NÁSTIN péče o kvalitu v analytické a klinické laboratoři

Transkript

1 NÁSTIN péče o kvalitu v analytické a klinické laboratoři Zbyněk Plzák Obsah NÁSTIN péče o kvalitu v analytické a klinické laboratoři... 1 Správnost měření... 3 Přesnost měření... 3 Nejistoty analytických stanovení... 5 Platné číslice... 7 Analytický chemik jako řešitel problému Zpracování dat chemických analýz Validace analytických metod, instrumentace a software Metrologie v chemii, referenční materiály Systémová péče o kvalitu a akreditace Akreditace podle normy ISO/IEC a ISO Správná laboratorní praxe

2 Vyhodnocení analýzy a vyjádření výsledků. Každé měření, tedy i chemická analýza, je zatíženo určitou chybou, o čemž nás přesvědčuje každodenní zkušenost. Chyby jsou příčinou toho, že při opakované analýze stejného vzorku stejným postupem získáme jednotlivé výsledky, x i, které se mohou odchylovat jak od skutečné hodnoty, tak i mezi sebou. Soubor takto získaných výsledků lze zařadit do jednoho z obrazů uvedených na obr. 1. Soubor A obsahuje výsledky, které se výrazně liší od skutečné hodnoty, ale málo jeden od druhého. Takové výsledky jsou nesprávné (liší se od skutečné hodnoty), ale přesné (výsledky opakovaných měření jsou si blízké). V souboru B jsou výsledky správné a přesné; takové výsledky jsou při analýze žádoucí. V souboru C jsou výsledky sice správné, ale naprosto nepřesné; byť se výsledek příliš neliší od skutečné hodnoty, nelze na něj spoléhat, protože byl určen z velice nepřesných měření. V souboru D jsou výsledky nesprávné a nepřesné. x A odchylka chyba x B x x skutečná hodnota C D Obr. 1. Schema mo žného rozlo žení výsledků zjištěných opakovaným m ěřením vzhledem ke skute čné hodnotě. Výsledky jednotlivých m ěření, x i, jsou znázorn ěny body na osách hodnot. Takovéto hodnocení opakovaných výsledků analýz je zažité v analytické literatuře. V roce 2009 byl u nás publikován překlad nového vydání mezinárodního metrologického slovníku (TNI :2009 Mezinárodní metrologický slovník - Základní a všeobecné pojmy a přidružené termíny (VIM)), který jako vrcholový terminologický dokument nově zahrnuje i měření v chemii, laboratorní medicíně, biologii nebo technice. Česká terminologie v klasické metrologii a měřicí technice na jedné straně a v analytické chemii a laboratorní medicíně na straně druhé se léta vyvíjely odlišně a dospěly u některých základních termínů k neslučitelným koncepcím. Jedná se především o používání českých ekvivalentů anglických termínů precision, accuracy a trueness. Slovník zavádí zcela nový ekvivalent pro precision a to preciznost (těsnost shody mezi naměřenými hodnotami získanými opakovanými měřeními za specifikovaných podmínek dosud v analytice přesnost). Measurement trueness uvádí jako pravdivost měření (těsnost shody mezi aritmetickým průměrem nekonečného počtu opakovaných naměřených hodnot a referenční hodnotou veličiny) a konečně poslední z trojice termínů measurement accuracy je překládán jako přesnost měření (těsnost shody mezi naměřenou hodnotou veličiny a pravou hodnotou dosud v analytice správnost). Jednotnost používání uvedených pojmů je nutností pro srozumitelnost a jednoznačnost aplikace technických dokumentů zasahujících několik oborů a bude nutno postupně na ni přecházet. Použití nových termínů znamená, že budeme hodnotit výsledky např. souboru A na obr. 1 jako precizní, ale nepravdivé s velkou hodnotou vychýlení (bias). 2

3 Správnost měření Rozdíl naměřené hodnoty od hodnoty skutečné je chyba. Příčinou tohoto rozdílu jsou tzv. chyby soustavné (systematické). Soustavné chyby ovlivňují správnost analýzy, zatěžují výsledek analýzy jedním směrem. Mají určitou příčinu, kterou lze do určité míry odhalit (špatně provedená kalibrace, nevhodně nastavený přístroj, nevhodně zvolená metoda atp). Při analýze neznámého vzorku případnou soustavnou chybu ve výsledku analýzy odhalit nelze, protože skutečná hodnota zjišťované veličiny není známa (její zjištění je úkolem analýzy). Lze však na přítomnost soustavné chyby otestovat analytický postup tím, že se např. provede analýza vzorku, u nějž je hodnota zjišťované veličiny známa (tzv. standardní vzorek). Složení matrice standardních vzorků, by měla být v ideálním případě totožná s matricí rutinně analyzovaných vzorků. Přesnost měření Při analýze neznámého vzorku je odhadem skutečné hodnoty střední hodnota opakovaných měření. Rozdíl mezi střední hodnotou a výsledkem jednotlivých měření je odchylka. Příčinou odchylek jsou tzv. chyby náhodné. Jejich zdroj nelze určit, jsou výsledkem působení velkého množství malých chyb, k nimž dochází při každém kroku analytického postupu (při vážení či odměřování objemů, při odhadu změny zabarvení indikátoru, malá změna teploty atd). Náhodné chyby ovlivňují přesnost analýzy. Je důležité, za jakých podmínek byly opakované výsledky změřeny. O opakovatelnosti měření hovoříme, pokud podmínky zahrnují stejný postup měření, stejný obslužný personál, stejný měřicí systém, stejné pracovní podmínky a stejné místo a opakování měření v krátkém časovém úseku. Další mírou přesnosti (preciznosti) měření je reprodukovatelnost. Ta se vztahuje k rozptýlení souboru výsledků, pokud podmínky zahrnují různá místa, obslužný personál, měřicí systémy a opakování měření na stejném nebo podobných objektech. Je typicky získávána v mezilaboratorních experimentech. Opakovatelnost a reprodukovatelnost jsou vlastností použité analytické metody (postupu). Určení přesnosti s jakou byla hodnota zjišťované veličiny (zpravidla obsah analytu) určena, je nezbytnou součástí každé analýzy. Přesnost analýzy se testuje tak, že se výsledky opakovaných měření zpracují vhodným statistickým (chemometrickým) postupem. Podle závažnosti a náročnosti analýzy se volí více či méně rafinovaný chemometrický postup. Pro základní statistické hodnocení přesnosti analýzy postačí postup, který je uveden schematicky v tab.1. Pro malý počet měření je vydatnějším odhadem střední hodnoty medián, pro velký počet měření lze použít aritmetický průměr. Odhadnutá směrodatná odchylka, s, charakterizuje šířku intervalu, v němž se mohou vyskytnout výsledky opakovaných měření. Z teorie chyb plyne, že v intervalu střední hodnota 1s se vyskytuje 68% všech výsledků, v intervalu střední hodnota 3s již prakticky všechny výsledky. Čím je tedy směrodatná odchylka menší, tím jsou výsledky soustředěny těsněji kolem střední hodnoty a tudíž měření je přesnější. Variační koeficient (relativní směrodatná odchylka vyjádřená v %) vztahuje přesnost měření k velikosti střední hodnoty. Byla-li při dvou různých analýzách vedoucích ke středním hodnotám ~ x 10 ~ 1 a x určena stejná hodnota směrodatné odchylky, např. s 1 = s 2 = 2, pak v prvním případě bylo měření méně přesné než v druhém, (s r ) 1 = 100 2/10 = 20%, (s r ) 2 = 100 2/100 = 2%. Tab. 1. Základní statistické hodnocení analytických výsledků A. Opakování analýzy téhož vzorku n počet opakovaných (paralelních) analýz x i (x 1 až x n ) výsledek i-tého měření B. Určení střední hodnoty pro n < 7 střední hodnotou je medián, ~ x (výsledky se seřadí podle velikosti při lichém počtu je mediánem prostřední hodnota, při sudém aritmetický průměr dvou 3

4 prostředních) pro n > 7 střední hodnotou je aritmetický průměr, x xi / n C. Odhad směrodatné odchylky pro n < 7 s kn R, kde k n je tabelovaný koeficient (tab. 16.2) a R = x max x min je rozpětí (rozdíl největší a nejmenší zjištěné hodnoty x) 2 pro n > 7 ( x x ) s i n 1 D. Určení variačního koeficientu (relativní směrodatná odchylka v %) pro n < 7 s r 100 s / ~ x pro n > 7 s r 100 s / x E. Určení intervalu spolehlivosti pro n < 7 L 1,2 = K n R, kde K n je tabelovaný koeficient (tab. 16.2) a R je rozpětí pro n > 7 L 1,2 t s / n, kde t je tabelovaný koeficient (tab. 16.2) F. Vyjádření výsledku pro n < 7 ~ x L1,2 pro n > 7 x L 1,2 výsledek musí být doplněn údajem o počtu paralelních stanovení, n. Interval spolehlivosti udává, že skutečná hodnota leží s určitou zvolenou pravděpodobností (zpravidla 95%) uvnitř stanoveného intervalu. V analytické praxi se zřídka opakuje měření více než sedmkrát, proto je k hodnocení přesnosti výhodné stanovovat směrodatnou odchylku a mez opakovatelnosti z rozpětí. Údaj o přesnosti měření musí být vyjádřen se stejným počtem desetinných míst s jakým je vyjádřen výsledek. Z údajů v tab. 2 je zřejmé, že koeficiety k n a K n klesají zprvu strmě, poté se mění málo. Zvyšování počtu opakovaných měření nad asi 5 proto již má malý vliv na hodnocení přesnosti analýzy. Při analýze se mohou vyskytnout i tzv. chyby hrubé, které jsou zpravidla způsobeny nedbalostí či neznalostí analytika (chybně odebraný vzorek, chyba ve výpočtu, znečištění chemikálie atp.). Lze se jich vyvarovat dobrou znalostí principů prováděných měření a pečlivou a pozornou prací. Tab. 2. Statistické koeficienty pro výpočet směrodatné odchylky a intervalu spolehlivosti. Počet měření, n k n K n t/ n 2 0,8862 6,4 9,00 3 0,5908 1,3 2,48 4 0,4857 0,72 1,59 5 0,4299 0,51 1,24 6 0,3946 0,40 1,05 7 0,3698 0,33 0,92 8 0,3512 0,29 0,84 9 0,3367 0,26 0, ,3249 0,23 0,72 4

5 Příklad 1. Tři paralelní stanovení obsahu zinku v zinkové rudě vedla k výsledkům: 7,47%, 6,98% a 7,27 %. Určete střední hodnotu obsahu zinku a přesnost stanovení. Řešení: a) střední hodnota, ~ x 7, 27 %; b) rozpětí: R = 7,47 6,98 = 0,49; c) interval spolehlivosti: L 1,2 = 1,3 0,49 = 0,637. Obsah zinku v rudě je (7,27 0,64)%, tj. skutečný obsah zinku leží s 95% pravděpodobností v uvedeném intervalu (pochopitelně za předpokladu absence soustavné chyby). Nejistoty analytických stanovení V nejprostší formě je způsob statistického zpracování experimentálních výsledků uveden v předcházející kapitole, kde je však uvažován pouze vliv náhodných chyb a nikoli vliv mnoha dalších faktorů s měřením souvisejících, které přispívají k celkové nejistotě získaného výsledku. Stanovení analytu, stejně jako každý měřící proces, poskytuje výsledek, který je odhadem skutečné hodnoty, ale který je současně ovlivněn výskytem jak náhodných tak systematických chyb během měřicího procesu. Pro použiti k rozhodování např. o shodě vlastností výrobků se specifikací je třeba znát celkovou toleranci se kterou jsme analýzu schopni provést. Velká většina chemických měření se v praxi provádí bez opakování měření nebo maximálně jako duplicitní stanovení, použití statistické analýzy dat naměřených pro daný vzorek k odhadu úrovně náhodných chyb pak nepřipadá v úvahu. Výsledek stanovení nemůže představovat exaktní hodnotu a tedy bez přidruženého údaje, který by charakterizoval úroveň zahrnutých chyb, není plnohodnotnou informací. Takovým údajem, který byl nově zaveden k odhadu celkové tolerance se kterou jsme schopni měřit, je hodnota nejistoty měření. Existuje široká shoda v tom, že znalost nejistoty měření je důležitá jak pro laboratoř, tak pro odběratele výsledků. Bez znalosti nejistoty není možné odhadnout stupeň spolehlivosti výsledku při jeho užití a rovněž porovnávat různá měření téže veličiny navzájem. Současné pojetí nejistot měření a způsobů jejich vyhodnocování bylo definováno v roce 1993 v dokumentu International Organization for Standardization - ISO "Guide to the Expression of Uncertainty in Measurements" (dále GUM), který vznikl jako výsledek koordinovaného mnohaletého úsilí velkého počtu mezinárodních organizací. Toto pojetí lze charakterizovat heslovitě v následujících klíčových bodech: - nedokonalosti měřicího procesu se projevují v chybě výsledku jednotlivých měření, tato chyba nemůže být kvantifikována (pokud by byla, mohla by se provést korekce výsledku měření), proto je možné odhadnout jen nejistotu výsledku měření; - pojem rozšířené kombinované nejistoty specifikuje interval okolo výsledku měření, o kterém se domníváme, že s určitou vysokou pravděpodobností zahrnuje skutečnou hodnotu měřené veličiny; - nejistoty odrážející náhodné vlivy (způsobující náhodnou chybu výsledku měření) i ty, které odrážejí nekorigovatelné systematické vlivy (způsobují systematickou chybu měření, kterou není možno korigovat) jsou zpracovávány stejným způsobem při výpočtu kombinované nejistoty; - příručka ISO GUM předkládá statistické postupy, pomocí nichž lze shrnout jednotlivé příspěvky nejistoty odlišného charakteru do kombinované nejistoty, která by měla dle definice zohlednit všechny významné vlivy v měřícím procesu. Nejistota je zaváděna proto, aby se nesrovnávaly nesouměřitelné údaje, jako je tomu např. u různých měr přesnosti (preciznosti, precision) získaných na základě statistické analýzy naměřených hodnot opakovaných měření. Vyhodnocení nejistoty dle ISO definičně zahrnuje shrnutí všech vlivů ať již náhodných či nekorigovatelných systematických, které mohou mít na vztah výsledku ke skutečné hodnotě významný vliv. Z její definice jasně vyplývá, že je kvalifikovaným odhadem vztahu výsledku ke skutečné hodnotě měřené veličiny. Základním předpokladem použití nejistoty měření je kvantitativní odhad nejistoty měření podle jednotné metodiky platné pro všechny obory. Uvádění nejistoty měření znamená tedy nutnost provést kvalifikovaný odhad rozsahu hodnot okolo výsledku měření, o kterém se důvodně domníváme, že zahrnuje skutečnou hodnotu 5

6 měřené veličiny se zvolenou pravděpodobností (obvykle 95 %). Parametrem charakterizující tento rozsah a tedy vyjadřujícím kvantitativně nejistotu měření může být směrodatná odchylka, a takto vyjádřená nejistota se označuje jako standardní nejistota, anebo pološířka intervalu spolehlivosti, pak mluvíme o rozšířené nejistotě. Nejistota měření má obecně více složek. Některé z těchto složek mohou být odhadnuty na základě statistického rozdělení výsledků série měření (vyhodnocení nejistoty typu A) a mohou být vyjádřeny výběrovými směrodatnými odchylkami. Odhady ostatních složek mohou být založeny pouze na zkušenostech nebo jiných informacích (vyhodnocení nejistoty typu B). Vzhledem k tomu, že nejistoty obojího typu jsou v principu zcela srovnatelné, vyjadřuje se nejistota souhrnně jako standardní kombinovaná nejistota, u c, a nerozlišuje se způsob získání jejích příspěvků. Jednotlivé standardní nejistoty se slučují na základě Gaussova zákona šíření chyb. Hodnota výsledku měření, y, spolu s nejistotou měření se uvádí nejčastěji ve tvaru y ± U, kde U je rozšířená nejistota, charakterizující interval hodnot ve kterém leží skutečná hodnota veličiny y s určitou apriorní pravděpodobností. Jako hodnota této (konfidenční) pravděpodobnosti se volí nejčastěji 0,95. Standardní kombinovanou nejistotu u c je nutné převést na rozšířenou nejistotu U dle vztahu: U = k. u c, -1 kde k je koeficient rozšíření, pro nějž bylo dohodnuto používat ve většině případů hodnotu 2. Doporučovaný formát zápisu konkrétního výsledku ve formě např.: celkový dusík: 3,52 ± 0.14 % (váh.) je třeba presentovat s poznámkou uváděná nejistota je rozšířená nejistota dle ISO vypočtená s použitím koeficientu rozšíření rovném 2 a odpovídá tedy hladině významnosti přibližně 95 %, aby bylo jasně patrné, že se jedná o nejistotu měření a jaké hladině významnosti její intervalový odhad odpovídá. Pro oblast chemických analýz je základní příručkou pro vyhodnocování nejistot mezinárodní příručka Stanovení nejistoty analytického měření (překlad anglického vydání z r Kvalimetrie 11. M. Suchánek (Ed.), EURACHEM-ČR, Praha 2001). Pro vlastní odhad nejistoty jsou používány dva postupy. Princip prvého nazývaného složka po složce, je znázorněn na obr. 2, kdy celý proces je analyzován krok po kroku, jsou určeny jednotlivé složky, vyhodnoceny a posléze sloučeny do kombinované nejistoty. Tento postup vede i u relativně jednoduchých analytických stanovení k vyhodnocování velkého množství vlivů, což je velmi pracné. Druhý postup je nazýván shora dolů nebo empirický a využívá k odhadu nejistoty údaje, které jsou v laboratoři často již dostupné a to údajů z validační studie, dlouhodobého sledování přesnosti metody při řízení kvality např. formou regulačního diagramu, z účasti laboratoře v mezilaboratorních porovnáváních anebo z analýzy referenčního materiálu. Tam, kde jsou takové údaje k dispozici, což je často u rutinních měření, je tomuto způsobu dávána v současné době v analytických laboratořích jednoznačně přednost. Pokud je měřicí proces ve stabilním stavu a tento stav je pod kontrolou řízení kvality (např. vkládáním kontrolních vzorků) odhad nejistoty se přiřazuje ke všem měřením provedeným v dané konfiguraci a není třeba odhad průběžně opakovat. I jediné neopakované změření vzorku má svou nejistotu. 6

7 Specifikace Identifikace zdrojů nejistot Vyhodnocení složek nejistoty Výpočet kombinované a rozšířené nejistoty Obr. 2. Postup odhadu nejistoty Pro kvalitu odhadu nejistoty není určující, jakým způsobem byl získán. Tedy zdali rozborem měřicího procesu po jednotlivých krocích "složka po složce" nebo využitím celkových informací o výkonnosti metody např. z validace, regulačních diagramů a mezilaboratorních porovnávacích zkoušek, tedy postupem "shora dolů". Laboratoř by měla demonstrovat např. ve formě diagramu příčin a následků nebo i jinak, že si uvědomuje, které významné složky tvoří nejistotu měření v používané konfiguraci měřicího procesu a z jakých informací vycházela při vyhodnocení nejistoty měření. Jaký způsob laboratoř pro odhad hodnot zvolí, záleží na konkrétní situaci tj. používaném analytickém postupu a informacích, které má laboratoř k dispozici. Postup odhadu nejistoty musí být určován principem vhodnosti pro daný účel - není cílem vyhodnocovat do detailů všechny možné složky, ale určit rozborem často jen několik zdrojů nejistot, které mají šanci se významně uplatňovat. Princip silné diskriminace malých složek je odrazem formy zákona propagace nejistot a má za následek, že v praxi postačí detailně se zabývat pouze těmi nejistotami, které přesahují 1/3 velikosti maximální nejistoty. Pro správný odhad nejistoty měření je tedy kritické kvalifikovaně vytipovat tyto dominantní složky, ať už to jsou složky elementární jako je např. koncentrace použitého standardu nebo sdružené jako přesnost stanovené koncentrace kalibrační smyčkou a věrohodně je odhadnout. Platné číslice Každý číselný výsledek by měl být presentován číslem, v němž jednotlivé číslice mají vztah k realitě, mají smysl, tj. měl by obsahovat jen tzv. platné číslice. K tomu je pomůckou i odhad nejistoty měření. Dle definice jsou platnými číslicemi v čísle všechny jisté a jedna nejistá. Při experimentální práci jsou jisté ty, které lze odečíst přímo z kalibrované stupnice přístroje, nejistá je ta ležící mezi dvěma kalibračními značkami, tedy odhadnutá (viz obr. 3). Problémem může být určení platnosti číslice nula. Zjednodušeně řečeno, pokud je nula obklopena jinými číslicemi (30,26 ml), je platnou číslicí, pokud pouze indikuje řád čísla (0,03026 ml) je číslicí neplatnou; obě uvedená čísla obsahují shodně čtyři platné číslice. Koncová nula může, ale nemusí být platnou číslicí. Platnou je tehdy, udává-li přesnost údaje, např. v údaji 2,00 g jsou obě nuly platnými číslicemi, udávají, že hmotnost je známa na setiny g. 7

8 2 2,3 A 3 B 2,4 Obr. 3. Odečet objemu odměrného roztoku z byret A a B ilustruje, jak charakter stupnice ovlivňuje počet platných číslic v odečteném experimentálním údaji. V souladu s definicí platných číslic by v případě A měl být odečtený objem udán číslem např. 2,33 ml, v případě B číslem 2,328 ml (odhad poslední, nejisté číslice je subjektivní). Požadovaný výsledek je zpravidla získán až příslušným matematickým zpracováním experimentálních čísel. Výsledek matematických operací může mít nejrůznější počet číslic, např. v závislosti na rozsahu displeje kalkulátoru. Valná většina z nich může být neplatných, nemajících vztah k realitě, ani nevyjadřují přesnost údaje. V tom případě je vypočítané číslo nutno zaokrouhlit tak, aby výsledek obsahoval jen číslice platné. Základními pravidly pro určení počtu platných číslic jsou: - při sečítání a odečítání má být výsledek zaokrouhlen na stejný počet desetinných míst, kolik jich má ve výpočtu číslo s nejmenším počtem desetinných míst (3,5 + 0, ,84 = 15,37 = 15,4); - při násobení či dělení je pravidlem zaokrouhlovat výsledek tak, aby obsahoval stejný počet platných číslic jako číslo ve výpočtu s nejmenším počtem platných číslic (24 4,02/100,0 = 0,9648 = 0,96). - je-li při výpočtu použito kombinace uvedených početních výkonů, jednotlivé dílčí výsledky se vyjádří číslem majícím o jedno desetinné místo či o jednu platnou číslici víc než odpovídá výše uvedeným pravidlům. Teprve konečný výsledek se zaokrouhlí na příslušný počet desetinných míst či platných číslic ((35,2/10,113) (235,3 42,687) = 3, ,61 = 670,5). Ve většině případů je počet číslic, tak jak je udává displej kalkulačky, nutno snížit. V některých případech naopak; výsledek dělení 5,05/2,02 je na displeji zobrazen jako 2,5, avšak musí být uveden jako 2,50, aby byl vyjádřen správným počtem platných číslic. Pozor, čísla ve výpočtu, která jsou definována, jsou přesná čísla a neovlivňují počet platných číslic ve výsledku (poloměr kruhu, r, byl určen měřením na 2,22 cm, průměr kruhu, d = 2.r, je odtud 2. 2,22 = 4,44). Pravidla pro zaokrouhlování jsou všeobecně dobře známa: - poslední uváděná číslice se zvýší o jednotku, je-li následována číslicí větší než 5 nebo číslicí 5 následovanou dalšími číslicemi; - poslední uváděná číslice se nemění, je-li následována číslicí menší než 5; - končí-li zaokrouhlované číslo číslicí 5 zaokrouhlí se tak, aby se poslední uváděná číslice zvýšila o jednotku. V tomto případě se lze setkat se zaokrouhlením s preferencí sudé číslice (norma IEEE 754), tj. po zaokrouhlení je poslední číslice sudá. Příklad 2. Zaokrouhlování. Zaukrouhlete čísla a) 1,6; b) 1,4; c) 1,5; d) 2,5; e) 2,5001; f) 1,500 na celá čísla. Řešení: a) 2; b) 1; c) 2; d) 2; e) 3; f) 2. Příklad 3. Zaokrouhlování. Zaokrouhlete čísla a) 124; b) 126; c) 125 tak, aby měla dvě platné číslice. Řešení: a) 120; b) 130; c) 120 (nula zde pouze udává řád čísla, proto by bylo lepší pro jejich vyjádření použít exponenciální formu, tj., 1, atd. 8

9 Příklad 4. Vyjádřete výsledky následujících početních výkonů správným počtem platných číslic. a) 3,2 + 8,007 = 11,207 = 11,2 b) 2,00. 3,051 = 6,102 = 6,10 c) 5,05/(2,02. 2,0. 3,12) = 0, = 0,40 d) 3,2. 8,007 = 25,6224 = 26 Příklad 5. V tabulce jsou údaje získané při argentometrickém stanovení obsahu draslíku (ve formě KCl) ve vzorku minerálního hnojiva. Vzorek byl titrován odměrným roztokem 0,1098 mol/l AgNO 3 (indikátorem byl roztok chromanu draselného). Vypočítejte obsah draslíku (K) v hmotnostních procentech (A r (K) = 39,102). vzorek navážka vzorku, g spotřeba odm. roztoku, ml 1 0, ,7 2 0, ,7 3 0, ,4 Řešení: Z uvedených údajů se vypočítá obsah draslíku (údaj o spotřebě odměrného činidla zde určuje počet platných číslic ve výsledku): 1 12, , , /0,3654 = 14, = 14,9 % 2 11, , , /0,3329 = 15, = 15,1 % 3 12, , , /0,3535 = 15, = 15,1 % a) střední hodnota: ~ x 15,1% ; b) interval spolehlivosti: (R = 0,2, K 3 = 1,3) L 1,2 = 0,26; Výsledek: Hnojivo obsahuje (15,1 0,3)% K. Příklad 6. Určete průměrný 24 hodinový obsah kademnatých iotů v odpadní vodě z analýz vzorků odebíraných v šestihodinových intervalech. Stanovení je prováděno voltametricky na základě kalibrační přímky I [ A] = 2,03 c(cd 2+ ) [ppm]. vzorek č. proud I [ A] Řešení: a) z uvedených údajů se vypočítá obsah kadmia a uvede číslem majícím o jednu platnou číslici víc než by odpovídalo údajům vzatým k výpočtu: 1 313/2,03 = 154,8 ppm 2 243/2,03 = 119,7 ppm 3 166/2,03 = 81,77 ppm 4 236/2,03 = 116,3 ppm b) určí se průměrný obsah kadmia a vyjádří se příslušným počtem platných číslic (čtyřka v děliteli je definovaná číslice, takže neovlivňuje počet platných číslic): (154,8+119,7+81,77+116,3)/4 = 118,1 = 118 ppm. 9

10 Analytický chemik jako řešitel problému Úkolem chemické analýzy je poskytovat informace o kvalitativním a kvantitativním složení a strukturním uspořádání hmotných systémů. Tato informace nemůže však být samoúčelná, ale cíleně směrovaná k řešení daného problému a musí poskytovat co nejlepší podklady umožňující kvalifikované rozhodování. Přínos analytika jako člena řešitelského týmu spočívá v jeho - porozumění chemickým dějům, které jsou v pozadí problému, - znalosti vzorkování, uchovávání a zpracování vzorků, - vhodném použití separačních technik, - používání potřebných kalibračních technik a - schopnosti vybrat nejvhodnější metodu či metody pro koncové měření. Rozhodovací procesy v oblasti obchodu, životního prostředí, zdravotnictví i soudních expertíz jsou z více než 60% závislé na výsledcích chemických měření chemických analýzách. Výsledek analýzy není výrobkem, je informací, službou. Jak je tedy odběrateli zákazníku v nejširším slova smyslu (objednateli analýzy u zkušební laboratoře, kolegovi z výzkumného týmu university nebo průmyslového závodu, lékaři požadujícímu biochemické analýzy či státnímu, soudnímu anebo celnímu orgánu) dokladována kvalita této informace? Pod pojmem kvalita v současné době chápeme stupeň splnění požadavků, které jsou presentovány určitými znaky. Takové pojetí zdůrazňuje orientaci kvality na splnění požadavků zákazníka, mírou kvality není tedy excelence. U výsledků chemických analýz znamená kvalita především: - jejich vhodnost pro daný účel, - věrohodnost a reprodukovatelnost a - splnění finančních a časových omezení. Kvalita analytických výsledků je v poslední době velice často probíraným tématem na různých úrovních a aktuálnost tohoto problému v poslední době je odrazem následujících faktorů: - Zajištění správnosti analytických dat a tedy i jejich reprodukovatelnosti a vzájemné srovnatelnosti v národním a mezinárodním měřítku je problém, který nemá jednoduché řešení. Kvalita analytických výsledků je ovlivněna mnoha faktory, které je třeba systematicky mít pod kontrolou. - Technologický pokrok v posledních letech zcela změnil způsob provádění chemických analýz. Využívání nových instrumentálních metod, často na fyzikálním principu, podstatnou měrou zvýšilo jak produktivitu provádění, tak i možnosti stanovovat stopové a ultrastopové koncentrace cílových látek v souladu s požadavky legislativy a ochrany životního prostředí. - Chemie postrádá metrologický systém, obdobný fyzikálním měřením např. hmotnosti, délky či času, kde na principu pyramidální návaznosti základních mezinárodních etalonů na národní etalony a etalony kalibračních laboratoří je zajištěno napojení koncové terénní laboratoře do řetězce porovnávání a tedy je tak principiálně zajištěna porovnatelnost výsledků jednotlivých zkoušek. - Zabezpečení kvality výsledků chemických analýz a další rozvoj měřicí infrastruktury se dostalo v Evropě pod silný tlak po vzniku společného evropského trhu. Vzájemné uznávání výsledků analýz a tedy i atestů výrobků představuje významné ulehčení obchodu a snížení nákladů na opakování analýz. Stejně tak řešení problémů životního prostředí a zdraví obyvatel přesahuje hranice jednotlivých států a vyžaduje si navzájem srovnatelná měření. Donedávna byla nejvyšším argumentem pro spolehlivost a důvěryhodnost analytických výsledků analytikova erudice a etika, a žádný z uživatelů se neodvážil položit otázku Lze tomu věřit? nebo Je to možné?. Posléze nastoupilo období apriorní nedůvěry. Vedly k tomu zkušenosti s nesprávnými výsledky, ať již získanými s nejlepším vědomím a svědomím či získanými nekvalitní prací. V důsledcích totiž nejsou mezi nimi rozdíly obě příčiny poškozují uživatele výsledků a způsobují často těžké ztráty na majetku, zdraví nebo životním prostředí, neboť nejdražší analýza je špatná analýza. Nový přístup tedy nastoluje nutnost, aby laboratoře svou důvěryhodnost, spolehlivost a věrohodnost byly neustále připraveny prokazovat. Aby prokazovaly, jak systematicky pečují o kvalitu výsledků prováděných analýz. Systematická pozornost je v laboratořích věnována prvkům určeným na základě letitých zkušeností analytiků: - prověrkám vhodnosti používaných metodik pro daný účel, - efektivním statistickým způsobům zpracování výsledků a volbě optimální experimentální strategie, 10

11 - používání vyzkoušených a ověřených metod analýzy a přístrojů jejich prověřování -validaci, - péči o zvyšování kvalifikace personálu, - používání referenčních materiálů, referenčních měření a účasti v programech mezilaboratorních porovnáváních výsledků analýz zkoušení způsobilosti. Jedním z dalších způsobů jak prokázat způsobilost laboratoře je také akreditace. Uživatelé vkládají svou důvěru v akreditační orgány, které vstupují do hry jako morální, odborně fundované a důvěryhodné orgány a přebírají svými výroky o způsobilosti laboratoří velký podíl odpovědnosti. V laboratořích se dále uplatňuje způsob managementu laboratoří založený na obecných zkušenostech i z jiných odvětví a formalizovaný v mezinárodně uznávaných systémech managementu kvality zpracovaných v technických normách. Uplatnění takové péče o kvalitu něco laboratoř stojí, což se nutně musí promítnout do ceny analýzy. V rukou zákazníka je pak rozhodnutí, zda cena analýzy bude tím jediným kriteriem, kterým se bude řídit při zadávání zakázky. Musí mít při svém rozhodování na paměti zkušenost vyjádřenou slovním spojením Zabezpečování kvality je drahou záležitostí, ale pouze do té doby, než laboratoř prohraje první soudní spor. Zpracování dat chemických analýz Aby byla informace poskytovaná chemickou analýzou kvalitní, tedy vhodná pro daný účel, je třeba již při návrhu experimentů sekvenci pokusů plánovat tak, aby výsledky pozorování bylo možno co nejjednoznačněji zpracovat do požadované informace. Pro metodologii i analytických experimentů je dnes patrný přesun od dřívější logické analýzy výsledků k matematickému zpracování prováděnému na osobních počítačích, které jsou často nyní přímo součástí analytické instrumentace. Pro tento účel je využíváno poznatků oboru, který se nazývá chemometrie a zabývá se využitím matematických metod pro: - volbu optimální experimentální strategie a - k získávání maxima relevantních informací z experimentálních výsledků a jejich uvádění. Rozvoj analytické chemometrie v osmdesátých a devadesátých letech minulého století byl dále stimulován požadavkem na vyloučení subjektivního faktoru při zpracování výsledků na jedné straně, ať již vyplývající z požadavku na zvýšení produktivity zpracování výsledků nebo automatizace stanovení, a na druhé straně možností provádět i na osobních počítačích relativně složité statistické výpočty. Chemometrické postupy využívané v analytické chemii lze rozdělit do několika skupin: - Statistické nástroje pro opakovaná měření - Statistické testování - Analýzu rozptylu - Kalibrace, regresní a korelační metody - Plánování experimentů - Multivariantní analýza a - Statistické řízení kvality a regulační diagramy. Příslušné statistické postupy jsou podrobně popsány v mnohých publikacích (viz Dodatek 3; v příslušné literatuře je třeba hledat i vysvětlení řady zde použitých termínů). K použití běžných statistických nástrojů není pak třeba mít na osobním počítači žádný speciální program, většinu výpočtů lze řešit s využitím statistických funkcí běžného tabulkového editoru. Není třeba znát složité statistické vzorce, je však nutné se seznámit s předpoklady, za jakých je možno daný statistický nástroj použít a dále jak interpretovat jeho výsledky. Validace analytických metod, instrumentace a software Primární otázkou při provádění analytických měření je prověřit, zda nástroje, které analytik má k dispozici analytickou metodu, instrumentaci i softwarové vybavení fungují tak, jak očekává, tedy mají-li v konkrétním prostředí jeho laboratoře takové charakteristiky, výkonnostní parametry, že je možné s jejich pomocí provádět požadovaná analytická stanovení a budou poskytovat výsledky očekávané kvality. Takové prověřování je nyní nazýváno validací, která představuje obecně získání důkazu ve formě dokumentace, který poskytuje vysoký stupeň jistoty, že určitý proces bude trvale poskytovat produkt odpovídající předem určené specifikaci. 11

12 V praxi analytické laboratoře je běžné ověřovat, zda metoda chodí a validace nepředstavuje nic převratně nového. Nové, kromě vlastního názvu, je důraz na vedení experimentů tak, aby bylo možno rozhodnout o vhodnosti pro daný účel a nutnost celý tento proces dokumentovat ve formě validační studie. Validaci vlastního postupu analýzy musí předcházet validace používané instrumentace a softwaru, která též prověří, že výkonnostní parametry konkrétní přístrojové konfigurace v prostředí laboratoře jsou vhodné pro použití pro uvažované měření a zpracování dat. Zkoumáme-li výkonnostní parametry metody např. pro účely jejího zavedení jako standardní metody, formou mezilaboratorní validace mluvíme o externí nebo mezilaboratorní validaci. Pokud není možné zapojit do validace externí laboratoře, např. u metody pro kontrolu nově uváděného léčiva, pak nemůžeme zjistit všechny parametry metody např. míru přesnosti (preciznosti) metody reprodukovatelnost, která je, dle definice svých podmínek, vázána na uskutečnění měření v několika laboratořích. V tomto případě mluvíme o vnitřní validaci. Chceme-li zavézt v laboratoři postup, který vychází ze standardní (validované) metody používané pro danou analýzu (příkladem standardních metod jsou nejen metody publikované v technických normách, ale i metody v daném oboru obecně uznávané, je třeba provést určité ověření, zda i v prostředí naší laboratoře metoda vykazuje deklarované parametry této standardní metody. Taková validace, která neprověřuje všechny parametry metody, je obvykle nazývaná ověřením - verifikací. Mezi parametry, které obvykle validací prověřují, patří: - přesnost (preciznost), - správnost (trueness pravdivost, existence vychýlení, bias), - rozsah, - mez detekce, - mez stanovitelnosti, - linearita, - selektivita a specifičnost, - citlivost, - robustnost. Pro výběr validačních parametrů je základním kriteriem nutnost získat dostatek údajů, aby bylo možno posoudit, zda metoda je vhodná pro zamýšlený účel. Mez detekce bude zřejmě validovaným parametrem u stopových stanovení polutantů, nebude však pravděpodobně zkoumána u metody stanovení obsahu hlavní složky. K revalidaci metody je třeba přistoupit při změně postupu vedoucí k změně parametru přesahující rozsah, změně matrice vzorku, změně typu instrumentace a když při používání řízení kvality indikuje, že systém se dostává mimo kontrolu. Kvalifikace návrhu Kvalifikace při instalaci Funkční kvalifikace Provozní kvalifikace Obr. 4. Kvalifikace měřicího zařízení 12

13 Validace přístrojové techniky je ověřením, že přístroj použitý pro danou analytickou metodu vykazuje plnou funkční způsobilost. U validace složitější analytické instrumentace vyžadující spolupráci uživatele a výrobce či dodavatele se prosazuje v poslední době model kvalifikace instrumentace znázorněný na obr. 4. U počítačových systémů, stejně jako u instrumentace obecně, se očekává, že uživatel odpovídá za to, že počítačový systém byl validován, má počítačový systém pod kontrolou, že systém otestoval a je schopen doložit, že má požadovanou funkčnost. Metrologie v chemii, referenční materiály Metrologie je vědou zabývající se měřením ve všech jejích teoretických i praktických aspektech. V oblasti legální metrologie pak zákonnou úpravou vytváří potřebnou metrologickou infrastrukturu, ať již ve formě jednotných jednotek měření nebo dalších opatření, která mají za účel chránit zájmy společnosti a podporovat její technický rozvoj. Metrologie chemických měření, tedy metrologie látkového množství se základní jednotkou SI mol, byla dlouho popelkou v metrologii, která se převážně zabývala problémy fyzikálních měření. Důležitým metrologickým konceptem zajišťujícím srovnatelnost měření je pojetí návaznosti pyramidálním srovnáváním měření a kalibrace měřidel až k mezinárodním etalonům základních jednotek SI soustavy. Návaznost je vlastnost výsledku měření, pomocí níž může být výsledek vztažen ke stanovené referenci přes dokumentovaný nepřerušený řetězec kalibrací, z nichž každá se podílí svým příspěvkem na stanovené nejistotě měření. Specifita metrologie chemických měření spočívá především v jejich diverzitě. Zatímco počet typů měření fyzikálních veličin nepřesahuje v zásadě počet základních a odvozených veličin, počet chemických měření je prakticky nekonečný a je rovný součinu počtu chemických sloučenin a počtu možných matric. Další odlišností od fyzikálních měření je vliv matričních efektů na stanovení látkového množství. Zatímco určení hmotnosti prakticky nezávisí na složení objektu, stanovení látkového množství určité látky (analytu) je silně závislé na složení matrice. Tak např. postup měření látkového množství olova v pitné vodě se značně odlišuje od stanovení olova ve vzorku půdy. Systém návaznosti v chemii není tedy realizován pomocí kalibrací měřidel, ale pomocí měření, v nichž přebírají úlohu etalonu tam, kde je to technicky možné, certifikované referenční materiály, referenční materiály, jejichž referenční hodnota vlastnosti byla stanovena předepsaným způsobem a je specifikována v certifikátu spolu s odhadnutou nejistotou a návodem na použití zahrnujícím u pevných látek minimální navážku, pro kterou je vlastnost certifikována. V oblasti metrologie v chemii se v Evropě i ve světě vytváří strukturovaný systém měření založený na použití různých kategorií referenčních materiálů a provádění referenčních měření obdobný modelu fyzikálních měření, jak ho znázorňuje obr. 5. Referenční materiály v chemii dělíme na dva základní typy čisté látky a tak zvané matricové referenční materiály, které obsahují stanovovanou složku v reálné matrici např. v sedimentu, biologickém materiálu apod. Výroba a certifikace referenčních materiálů je nákladnou a zdlouhavou záležitostí, kterou zvládají výrobci, z nichž mnozí významní mají podporu státu. K získání informací o jednotlivých referenčních lze použít různých zdrojů. Byla vybudována databáze referenčních materiálů COMAR ( která umožňuje při zadání analytu, jeho koncentrační úrovně a druhu matrice zjistit, zda existuje referenční materiál vhodný pro danou analýzu. 13

14 Návaznost Srovnatelnost SI PRM CRM RM Terénní laboratoře Referenční laboratoře Národní metrologické laboratoře Obr. 5. Schéma strukturovaného systému měření. RM - referenční materiály, CRM - certifikované referenční materiály, PRM primární referenční materiály, SI základní jednotka SI soustavy (v chemii mol). Realizace návaznosti: horizontální návaznost srovnávací měření uvnitř jednotlivých prstenců, vertikální návaznost mezi jednotlivými prstenci. Zákonná úprava metrologie definuje též kategorizaci měřidel. Některá měřidla používaná pro stanovení sankcí, poplatků, tarifů a daní, pro ochranu zdraví, pro ochranu životního prostředí, pro bezpečnost při práci apod. jsou stanovena jako měřidla stanovená. U těchto měřidel je stanovena povinnost používat jen schválené typy, je stanoven způsob kalibrace i lhůty, ve kterých je nutné kalibraci provádět. Naprostá většina instrumentace v analytických laboratořích nepatří do této kategorie a tak je v odpovědnosti pracovníků analytické laboratoře stanovit způsob kalibrace a péče o instrumentaci včetně softwarového vybavení a jak často se mají tyto úkony provádět. Toto spolu s odpovědností jednotlivých pracovníků, evidencí měřidel (včetně referenčních materiálů) a schémat zajišťování návaznosti zachycuje obvykle dokument nazývaný metrologický řád laboratoře. Systémová péče o kvalitu a akreditace Systematická péče o kvalitu se stala jedním ze základních přístupů managementu výrobních podniků v posledním desetiletí ve světě i v naší republice. Po velkých společnostech se zavádění managementu kvality podle mezinárodně uznávaných principů formulovaných v normách mezinárodní organizace pro normalizaci ISO řady ISO 9000 začaly všímat i menší firmy a odhaduje se, že v ČR získalo certifikát dle ISO 9001 již několik tisíc podniků. Na analytickou laboratoř lze pohlížet jako na produkční jednotku, která ze vstupů (analytické problémy, vzorky, činidla, standardy aj.) vytváří produkty analytickou informaci, výsledky. Je tedy možno pojetí systémů managementu kvality založených na systematické péči o všechny prvky, které mohou ovlivňovat kvalitu, aplikovat, po přihlédnutí ke zvláštnostem analytické laboratoře, i v tomto prostředí. Systém managementu kvality je založen na souboru striktně dodržovaných zásad, vytvořených v laboratoři a zachycených v dokumentu zvaném obvykle příručka kvality. Management kvality sestává z: - zabezpečování kvality (Quality assurance), které představuje obecná a perspektivní opatření zavedená v laboratoři, která laboratoř používá k zajištění kvality svých činností (validované a dokumentované metody, vyhovující laboratorní prostředí, udržované a kalibrované zařízení, vzdělaný, zacvičený a zkušený personál, postupy kontroly a vydávání zpráv, návaznost výsledků, interní audity a přezkoumání systému, požadavky na činidla, kalibrační a kontrolní standardy, referenční materiály, plány vzdělávání a záznamy o něm aj.) a - řízení kvality (Quality Control) představující postupy, přijaté personálem laboratoře k průběžnému sledování postupů a výsledků měření s cílem rozhodnout, zda jsou výsledky dostatečně spolehlivé, aby vyhověly potřebě zákazníka a mohly být mu předány (používání kontrolních vzorků a regulačních diagramů, analýza referenčních materiálů/vnitřních standardů, analýza slepých vzorků a vzorků s přídavkem a též pravidelná účast v mezilaboratorních projektech zkoušení způsobilosti). 14

15 Laboratoř může sama vyvinout takový systém managementu kvality své práce nebo zabezpečit důvěryhodnost zavedením, prověřením a používáním některého z mezinárodně uznávaných systémů managementu kvality, kterými jsou: - systém akreditace podle normy ISO/IEC (nebo ISO pro klinické laboratoře), kterým laboratoř prokazuje technickou způsobilost, - systém Správné laboratorní praxe (SLP), který se používá v regulované sféře pro laboratoře zabývající se studiemi bezpečnosti užití studovaných látek a - systém certifikace podle obecných zásad normy ISO 9001 (2000), používaný v podnikových laboratořích zabývajících se výkonem vnitřní kontroly. Akreditace podle normy ISO/IEC a ISO Princip fungování akreditačního systému je založen na myšlence, že pokud laboratoře budou z hlediska technické způsobilosti posuzovány třetí stranou nezávislým akreditačním orgánem jednotným způsobem, bude tak vytvořena racionální báze pro výběr laboratoří, jejichž výsledky bude možno navzájem uznávat. Akreditace je tedy oficiální uznání, že zkušební laboratoř je způsobilá provádět určité zkoušky. Jednotnost posuzování je dána jednotnými požadavky, které musí laboratoře splňovat, pokud chtějí prokázat, že provozují systém managementu kvality a že jsou odborně způsobilé a schopné dosahovat technicky platných výsledků. Příslušné požadavky jsou formulovány v technických normách (norma ISO/IEC 17025, ISO 15189) a jsou slaďovány akreditačními orgány a nadnárodními koordinačními orgány. Co tedy konkrétně znamená, když laboratoř prohlašuje, že pracuje v systému managementu kvality, který je v souladu se zásadami příslušné normy ISO, nebo dokonce má "Osvědčení o akreditaci" dle této normy? Z tohoto tvrzení by mělo vyplývat následující: - jedná se o nezávislou laboratoř s jasně definovanou organizační a manažerskou strukturou s definovanými a dokumentovanými kompetencemi jednotlivých pracovníků; - laboratoř má fungující systém managementu kvality, manažera kvality a všechny postupy dokumentované v příručce kvality; - uzavírání zakázek, zabezpečování analýz mimo vlastní laboratoř, způsob uvádění výsledků, včetně nejistoty měření tam, kde je to vyžadováno, i nákup materiálů a služeb jsou v této laboratoři prováděny definovaným standardním způsobem popsaným v příručce kvality; - laboratoř disponuje kvalifikovaným personálem, vhodnými prostorami a vybavením na potřebné úrovni k provádění deklarovaných zkoušek, přístroje jsou systematicky kalibrovány a udržovány, personál si plánovitě zvyšuje kvalifikaci; - zkušební metody, které laboratoř používá, byly předem prokazatelně prověřeny, že vyhovují požadovanému použití validovány; - návaznost výsledků měření laboratoře je ve vhodné míře garantována používáním certifikovaných referenčních materiálů nebo účastí v mezilaboratorních porovnávacích zkouškách. Zabezpečení kvality výsledků je monitorováno a dokumentováno nástroji vnitřního i vnějšího řízení kvality; - zacházení a transport vzorků (ev. i vzorkování) je v laboratoři prováděno stanoveným způsobem, - v laboratoři jsou prováděny plánovitě vnitřní prověrky systému managementu kvality a prověrky systému vedením; - pro laboratoř je povinností spolupracovat se zákazníkem, včetně zajištění jeho přítomnosti při provádění zkoušek, pokud si to přeje, a informovanosti o postupu případně zdržení analýz. Správná laboratorní praxe Dalším systémem managementu kvality, se kterým, i když s menší četností než s akreditací, se můžeme setkat v analytických laboratořích je systém Správné laboratorní praxe (GLP Good Laboratory Practice). SLP je mezinárodně dohodnutý systém zabezpečení a kontroly kvality práce laboratoří, který se ověřuje a jeho splnění se potvrzuje vydáním osvědčení. Jeho zavedení je zákonnou povinností pro laboratoře v oblasti kontroly chemických látek (včetně léčiv) s cílem minimalizovat jejich zdravotní rizika pomocí zkoušení a posuzování potenciálního nebezpečí těchto látek. Účelem SLP je zabezpečení vysoké kvality a věrohodnosti výsledků laboratorních studií při: 15

16 - neklinickém testování léčiv, - testování účinků pesticidů, - testování přísad do potravin a - testování výbušnin. SLP a akreditace mají mnoho společných požadavků, zásadní rozdíl mezi oběma systémy tkví v důrazu SLP na řízení archivovaných primárních dat s možností úplné rekonstrukce studie, zdůrazňování popisu všech standardních činností ve formě Standardních pracovních postupů (SOP Standard Operation Procedure), existence nezávislého útvaru zabezpečování kvality a zaměření na studii vedenou vedoucím studie v oblastech, pro které je aplikace tohoto systému managementu kvality ze zákona povinností. 16