzitometricky a z celkové aktivity ALP. Z proužku s lektinem lze určit izoenzymy L1-jaterní a P1 placentární. Z proužku s lektinem lze určit izoenzymy L1-jaterní a P1 placentární. Hodnotu kostní frakce obdržíme po odečtení denzitometrických hodnot L1 a P1 frakcí z lektinového proužku od bloku L1 + B (+ P1) v proužku bez lektinu. Všechny ostatní frakce L2, I1, I2, I3, P2 a lipo-iso-pal komplex jsou určeny ve stopě bez lektinu. Normální hodnoty Fyziologicky - závisí na věku, pohlaví, těhotenství, menopauze, pubertě a lécích. U dospělých ve věku let jsou hodnoty podobné. S věkem populace má celková ALP zvyšující tendenci díky fyziologickým faktorům. U dětí je celková ALP vyšší - dominantní je kostní izoenzym. Normální hodnoty pro jednotlivé hlavní elektroforetické zóny ALP na gelech HYDRAGEL ISO-PAL byly stanoveny na zdravé populaci 100 dospělých (50 mužů a 50 žen ve věku mezi lety) a 50ti dětí (2-18 let) : ŽENY MUŽI DĚTI % IU/L % IU/L % IU/L *Celková ALP L B L I1, I2, I3 Chybí u 60 % normálních subjektů, pokud přítomny nepřesáhnou 14 % *Celková ALP byla stanovena při 37 C v AMP pufru. Doporučuje se, aby každá laboratoř stanovila své vlastní normální hodnoty. Výše uvedené hodnoty aktivity (IU/L) reprezentují maximální normální hodnoty. Normální celková aktivity ALP závisí na použité teplotě a proceduře k jejímu stanovení (kity a laboratorní podmínky se mohou lišit). Aktivita frakcí musí vycházet z celkové aktivity s specifikace podmínek použité metody. Interpretace K interpretaci výsledků elektroforetických dělení séra je třeba znát celkovou aktivitu ALP, pohlaví a věk pacienta. Všechny frakce, které obsahují sialylové zbytky jsou zpomaleny ve stopě s aplikovaným lektinem ve srovnání se stopou bez lektinu. Jen střevní frakce, které neobsahují sialylové zbytky, nejsou ovlivněny lektinem. Ve stopě s lektinem obvykle vytváří kostní frakce otrou, soustředěnou frakci těsně u bodu aplikace. Často lze taktéž pozorovat její rozštěpení (stín) anodickým směrem. Tento fenomén je obecně důsledkem překročení vazebné kapacity lektinu a následně neúplné precipitace, např. pokud je kostní izoenzym silně zvýšený např. při rakovině kostí nebo při aktivním kostním metabolizmu. V žádném případě toto rozštěpení (stín) nezasáhne migrační pozice L1 nebo P1 frakce, takže tyto dvě frakce mohou být denzitometricky přesně stanoveny z proužku s pektinem, viz. elektroforeogram v závěru tohoto návodu. Viz elektroforeogram v závěru tohoto návodu. 1. Normální sérum Jaterní (L1) a kostní (B) izoenzym jsou dvě obvykle se vyskytující frakce u zdravé populace. Na gelech HYDRAGEL 7/15 ISO-PAL ve stopě bez lektinu se po migraci překrývají, ve stopě s lektinem dojde k jejich oddělení. V normálním séru může být taktéž pozorován jeden až tři intestinální (střevní) izoenzymy ALP. Pokud je hladina celkové ALP v referenčních mezích, není přítomnost střevních frakcí známkou žádné patologie. Častější výskyt střevních izoenzymů lze pozorovat u osob s krevními skupinami O a B a u těch, kteří před odběrem krve nedodrží lačnění

8 2. Zvláštní případy Jaterní izoenzymy Existují dva jaterní izoenzymy L1 a L2. Významnější L1 frakce je umístěna blíže k anodě. Ke zvýšení dochází u cholestázy, cirhózy, virové hepatitidy a u dalších biliárních a hepatálních patologických stavů. Ke zvýšení dochází rovněž u malignit s jaterními metastázami, u tumorů plic, zažívacího traktu a u lymfomu. Frakce L2 (makrohepatická nebo rychlá) existuje u zdravých v malém množství (< 8 IU/L). Zvýšení L2 může způsobovat cholestáza, biliární onemocnění (cirhóza, virová hepatitida), malignity (Ca prsu, jater, plic, prostaty, GIT) s jaterními metastázami. Na gelech HYDRAGEL 7/15 ISO-PAL izoenzym L2 migruje mezi (L1 + B) a intestinálními frakcemi. Kostní izoenzym Tento významný izoenzym je přítomen ve všech vzorcích. Při interpretaci je nutno vzít v úvahu věk. K jeho zvýšení může dojít : u malignit jako je Ca prsu s jaterními a kostními metastázami, stejně jako u osteosarkomu a lymfomu i bez metastáz. hyperparathyreodismus, revmatické choroby, rachitis a Pagetova nemoc. přechodná hyperfosfatázemie v dětství je sdružena se zvláštní jaterní frakcí, která migruje blíže k anodě než L1. Celková ALP je extrémně zvýšena (> 2000 IU/L). Pokud je navíc dále doprovázená zvýšením dalších frakcí (např. L1, L2), může indikovat malignitu tlustého střeva, plic a prostatu (s metastázou kostí a jater). Intestinální isoenzymy Pohyblivost střevních izoenzymů je stejná v obou stopách. Vyskytují se jako 1, 2, a 3 frakce. U 40 % zdravých osob intestinální frakce chybí. Zvýšená aktivita může být pozorována u některých onemocnění jako je jaterní cirhóza, diabetes a chronické renální poruchy. Placentární izoenzymy Vždy 2 formy izoenzymů větší P1 (90 %), menší P2 (10 %). Fyziologicky se nachází v těhotenství. Jinak je lze pozorovat u některých malignit - Ca vaječníků, sarkomy, Ca pankreatu a žaludku. Zvýšení může být pozorováno u těžkých kuřáků (způsobeno poškozením plic). Komplex imunoglobulinů nebo makro-alp Tato frakce se nachází vzácně. Je to komplex s imunoglobulinem nachází se těsně za bodem aplikace v obou stopách. ALP-LP komplex Jedná se o komplex lipoproteinu a L2 jaterního izoenzymu ALP. Tato frakce se nachází se těsně za bodem aplikace v obou stopách. Může se vyskytovat u biliárního onemocnění s obstrukcí. Atypické izoenzymy Izoenzymy s atypickou migrací jako např. Nagao, Regan a Kasahara, jejich identifikace je obtížná. Omezení Viz čl. ANALYZOVANÉ VZORKY. Nebyla detekována žádná interference s HYDRAGEL ISO-PAL procedurou u vzorků s vysokou koncentrací cholesterolu ( 360 mg/dl), triglyceridů ( 1560 mg/dl) a bilirubinu ( 10 mg/dl). POZN. : Na elektroforéze je žluté zbarvení ikterických vzorků způsobené bilirubinem přítomné ve dvou frakcích. Jedno, které ko-migruje s albuminem (např. je o 10 mm rychlejší než L1 izoenzym) a druhá forma se nachází jako difúzní frakce na úrovni L2. Žluté zbarvení je virtuálně eliminováno při blottingu a promývacíh krocích vizualizační procedury. Zbytkový bilirubin neinterferuje při skenování žlutým filtrem o 570 nm. Problémy Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte Technicko- Servisní středisko vašeho dodavatele. Soupravy, reagencie, bezpečnostní listy a informace o likvidaci odpadu jsou dostupné na Technicko-Servisním středisku vašeho dodavatele. HODNOTY HYRYS Denzitometr HYRYS fy SEBIA byl použit pro denzitometrická hodnocení. Reprodukovatelnost na gelu Tř různé vzorky séra (A, B a C) byly analyzovány elektroforézou na HYDRAGEL 15 ISO-PAL gelech stejné šarže. Vzorek A bylo normální sérum, B - sérum s intestinálními frakcemi I1 a I2 a vzorek C - sérum se zvýšenými frakcemi L1 a L2. Každý vzorek byl testován na všech drahách jednoho gelu. Elektroforeogramy byly hodnoceny denzitometricky. Následující tabulka ukazuje průměry, SD a CV pro každou AP frakci všech tří vzorků každého gelu. PARAMETR % L1 % B % L2 % I1 % I2 % I3 Vzorek A PRŮMĚR % / / / SD / / / CV % / / / Vzorek B PRŮMĚR % SD CV % Vzorek C PRŮMĚR % / / / SD / / / CV % / / /

9 Reprodukovatelnost mezi gely Sedm (7) různých vzorků séra bylo podrobeno testům každý na 10ti gelech HYDRAGEL 15 ISO-PAL stejné šarže. Průměr, SD a CV (n = 10) byly kalkulovány pro každý vzorek a každou AP frakci. Výsledky byly obecně stejné pro všechny vzorky. Následující tabulka ukazuje rozsahy SD a CV reprezentující všechny vzorky a průměrné CV vypočítané ze směsného CV pro všechny vzorky. FRAKCE SD CV % PRŮMĚR CV % L P B L P I I I Přesnost Srovnávací studie Šedesát (60) různých vzorků séra (normálních i patologických) bylo analyzováno pomocí HYDRAGEL 15 ISO-PAL soupravy fy SEBIA a jiného, komerčně dostupného elektroforetického systému pro stanovení izoenzymů ALP. Hodnoty stanovené na obou systémech byly srovnatelné. Výsledky lineární regresní analýzy denzitometrických hodnot L1, B a L2 frakcí (n = 60) jsou vyneseny v následné tabulce (y = hodnoty SEBIA). Parametr Korelační koef. y - úsek Sklon Rozsah IU/L hodnot (na SEBIA systému) L1 frakce B frakce L2 frakce Citlivost Jeden sérový vzorek s I1, I2 a I3 frakcemi a jiný s P1 a P2 frakcema byly následně ředěny a tato ředění byla elektroforeticky analyzována na HYDRAGEL 15 ISO-PAL gelu. Nejnižší detekovaná aktivita jednotlivých denzitometricky stanovených izoenzymů byla v rozmezí od 2 do 3 IU/L. Linearita Byly použity dva vzorky : č. 1 obsahující L1 a L2 (celková AP 1000 IU/L) a č. 2 obsahující L1 a B (celková AP 600 IU/L). Následná ředění v rozsahu IU/L a IU/L, byla analyzována na HYDRAGEL 15 ISO-PAL gelech. Systém byl lineární v požadovaném rozsahu studie. POZN. : Maximální hodnota zúženého rozsahu studie linearity (600 IU/L) byla vzata jako přibližná cílová hodnota pro ředění vzorků s vysokou celkovou aktivitou AP. GELSCAN Pro veškerá denzitometrická měření byl použit Denzitometr GELSCAN SEBIA. Tyto výsledky byly získány snímáním denzitometrem GELSCAN na gelech HYDRAGEL 7 ISO-PAL a HYDRAGEL 15 ISO-PAL postupy prováděnými na systému HYDRASYS. Ukázala se velmi dobrá reprodukovatelnost kvantitativního rozboru pomocí GELSCANu jak v rámci jednoho použitého gelu tak mezi různými gely s variačním koeficientem okolo 3,6 % pro každou frakci zásaditého isoenzymu fosfatázy. Reprodukovatelnost na gelu Na zařízení HYDRASYS byly postupy HYDRAGEL 7 a 15 ISO-PAL analyzovány tři (3) různé vzorky sér a byly snímány pomocí denzitometru GELSCAN. Každý vzorek měl analyzovány všechny stopy každého gelu. Pro každý vzorek a gel byl spočítán průměr, směrodatná odchylka a variační koeficient (n = 3 nebo 7 v závislosti na postupu) Následující tabulka ukazuje hodnoty tří testovaných vzorků pro každou sledovanou frakci zásaditého isoenzymu fosfatázy vypočítané 2 postupy provedenými na zařízení HYDRASYS a po denzitometrickém snímání pomocí GELSCANu. FRAKCE L1 L2 I1 I2 I3 B Vzorek séra č. 1 : HYDRAGEL 7-15 ISO-PAL PRŮMĚR (%) / / SD / / CV (%) / / Vzorek séra č. 2 : HYDRAGEL 7-15 ISO-PAL PRŮMĚR (%) SD CV (%) Vzorek séra č. 3 : HYDRAGEL 7-15 ISO-PAL PRŮMĚR (%) SD CV (%)

10 Reprodukovatelnost mezi jednotlivými snímáními bez posunování gelu na držáku na GELSCANu Reprodukovatelnost byla stanovena analýzou jednoho vzorku séra postupem HYDRAGEL 15 ISO-PAL (14 analýz na gel, s a bez lektinu) na zařízení HYDRASYS se šesti následujícími denzitometrickými snímáními GELSCANem bez posunování gelu v jeho držáku. Pro každý rozbor tohoto vzorku séra a každou zónu byl ze šesti snímání spočítán průměr, směrodatná odchylka a variační koeficient. Tabulka ukazuje limitní hodnoty pro sledované vzorky společně s průměrným variačním koeficientem určeným z každé sledované frakce zásaditého isoenzymu fosfatázy (n = 7). FRAKCE PRŮMĚR (%) SD CV (%) PRŮMĚR CV (%) L L I B Reprodukovatelnost mezi jednotlivými snímáními po přenastavení gelu v držáku na GELSCANu Reprodukovatelnost byla stanovena analýzou jednoho vzorku séra postupem HYDRAGEL 15 ISO-PAL (14 analýz na gel, s a bez lektinu) na zařízení HYDRASYS se šesti následujícími denzitometrickými snímáními GELSCANem po přenastavení gelu v jeho držáku. Pro každý rozbor tohoto vzorku séra a každou zónu byl ze šesti snímání spočítán průměr, směrodatná odchylka a variační koeficient. Tabulka ukazuje limitní hodnoty pro sledované vzorky společně s průměrným variačním koeficientem určeným z každé sledované frakce zásaditého isoenzymu fosfatázy (n = 7). FRAKCE PRŮMĚR (%) SD CV (%) PRŮMĚR CV (%) L L I B Přesnost Srovnávací studie Rozbor 48 různých patologických a normálních vzorků sér pomocí elektroforézy na agarózovém gelu a postupy HYDRAGEL 7 a 15 ISO-PAL na systému HYDRASYS se snímáním pomocí denzitometru GELSCAN nebo HYRYS ukázal dobrou shodu mezi oběma kvantifikačními systémy pro různé L1 + P1, L2, I1, P2, I2, I3 a kostní frakce zasaditého isoenzymu fosfatázy. Korelační parametry pro jednotlivé zóny vypočítané ze směsných hodnot pro gely HYDRAGEL 7 a 15 ISO-PAL a GELSCAN vs. srovnávací systém (y = HYDRAGEL 7 a 15 ISO-PAL a GELSCAN) byly : Frakce Korelační koeficient y-úsek Sklon Rozsah hodnot (%) HYDRAGEL 7 & 15 ISO-PAL (GELSCAN) L1 + P L I P I I B Linearita Byly použity dva vzorky : Č. 1 obsahoval L1 a L2 (celkem AP 1000 UI/l) ; č. 2 obsahoval L1 a L2 (celkem AP 600 UI/L). Na gelech HYDRAGEL 15 ISO-PAL byly analyzovány postupně ředěné vzorky v rozsahu UI/L a UI/L. Systém byl lineární v celém studovaném rozsahu. Citlivost Jeden vzorek séra s frakcemi I1, I2 a I3 a další s frakcemi P1 a P2 byly postupně zředěny a zředěné vzorky byly elektroforeticky analyzovány na gelu HYDRAGEL 15 ISO-PAL. Nejnižší denzitometricky detekovaná aktivita jednotlivých isoenzymů se pohybovala od 1 do 4 UI/L

11 ELEKTROFOREOGRAM + L1 Bone { L1 P1 P1 L2 L2 I1 P2 I2 I3 I1 P2 I2 I3 WITHOUT lectin _ WITH lectin Bone lipo-alp complex at application point

12 BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. Bayer PM. Intestinal alkaline phosphatase and the ABO blood group system. A new aspect. Clin. Chem. Acta, 1980, 108, Farley J et al. Skeletal alkaline phosphatase activity in serum. Clin. Chem., 1995, 41, Faure G et al. Les phosphatases alcalines : aspect génétique, identification et interprétation clinique. Ann. Biol. Clin., 1990, 48, Fishman WH. Alkaline phosphatase isoenzymes : Recent progress. Clin. Biochem., 1990, 23, Foucault P. Interêt de l étude des phosphatases alcalines totales et de l isoenzyme osseuse dans une population de sujets atteints d ostéoporose. Ann. Biol. Clin., 1991, 49, Kuwana T et al. Reference limits of bone and liver alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of healthy subjects according to age and sex as determined by wheat germ lectin affinity electrophoresis. Clin. Chem. Acta, 1988, 173, Mc Kenna MJ, Hamilton TA, Sussman HH. Comparison of human alkaline phosphatase isoenzymes. Structural evidence for three protein classes. Biochem. J., 1979, 181, Moss DW. Alkaline phosphatase isoenzymes. Clin. Chem., 1982, 28, Moss DW. Diagnostical aspects of alkaline phosphatase and its isoenzymes. Clin. Biochem., 1987, 20, Piva MT. Détection de métastases hépatiques d un cancer digestif. Interêt des phosphatases alcalines, de leur isoenzyme macromoléculaire et de la ceruléoplasmine. Ann. Biol. Clin., 1997, 55, Rosalki SB et al. Lectin affinity electrophoresis of alkaline phosphatase for the differentiation of bone and hepatobiliary disease. Electrophoresis, 1989, 10, Saheki S et al. Intestinal type alkaline phosphatase hyperphosphatasemia associated with liver cirrhosis. Clin. Chem. Acta, 1992, 210, Schiele F, Henny J, Hitz S, PetitClerc C, Gueguen R, Siest G. Total bone and liver alkaline phosphatases in plasma : biological variation and reference limits. Clin. Chem., 1983, 23, Van Hoof VO, Lepoutre LG, Hoylaerts MF, Chevigne R, De Broe ME. Improved agarose electrophoretic method for separating alkaline phosphatase isoenzymes in serum. Clin. Chem., 1988, 34, Van Hoof VO and Van Mullen M. Comparison of two commercially available systems for the electrophoretic separation of alkaline phosphatase isoenzymes. J. Chrom., 1993, 646, Van Hoof VO et al. Interpretation and clinical significance of alkaline phosphatase isoenzyme patterns. Clinical Lab. Sci., 1994, vol 31, issue Van Hoof VO. Alkaline phosphatase isoenzyme patterns in malignant disease. Clin. Chem., 1992, 38, Vergote I. Placental alkaline phosphatase as a tumor marker in ovarian cancer. Obstet-Gynecol., 1987, 69, Woitge MW et al. Comparison of total and bone-specific alkaline phosphatase in patients with non skeletal disordey or metabolic bone diseases. Clin. Chem., 1996, 42, Wolf P. Clinical significance of serum high molecular mass, alkaline phosphatase, alkaline phosphatase lipoprotein X complex and intestinal variant alkaline phosphatase. J. Clin. Lab. Anal., 1994, 8, Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage, sensibilité, spécificité. Impact- Internat, 1986, Sept :

13 SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure Figure 3 Figure sebia Figure 5 Figure

14 sebia sebia sebia sebia HYDRAGEL 7 & 15 ISO-PAL /10 SCHÉMAS / FIGURES Figure 7 HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/ HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/ HYDRAGEL 7 PROTEIN(E) HYDRAGEL 7 PROTEIN(E)