VOŠZ a SZŠ Praha 1, Alšovo nábřeží 6 ABSOLVENSKÁ PRÁCE

Transkript

1 VOŠZ a SZŠ Praha 1, Alšovo nábřeží 6 ABSOLVENSKÁ PRÁCE Praha 2017 Andrea Lněničková

2 Vyšší odborná škola zdravotnická a střední zdravotnická škola Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Absolventská práce Andrea Lněničková Glutation a glutation dependentní enzymy Glutathione and glutathione dependent enzymes Studijní obor: Diplomovaný zdravotní laborant Vedoucí práce: RNDr. Lucie Vávrová, Ph.D. Datum odevzdání práce: Datum obhajoby: červen 2017 Praha 2017

3 Prohlášení Prohlašuji, že jsem absolventskou práci vypracovala samostatně a všechny použité parametry jsem uvedla podle platného autorského zákona v seznamu použité literatury a zdrojů informací. Praha 18. dubna 2017 Podpis

4 V první řadě bych ráda poděkovala RNDr. Lucii Vávrové za skvělý přístup, vedení a cenné rady, které mi byly velkou oporou. Také bych jí ráda poděkovala za její trpělivost, která neměla mezí. Mé díky patří též rodině, která mi je vždy oporou a podporuje mě ve všem, co si umanu. Poděkovat chci i Jirkovi, který je mi vždy po boku.

5 Souhlasím s tím, aby byla moje absolventská práce půjčována v knihovně Vyšší odborné školy zdravotnické a Střední zdravotnické školy, Praha 1, Alšovo nábřeží 6. Podpis

6 Abstrakt Jméno: Andrea Lněničková Název práce: Glutation a glutation dependentní enzymy Název anglicky: Glutathione and glutathione dependent enzymes Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Vedoucí práce: RNDr. Lucie Vávrová, Ph.D. Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2017, 47 stran Udržení oxidační rovnováhy organismu zajišťuje antioxidační systém, tvořený jednak antioxidačními enzymy jako např. kataláza, glutationperoxidasa (GPX), glutationreduktasa GR) jednak neenzymovými antioxidanty jako např. redukovaný glutation (GSH). Nedostatečnou činností antioxidačního systému a/nebo nadměrnou tvorbou reaktivních forem kyslíku a dusíku dochází k porušení oxidační rovnováhy a vzniku oxidačního stresu. Oxidační stres hraje roli v patogenezi celé řady onemocnění, jako jsou např. diabetes mellitus (DM), různé druhy karcinomů, či depresivní poruchy (DD). Cílem této práce je srovnat koncentrace GSH a aktivity GPX a GR u pacientů s karcinomem prsu (BC), DM, DD, karcinomem pankreatu (PC) a chronickou pankreatitidou (ChP) a zdravých kontrol (CON). Do studie bylo celkem zařazeno 5 skupin pacientů (pacienti s BC, DM, DD, PC, ChP) a jedna kontrolní skupina. Všechny skupiny byly spárovány na základě věku a pohlaví. Každá skupina čítala 22 žen. Sledovány byly aktivity GPX a GR a koncentrace GSH a konjugovaných dienů v precipitovaných LDL. U všech skupin pacientů byly pozorovány zvýšené hladiny markeru oxidačního stresu konjugovaných dienů oproti zdravým kontrolám. U pacientů s PC, BC a ChP byly zjištěny snížené aktivity GPX1 ve srovnání se zdravými kontrolami. Naopak aktivity GR byly u pacientů s PC a BC zvýšené. Koncentrace glutationu byla snížená u pacientů s PC a zvýšená u pacientů s BC oproti CON. Výsledky ukazují, že u všech zkoumaných onemocnění je přítomen oxidační stres. Hladiny antioxidantů jsou pak nejvýrazněji ovlivněny u pacientů s nádorovým onemocněním. Klíčová slova: glutation, glutationperoxidasa, glutationreduktasa, oxidační stres

7 Abstract Jméno: Andrea Lněničková Název práce: Glutation a glutation dependentní enzymy Název anglicky: Glutathione and glutathione dependent enzymes Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Vedoucí práce: RNDr. Lucie Vávrová, Ph.D. Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2017, 47 stran Antioxidant system, which consists of both antioxidant enzymes such as catalase, glutathione peroxidase (GPX), glutathione reductase (GR) and non-enzymatic antioxidants such as reduced glutathione (GSH), is responsible for the oxidative equilibrium of organism. The insufficient functions of antioxidant system and/or the overproduction of reactive oxygen and nitrogen species lead to loss of oxidative equilibrium and to oxidative stress. Oxidative stress plays important role in the pathogenesis of many diseases, such as diabetes mellitus (DM), different types of carcinomas or depressive disorders (DD). The aim of this study is to compare the concentrations of GSH and activities of GPX and GR in patients with breast cancer, DM, DD, carcinoma of pancreas (PC) and chronic pancreatitis (ChP) with those of healthy controls (CON). Into the study 5 groups of patients (patients with BC, DM, DD, PC, ChP) and one control group were enrolled. All groups were age- and sex-matched. In every group were 22 women. Activities of GPX and GR and concentrations of GSH were analyzed. In all patient groups increased levels of oxidative stress marker conjugated dienes were found compared to controls. Depressed activity of GPX1 was observed in patients with PC, BC, ChP in comparison with CON, however activity of GR was found to be increased in patients with PC and BC. The concentration of reduced glutathione was decreased in PC and increased in BC compared to CON. The results show that all observed diseases are connected with oxidative stress. The levels of antioxidants are most impressed in patients with carcinoma. Key words: glutathione, glutathione peroxidase, glutathione reductase, oxidative stress

8 Obsah 1 Úvod Literární přehled Reaktivní formy kyslíku a dusíku Reaktivní formy kyslíku Reaktivní formy dusíku Oxidační stres Glutation Syntéza a odbourávání GSH Funkce GSH Glutationperoxidasy Izoenzymy glutationperoxidasy Glutationreduktasa Onemocnění Karcinom prsu Karcinom pankreatu Chronická pankreatitida Diabetes mellitus Depresivní poruchy Materiál a metodika Sledované skupiny Odběr a zpracování vzorků Metody stanovení Glutationperoxidasa Glutationreduktasa Glutation... 27

9 3.3.4 Stanovení koncentrace CD-LDL Stanovení C reaktivního proteinu CRP Stanovení kyseliny močové Stanovení celkového bilirubinu Stanovení albuminu Výpočet hladiny celkové antioxidační kapacity organismu Výpočet BMI Statistické zpracování dat Výsledky Diskuze a závěr Seznam literatury Seznam zkratek Seznam tabulek Seznamy obrázků... 47

10 1 Úvod Téma zabývající se glutationem a glutation dependentními enzymy jsem si vybrala, protože je to zajímavé a v posledních letech velmi populární téma, které se věnuje pro organismus velmi podstatným a důležitým sloučeninám - antioxidantům. Antioxidanty jsou nedílnou součástí lidského organismu - udržují ho v redoxní rovnováze tím, že zabraňují tvorbě reaktivních forem kyslíku a dusíku (RONS, Reactive Oxygen and Nitrogen Species) a už vzniklé RONS neutralizují. Zvýšený výskyt RONS nebo jejich nedostatečné odstraňování způsobuje oxidační stres. Redukovaný glutation (GSH) a glutation dependentní enzymy se řadí mezi nejdůležitější antioxidanty a velkou měrou se podílí na neutralizaci RONS a ochraně buněk před oxidačním stresem. Oxidační stres hraje roli v patogenezi celé řady onemocnění, jako jsou např. diabetes mellitus (DM), různé druhy karcinomů, či depresivní poruchy (DD). Čím je způsoben oxidační stres, který se podílí na rozvoji dané nemoci? Je to dáno zvýšenou tvorbou RONS, které organismus již nezvládá odstraňovat, nebo je u daného onemocnění postižen antioxidační systém a jsou snížené koncentrace antioxidantů a nižší aktivita enzymů, nebo je to dáno kombinací obojího? Pro tuto práci bylo vybráno pět různých onemocnění, v jejichž patogenezi se uplatňuje oxidační stres, u kterých budou sledovány hladiny antioxidantů a jejich změny oproti fyziologickým hodnotám. Cílem této práce je srovnat koncentrace GSH a aktivity glutationperoxidasy (GPX) a glutationreduktasy (GR) u pacientů s karcinomem prsu (BC), DM, DD, karcinomem pankreatu (PC) a chronickou pankreatitidou (ChP) a zdravých kontrol (CON). 9

11 2 Literární přehled 2.1 Reaktivní formy kyslíku a dusíku Reaktivní formy kyslíku a dusíku vznikají u aerobních organismů přirozeně během metabolických pochodů. Reaktivní formou může být volný radikál, tedy látka s nepárovým elektronem, nebo to může být látka, která má všechny elektrony v orbitalech spárované, není tedy radikálem, ale přesto je velmi nestabilní a reaktivní a podílí se na vzniku radikálů. Volné radikály mohou být neutrální atomy/molekuly ale též i ionty. Příčiny vzniku RONS můžeme rozdělit na endogenní a exogenní. Endogenními příčinami mohou být popáleniny, rozpad fagocytů a makrofágů či zánět. Mezi exogenní vlivy se řadí např. léky, toxiny, xenobiotika či ionizační záření (1). RONS nepůsobí pouze patogenně, ale mají i své fyziologické funkce - podílí se na ochraně vůči infekčním agens a oxid dusnatý je jednou z nejvýznamnějších signálních molekul v lidském organismu (2). Přehled RONS podává Tabulka 1. Tabulka 1. Přehled reaktivních forem kyslíku a dusíku (3) Reaktivní formy kyslíku Reaktivní formy dusíku Volné radikály Látky, které nejsou volnými radikály Volné radikály Látky, které nejsou volnými radikály Tripletový kyslík Superoxidový anion Hydroxylový radikál Alkoxyl Hydroperoxyl Peroxyl Peroxid vodíku Kyselina chlorná Ozon Singletový kyslík Oxid dusnatý Oxid dusičitý Nitroxylový anion Nitrosonium Dimer oxidu dusičitého Kyselina dusitá Oxid dusitý Nitronium Peroxynitrit Alkylperoxynitrit 10

12 2.1.1 Reaktivní formy kyslíku Mezi nejvýznamnější reaktivní formy kyslíku (ROS, Reactive Oxygen Species) patří superoxidový anion, hydroxylový radikál a peroxid vodíku. Jedním z přirozených zdrojů ROS v organismu je atmosférický kyslík, ze kterého se v mitochondriích v dýchacím řetězci postupnou redukcí vytváří voda. Redukce molekulárního kyslíku až na 2 molekuly vody vyžaduje celkem čtyři elektrony, při pouze částečné redukci vznikají ROS. V prvním kroku je kyslík redukován na superoxidový anion, dalším krokem je redukce superoxidového aniontu na peroxid vodíku, ze kterého při následné redukci vzniká první molekula vody a hydroxylový radikál. Hydroxylový radikál je v posledním kroku redukován na druhou molekulu vody. Až 3% molekul kyslíku je v mitochondriích přeměněno pouze na superoxidový anion (3). Dalším důležitým přirozeným zdrojem RONS v organismu jsou fagocytární buňky (makrofágy, neutrofilní leukocyty), které RONS produkují a to prostřednictvím jednak enzymů jako NADPH-oxidasa, myeloperoxidasa či inducibilní synthasa oxidu dusnatého, jednak díky působení volného železa. NADPH-oxidasa používá elektrony z NADPH k redukci molekulárního kyslíku na superoxidový anion. Myeloperoxidáza je enzym, který se nachází v azurofilních granulech neutrofilů a lyzozomech monocytů, kde vytváří kyselinu chlornou z peroxidu vodíku a chloridů. Kyselina chlorná poté reaguje s přítomným superoxidovým aniontem a vytvářejí mimořádně reaktivní hydroxylový radikál. Ve fagocytech vzniklé RONS se podílí na obranné reakci organismu - působí baktericidně (2) Peroxidu vodíku Peroxid vodíku je elektroneutrální, pro organismus velice toxická látka, která může volně difundovat buněčnými membránami. Sám o sobě reaguje peroxid vodíku s biomolekulami velmi pomalu, v přítomnosti Fe 2+ nebo Cu + se redukuje na mnohem reaktivnější a nebezpečnější hydroxylový radikál, tzv. Fentonova reakce (v případě Fe 2+ ): H 2 O 2 + Fe 2+ HO. + OH - + Fe 3+ Redukci železa Fe 3+ na Fe 2+ má na svědomí superoxidový anion (3). HO 2 + Fe 3+ O 2 + Fe 2+ + H + 11

13 Aby nedocházelo ke vzniku hydroxylového radikálu, organismus se snaží peroxid vodíku rychle odbourávat. V organismu existují tři systémy, které mohou odstraňovat peroxid vodíku (4): (1) Enzym katalasa štěpí peroxid vodíku na vodu a kyslík, působí až při hodně vysokých koncentracích peroxidu vodíku, působí hlavně v peroxisomech 2 H 2 O 2 2 H 2 O+ O 2 (2) Glutationperoxidasa redukuje peroxid vodíku již při jeho velmi nízkých koncentracích, je schopna redukovat i organické peroxidy; pro svou funkci GPX vyžaduje ještě druhý substrát redukovaný glutation H 2 O 2 + 2GSH 2H 2 O + GSSG (3) Peroxiredoxiny redukují peroxid vodíku při jeho nízkých koncentracích, ale působí pomaleji než GPX Reaktivní formy dusíku Mezi nejvýznamnější reaktivní formy dusíku (RNS, Reactive Nitrogen Species) patří radikály oxidu dusnatého a dusičitého a RNS neradikálové povahy peroxynitrit či nitrosyl. Produkce oxidu dusnatého byla poprvé prokázána v roce 1985 (5). Díky jednomu nespárovanému elektronu má NO velmi krátký poločas rozpadu, v řádu několika sekund. Oxid dusnatý patří mezi nejmenší molekuly, které savčí buňky syntetizují. Jeho prekurzorem je aminokyselina L-arginin, ze které je syntetizován pomocí nitroxidsynthas (6). Oxid dusnatý slouží jako signální molekula jak v centrální tak periferní nervové soustavě. V CNS stimuluje guanylátcyklasu a tím vzestup hladiny cgmp, který pak ovlivňuje tvorbu dalších neurotransmiterů (např. noradrenalin, glutamát). V periferní nervové soustavě je NO neurotransmiter urogenitálního, vaskulárního systému a gastrointestinálního traktu. Ovlivňuje např. relaxaci hladké svaloviny střeva a cév, působí jako signální molekula u nervových zakončení topořivého tělesa a stimuluje erekci (6). Mezi negativní účinky oxidu dusnatého se řadí například poškozování enzymů se železem (enzymy spojené s dýchacím řetězcem, a tvorbou ATP či katalasa), snížení sekrece insulinu a destrukce β-buněk pankreatu (7). 12

14 2.2 Oxidační stres Porušení rovnováhy mezi tvorbou a odbouráváním RONS vede k rozvoji oxidačního stresu. Jedná se tedy o stav, kdy dochází k nadměrné tvorbě RONS a/nebo k jejich nedostatečnému odstraňování prostřednictvím antioxidantů (8). Buňka vystavená oxidačnímu stresu podléhá některým charakteristickým změnám. Nejprve dochází k lipoperoxidaci plasmatické membrány, úbytku thiolových skupin proteinů a k výraznému snížení koncentrace GSH. Následují změny ve funkčnosti mitochondrií, porucha iontové homeostázy, poškození DNA a cytoskeletu. Všechny tyto změny mají za následek metabolické vyčerpání a funkčnímu poškození buňky, celý proces může vést až k buněčné smrti (3). 2.3 Glutation Glutation se v organismu vyskytuje ve dvou formách, redukované (GSH) a oxidované (GSSG). V redukované podobě se jedná o tripeptid γ-l-glutamyl-l-cysteinylglycin, který ve své molekule obsahuje volnou thiolovou skupinu cysteinu. Při oxidaci GSH dochází ke spojení dvou molekul GSH přes thiolové skupiny a tvorbě disulfidu GSSG. Glutation se řadí mezi nejdůležitější neenzymatické antioxidanty (9). Glutation se nachází u lidí, rostlin, zvířat, hub a některých prokaryot (10). Glutation produkují všechny buňky v lidském těle, nejvíce pak hepatocyty, následované renálními buňkami, slezinou, erytrocyty, leukocyty a buňkami oční čočky. Hladina intracelulární koncentrace GSH se pohybuje okolo 10 mmol/l, a extracelulární 2-20 µmol/l. Výjimkou je žluč, která má jako extracelulární tekutina koncentraci glutationu vyšší než 10 mmol/l. U eukaryotických buněk je nejvíce glutationu v cytosolu (až 90%), v mitochondriích (10%) a je i v endoplazmatickém retikulu (11) Syntéza a odbourávání GSH Glutation je produkován v cytosolu téměř všech buněk, primárně však v hepatocytech. Syntéza GSH z glutamátu, cysteinu a glycinu je tvořená dvěma postupnými reakcemi, které jsou katalyzovány gama-glutamylcysteinsyntetasou a glutationsyntetasou (10): (1) L-Glu + L-Cys + ATP γ-l-glu-l-cys + ADP + Pi (2) γ- L-Glu-L-Cys + Gly + ATP GSH + ADP + Pi 13

15 Syntéza GSH je součástí γ-glutamylového cyklu, který poprvé popsali v roce 1970 Alton a Meister. Tento cyklus se skládá z šesti enzymaticky katalyzovaných reakcí, které zodpovídají za syntézu a degradaci glutationu a transport některých aminokyselin přes buněčnou membránu z extracelulární tekutiny do buněk (12). Při odbourávání GSH je γ-glutamylová složka pomocí γ-glutamyltranspeptidasy přenesena na určitou aminokyselinu. Z GSH vzniká odtržením γ-glutamylové skupiny cysteinylglycin. Ten je dále štěpen dipeptidasami na glycin a cystein. γ-glutamylované aminokyseliny jsou transportovány zpět do buňky, kde je γ-glutamylcyklotransferasa převede na původní aminokyseliny a 5-oxoprolin. 5-oxoprolin je za katalýzy 5-oxoprolinasou přeměněn na glutamát, který může být znovu využit pro syntézu GSH (10, 13) Funkce GSH Glutation je jedním z nejdůležitějších neenzymatických antioxidantů, je schopen přímé reakce s reaktivními formami kyslíku nebo dusíku. Glutation je zapojen do biologických procesů, při kterých chrání buňky proti škodlivým xenobiotikům, oxidantům či před radiačním poškozením. V redukčních a konjugačních reakcích GSH hraje zásadní roli jeho thiolová skupina na cysteinu. Mnohé reakce glutationu jsou katalyzovány glutation dependentními enzymy - glutationtransferasa (GST), GPX, či GR (14). Přehled základních funkcí glutationu podává Tabulka 2. Jako indikátor oxidačního stresu je důležitý poměr mezi redukovanou a oxidovanou formou glutationu. Za fyziologických podmínek je v těle přítomna z cca 99% redukovaná forma (11). Poměr GSH/GSSG je 100:1 a je udržován biochemickými procesy, jako jsou samotná syntéza GSH či redukce GSSG na dvě molekuly GSH, pomocí GR. Při patologických stavech může být poměr snížen až 1:1 (15). Mezi takovéto patologické stavy můžeme řadit například maligní nádory, infarkt myokardu, Parkinsonovu chorobu, srpkovitou anémii nebo zánětlivá onemocnění (16, 17). 14

16 Tabulka 2. Přehled funkcí glutationu (14, 17, 18) (1) Antioxidační působení Ochrana buněk před oxidačním stresem Reakce s reaktivními formami kyslíku Regenerace vitamínu E a C Udržování -SH skupin proteinů v redukované formě Udržení kyseliny askorbové v redukované formě Kofaktor vybraných oxidoreduktas Redoxní potenciál cytosolu (2) Účast na metabolismu prostaglandinů a leukotrienů (3) Regulace buněčného cyklu Zapojen do procesů apoptózy Modulace buněčné proliferace Modulace buněčných procesů (replikace DNA, proteinů) (4) Aktivace T-lymfocytů a polymorfonukleárních leukocytů (5) Obranná funkce Detoxikace xenobiotik nebo jejich metabolitů Inhibice tvorby mutagenních látek (6) Transportní funkce Transport aminokyselin do buněk přes membránu v ledvinách Zásobárna a transportní forma cysteinu 2.4 Glutationperoxidasy Glutationperoxidasy se řadí mezi oxidoreduktasy a jsou to selenoproteiny, tedy molekuly, které obsahují ve svém aktivním centru selen a to ve formě selenocysteinu. Selen je podstatný pro katalytickou aktivitu GPX. Celkem bylo identifikováno 8 izoenzymů GPX, které se vzájemně liší tkáňovou specificitou, lokalizací v buňce, funkcí nebo strukturou. Celkem 5 izoenzymů je Se-dependentní, zbývající 3 izoenzymy ve své struktuře selen neobsahují, ale mají více než 40% shodu v sekvenci s cytosolickou GPX. Molekulová hmotnost jedné podjednotky GPX je okolo 20 kda. (19). 15

17 Glutationperoxidasy katalyzují reakce mezi GSH a H 2 O 2, při které se peroxid vodíku přeměňuje na vodu a zároveň dochází k oxidaci GSH na GSSG. Navíc zajišťují redukci lipidových peroxidů, alkoxylových radikálů a hydroperoxidů cholesterolu (20). Hlavní funkcí GPX je ochrana buněčné membrány před účinky oxidačního stresu a tím i zajištění fyziologického průběhu buněčného metabolismu. Pokles aktivity GPX může být způsobený nedostatkem selenu či GSH. Při poklesu aktivity GPX může dojít k poškození buněčných membrán, kterým tak chybí ochrana před lipoperoxidací. Na ochraně organismu před oxidačním poškozením se podílí i další GSH dependentní enzymy, jako glutation-stransferasy, které katalyzující detoxikaci řady xenobiotik (19). Nejvíce se GPX vyskytuje v cytoplazmě (cca ze 70 %), z 20% v mitochondriích a z 10% v jádře. Nejvyšší aktivita GPX je v játrech, krvi a plicích. Nejnižší aktivita potom je v mozku a oční čočce (20, 21) Izoenzymy glutationperoxidasy Glutationperoxidasa byla poprvé popsaná roku 1957 Millsem, který předpokládal, že její funkcí je ochrana erytrocytů před působením peroxidu vodíku, neboť jeho nahromadění vedlo ke snížení životnosti erytrocytů způsobené zvýšením rychlosti oxidace hemoglobinu na methemoglobin. Dnes je tato forma GPX označována jako GPX1 (22). Přehled o jednotlivých izoenzymech GPX podává tabulka 3. Schéma struktury GPX1 zobrazuje Obrázek 1. Obrázek 1. Struktura GPX1 (23) 16

18 Tabulka 3. Přehled izoenzymů glutationperoxidasy (19, 24, 25) Název izoenzymu Zkratka Struktura Výskyt Funkce Cytosolická GPX 1 Tetramer erytrocyty, plíce, játra, ledviny rozklad peroxidu vodíku a lipoperoxidů, peroxidů (buněčná/klasická) Se-Cys cytosol, ER, jádro, MK z cholesterolesterů, ochrana membránových mitochondrie lipidů Gastrointestinální GPX 2 Tetramer Se-Cys střevo, žaludek cytosol rozklad peroxidu vodíku a peroxidů z metabolismu xenobiotik Plasmatická GPX 3 Glykoprotein ledviny, plíce, srdce, placenta, antioxidační účinky jsou vzhledem k nízké hladině (extracelulární) tetramer semenný váček GSH zanedbatelné Se-Cys cytosol Fosfolipid-hydroperoxidová GPX 4 Monomer Se-Cys srdce, mozek, varlata vázaná v membránách rozklad organických peroxidů i u fosfolipidů, regulace syntézy prostaglandinů a leukotrienů Epididymální GPX 5 tetramer nadvarlata, játra, ledviny redukce organických peroxidů (nadvarlatová) Cys vázaná v membránách Čichová GPX 6 tetramer čichový systém funkce není zatím známá Se-Cys sekretovaná Fosfolipid-hydroperoxidová bez selenocysteinu GPX 7 Monomer Cys varlata, plíce, ledviny, tuková tkáň cytosol redukce peroxidů u fosfolipidů Zatím není určen GPX 8 Cys vázaná v membránách redukce organických peroxidů 17

19 2.5 Glutationreduktasa Glutationreduktasa byla objevená roku 1951 v pšeničných klíčcích a v semenech hrachu a byla předpokládáno, že se jedná o enzym redukující GSSG na GSH (26). Později byla objevena ve většině aerobních forem života (27). Struktura GR byla pak poprvé popsaná v roce 1978, kdy k pokusu byly použity lidské erytrocyty (28). Přesná aminokyselinová sekvence byla zjištěna až o tři roky později. Bylo zjištěno, že GR je homodimer o molekulové hmotnosti 55 kda. Každý monomer obsahuje celkem tři domény: (1) vázající FAD (2) vázající NADPH, (3) dimerizační doména (29). Struktura GR je zobrazena na Obrázku 2. Obrázek 2. Struktura GR (30) GR se řadí mezi oxidoreduktasy a nachází se především v cytosolu a v matrix mitochondrií, ale vyskytuje se i v chloroplastech (31). GR se podílí na metabolismu glutationu tím, že katalyzuje NADPH dependentní redukci GSSG na GSH, čímž udržuje vysoký poměr GSH a GSSG, 100:1 (32). 2.6 Onemocnění Karcinom prsu Karcinom prsu je nejčastěji diagnostikovaný karcinom u žen. V ČR je každý rok okolo šesti tisíc žen, u kterých je tato nemoc nově diagnostikována. Ve světě je to za rok více než půl milionu žen. Zásadní pro možnost úspěšně léčby je včasná diagnóza, kterou umožňují preventivní vyšetření (samovyšetření prsu, mamograf, ultrazvuk). Samovyšetření prsu je nejjednodušší metodou, která by se měla opakovat každý měsíc. Dalším důležitým 18

20 preventivním vyšetření je mamograf. Jedná se o rentgenologické vyšetření, které může odhalit až 95% karcinomů. Mamograf může být doplněn ultrazvukem. Od roku 2002 je v ČR zavedeno celoplošné sledování žen. Cílem je podchytit nádory v raném stádiu, než dojde k rozšíření metastází (33). Co všechno ovlivňuje vznik BC, není zcela objasněno, ačkoliv je obecně akceptován předpoklad, že za vznikem tohoto onemocnění stojí souhra genetických a environmentálních faktorů. Předpokládá se, že oxidační stres může hrát roli nejen ve vzniku, ale též v dalším rozvoji BC. Působením oxidačního stresu může dojít k poškození DNA, které může vést k mutacím v genech, což může mít za následek maligní transformaci buněk a iniciaci nádorového bujení (34) Karcinom pankreatu Karcinom pankreatu je třetím nejčastějším nádorovým onemocněním u mužů, po karcinomu plic a tlustého střeva. V ČR je přibližně 16 nových případů na obyvatel za rok a výskyt se neustále zvyšuje. Ve většině případů se jedná karcinom hlavy pankreatu. Často se objevuje i vrůstání PC do okolních struktur a metastáze do uzlin. Příznaky PC můžeme rozdělit podle umístění karcinomu. Karcinomy hlavy pankreatu mohou být doprovázené úbytkem hmotnosti, žloutenkou, bolestí v podbřišku a v zádech. Ikterus u karcinomu těla a ocasu bývá příznakem metastáz do jater. Diabetes mellitus se vyskytuje asi u třetiny pacientů s PC. Většinou však se příznaky projeví až v pozdějších stáiích a nemoc je diagnostikována až v pokročilejších špatně léčitelných stádiích. K diagnostice slouží CT vyšetření, ultrasonografické vyšetření i biopsie pro histologické vyšetření (35). Stejně jako u BC je i u PC je předpoklad zapojení oxidačního stresu v jeho patogenezi. K rizikovým faktorům rozvoje PC se řadí nadměrné užívání alkoholu, kouření, či chronická pankreatitida (36) Chronická pankreatitida Jedná se o chronický zánět pankreatu, při kterém je funkční parenchym nahrazován vazivem. Proto dochází v pokročilém stádiu k nedostatečnosti pankreatu. Jednou z nejčastějších příčin onemocnění je alkoholismus. Příčinou může být i poškození pankreatických acinů volnými kyslíkovými radikály. Radikály poškozují membránu buněk, tím ovlivňují nitrobuněčný metabolismus a činnost organel, především mitochondrií. Dochází k peroxidaci membrán a tím k poškození acinů. 19

21 Nemoc se projevuje bolestmi v břiše, trávicími potížemi a hubnutím. U pokročilých forem může dojít k nedostatečné produkci inzulinu (37) Diabetes mellitus Diabetes mellitus je metabolické chronické onemocnění, při kterém je zvýšená hladina glukosy v krvi. Rozlišujeme dva základní typy DM: DM I. typu, též označovaný jako na insulinu závislý DM (IDDM, insulin-dependent DM) a DM II. typu, neboli na insulinu nezávislý DM (NIDDM, non-insulin-dependent DM). Na udržení stálé hladiny glukosy v krvi se podílí několik hormonů, většina z nich hladinu glukosy v krvi zvyšuje (glukagon, katecholaminy, kortisol), za její snižování je zodpovědný pouze insulin, který je produkovaný β-buňkami pankreatu. Insulin je zodpovědný za vstřebávání glukosy tkáněmi. Je popsáno několik různých mechanismů vedoucích k hyperglykemii žádná či nedostatečná produkce insulinu β-buňkami pankreatu, či poškození insulinových receptorů (insulin je produkován v dostatečném množství, ale není schopen se navázat na svoje receptory a tedy neúčinkuje), (38). Diabetes mellitus je onemocnění, které je charakterizováno zvýšeným oxidačním stresem, zvýšená hladina cukru je spojená s vyšší tvorbou RONS. Předpokládá se, že oxidační stres hraje podstatnou roli v etiopatogenezi DM 1. i 2. typu a má klíčový význam pro vznik a rozvoj diabetických komplikací (3) Depresivní poruchy Výskyt depresivních poruch se neustále zvyšuje. Depresemi trpí 4,4% lidí na světě, přičemž nejvyšší výskyt je v Afghánistánu a nejnižší v Japonsku (39). U žen je onemocnění častější (10-20%) než u mužů (5-12%). V České republice bylo v roce nových případů onemocnění na obyvatel, a výskyt byl dvakrát vyšší u žen než mužů (40). V rámci Evropského výběrového šetření o zdraví (EHIS) bylo provedeno mezi lety 2007 a 2010 v 17 zemích Evropské Unie, včetně ČR, šetření týkající se depresivních poruch. Podle tohoto průzkumu během posledních 12 měsíců trpělo v ČR depresí 3,9% lidí. U mužů je deprese nejčastější ve věku let. U žen je deprese nejčastěji ve věku 75 let a více, méně početnější je skupina žen ve věku a let (41). 20

22 Hlavním příznakem depresivní poruchy je klinická deprese trvající v kuse déle než dva týdny. Člověk má velmi smutnou náladu, ztrácí zájem o záliby a okolí, trpí poruchami spánku a tím i únavou a ztrátou energie (42). Důležitou roli v patogenezi depresivních poruch hraje dysfunkce serotoninergní, noradrenergní a dopaminergní neurotrasmise, abnormální regulace hypotalamo-hypofyzární adrenální dráhy, či chronické záněty (43). Citlivost mozku na oxidační stres zvyšuje řada faktorů, například vysoké množství železa, nízká aktivita antioxidačních enzymů či vysoké množství polynenasycených mastných kyselin, které jsou náchylné k oxidaci (40). Neurodegenerativní změny rozšířené při zánětu a oxidačním stresu, hrají také významnou roli při vzniku depresivní poruchy. U pacientů s depresí mohou být pozorovány kardiovaskulární nemoci či diabetes mellitus II. typu. Jako jeden z faktorů, který stojí za zvýšeným výskytem těchto nemocí, je zvýšená hladina oxidačního stresu (40). 21

23 3 Materiál a metodika 3.1 Sledované skupiny Do studie bylo celkem zařazeno 5 skupin pacientů (pacienti s BC, PC, ChP, DM, DD) a jedna kontrolní skupina. Všechny skupiny byly spárovány na základě věku a pohlaví. Každá skupina čítala 22 žen. Pacientky s PC, ChP a DM byly nabírány v ambulancích či na lůžkových odděleních IV. interní kliniky, pacientky s DD byly diagnostikovány na Psychiatrické klinice a pacientky s BC byly nabírány na Onkologické klinice 1. LF UK a VFN v Praze. Všichni sledovaní podepsali informovaný souhlas se zařazením do studie. Mezi vylučovací kritéria patřilo užívání antioxidantů, suplementů polynenasycených mastných kyselin či etylalkoholu v dávce vyšší než 20 g denně; manifestní kardiovaskulární, jaterní či renální onemocnění, prodělaný operační zákrok či infekční onemocnění. Pro kontrolní skupinu pak byly dalšími vylučovacími kritérii onemocnění diabetes mellitus, onemocnění pankreatu, karcinomy či depresivní porucha. 3.2 Odběr a zpracování vzorků Odběry krve byly prováděny po celonočním lačnění. Aktivity GPX1 a GR a koncentrace GSH byly stanovovány v hemolyzátech erytrocytů. Ostatní neenzymatické antioxidanty (kyseliny močová, bilirubin, albumin), marker oxidačního stresu konjugované dieny a stejně tak marker zánětu CRP byly stanovovány v séru. Vacutainery se srážlivou krví necháme po odběru minut stát při laboratorní teplotě a následně centrifugujeme při 3000 g po dobu 10 minut, sérum následně rozpipetujeme na jednotlivé vzorky. Krev s antikoagulačním činidlem K 2 EDTA centrifugujeme při 3000 g a 4 o C po dobu 10 minut. Následně oddělíme plasmu a zbylé erytrocyty 3x promyjeme vychlazeným fyziologickým roztokem (9g/l NaCl) v poměru 1 : 10. Promyté erytrocyty rozpipetujeme na jednotlivé vzorky. Před vlastním měřením z promytých erytrocytů připravujeme hemolyzát - promyté krvinky rozsuspendujeme vychlazenou redestilovanou vodou v poměru 1 : 4. Všem vzorkům byly přiřazeny unikátní anonymizační kódy, vzorky byly poté před analýzou skladovány při -80ºC. Rutinní analýzy byly provedeny v laboratoři Ústavu lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky VFN v Praze. 22

24 3.3 Metody stanovení Glutationperoxidasa 1 Princip metody: Aktivitu GPX1 měříme pomocí spektrofotometrické kinetické metody dle Paglia & Valentine (44). Metoda je složena ze dvou spřažených reakcí. Nejprve probíhá reakce organického peroxidu s redukovaným glutationem za vzniku alkoholu a oxidovaného glutationu (GSSG). Reakce je katalyzována GPX1. Následně dochází k zpětné redukci vzniklého GSSG na GSH za katalýzy GR, redukčním činidlem v této reakci je NADPH+H +. Pokles koncentrace NADPH+H + je měřen spektrofotometricky při 340 nm. Reakce: (1) ROOH + 2GSH GPX ROH + GSSG (2) GSSG + NADPH+H + GR 2 GSH + NADP + Chemikálie: Roztoky B až E připravujeme vždy čerstvé. A. TRIS HCl zásobní pufr (1 M, ph = 8,0) s obsahem Na 2 EDTA.2H 2 O (5 mm) M r (TRIS)= 121,14 M r (Na 2 EDTA.2H 2 O) = 372,24 Navážíme 12,1 g TRIS a 0,3723 g Na 2 EDTA.2H 2 O a rozpustíme v cca 50 ml vody. Pomocí 2 M HCl upravíme ph na hodnotu 8,0 a doplníme H 2 O do 100 ml. Pufr uchováváme jeden týden při 4 C. Před stanovením ředíme zásobní pufr vodou v poměru 1 : 4,8 (pufr : voda). B. Redukovaný glutation (20 mm) M r (GSH) = 307,3 Navážíme 6,146 mg GSSG na 1 ml H 2 O. C. NADPH (2 mm) M r (NADPH) = 745,4 Navážíme 1,491 mg na 1 ml H 2 O. D. Glutationreduktasa (10 U/ml) Naředíme 5,464 µl originální GR (184 U/mg, 9,95 mg/ml) v 994 µl H 2 O na přípravu 1 ml roztoku GR. 23

25 E. Startovací roztok - t-butyl-hydroperoxid (t-bhp) Originální t-bhp ředíme 1000x H 2 O Roztoky pipetujeme do plastových semimikrokyvet podle postupu uvedeného v tabulce 5, při nastavení spektrofotometru podle tabulky 4. Tabulka 4. Nastavení spektrofotometru Helios γ pro stanovení GPX1 Parametr Vlnová délka Hodnota parametru 340 nm Počet kyvet 7 Celkový čas měření Perioda 120 s 30 s Teplota 37 C Tabulka 5. Pipetovací schéma pro stanovení aktivity GPX1 Chemikálie Slepé stanovení (µl) Vzorek (µl) TRIS pufr ph = 8, mm GSH U/ml GR mm NADPH Destilovaná voda Hemolyzát (20x ředěný) Řádně promícháme a 10 minut necháme směs temperovat při 37 C. t-bhp

26 Výpočet: Aktivita GPX1 je vyjádřena jako specifická aktivita v U/g hemoglobinu. 1 = A/min ě ε l V vzorku a (GPX1) = aktivita GPX1; A/min = rozdíl absorbance za minutu pro vzorek hemolyzátu po odečtení vlivu spontánní reakce peroxidu s GSH; V (v kyvetě) = celkový objem v kyvetě (1,0 ml);10 6 = zahrnuje převedení jednotek mol/l na jednotky µmol/l; ε = molární absorpční koeficient NADH+H + při 340 nm (ε = 6220 mol.cm -1.l -1 ); l = optická dráha (1 cm); V (vzorku) = 100µl hemolyzátu; HTC hematokrit; Hb - hemoglobin (g/l), ředění - 20x Glutationreduktasa Princip metody: Aktivitu GR měříme metodou dle Goldberga & Spoonera (45), kdy sledujeme pokles absorbance v důsledku oxidace NADPH při redukci GSSG na GSH. Tato reakce je katalyzována právě GR. Měření se provádí spektrofotometricky při vlnové délce 340 nm a při teplotě 37 C. GSSG + NADPH+H + 2GSH + NADP + Chemikálie: Roztoky B a C připravujeme vždy čerstvé. Při měření udržujeme při teplotě 4 o C. A. Fosfátový pufr 0,127 M (ph = 7,2) s přídavkem Na 2 EDTA.2H 2 O (0,633 mm) M r (KH 2 PO 4 ) = 136,086 M r (Na 2 HPO 4.7H 2 0) = 268,07 M r (Na 2 EDTA.2H 2 O) = 372,24 Navážíme 1,270 g KH 2 PO 4, 5,996g Na 2 HPO 4.7H 2 0 a 0,059g Na 2 EDTA.2H 2 O. Vše rozpustíme ve vodě a doplníme na objem 250 ml. Skladujeme při 4 C maximálně po dobu 1 měsíce. B. GSSG 22 mm M r (GSSG) = 612,63 Navážíme 0,0135 g GSSG na 1 ml H 2 O. 25

27 C. NADPH 1,7 mm Navážíme 0,00127 g NADPH na 1 ml H 2 O. Roztoky pipetujeme do plastových semimikrokyvet podle postupu uvedeného v tabulce 7, při nastavení spektrofotometru podle tabulky 6. Tabulka 6. Nastavení spektrofotometru Helios γ pro stanovení GR Parametr Vlnová délka Hodnota parametru 340 nm Počet kyvet 7 Celkový čas měření Perioda 10 min 120 s Teplota 37 C Tabulka 7. Pipetovací schéma pro stanovení aktivity GR Chemikálie Slepé stanovení (µl) Vzorek (µl) Fosfátový pufr ph = 7, mm GSSG Destilovaná voda Hemolyzát (30x zředěný) Řádně promícháme a 10 minut necháme směs temperovat při 37 C. 1,7 mm NADPH

28 Výpočet: Aktivita GR je vyjádřena jako specifická aktivita v U/g hemoglobinu. = / ě ε a (GR) = aktivita GR; A/min = rozdíl absorbance za minutu pro vzorek hemolyzátu po odečtení vlivu spontánní reakce NADH+H + a GSSG;V (v kyvetě) = celkový objem v kyvetě (1,0 ml);10 6 = zahrnuje převedení jednotek mol/l na jednotky µmol/l; ε = molární absorpční koeficient NADH+H + při 340 nm (ε = 6220 mol.cm -1.l -1 ); l = optická dráha (1 cm); V (vzorku) = 100 µl hemolyzátu; HTC hematokrit; Hb - hemoglobin (g/l), ředění - 30x Glutation Princip metody: Metoda stanovení GSH vychází z metodiky dle Griffitha a je založeno na stanovení relativně stabilního produktu redukce 5,5 -dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) redukovaným glutationem za vzniku žlutého produktu (46). GSH + DTNB GSSG + TNB Postup: Promyté krvinky bylo nutno pro stanovení GSH dále upravit izolovat z nich glutation. Ke 100 µl 6% kyseliny octové bylo přidáno 500 µl krvinek, řádně promícháno a poté bylo přidáno 400 µl 10% kyseliny 5-sulfosalicylové. Následně byla směs centrifugována po dobu 2 minut při g. Supernatant se využívá k následnému stanovení GSH. Roztoky pipetujeme do jamek v mikrotitrační destičce podle postupu uvedeného v tabulce 9, při nastavení spektrofotometru podle tabulky 8. Tabulka 8. Nastavení ELISA readeru pro stanovení GSH Parametr Vlnová délka Hodnota parametru 412 nm Počet jamek 96 Teplota 25 C 27

29 Tabulka 9. Pipetovací schéma pro stanovení GSH Standard (µl) Vzorek (µl) Chemikálie Fosfátový pufr ph = 7, Standard GSH 37,5 - Supernatant vzorku - 37,5 Řádně promícháme 6 mm DTNB 12,5 12,5 Výpočet: Koncentrace GSH byla stanovena na základě hodnot z kalibrační křivky a vyjádřena v jednotkách µg/g hemoglobinu Stanovení koncentrace CD-LDL Princip: Sérové LDL byly izolovány srážecí metodou Ahotupa a kol. (47). Koncentrace konjugovaných dienů v precipitovaných LDL byla měřena modifikovanou spektrofotometrickou metodou dle Wieland a kol. (48). Postup: Sérové vzorky byly stabilizovány přídavkem 25 µl EDTA k 250 µl séra a stanovení bylo prováděno nejpozději do 2 týdnů od odběru, vzorky byly skladovány při -20 C. K 110 µl séra s přídavkem EDTA byl přidán 1ml srážecího heparin-citrátového pufru o ph = 5,05. Směs byla řádně promíchána a inkubována 10 minut při laboratorní teplotě. Lipoproteiny byly izolovány centrifugací při 2800 rpm po dobu 10 minut. 28

30 Supernatant byl odstraněn, a sražená peletka byla resuspendována ve 100 µl fyziologického roztoku (NaCl, 9g/l) nutno dělat každý vzorek zvlášť, aby sraženina nebyla dlouho na vzduch a nedošlo k oxidaci. Lipidy byly následně extrahovány směsí chloroform : metanol (2 : 1) se kterou byly inkubovány 10 min za průběžného míchání. Následně bylo přidáno 250 µl redestilované vody, pro lepší separaci fází. Směs byla centrifugována 5 minut při 3000 rpm. 800 µl ze spodní vrstvy bylo usušeno pod dusíkem a následně bylo znova rozpuštěno v 300 µl cyklohexanu. Takto připravený vzorek byl analyzován spektrofotometricky při 234 nm. Výpočet: Koncentrace konjugovaných dienů byla počítána s pomocí hodnot molárního extinkčního koeficientu (ε = 2.95 x 10 4 M -1 cm -1 ) a vyjádřena v jednotkách mmol/l sera Stanovení C reaktivního proteinu CRP Princip stanovení: Hladina CRP v séru se analyzuje imunoturbidimetrickou metodou pomocí komerčně dostupného kitu K-ASSAY CRP (Kamiya Biomedical Company, USA) a měření se provádí na automatickém analyzátoru Hitachi Modular (Japonsko). CRP reaguje se specifickou kozí protilátkou proti lidskému CRP a vzniká precipitát imunokomplexu. Na jeho částicích dochází k rozptylu světla. Množství CRP je přímo úměrné stupni turbidity v kyvetě, který se měří při 340 nm Stanovení kyseliny močové Princip stanovení: Ke stanovení kyseliny močové (KM) se využívá dvoukroková metoda, kdy se nejprve KM oxiduje na allantoin a peroxid vodíku za katalýzy enzymem urikasou. Vzniklý peroxid vodíku potom v dalším kroku reaguje s chromogenem a intenzita vzniklého barevného komplexu se měří fotometricky při vlnové délce 546 nm. 29

31 Reakce: KM + 2 H 2 O + O 2 allantoin + CO 2 + H 2 O 2 Stanovení koncentrace KM v lidském séru se v rutinním provozu provádí na automatickém analyzátoru Modular a využívají se chemikálie dodané firmou Roche diagnostics GmbH souprava UA plus. Množství vzorku pro analýzu je 5 µl Stanovení celkového bilirubinu Princip metody: V silně kyselém prostředí v přítomnosti solubilizačního činidla reaguje bilirubin s 3,5-dichlorfenyl-diazoniem. Intenzita vzniklého červeného chromogenního komplexu je přímo úměrná koncentraci celkového bilirubinu a měří se fotometricky při 546 nm. Koncentrace celkového bilirubin v séru se v rutinním provozu stanovuje na automatickém analyzátoru Modular s využitím soupravy BILT 3 od firmy ROCHE Diagnostics s.r.o. Množství vzorku pro analýzu je 4µl Stanovení albuminu Princip metody: Albumin se váže na bromkrezolovou zeleň a vytváří s ní modrozelený komplex. Intenzita tohoto modrozeleného komplexu je přímo úměrná koncentraci albuminu a lze ji měřit fotometricky. Stanovení albuminu v séru se v rutinním provozu provádí na automatickém analyzátoru Modular s využitím chemikálií od firmy ROCHE Diagnostics s.r.o Výpočet hladiny celkové antioxidační kapacity organismu Hladina celkové antioxidační kapacity organismu (Total radical trapping antioxidant parameter, TRAP) byla vypočítána podle vzorce (49): TRAP = (0,63 (albumin) + 1,02 (kyselina močová) + 1,50 (bilirubin) 30

32 Výpočet BMI Index tělesné hmotnosti slouží jako měřítko obezity. Jedná se o poměr hmotnosti v kilogramech a výšky v centimetrech, umocněné na druhou (50). Tabulka 10. Vyhodnocení BMI indexu (50) BMI Kategorie Zdravotní rizika Méně než 18,5 Podváha Vysoká 18,5 24,9 Norma Minimální 25,0-29,9 Nadváha Nízká až lehce vyšší 30,0-34,9 Obezita 1. Stupně Zvýšená 35,0-39,9 Obezita 2. Stupně Vysoká 40,0 a více Obezita 3. stupně Velmi vysoká 3.4 Statistické zpracování dat Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± S. D. pro parametrické veličiny a jako medián (0,25-0,75 percentil) pro neparametrické veličiny. Normalita byla testována prostřednictvím Shapiro-Wilkova W testu. Rozdíly mezi skupinami pacientů a zdravými kontrolami byly zkoumány pomocí testu one-way ANOVA s Tukey post-testem. Pro neparametrickou analýzu byla použita Kruskal-Wallisova ANOVA. Pro všechny statistické analýzy byl používán program STATISTICA 12.0 (Stat Soft, CZ). Za statisticky signifikantní byly považovány výsledky s p < 0,05. 31

33 4 Výsledky Tato absolventská práce byla zaměřena na glutationové antioxidanty, konkrétně bylo jejím hlavním cílem stanovit aktivity enzymů glutationperoxidasy a glutationreduktasy a koncentraci redukovaného glutationu u pacientů s různým druhem onemocnění a srovnat je s hodnotami zdravých kontrol. Celkem bylo sledováno 5 skupin pacientů a jedna kontrolní skupina. Byli sledováni pacienti s karcinomy prsu a pankreatu, pacienti s chronickou pankreatitidou, pacienti s diabetem mellitus a pacienti s depresí. Do všech skupin byly zařazeny pouze ženy a skupiny byly spárovány na základě věku. Základní charakteristiky jednotlivých skupin shrnuje tabulka 11. Tabulka 11. Obecné charakteristiky skupin Skupina Počet (Ž) Věk (roky) BMI CRP (mg/l) BC 22 60,6 ± 11,6 28,31 ± 5,3 bb 4,4 (2,8-5,4) PC 22 61,1 ± 8,9 24,0 ± 4,2 bb 8,8 (3,0 30,9)* ChP 22 60,1 ± 11,3 26,3 ± 6,1 bb 4,5 (1,4 11,6) DM 22 60,4 ± 11,3 35,4 ± 7,1**, xx 3,4 (2 6,8) DD 22 60,3 ± 11,8 24,6 ± 4,7 4,5 (3,1 8,0) CON 22 59,7 ± 11,7 25,0 ± 3,4 2,1 (1,2-8,3) BC: karcinom prsu, PC: karcinom pankreatu, ChP: chronická pankreatitida, DM: diabetes mellitus, DD: depresivní porucha, CON: zdravá kontrola; Ž: ženy; BMI: body mass index, CRP: C-reaktivní protein; one way ANOVA, Neuman Keulsův post test pro parametrické veličiny, Kruskal Wallis Anova pro neparametrické veličiny; * pacienti vs. CON, * p < 0,05; ** p < 0,01; b BC, PC, ChP vs. DM, bb p < 0,01; x DM vs. DD, xx p < 0,01. Jak ukazuje tabulka 11, ve všech sledovaných skupinách se průměrný věk pohyboval kolem 60 let a mezi skupinami nebyl pozorován žádný signifikantní rozdíl. Hodnoty BMI byly signifikantně zvýšené u pacientek s DM ve srovnání se všemi ostatními skupinami pacientů i se zdravými kontrolami. Mírně zvýšené hodnoty CRP, markeru zánětu, byly pozorovány u všech skupin pacientů ve srovnání s kontrolní skupinou, signifikance dosáhl tento rozdíl však pouze u skupin pacientů s PC. Hlavní sledovanou skupinou látek však byly antioxidanty. Tabulka 12 podává přehled o neenzymatických antioxidantech kyselině močové, albuminu a bilirubinu a z nich počítané celkové antioxidační kapacitě organismu. Jak je z tabulky patrné, skupina pacientů s PC měla 32

34 signifikantně snížené hodnoty albuminu oproti všem ostatním skupinám. Naproti tomu koncentraci bilirubinu měli pacienti s PC zvýšenou ve srovnání s pacienty s ChP, DM, DD a též v porovnání s CON. Pacienti s DM měli zvýšenou koncentraci kyseliny močové ve srovnání s pacienty s PC a CON. Ačkoliv v hodnotách albuminu, bilirubinu a kyseliny močové byly pozorovány signifikantní rozdíly mezi pacienty s PC a ostatními sledovanými skupinami, v hodnotách celkové antioxidační kapacity organismu nebyly nalezeny žádné výrazné rozdíly mezi sledovanými skupinami. Tabulka 12. Neenzymatické antioxidanty Skupina Albumin Bilirubin Kyselina močová ctrap g/l µmol/l µmol/l BC 44,8 ± 1,7 oo 11,3 (7,3 12,7) 296,3 ± 63,9 710,8 ± 169,7 PC 41,2 ± 4,3**, bb, xx 11,6 (10,1 42,6)**,bb, xxxx 235,2 ± 84,4 bb 681,04 ± 105,7 b CHP 45,1 ± 2,5 ## 10,0 (7,3 14,2) # 281,5 ± 68,0 726,4 ± 70,0 DM 46,4 ± 2,5 9,1 (6,9 11,2) 311,7 ± 72,2* 773,1 ± 76,7 DD 46,7 ± 2,7 8,0 (6,7 10,2) 281,5 ± 76,2 743,7 ± 75,2 CON 45,5 ± 2,8 8,8 (6,8 10,8) 248,3 ± 55,9 698,5 ± 68,2 BC: karcinom prsu, PC: karcinom pankreatu, ChP: chronická pankreatitida, DM: diabetes mellitus, DD: depresivní porucha; CON: zdravá kontrola; ctrap: počítaná celková antioxidační kapacita organismu (calculated total peroxyl radical trapping); one way ANOVA, Neuman Keulsův post test pro parametrické veličiny, Kruskal Wallis Anova pro neparametrické veličiny, * pacienti vs. CON, ** p < 0,01; b PC vs. DM, bb p < 0,01; x PC vs. DD, xx p < 0,01; xxxx p < 0,0001; o BC vs. PC, oo p < 0,01; # PC vs. ChP, # p < 0,05; ## p < 0,01. Hlavním sledovaným neenzymatickým antioxidantem byl redukovaný glutation. Jak je ukázáno na obrázku 3, koncentrace glutationu byla signifikantně snížená u pacientů s PC a DD a zvýšená u pacientů s BC ve srovnání s CON. Pacienti s PC měli koncentraci GSH signifikantně nižší než všichni ostatní pacienti a pacienti s BC naopak měli koncentraci GSH signifikantně vyšší než všichni ostatní pacienti (s výjimkou DM). 33

35 oooo # xxxx * x ** ## bbbb x **** BC PC ChP DM DD CON Obrázek 3. Koncentrace redukovaného glutationu BC: karcinom prsu, PC: karcinom pankreatu, ChP: chronická pankreatitida, DM: diabetes mellitus, DD: depresivní porucha; CON: zdravá kontrola, GSH: redukovaný glutation; Kruskal Wallis Anova pro neparametrické veličiny, * pacienti vs. CON, * p < 0,05; ** p < 0,01; **** p < 0,0001; b PC vs. DM, bbbb p < 0,0001; x BC, PC a DM vs. DD, x p < 0,05; xxxx p < 0,0001; o BC vs. PC, oooo p < 0,0001; # BC a PC vs. ChP, # p < 0,05; ## p < 0,01. Výsledky měření aktivity antioxidačních enzymů GPX1 a GR jsou ukázány na obrázku 4. Aktivita GPX1 byla snížena u pacientů s karcinomy prsu i pankreatu a u pacientů s chronickou pankreatitidou ve srovnání s kontrolní skupinou. Pacientky s BC a PC měly snížené hodnoty GPX1 i v porovnání s pacientkami s DD a DM. Na druhou stranu aktivita GR byla zvýšená u pacientek s karcinomy (BC a PC) oproti kontrolám. 34

36 A U/g Hb * xx bb ** GPX1 xx bb ** 20 0 BC PC ChP DM DD CON B 12 ** ** GR 9 U/g Hb BC PC ChP DM DD CON Obrázek 4. Aktivita antioxidačních enzymů GPX1 a GR BC: karcinom prsu, PC: karcinom pankreatu, ChP: chronická pankreatitida, DM: diabetes mellitus, DD: depresivní porucha, CON: zdravá kontrola; GPX1: glutationperoxidasa 1, GR: glutationreduktasa, Hb: hemoglobin; one way ANOVA, Neuman Keulsův post test; * pacienti vs. KON, * p < 0,05; ** p < 0,01; b PC a ChP vs. DM, bb p < 0,01; x PC a ChP vs. DD, xx p < 0,01. 35

37 Hladina oxidačního stresu byla hodnocena na základě markeru oxidačního stresu. Námi zvoleným markerem oxidačního stresu byla koncentrace konjugovaných dienů v precipitovaných LDL, která byla následně vztažena na koncentraci LDL-C ve vzorku. Výsledky našich měření jsou zobrazeny na obrázku 5, ze kterého je patrné, že u všech sledovaných onemocnění (s výjimkou DD, kde rozdíl těsně nebyl signifikantní) byla zvýšená hladina CD/LDL ve srovnání se zdravou kontrolou. Nejvýraznější rozdíl byl pozorován u pacientů s DM. CD/LDL-C 0,04 0,03 * * * *** poměr 0,02 0,01 0 BC PC ChP DM DD CON Obrázek 5. Marker oxidačního stresu CD/LDL BC: karcinom prsu, PC: karcinom pankreatu, ChP: chronická pankreatitida, DM: diabetes mellitus, DD: depresivní porucha, CON: zdravá kontrola; CD: konjugované dieny, LDL: low density lipoproteins lipoproteiny o nízké hustotě; one way ANOVA, Neuman Keulsův post test; * pacienti vs. KON, * p < 0,05; *** p < 0,

38 5 Diskuze a závěr Ve své práci jsem sledovala aktivity dvou velmi důležitých antioxidačních enzymů GPX1 a GR a nejdůležitějšího neeznymatického antioxidantu GSH. Dále byly měřeny též koncentrace dalších neenzymatických antioxidantů a to kyseliny močové, bilirubinu a albuminu, z jejichž hodnot byla počítána celková antioxidační kapacita organismu a také byla stanovována hladina konjugovaných dienů v precipitovaných LDL. Všechny tyto parametry byly měřeny u 5 různých skupin nemocných pacientky s BC, PC, ChP, DM a DD a byly srovnávány s hodnotami naměřenými u zdravých kontrol. Do každé skupiny bylo zařazeno 22 žen a všechny skupiny byly spárovány na základě věku. U všech sledovaných skupin pacientů byly v rámci této studie nalezeny zvýšené hladiny markeru oxidačního stresu - CD/LDL, což potvrzuje spojení těchto onemocnění s oxidačním stresem. Oxidační stres podle mnoha studií hraje podstatnou roli v patogenezi velkého počtu onemocnění, ať už kardiovaskulárních, neurodegenerativních či nádorových. Oxidační stres je spojen s nadprodukcí RONS a/či nedostatečnou funkcí antioxidačního systému. Dlouhodobé působení oxidačního stresu může vést k snížení aktivit antioxidačních enzymů, spotřebě antioxidantů a následně k peroxidaci lipidů nebo dokonce i k poškození DNA (8). V této studii byly naměřeny snížené aktivity GPX1 u pacientů s BC, PC a ChP oproti CON, v případě BC a PC i ve srovnání s DM a DD. Stejné výsledky u pacientů s BC v porovnání s CON byly nalezeny též ve studiích Khalil a kol. a Gomes a kol. (51, 52). Snížené aktivity GPX1 u pacientů s PC a ChP, stejně jako v naší studii, byly nalezeny i ve studii Kodydková a kol. (36). Snížené aktivity GPX1 u pacientů s ChP ve srovnání s CON byly pozorovány i v dalších studiích (53-56). Ne všechny výzkumy však uvádějí shodné výsledky, v některých studiích nebyly prokázány žádné změny v aktivitě GPX1 mezi ChP a CON (57-59). V této studii nebyly pozorovány signifikantní rozdíly v aktivitě GPX1 mezi pacienty s DM, pacienty s DD a zdravými kontrolami. Výsledky jiných studií u pacientů s DD nejsou konsistentní, v některých studiích byly pozorovány snížené aktivity GPX1 (40, 60, 61), v jiných studiích naopak zvýšené aktivity GPX1 (62) a byly publikovány i studie, kde ve shodě s výsledky této studie nebyly pozorovány žádné rozdíly mezi DD a CON (63, 64). Aktivita GR v rámci této studie byla zvýšená u všech pacientek, ale signifikantní změna byla pozorována jen u pacientek s BC a PC v porovnání s CON. 37