Každý agarózový gel v kitu HYDRAGEL Lp(a) je uren k analýze 14 vzork.

Transkript

1 kitu HYDRAGEL Lp(a) kit je uren ke kvantitativnímu stanovení lipoproteinu Lp(a) elektroimunodifuzí na slab alkalicky pufrovaných agarózových gelech o ph 7.6. Gely obsahují anti-apo(a) monospecifické protilátky. Po migraci jsou výsledné raketky obarveny kyselou violetí. Pebytek barviky je odstrann smsí kyseliny a alkoholu. Kalibraní kivka je sestrojena na podklad hodnot Lp(a), získaných zmením standard sér se známou koncentrací Lp(a). Výšky raketek pacient poskytují sérové hladiny Lp(a). Každý agarózový gel v kitu HYDRAGEL Lp(a) je uren k analýze 14 vzork. Ureno pro diagnostické použití in vitro! PRINCIP TESTU Lp(a) je plazmatický lipoprotein svými fyzikáln-chemickými a funkními vlastnostmi podobný LDL. Liší se však proteinovou složkou. Je to apo B100 spojený pomocí disulfidických mstk se specifickým glykoproteinem apo(a). Tento zvláštní antigen pedstavuje dležitou strukturální homologii s plazminogenem (týkající se domény Kringle IV). Proto Lp(a) mže soutžit s plazminogenem o vazbu na fibrin). Úastní se vzniku trombózy i aterosklerózy. Mnoho studií dokazuje jeho ddiný penos a rovnž heterogenitu ve velikosti. V souasné dob je známo šest hlavních fenotyp. Jednoznaný vztah mezi fenotypy a aterogenním rizikem nebyl prokázán. Koncentrace Lp(a) nad 0.3 g/l je dnes považována za další nezávislý rizikový faktor vzniku aterosklerózy. Kvantitativní stanovení Lp(a) by tudíž mlo být bráno v úvahu pro jeho prediktivní hodnotu. Vývoj specifické protilátky proti bílkovinné ásti Lp(a) bez zkížené reaktivity s LDL a plazminogenem vedl ke znanému zdokonalení tohoto jednoduchého stanovení pomocí elektroimunodifúze. Pozn.: LDL : Low Density Lipoprotein. REAGENCIE A MATERIÁL OBSAŽENÝ V KITU HYDRAGEL Lp(a) POLOŽKY kat..: 4057 Agarózové gely (pipraveny k použití) 5 gel TGM pufr (zásobní roztok) 2 lahv. po 100 ml Roztok kyselé violeti (zásobní roztok) 1 lahv., 75 ml Odbarvovací roztok (zásobní roztok) 1 lahv., 100 ml Sérový standard ( sušený mrazem) 5 lahv. Filtraní papíry - tenké 1 bal., 10 ks Filtraní papíry - tlusté 2 bal. po 10 ks Pro optimální provedení používejte všechny reagencie pouze z jediné soupravy a dle instrukcí uvedených v píbalovém letáku. PROSÍME, TTE PELIV PÍBALOVÝ LETÁK.

2 1. AGARÓZOVÉ GELY* Pipraveny k použití, každý gel obsahuje agarózu 0.9 g/dl, alkalický pufr o ph 7.6 ± 0.1 a pídavné látky nezbytn nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro lovka neškodných. Nosné medium pro elektroimunodifúzi. Skladování, stabilita a známky poškození Skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech šipkou na pední stran krabice smrem nahoru. Skladujte v chladnice (2 8 C). Zamezit prudkým zmnám teploty neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. Stabilní do doby expirace vyznaené na krabici i štítcích na obalech gel. NEMRAZIT! Nepoužívejte : (i) v pípad nálezu krystal nebo precipitát na povrchu gel a pokud struktura gelu v dsledku zmrazení zmkne, (ii) jsou-li pítomny mikroby a plísn, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v dsledku nesprávného skladování). 2. TGM PUFR Každá lahvika zásobního pufru je urena k naední do 1 litru destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po naední vzniklý pracovní roztok obsahuje : Tris glycin MES (Morpholino Ethane Sulfonate) pufr o ph 7.8 ± 0.3, azid sodný a pídavné látky nezbytn nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro lovka neškodných. Pufr na elektroforézu. Skladování, stabilita a známky poškození Skladovat pi pokojové teplot nebo v chladnice. Zásobní roztok je stabilní nkolik let, nejmén do data expirace vyznaeného na balení kitu i na štítcích jednotlivých lahviek. Zedný roztok je stabilní jeden rok v uzavené láhvi pi pokojové teplot. Nepoužívejte naedný pufr pi zmn jeho vzhledu, nap. vzniku zákalu v dsledku mikrobiální kontaminace. 3. KYSELÁ VIOLE Obsah lahviky se zásobním roztokem kyselé violeti doplte do 300 ml destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po rozední pracovní barvící roztok obsahuje kyselý roztok ph 2, kyselou viole, 0.2 g/dl, 3.25% etylen glykol a pídavné látky nezbytné pro optimální provedení testu, v koncentracích, které neškodí zdraví. Pozor! Nepolykat, zdraví škodlivé!

3 K barvení gel po elektroimunodifúzi. Skladování, stabilita a známky zhoršení kvality Zásobní i pracovní roztok se skladuje pi pokojové teplot nebo pi 2-8 C v tsn uzavených nádobách tak, aby nedošlo k odpaování. Zásobní roztok je stabilní do data expirace vyznaeného na obalu i na štítku lahviky. Pracovní roztok vydrží 6 msíc. 4. ODBARVOVACÍ ROZTOK Každá lahvika zásobního roztoku se edí do 5 litr destilovanou nebo deionizovanou vodou. Je praktické pipravit ední 1/50 malého množství zásobního roztoku, nap. zedit 20 ml zásobního roztoku do 1 litru. Po zední vznikne odbarvovací roztok, obsahující 1.0g/dl kyseliny citrónové. Nejmén 15 minut ped použitím pipravte následující roztok (obj. / obj.): 50% etanolu, 50% odbarvovacího roztoku. Lze rovnž použít 90 % etanol, v tomto pípad je nutno upravit objemy. K odbarvení, tj. odstranní pebytené barviky a k projasnní pozadí gel. Skladování, stabilita a známky znehodnocení Zásobní odbarvovací roztok se skladuje pi pokojové teplot nebo v lednice (2-8 C). Je stabilní do doby expirace vyznaené na obalu soupravy nebo pímo na štítcích lahviek s odbarvovacím roztokem. Zedný roztok v uzavené láhvi je stabilní pi pokojové teplot po dobu jednoho msíce. Nepidávejte azid sodný! Nepoužívat pi zmn vzhledu, vzniku zákalu nebo precipitátu v roztoku. K zabránní mikrobiálního rstu v pracovním roztoku skladovaném déle než 1 týden lze pidat 5 µl/dl ProClin 300. Pracovní odbarvovací roztok s pídavkem ProClinu je stabilní v uzavené nádob do doby expirace vyznaené na obalu soupravy nebo na štítku lahviky. 5. SÉROVÝ STANDARD* Standardní sérum Lp(a) je vyrobeno ze smsi lidských sér, je stabilizováno speciálním postupem a vysušeno zmrazením. POZOR: Sérum bylo testováno na nepítomnost vir HIV, hepatitidy B a C i dalších infekních látek. K prevenci nákazy je však nutno dodržet obvyklá bezpenostní opatení. Lahviku lyofilizovaného séra naete 0.5 ml destilované vody. Ponechejte 30 minut stát pi pokojové teplot (15-30 C). Jemn promíchejte tak, aby nedošlo ke vzniku pny. Standard naete podle následujícího schématu a promíchejte na Vortexu.

4 Ke kalibraci. Body Fyziol. roztok Standard koncentrace l 20 l Standard x l 50 l Standard x l 100 l Standard x l 200 l Standard x 1 Skladování, stabilita a známky znehodnocení Skladujte lyofilizovaný sérový standard v chladnice (2-8 C). Stabilní do data expirace vyznaeného na obalu kitu a štítcích lahviek. Naedný standard lze v chladnice skladovat až 5 dní. Kalibraní roztoky lze skladovat v chladnice 1 den. 6. TENKÉ FILTRANÍ PAPÍRY Proužky tenkého filtraního papíru, na jedno použití. Jsou ureny k odsátí pebytené tekutiny z povrchu gelu ped aplikací vzork. Skladování Skladujte na suchém míst pi pokojové teplot nebo v chladnice. 7. TLUSTÉ FILTRANÍ PAPÍRY K odsátí nezprecipitovaných protein z gelu. Skladování Skladujte na suchém míst pi pokojové teplot nebo v chladnice. * POZN.: Bhem transportu gely a sérový standard vydrží pi teplot C až 15 dní bez nepíznivých efekt na provedení testu. DALŠÍ POTEBNÉ REAGENCIE (nejsou souástí setu) 1. ISTÝ ETANOL 2. FYZIOLOGICKÝ ROZTOK Pipravte 0.15 M (0.9 g/dl) roztok NaCl v destilované nebo v deionizované vod. Používá se k ední vzork. Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku Vydrží asi 3 msíce v tsn uzavených láhvích pi pokojové teplot. Pi zmn vzhledu,

5 tj. výskytu zákalu zpsobeného mikrobiální kontaminací, odstrate. Pro delší skladování pidejte azid sodný, 0.1g/dl. ZAÍZENÍ NEZBYTNÁ K PROVEDENÍ TESTU 1. Zdroj proudu : GD 61 D SEBIA, kat , GD 251 D SEBIA, kat , MG 300 SEBIA, kat nebo MG 500 SEBIA, kat Elektroforetická komora, K20 SEBIA, kat Nádobky a držáky gel pro manipulaci s nimi HYDRAGEL ACCESSORY KIT SEBIA, kat Pipety 5 µl, 20 µl, 100 µl a 200 µl. 5. Sušika inkubátor, IS 80 SEBIA, kat EID skenovací systém (pro raketky) SEBIA, kat ANALYZOVANÉ VZORKY Odbr a skladování vzork Nejlepších výsledk se dosahuje analýzou erstvých vzork v pípad nutnosti lze po dobu jednoho týdne skladovat v chladnice. Mražené vzorky jsou stabilní nejmén 1 msíc. vzork Používejte needná séra PRACOVNÍ POSTUP I. MIGRACE 1. Z obalu vyjmte gel. Je výhodné jej položit po vybalení na svou zavenou krabiku. 2. Naneste 5 µl needného vzorku nebo naedného standardu do každé jamky. Ped každou aplikací vymte / otete špiku pipety. Do první a poslední jamky neaplikujte ani vzorky, ani standardy vyhnete se tzv. okrajovému efektu. Tyto jamky naplte 5 µl fyziologického roztoku. 3. Ponechejte vzorky 20 minut difundovat do gelu. 4. Pi použití migraní komory SEBIA K20, vložte HYDRAGEL do zub mstku, gelovou stranou smrem dol; mstek musí být pi tom mimo komoru pro zabránní vniknutí pufru do jamek. Potom mstek i s gelem umístte peliv do komory vzorky na katodické stran. Gel se ponoí do pufru asi 1 cm hluboko na každé stran. Další detaily viz v píbalovém letáku komrky K Komrku nyní pipojte ke zdroji proudu. PODMÍNKY DLENÍ Objem pufru ke každé elektrod Celkový objem pufru Doba dlení Konstantní naptí Poátení proud (na gel) SEBIA K ml 300 ml 4 hodiny 50 V 18 ± 3 ma

6 6. Po migraci komoru odpojte a gelovou plotnu vyjmte a položte na rovnou plochu. II. ODSTRANNÍ ZBÝVAJÍCÍCH BÍLKOVIN 1. Jeden tenký filtraní papír se vsáknutým fyziologickým roztokem položte na gel. Pidejte dv vrstvy tlustého filtraního papíru a na vrchol umístte na 20 minut závaží o hmotnosti kg. Závaží musí psobit rovnomrn. Pokud je zpracováváno nkolik gel najednou, mohou se nakupit na sebe a na vrchol se položí závaží. 2. Odstrate filtraní papíry. Gely oplachujte ve fyziologickém roztoku 60 minut ve svislé poloze. 3. Nyní na gel položte opt jeden tenký filtraní papír namoený pedtím do fyziologickéroztoku. Pidejte 2 vrstvy tlustého filtraního papíru a na vrchol takto vzniklé hromádky položte na 10 minut kg závaží. 4. Odstrate filtraní papíry a gel dokonale osušte v sušice-inkubátoru pi 80 C. III. BARVENÍ A ODBARVOVÁNÍ 1. Usušený a ochlazený gel ponote ve svislé poloze na 5 minut do barvícího roztoku. 2. Odbarvte ve tech po sob následujících lázních s odbarvovacím roztokem, dokud není pozadí zcela bezbarvé a prhledné. 3. Odsajte pebytenou tekutinu z povrchu gelu tenkým papírem a osušte gel proudem 80 C teplého vzduchu. Je-li teba, oistte zadní plastikovou podprnou ást gelové plotny vlhkým mkkým hadíkem nebo buniinou. IV. ODETENÍ 1. Zmte raketky 2. Sestrojte kalibraní kivku s vyznaením koncentrací standardu Lp(a) na ose X a odpovídajících výšek raketek na ose Y. VÝSLEDKY Kontrola kvality Doporuuje se zaadit za každou sérii vzork kontrolní sérum LIPO + Lp(a) Control SEBIA, kat Hodnoty Zmte výšky raketek vzork a naneste je na osu Y kalibraní kivky. Pímo odette koncentrace Lp(a). Fyziologické hodnoty: 0.03 g/dl. Interpretace U jedinc s normálními hladinami lipid jsou plazmatické koncentrace Lp(a) vyšší než 0.3 g/l považovány za dležitý rizikový faktor ateriosklerózy. Pokud hladiny Lp(a) dosáhnou 0.5 g/l, zvyšuje se riziko ischemické choroby srdení 2.5 krát.

7 Problémy Pokud testy nevycházejí pi dodržení veškerých instrukcí pro pípravu, skladování a provedení testu uvedených v píbalovém letáku, volejte technicko-servisní stedisko vašeho dodavatele. Soupravy, reagencie, bezpenostní listy a informace o likvidaci odpadu jsou dostupné na technicko-servisním stedisku vašeho dodavatele. LITERATURA