Proč jsme zavedli cytometrické vyšetření uzlin. Tomáš Zajíc Oddělení klinické mikrobiologie a imunologie KNL a.s.

Transkript

1 Proč jsme zavedli cytometrické vyšetření uzlin Tomáš Zajíc Oddělení klinické mikrobiologie a imunologie KNL a.s.

2 Proč jsme zavedli cytometrické vyšetření uzlin? Protože nás o to požádali patologové

3 Limitace patologie Na základě morfologie lze jen obtížně určit typ lymfomu (či lymfom vůbec) Imunohistochemie používá jednu protilátku Velmi omezené použití Kappa/Lambda protilátek u parafínových preparátů Obtížné hodnocení změny exprese antigenů

4 CLL HE zmražený (10x) HE parafín (10x)

5 FL HE 10x, a CD10 10x

6 Východiska naší laboratoře Malá laboratoř průtokové cytometrie Cytometr FC laser, 5 fluorescenčních kanálů Standardně prováděné vyšetření základní imunofenotypizace periferní krve (BAL, fagocytosa, FMH) Bez zkušeností s hematoonkologickými diagnosami jak v FCM obraze, tak v interpretaci Ekonomické omezení Ochota a chuť takové vyšetření provádět, pokud bude přínosem s vědomím veškerých limitací

7 Dohoda o vyšetření pro potřeby patologie První prohlédnutí Původně jen Kappa Lambda CD19 CD5 CD45 a protilátky ze základní imunofenotypizace, později ClearLLab Vyšetření orientační vzhledem k použitým protilátkám Popis cytometrického obrazu bez podrobnější interpretace Vyšetření částečně duplicitní Vyšetření, které by jinak nebylo Sporné nálezy odeslat ke druhému čtení Přínos posoudí zejména patologové Limity cytometrického vyšetření uzliny Viabilita buněk Převedení buněk do suspenze fibrosní složka Možné odchylky při ložiskovém nálezu Spektrum antigenů U nás hlavně B NHL orientačně, T lymfomy omezeně, m.hodgkin 0, ev. jiné nálezy jen orientačně Interpretace nálezu

8 Předchozí standardní vyšetření uzliny Indikace k extirpaci Provedení extirpace, fixace vzorku a transport na patologii Patologie dokončení fixace a zalití do parafínu Základní barvení HE, následně další (imuno, BK, ) Při susp. nálezu lymfomu vždy druhé čtení (FNM)

9 Současné standardní vyšetření uzliny Indikace k extirpaci Provedení extirpace, odeslání nativního materiálu na patologii Patologie makroskopické posouzení uzliny, část k fixaci, část na cryostat, část k FCM Na základě HE obarveného zmraženého vzorku indikace k dalšímu barvení Definitivní odečítání (ev. doplnění dalších vyšetření) na základě fixovaného vzorku Telefonická konzultace nálezu patologie a cytometru Při susp. nálezu lymfomu nebo nejasném nálezu na FCM vždy druhé čtení (FNM)

10 Zpracování uzliny Mechanická homogenizace pomocí pinzety Filtrace (50µm) Promytí v PBS +2%FBS (1x) Barvení viability (CD45, PI) + počítací kuličky Úprava kvantity buněk, zamražení části vzorku Zamražovací medium: RPMI 1640, 2% FBS, 10% DMSO Zamražení při 80 st.c Barvení ClearLLab (+ další) pouze povrchové Fixace a lýza ery a promytí Měření na cytometru

11 ClearLLab FITC, PE, ECD, PC5.5, PC7 B1 Kappa, Lambda, CD19, CD5, CD45 B2 CD20, CD10, CD19, CD38, CD45 T1 CD2, CD56, CD7, CD5, CD45 T2 CD8, CD4,, CD3, CD45 M CD7, CD13, CD34, CD33, CD45 Další antigeny (CD14, CD16, CD23, )

12 Možnosti kontroly kvality ClearLLab nelze FMO, kompenzace Kalibrační kuličky Isotypové kontroly a blank Kontrolní vzorek ImmunoTrol Periferní krev Zamražené vzorky Vnitřní kontroly jednotlivé populace Vyšetření na jiném pracovišti (zamražené vzorky) Zejména zpětná vazba patologie

13 Výsledky souhrn: 83 vyšetření (12/ /2017) Neonkologický nález 40(lymfadenitis, ) 48,2% B NHL 24(FL 10, DLBCL 6, CLL/SLL 5, MCL 2, MZL 1) 28,9% m.hodgkin 4 4,8% T lymfom 2 2,4% Nehematologické tumory 11 13,3% Nejasné 2(2x nekrotický tumor, susp. B NHL) 2,4%

14 Folikulární lymfomy 10 vyšetření 8x monoklonální populace CD5, CD10+ 2x bez záchytu patologie Dle imunohistochemie CD10 pozitivní FCM bez průkazu klonální restrikce K/L CD10+ 1 a 3% lymfocytů v.s. nehomogenní nález v uzlině CLL/SLL 5 vyšetření Zřetelná monoklonální populace CD5+, (CD23+) Lymfom z buněk pláště 2 vyšetření Zřetelná monoklonální populace CD5+, (CD23 ) Lymfom z buněk marginální zóny 1 vyšetření Zřetelná monoklonální populace CD5, CD10

15 T lymfomy 2 vyšetření 1x neviabilní vzorek 1x bez patologické nálezu Histologicky anaplastický velkobuněčný lymfom Nádorové buňky zavzaty do zmnoženého kolagenního vaziva Četné apoptosy a nekrosy Neonkologické nálezy 40 vyšetření 3x příliš nízká viabilita nehodnotitelné 2x nejasný nález (folikulární hyperplazie) odesláno ke 2.čtení na základě FCM 1x monoklonální populace CD5, CD10 Později přehodnoceno jako MZL

16 Viabilita Histologicky: chronická lymfadenitis

17 Patologický nález folikulární lymfom Předmět, klinická dg.: uzlina na krku l.dx., lymphadenitis. Makroskopicky: částka 38x20x10 mm a tři samostatné částky průměrů 15 mm, 10 mm a 15 mm, vyšetřeno cryostatovou metodou v 1 bloku, k dispozici je zamrazený materiál, proveden odběr na vyšetření průtokovým cytometrem. Zpracováno kompletně parafínovou technikou ve 12 blocích Mikroskopicky: rozpadající se materiál, tvořený tkání lymfatické uzliny a přiléhajícími měkkými tkáněmi, struktura lymfatické uzliny je téměř kompletně setřelá folikulárně členěným nádorovým infiltrátem, který ložiskově přechází na perinodální měkké tkáně, fokálně zachycena ložiska rozvolnění nodulárních struktur, místy až s náznaky přechodu difúzního růstu. Metodou PAS bez zachycené přítomnosti patologických depozit. Imunohistochemie (metody SPP03, FRA): nádorový infiltrát vykazuje silnou membránovou expresi CD20, průkazem CD3 a CD5 se znázorňují malé lymfocyty na pozadí, infiltrát je dále pozitivní v průkazu CD23, který znázorňuje i folikulárně dendritické buňky, infiltrát exprimuje CD10 a Bcl2. Průkaz cyklinu D1 je v infiltrátu negativní. Prolifereční aktivita (Ki-67, MIB-1) odpovídá asi 20 až 30 % buněčnosti infiltrátu. Závěr: lymfatická uzlina na krku vpravo; nacházíme lymfoidní infiltraci, kterou vzhledem k celkovému obrazu hodnotíme jako folikulární non-hodgkinský B maligní lymfom, grade 1-2, ložiskově již suspektní přechod do grade 3a v krátkém rozsahu. Materiál zasíláme na druhé čtení do Ústavu patologie FN Motol, o výsledku budeme dále informovat.

18 Viabilita a fixace (FL)

19 Folikulární lymfom

20 Biopsie ložiska v mozku DLBCL

21 Zdroje wiki.clinicalflow.com flowrepository.org Lymfomová skupina FN Motol Wojciech Gorczyca Flow Cytometry in Neoplastic Hematology

22 Závěr Patologové se významnou měrou podílí na diagnostice hematologických malignit Vyšetření průtokovým cytometrem je pro ně velkým přínosem Při dobré spolupráci lze začít s omezeným spektrem antigenů a bez větších znalostí hematoonkologické problematiky Vzorky lze uchovat pro potřeby dalších vyšetření I orientační vyšetření má význam jak pro okamžitou diagnostiku tak pro budoucí vyšetřování (staging apod.) Použití hotových koktejlů má své výhody i nevýhody záleží na potřebách laboratoře Dle potřeb všech zúčastněných lze dále vyvíjet cytometrickou diagnostiku zeptejte se svých kolegů z patologie

23 Poděkování Všem kolegům a kolegyním za spolupráci a Vám za pozornost