RM při verifikaci linearity v českém národním systému mezilaboratorního porovnávání v klinické biochemii

Transkript

1 RM při verifikaci linearity v českém národním systému mezilaboratorního porovnávání v klinické biochemii Reference materials at verification of linearity. Czech national interlaboratory comparison system in clinical biochemistry proficiency testing Luděk Dohnal 1, Paul Faigl 2, Květa Pelinková 3 1 Emeritní odb. pracovník Referenční laboratoře pro klinickou biochemii MZ ČR, ludek.dohnal@seznam.cz 2 Technical Consultant for Advanced Clay Technologies, Assoc. Member of the Royal Australian Chem. Soc., paul.faigl@adclaytech.com 3 Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky Všeobecné fakultní nemocnice v Praze a 1. lékařské fakulty University Karlovy, kveta.pelinkova@vfn.cz Paper describes usage of two reference materials. These materials are intended primarily for linearity control on routine determinations of frequent analytes in clinical laboratories - Na +, K +, Cl -, Li +, Ca total, P inorg., glucose, urea, creatinine, Mg 2+, triacylglycerols. It is described their application and samples of graphic evaluation with comments are presented. Motto: Dí jemu Pilát: Co jest pravda? (1) 1. Úvod Kalibrační závislost v analytické chemii je závislost měřeného signálu na koncentraci stanovovaného analytu. Jednou z charakteristik, které určují vlastnosti analytické metody, je její linearita resp. linearita její kalibrační závislosti. Aby byla metoda lineární v celém měřícím rozsahu je důležité především tehdy, když kalibrační závislost je aproximována přímkou. Pokud je podmínka linearity splněna, pak ke konstrukci kalibrační závislosti postačují dva body. Často bývá jedním z nich odezva slepého pokusu (nulová koncentrace analytu) a druhým odezva kalibrátoru. Tento způsob kalibrace se v klinické biochemii často používá. Koncentrace analytu v použitém kalibrátoru bývá nejčastěji v rozmezí tzv. fysiologických hodnot resp. referenčních mezí daného analytu. Je tedy žádoucí preventivně a/nebo v čase potřeby linearitu kontrolovat resp. verifikovat v celém rozsahu stanovitelnosti, tedy i při koncentracích, které jsou těm fysiologickým či referenčním značně vzdálené. 117

2 2. Materiál a metody V českém národním systému mezilaboratorního porovnávání v klinické biochemii, jehož organisátorem je SEKK spol. s r.o., existuje již více než 10 let cyklus Verifikace linearity měření. Cyklus se koná jedenkrát ročně pro následující analyty: Na +, K +, Cl +, Li +, Ca celkový, P anorganický, glukosa, močovina, kreatinin. Od r došlo ke změně používaného RM. Místo Li + je Mg 2+ a triacylglyceroly Materiál Align - Vital Scientific, USA (2) Deklarované použití: hodnocení linearity metod stanovení. Balení: roztoky v kapacích lahvičkách z plastické hmoty, 7 různých koncentrací po 12 ml. Charakteristika: syntetické roztoky připravené odvážením čistých substancí a jejich rozpuštěním v definovaném objemu rozpouštědla nematricový materiál.. Skladování: +2 až +8 C. Expirace: typicky 1 rok. Analyty a jejich nejvyšší a nejnižší koncentrace jsou uvedeny v tab. 1. Tab. 1 analyt jednotky dolní mez horní mez Na + mmol/l K + mmol/l 1 20 Cl - mmol/l Li + mmol/l 0 12 Ca celk. mmol/l 0 5 P anorg. mmol/l 0 7,4 glukosa mmol/l 0 55 močovina mmol/l 0 53 kreatinin µmol/l Materiál Matrix Plus Reference Kit Verichem (3) Deklarované použití: kalibrace a verifikace kalibrace metod stanovení. Balení: roztoky v kapacích lahvičkách z plastické hmoty, 5 různých koncentrací po 15 ml. Charakteristika: syntetické roztoky připravené odvážením čistých substancí a jejich rozpuštěním v definovaném objemu roztoku hovězí sérové bílkoviny pseudomatricový materiál. Skladování: +2 až +8 C. Expirace: 21 měsíců od data výroby. Analyty a jejich nejvyšší a nejnižší koncentrace jsou uvedeny v tab

3 Tab. 2 analyt jednotky dolní mez horní mez Na + mmol/l K + mmol/l 1 9 Cl - mmol/l Mg 2+ mmol/l 0,3 2,8 Ca celk. mmol/l 1,3 3,8 P anorg. mmol/l 0,3 3,5 glukosa mmol/l 1,4 40 močovina mmol/l 1,8 49 kreatinin µmol/l triacylglyceroly mmol/l 0, Výsledky a diskuse Výsledky získané analysou popsaných RM nejsou primárně určené k posouzení správnosti (accuracy) ani přesnosti (precision) stanovení (5), ale k posouzení linearity. Pro posouzení linearity slouží tedy koncentrace uváděné výrobcem primárně jako relativní čísla a na vodorocné ose v grafech jsou označeny písmeny. Přesto je možné správnost orientačně posoudit. Pokud je v regresní rovnici (vpravo dole v grafu výsledků účastníka) u proměnné x koeficient značně odlišný od jedničky, tedy např. 0,8 a méně nebo 1,2 a více, pak pravděpodobně správnost není v pořádku. Součástí hodnocení cyklu zasílaného účastníkům jsou klasické lineárně regresní závislosti s přímkovým modelem pro všechny analyty. V jedné sadě těchto grafů jsou výsledky všech účastníků cyklu, v druhé sadě výsledky konkrétního účastníka. V každém grafu je uvedena rovnice vypočtené regresní přímky a v grafu výsledků všech účastníků jejich počet n. Ukázky grafů jsou na obrázcích č. 1 a 2. Obr. 1 Výsledky všech účastníků cyklu, rok 2009, draselný kation 119

4 Obr. 2 Výsledky jednoho účastníka cyklu, rok 2009, draselný kation Podrobné matematicko-statistické posouzení linearity lze provést např. pomocí lineární regrese metodou nejmenších čtverců s lineárním, kvadratickým a kubickým modelem s následným testováním. Lze testovat především jednotlivé regresní koeficienty, zda jsou významně nenulové. Dále pak např. významnost regresního modelu (Fischer-Snedocorův test), skedasticitu residuí (Cook-Weisbergův test), normalitu distribuce residuí (Jarque- Berraeův test), autokorelaci residuí (Waldův test), trend residuí (znaménkový test). A konečně pro jednotlivé modely lze porovnat střední chyby predikce, residuální součty čtverců a průměry absolutních hodnot residuí. Podrobnosti lze nalézt ve sdělení Posouzení kalibrační závislosti ze semináře Zajištění kvality analytických výsledků v Komorní Lhotce v r (6). Na obrázcích č. 3 a 4 je ukázka zajímavé situace. Obr. 3 Výsledky všech účastníků cyklu, rok 2009, chloridový anion 120

5 Obr. 4 Výsledky jednoho účastníka cyklu, rok 2009, chloridový anion U jednoho účastníka byla v rozsahu 50 až 200 mmol/l zjištěna zcela nevyhovující linearita. Regresní rovnice na obr. 4 (vpravo dole) naznačuje, že jeho výsledky jsou přibližně třikrát vyšší. Podrobnějším zkoumáním grafu na obr. 4 zjišťujeme, že linearita a pravděpodobně i správnost je v rozmezí B až E (cca 60 až 130 mmol/l) v pořádku. Koncentrace nižší než 60 mmo/l účastník prakticky nebyl schopen stanovit viz nesprávný nulový výsledek pro vzorek A (50 mmol/l). U vzorků s koncentracemi vyššími než 130 mmol/l účastníkovy trojnásobně vyšší výsledky jsou s velou pravděpodobností způsobeny nesprávným ředěním vzorku. Pokud byl vzorek ředěn správně, pak došlo patrně k hrubé chybě při zpětném přepočtu. Jinou zajímavou skutečnost ilustrují obrázky č. 5 a 6. Zatímco při stanovení anorganických fosfátů se linearita v účastnických laboratořích od r do r výrazně nezměnila, v témže období se u tohoto analytu výrazně zlepšila mezilaboratorní srovnatelnost. Obr. 5 Výsledky všech účastníků cyklu, rok 2005, anorganický fosfor 121

6 Obr. 6 Výsledky všech účastníků cyklu, rok 2010, anorganický fosfor 4. Závěr Tento cyklus MPZ je pomůckou pro laboratoře, které potřebují verifikovat linearitu svých stanovení. Jeho prostřednictvím se též dozvídají o reálných možnostech linearity stanovení této skupiny analytů v naší republice. To je významné především tehdy, jestliže laboratoř stanovení konkretních analytů zavádí anebo mění metodu. Z uvedeného příkladu je zřejmé, že cyklus je schopen i upozornit na problém se správností, a to především v oborech koncentrací, v nichž je možnost kotroly správnosti omezená. Problémem je nedostatečná nabídka vhodných RM a jejich dostupnost a cena. Specifickým problémem je značná nestabilita řady analytů, které jsou v klinických labratořích běžně stanovovány, např. Bilirubinu a enzymů. 5. Literatura 1) Biblí česká šestidílná, Jan 18:38, ( ) 2) Dohnal L., Schneiderka P., Břichnáčová A.: Ověření linearity a meze stanovitelnosti. Sborník symposia klinické biochemie FONS 96, vyd. Stapro s.r.o., Pardubice 1996, str ) ( ) 4) Bičovský K., Dempír J., Dohnal L., Friedecký B., Kratochvíla K., Kučera J., Plzák Z.: Používání referenčních materiálů v chemické analýze - metodická příručka. Kvalimetrie 14, Eurachem-ČR, Praha ) Terminologická komise: Metrologická terminologie v chemii. Chem. Listy vol. 94, (2000) 6) Dohnal L., Faigl P.: Posouzení linearity kalibrační závislosti. Sborník přednášek 10. ročníku semináře Zajištění kvality analytických výsledků, Komorní Lhotka, , ( ) 122