Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin

Transkript

1 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin Mikroflóra vybraných fermentovaných salámů Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D. Vypracovala: Bc. Veronika Kovářová Brno 2008

2 Zadání diplomové práce 2

3 PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Mikroflóra vybraných fermentovaných salámů vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně. dne 30. dubna 2008 podpis diplomanta Kovářová Veronika 3

4 Vzor 4 PODĚKOVÁNÍ Děkuji touto cestou vedoucímu diplomové práce Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za odborné vedení a cenné rady při zpracování této diplomové práce, taktéž i Ing. Haně Polednové za poskytnuté podklady a připomínky. Mé poděkování patří také celému Ústavu agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin. A v neposlední řadě také mým rodičům za umožnění a podporu při studiu. 4

5 ABSTRAKT Cílem této práce bylo zhodnotit vliv startovacích kultur na mikrobiální osídlení fermentovaných salámů. Běžnými laboratorními mikrobiologickými metodami byl zjišťován počet bakterií mléčného kvašení, anaerobních bakterií, celkový počet mikroorganismů, koliformní mikroorganismy a také plísně a kvasinky. K analýzám byl použit fermentovaný salám Poličan Kosteleckých uzenin a.s. a také příslušná kořenící směs. Bylo zjištěno, že technologicky nejdůležitější skupinou mikroorganismů byly bakterie startovací kultury (Pediococcus pentosaceus, Staphylococcus carnosus a Staphylococcus xylosus), jejichž počty se výrazně projevily v počtech tří analyzovaných skupin mikroorganismů (BMK, CPM, ANA). Počty nežádoucích koliformních bakterií, plísní a kvasinek byly nízké. Použitá kořenící směs obsahovala relativně vysoké počty mikroorganismů. Celkově lze říci, že salámy na konci výrobního procesu nebyly hygienicky závadné. KLÍČOVÁ SLOVA fermentované salámy, startovací kultury, mikroorganismy 5

6 ABSTRACT The objective of the graduation thesis was evaluation of influence of the starting cultures on microbial colonisation of fermented salamis. Common laboratory microbiology methods ware used on findings of quantity of the lactic acid bacteria, anaerobic bakteria, total quantity of microorganisms, coliform microorganisms, fungi and yeasts. For analyse was provided fermented salami Poličan from Kostelecké uzeniny a.s. and mixture of spice. It was found, that technologically the most important category of microorganisms was bacteria of starting culture (Pediococcus pentosaceus, Staphylococcus carnosus and Staphylococcus xylosus). Their quantity showed in quantities of three analysed categories of microorganisms (LAB, TQM, ANA). Quantity of the undesirable coliform bacteria, fungi and yeasts was low. Used mixture of spice contained relatively high quantities of microorganisms. It is possible to say, that salamis at the end of the process of manufacture were not unhealthy. KEY WORDS: fermented salamis, starter cultures, microorganisms 6

7 OBSAH 1. ÚVOD CÍL PRÁCE LITERÁRNÍ PŘEHLED Fermentované masné výrobky Vývoj fermentovaných masných výrobků Rozdělení fermentovaných masných výrobků Údržnost Překážkové efekty ve fermentovaných salámech Vady fermentovaných masných výrobků Balení fermentovaných masných výrobků Technologie výroby fermentovaných masných výrobků Suroviny pro fermentované salámy Výroba fermentovaných výrobků Zrání Technologický postup výroby Kosteleckého Poličanu Mikrobiální kultury Základní funkce a vlastnosti čistých mikrobiálních kultur Výroba čistých mikrobiálních kultur Startovací kultury Historický vývoj startovacích kultur pro fermentované masné výrobky Význam startovacích kultur pro fermentované masné výrobky Aplikační formy startovacích kultur Ochranné kultury Bakteriociny Plísňové kultury Mikroflóra fermentovaných masných výrobků Bakterie mléčného kvašení Význam bakterií mléčného kvašení

8 Rozlišení bakterií mléčného kvašení Bakterie používané ve startovacích kulturách Rod Pediococcus, (čeleď Lactobacillaceae) Rod Lactobacillus, (čeleď Lactobacillaceae) Rod Staphylococcus, (čeleď Staphylococcaceae) Rod Lactococcus, (čeleď Streptococcaceae) Rod Micrococcus, (čeleď Micrococcaceae) Nežádoucí mikroorganismy a produkty jejich metabolismu Rod Leuconostoc, (čeleď Leuconostocaceae) Rod Salmonella,(čeled Enterobacteriaceae) Rod Escherichia, (čeled Enterobacteriaceae) Rod Staphylococcus, (čeleď Staphylococcaceae) Rod Clostridium, (čeleď Clostridiaceae) Rod Bacillus, (čeleď Bacillaceae) Rod Listeria, (čeleď Listeriaceae) Mykotoxiny Biogenní aminy MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ Charakteristika materiálu Mikrobiologické analýzy Příprava mikrobiologických analýz Sterilace laboratorního skla Složení živných půd Postup při vlastních mikrobiologických analýzách Vyjádření výsledků VÝSLEDKY A DISKUZE ZÁVĚR POUŽITÁ LITERATURA

9 8. SEZNAM ZKRATEK SEZNAM OBRÁZKŮ A GRAFŮ SEZNAM TABULEK.. 86 PŘÍLOHY 9

10 1. ÚVOD Pravděpodobně nejnáročnějším z technologických postupů v masné výrobě a snad i v celé oblasti masného průmyslu, je produkce tepelně neopracovaných masných výrobků. Fermentované masné výrobky, jsou výrobky tepelně neopracované, určené k přímé spotřebě s minimální dobou trvanlivosti 21 dní při teplotě 20 C. Na rozdíl od jiných masných výrobků nepodléhají během procesu výroby ani před vlastní konzumací tepelnému zákroku a proto si zachovávají některé organoleptické vlastnosti syrového masa, které jsou doplněny o aroma a chuť produktů fermentace. Klasická fermentace využívala přítomnosti mikroorganismů ve výchozí surovině, kdy vytvořením příznivých vnějších i vnitřních podmínek bylo umožněno kulturní mikroflóře dosáhnout dominance vůči svým konkurentům, tj. ostatním bakteriím, kvasinkám a plísním a tím pak došlo k prodlužení trvanlivosti výrobku a zlepšení jejich senzorických vlastností. Na počátku 70. let byly v tehdejším Československu vyráběny patrně první tepelně neopracované salámy a to v Hodicích pod značkou JOB, dále v nedalekém Kostelci, Studené a v dalších podnicích na Vysočině. V této době vznikly salámy Poličan a Herkules, na Slovensku Nitran a Malokarpatská saláma. Tyto salámy mají dodnes neotřesitelnou pozici na trhu. Rozvojem potravinářské mikrobiologie a odhalením úlohy mnohých mikrobiálních kmenů při fermentačních procesech dochází ke stále častější aplikaci tzv. startovacích kultur. Tímto pojmem se označují vybrané a prověřené kmeny mikroorganismů, které jsou v čisté kultuře nebo ve směsích s jinými kmeny aplikovány do potravin v průběhu výrobního procesu za účelem vyvolání určitých požadovaných změn. Při výběru startovací kultury se přihlíží i ke zvyklostem v příslušné zemi. Nejstarší startovací kultury byly vyvinuty pro produkci mléčných výrobků zhruba před 100 lety. V masném průmyslu se startovací kultury používají při výrobě tepelně neopracovaných fermentovaných salámů, příp. tepelně neopracovaných šunek. 10

11 2. CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce je: Prostudovat literaturu a shrnout poznatky o mikroflóře fermentovaných salámů. Charakterizovat skupiny mikroorganismů a jednotlivé mikroorganismy používané ve startovacích kulturách. Charakterizovat vlastnosti, funkci a využití startovacích kultur při výrobě trvanlivých salámů. Zhodnotit vliv startovacích kultur na mikrobiální osídlení fermentovaných salámů. Ve vybraných fermentovaných salámech stanovit významné skupiny mikroorganismů. Výsledky zpracovat tabelárně popř. graficky. Vyhodnocení provést formou diskuse a výsledky shrnout v závěru práce. 11

12 3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Fermentované masné výrobky Podle Vyhlášky Ministerstva zemědělství ČR 264/2003 Sb. se rozumí fermentovaným trvanlivým masným výrobkem - výrobek tepelně neopracovaný určený k přímé spotřebě, u kterého v průběhu fermentace, zrání, sušení, popřípadě uzení za definovaných podmínek došlo ke snížení aktivity vody s hodnotou a w(max) = 0,93, s minimální dobou trvanlivosti 21 dní při teplotě plus 20 C. Na rozdíl od jiných masných výrobků nepodléhají během procesu výroby ani před vlastní konzumací tepelnému zákroku a proto si zachovávají některé organoleptické vlastnosti syrového masa, které jsou doplněny o aroma a chuť produktů fermentace. Jsou tradičními výrobky v mnoha evropských zemích a významně se rozšířily i u nás. K rozhodujícím výrobním oblastem v Evropě patří: oblast Německa, Itálie a Španělska. Známými producenty jsou ovšem i Francie, Maďarsko a další státy. Jejich výroba je vzhledem k vysokým nárokům na hygienu složitější a v mnoha směrech odlišná od jiných masných výrobků. (Pipek, 1998) Vývoj fermentovaných masných výrobků První historicky doložený, tepelně neopracovaný masný výrobek se jmenoval Lup Cheong. Počátek novodobé výroby fermentovaných salámů je datován do roku 1730, kdy bylo započato s produkcí salámů v severní Itálii. (Král aj., 2005) Nedlouho na to se rozšířila produkce do Maďarska a posléze do Německa (Pipek,1998). Vzhledem k tomu, že v těchto zemích nebyly optimální klimatické podmínky pro celoroční výrobu tepelně neopracovaných salámů, bylo nutné produkci soustředit pouze do chladných zimních měsíců tak, aby se minimalizovalo riziko kažení způsobené vysokými teplotami. Z této doby pochází i název zimní salám, který je dodnes používán v Maďarsku, ale i v dalších zemích. Obliba a relativní bezpečnost těchto výrobků přispěla k tomu, že se jejich výroba rozšířila nejen po celém Středomoří, ale i do ostatních částí Evropy. Vývoj těchto tepelně neopracovaných výrobků odrážel 12

13 klimatické podmínky, chuťové zvyky a dostupné suroviny v zemích produkce. Tomu vděčíme za obrovskou rozmanitost. V tehdejším Československu byly patrně první tepelně neopracované salámy vyráběny v průmyslovém měřítku v Hodicích pod značkou JOB, dále v nedalekém Kostelci, Studené a v dalších podnicích na Vysočině, kde byly příznivé podmínky pro zrání. Na počátku 70. let byly vyvinuty salámy Poličan a Herkules, na Slovensku Nitran a Malokarpatská saláma. Tyto salámy mají dodnes neotřesitelnou pozici na trhu a byť byla technologie značně modifikována, jsou stále zákazníky velmi oblíbené. (Král aj., 2005) Chuť těchto výrobků totiž vychází nejenom z použitého koření a skladby surovin, ale i z fermentačních procesů přítomných mikroorganismů, kombinace cukrů, podmínek zrání a dalších faktorů. Celý tento komplex vlivů utváří konečný buket salámů. (Pipek, 1998) Rozdělení fermentovaných masných výrobků Ingr (2004) uvádí, že lze fermentované masné výrobky členit podle několika hledisek výrobní technologie, struktury a rozdílné údržnosti na: Fermentované salámy s nízkou kyselostí - klasické syrové trvanlivé salámy, s vysokou konečnou hodnotou ph v rozmezí 5,3 6,2; nejčastěji 5,8 6,2. Trvanlivost je dána především vysoušením, tj. snížením aktivity vody, která by měla být 0,90 0,65, proto nemusí být ph výrobku příliš nízké. Tyto výrobky se vyznačují poměrně dlouhou výrobní dobou - 3 týdny, až několik měsíců, vlivem čehož dochází k významné ztrátě vlhkosti, jak uvádí Pipek (1998) i o víc jak 20 %. Dalším charakteristickým rysem této skupiny výrobků je, že se do nich nepoužívají sacharidy, ph proto většinou neklesá pod 5,8. Mívají větší velikost zrn (5 10 mm), a převážně jsou naráženy v přírodních střevech. Z důvodu pomalého nástupu fermentace je nutné salámy startovat pří nízkých teplotách o C. Výrobky nejsou zauzeny a na povrchu jsou tedy kryty většinou plísní. Jsou výrazněji kořeněné, převládá pepř, česnek a zázvor. Z důvodu dlouhého zrání mají plnou výraznou chuť, ve které se již projevuje charakteristický přípach nažluklého tuku. (Pipek, 1998) V současné době jsou i pro výrobu těchto tradičních salámů využívány nízkookyselující startovací kultury rostoucí za nízkých teplot (Staphylococcus carnosus, Pediococcus acidilactici, Lactobacillus curvatus) a plísňové kultury např. Penicillium 13

14 nalgiovensis, pro aplikaci na povrch. Důvodem je především kontrola zracího procesu. (Král aj., 2005) Tyto fermentované salámy se vyrábějí v celém Středomoří a liší se použitým kořením, stupněm okyselení, dobou zrání nebo přítomností plísní na povrchu. Velmi známým salámem pocházejícím ze Španělska, ale i z jižní a střední Ameriky je Chorizo. Jako základ koření je použita kvalitní paprika různé pálivosti. Je vyráběn jako úplně syrový vepřový výrobek, bez plísně, určený k další kulinární úpravě, jako krájitelný salám, nebo jako trvanlivý fermentovaný salám. V jižní Americe se pod jménem Chorizo většinou rozumí výrazně kořeněná klobása. Ve Španělsku a jižní Francii se rovněž vyrábí celá řada místních specialit, jako např. salám Sobresada, který je vyrobený převážně z vepřového masa a kozího sýra, kořeněný pálivou paprikou, ale i celou řadou aromatických bylin (tymián, majoránka, rozmarýn). Konzistence salámu je spíše měkčí, bývá naražen do hovězí konečnice a zaplísněn. V této zeměpisné oblasti bývá pro zjemnění chuti do receptur občas přidáváno desertní víno nebo brandy. Další specialitou je např. výrobek Saucisson de sanglier, vyráběný z masa divokého prasete. Mezi speciality patří i Salame ďoca z Lombardie, což je salám vyráběný z husího masa a sádla, jemně kořeněný a naražený do kůže z husích krků. Ve východním středomoří, v Turecku a dále na východ je velmi rozšířen Sudžuk. Salám je vyráběný výhradně z hovězího a ovčího masa, kořeněn pepřem, paprikou, česnekem, kmínem, skořicí a hřebíčkem. Má výrazné zrnění (10 mm), je velmi silně zauzen (2 3 dny) a následně sušen. Chuť tohoto výrobku je naprosto odlišná od středoevropských zvyklostí. (Král aj., 2005) Ze zahraničních výrobků do této kategorie patří zejména Sibiu, Banatean salami (Rumunsko), Lukanka (Bulharsko), Venetian Salami, Milanesse (Itálie), Wintersalami (německé oblasti) aj. Z našich výrobků sem lze zařadit např. Poličan, Paprikáš, Uherský salám, aj. (Pipek, 1998) Fermentované salámy s vyšší kyselostí jsou typické pro oblast na západ a severozápad od našich hranic. Oproti předchozí skupině mají měkčí konzistenci, avšak natolik pevnou, že je lze krájet (odtud název = krájitelné) a to již po několika dnech. Vyznačují se kyselostí okolo ph 4,6 5,2. Jsou rychle zrající a zrají obvykle méně než 3 týdny, proto i ztráty jsou nižší a to většinou do 15 %. Aktivita vody těchto výrobků se požaduje 0,93 a nižší. Základní podmínkou pro výrobu těchto salámů je použití vhodné startovací kultury spolu s vhodně zvolenou kombinací cukru (typický je 14

15 přídavek 0,3 0,7 %). (Ingr, 2004) Kultura musí být schopna velmi rychlého okyselení a vytvrzení salámu. Má být volena i s ohledem na chuť salámu a jeho vybarvení. Je potřebná vyšší teplota na počátku zrání, aby fermentační proces, resp. přeměna sacharidů, byla velmi rychlá a aby rychle dosažená nízká kyselost zabránila nežádoucím mikrobiálním změnám. Mezi touto a předchozí skupinou však neexistuje ostrá hranice a mnohé výrobky leží právě na hranici mezi oběma skupinami. ph okolo 4,9 je typické pro německé salámy, pro belgické 4,7, pro holandské ještě nižší 4,6 4,65. Salámy jsou většinou naráženy do umělých střev většího kalibru, často různě tvarovány. Typický salám tohoto typu má jemné zrnění (2 4 mm), ale jsou i hrubší varianty (8 12 mm). Salámy se buď lehce zauzují, nebo se neudí vůbec. Typická je rovněž červená barva, která přechází z jasně červené v Německu až po nafialovělou v Dánsku a Holandsku. Koření je většinou jednoduché (pepř, česnek), v Německu se často používá hořčičné semínko. Salámy mívají většinou nižší obsah tuku než naše, do 30 %. (Král aj., 2005) Z našich výrobků sem patří: Herkules, Lovecký salám, Dunajská a Gombasecká klobása. Ze zahraničních výrobků např. Cervelat, Schlackwurst, maďarské klobásy Csabay a Gyulay ( čabajky ), Pepperoni 1 (Amerika) aj. (Pipek, 1998) Roztíratelné fermentované salámy představují poněkud zvláštní skupinu fermentovaných výrobků. Mají jemnou nebo hrubou strukturu, jsou měkké na omak i skus, více či méně pastovitého charakteru. Zrají méně než 14 dní. (Pipek, 1998) Jejich roztíratelnost je dána vysokým obsahem tuku (přibližně 65 %). Stabilitu výrobků zajišťuje přídavek dusitanů, GdL a startovací kultury. Fermentací se dosáhne hodnot ph 5,4 5,6. Tyto výrobky se vůbec nesuší, zauzují se pouze studeným kouřem (2 3 dny) a před expedicí je třeba je vychladit na 2 8 o C. Pro spotřebitele jsou tyto výrobky do jisté míry riskantní, zejména při porušení řetězce nízkých teplot, při jejich uchovávání a nedodržení doby použitelnosti, která je max. 48 hodin od jejich expedice. Problémy zde mohou činit zejména salmonely (Schmidt, 1987), proto je povinností výrobce nechat suroviny vyšetřit na nepřítomnost salmonel a věnovat maximální pozornost i hygieně. (Lát a Látová, 1987) Oblíbené jsou především v Německu 1 Pepperoni - salám velmi výrazně kořeněný (chilli, pepř, paprika, česnek), při technologickém procesu je zvláštností, že startovní teplota fermentace je přes 30 o C, často o C, používá se u 30 % pizz. (Král aj., 2005) 15

16 Teewurst, Mettwurst, aj. U nás je objem těchto výrobků malý, známé jsou Čajovky a Métský salám (2) Syrové šunky patří mezi nejnáročnější z hlediska výroby, a proto jsou i nejdražšími masnými výrobky. V úvodní fázi jsou přechovány při nízkých teplotách, pak dlouhou dobu zrají a schnou. Jejich trvanlivost je dána nízkou vodní aktivitou a větším množstvím soli. (Ingr, 2004) Vzhledem k dlouhé výrobní době nemá význam přidávat dusitany. Mezi nejznámější patří parmská šunka (Prosciutto di Parma), španělské, německé šunky, náš Pršut a Lososová šunka (z vepřové pečeně a kýty). Ingr (2004) uvádí rozdělení syrových šunek podle lokality, ve kterých se produkují na 3 typy: Syrové šunky s nízkým obsahem soli (italské, španělské, francouzské) zrají více než 6 měsíců a jejich nízká slanost může na počátku zrání činit mikrobiologické problémy (dáno vysokou hodnotou a w ). Šunky s vysokým obsahem soli (jihoevropská oblast) zrají méně než 3 měsíce. Zauzené syrové šunky (belgické a německé) s dobou zrání kratší než 1 měsíc Údržnost Údržnosti se u fermentovaných výrobků nedosahuje tepelným zákrokem, proto zde nabývají na významu jiné překážky, které působí v určitém sledu. Zvýšit údržnost fermentovaných salámů znamená především zpomalit nebo zabránit vývoji bakterií způsobujících jejich kažení a také má prvořadou úlohu zabránit přítomnosti patogenních mikroorganismů. (Nicolai, 1997) K údržnosti fermentovaných výrobků však musí přispívat i pečlivý výběr suroviny a celková hygiena výroby, a to ve větší míře než u jiných výrobků. Pokud se použijí při výrobě suroviny nevhodné jakosti (maso s vysokým obsahem mikroorganismů nebo mikrobiologicky kontaminované obaly), nebo nevhodné podmínky zrání (teplota vzduchu, jeho vlhkost a cirkulace), zvyšuje se riziko kažení. Na začátku snažení zvýšení údržnosti je určující vstupní překážka, počáteční mikrobiální zátěž (primární kontaminace). Jako u všech druhů zpracovávaných masných výrobků, počáteční CPM celkový počet životaschopných mikroorganismů 2 Označení métský salám (Mettwurst) pochází z dolnoněmeckého výrazu Mett označujícího syrové libové vepřové maso. (Leistner, 1986) 16

17 přítomných na povrchu syrového masa se odrazí na údržnosti každého výrobku vyrobeného z této suroviny. Čím bude primární kontaminace vyšší, tím větší bude riziko, že někteří z mikroorganismů by mohly překonat všechny překážky a způsobit otravu z potravin, v nejhorším případě onemocnění z potravin, které končí letálně, smrtí konzumenta (Nicolai, 1997) Překážkové efekty ve fermentovaných salámech Překážkové efekty byly popsány Leistner (1995) jako: konzervační prostředky redox potenciál kompetitivní bakteriální flóra aktivita vody ph teplota Konzervační prostředky Přídavek dusitanů do díla syrových masných výrobků je zvlášť důležitý v počáteční fázi výrobního procesu, kvůli svému baktericidnímu účinku, který na počátku výroby chybí. Potlačuje růst nežádoucích mikroorganismů (především salmonel) a tím napomáhá rozvoji žádoucí mikroflóry. Minimální koncentrace pro zabezpečení antibakteriálního účinku je 125 mg NO 2 na kg díla, což je dosaženo přídavkem 2,5 % dusitanové solicí směsi. Reziduální koncentrace by měla být pro spotřebitele omezena na 50 mg dusitanu v 1 kg finálního výrobku. (Nicolai, 1997) Dusitan je použit v dusitanové solící směsi, obsahující 99,4 % NaCl a 0,6 % NaNO 2 a v průběhu výrobního procesu se postupně odbourává. Při reakcích s tuky a hemovými barvivy je rychleji spotřebován kyslík, což vede k chuťově negativním změnám (Rödel et. al, 1992). Chlorid sodný, který je součástí dusitanové směsi potlačuje mimo jiné sladkou chuť sacharidů a kyselou chuť organických kyselin. Jinou konzervační metodou, i když použitelnou jen pro povrch sušených výrobků, je použití přírodního kouře. Tím se omezí zejména růst kvasinek, dojde k vyloučení tvorby mykotoxinů a zároveň dochází ke zpevnění obalu. (Nicolai, 1997) 17

18 Redox potenciál (Eh) Maso získané bezprostředně po porážce má malý redoxní potenciál. Na počátku zrání se Eh snižuje, protože mnohé mikroorganismy spotřebovávají kyslík. Tím jsou (uvnitř salámu) bržděny v růstu některé bakterie, které by jinak způsobily hnilobu např. pseudomonády a enterobakterie. Zároveň jsou zvýhodněny bakterie mléčného kvašení, které okyselují zrající salám a zajišťují stabilitu výrobku (Leistner, 1986). Přidáním redukčních látek (antioxidačních činidel, redukujících cukrů, atd.) se stabilita může posílit. (Nicolai, 1997) Kompetitivní mikroorganismy Žádoucí mikroorganismy mohou potlačovat nežádoucí mikroflóru několika způsoby, a to snížením ph, tvorbou kyseliny mléčné (bakteriostatické účinky), konkurencí při získávání živin, tvorbou peroxidů a bakteriocinů. Mezi tyto mikroby patří bakterie mléčného kvašení. Někdy se tyto mikroorganismy záměrně přidávají pod označením ochranné kultury (pokud mají za účel změnit i organoleptické vlastnosti, označují se jako startovací kultury) (Pfeil et. al, 1973). Aktivita vody (a w ) Aktivita vody se snižuje jednak osolením výrobku a jednak sušením. Ke snížení její hodnoty však může přispět i vyšší obsah tuku a sacharidů. (Incze, 1992) Úroveň aktivity vody se u různých typů masných výrobků podstatně liší a to přibližně v rozmezí 0,86 0,96. Při zrání a sušení aktivita vody postupně klesá a dosahuje hodnot zamezujících růstu mikroorganismů. Aktivita vody má význam také při porůstání povrchu salámů plísněmi. Snižování aktivity vody může probíhat u mělněných výrobků (vzhledem k rychlému prosolení) relativně rychle, naopak u kusových výrobků (syrové šunky) je to záležitost mnoha měsíců (Leistner, 1986). V Tab.1 jsou uvedeny minimální hodnoty a w, s jejíž pomocí můžeme vyhodnotit účinky hladiny aktivity vody na některé mikroorganismy. 18

19 Tab. 1 Růst mikroorganismů v závislosti na hodnotách aktivity vody (Nicolai, 1997) a w Bakterie Kvasinky Plísně 0,98 0,97 0,96 Clostridium, Pseudomonas Clostridium Flavobacterium, Klebsiella, Lactobacillus, Proteus, Pseudomonas, Shigella 0,95 Alcaligenes, Bacillus, Citrobacter, Clostridium, - - Enterobacter, Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Salmonela, Sarratia, Vibrio 0,94 Lactobacillus, Pediococcus, Microbacterium, Vibrio, - - Streptococcus 0,93 0,92 0,91 Lactobacillus, Streptococcus - Corynebacterium, Staphylococcus,Streptococcus - Rhodotoruala, Pichia - 0,90 Lactobacillus, Microocccus, Pediococcus, Vibrio - 0,88-0,87 0,86 0,80 0,75 0,70 0,62 - Staphylococcus - Halofilní bakterie - - Hansenula, Saccharomyces Candida, Torulopsis Debaryomyces, Debaryomyces - Saccharomyces - - Saccharomyces Rhizopus, Mucor - - Cladosporium - Peacilomyces Aspergillus, Penicillium, Emericella, Eremascus Aspergillus, Wallemia Eurotium, Chrysosporium Eurotium, Monascuc ph Snížení ph nastává obvykle působením bakterií mléčného kvašení v průběhu zrání nebo použitím okyselujících látek (GdL). K okyselení přispívá i hydrolýza tuků (vznik masných kyselin). Okyselení má význam zejména u rychle zrajících salámů, a dále u těch výrobků, u nichž není dosaženo významného snížení aktivity vody vysušením. Pokles ph se zastavuje při snížení aktivity vody na hodnotu a w = 0,93, kdy je zabráněno růstu laktobacilů (Stiebing et Rödel, 1989). Právě tato hodnota aktivity vody je u trvanlivých salámů určena jako hraniční (Vyhláška Ministerstva zemědělství č. 264/2003 Sb.). Hodnota ph se u většiny fermentovaných salámů pohybuje mezi 5,0 19

20 a 5,3. U dlouhodobě sušených salámů bývá i vyšší než 6; naopak u rychle zrajících salámů bývá nižší než 5. Hodnota ph je tedy nižší u salámů s vyšší aktivitou vody a naopak; podle toho je pak rozhodující překážkou pro zajištění údržnosti buď ph nebo aktivita vody (Leistner, 1986). Teplota Snížená teplota má význam pro potlačení rychlého rozvoje mikroflóry na počátku výroby. Podle Incze (1992), má nízká teplota význam zejména u syrových šunek, které musí být vyráběny při teplotách, nižších než 5 o C, v nich dochází k pomalému poklesu aktivity vody, která je pak rozhodující překážkou. Při zrání fermentovaných salámů se nemá překračovat teplota 23 o C, jinak hrozí nebezpečí pomnožení stafylokoků a salmonel (Stiebing, 1992). Naproti tomu příliš nízká teplota (kolem 0 o C) zabraňuje pomnožení ušlechtilé mikroflóry zajišťující okyselení. Pro prodloužení údržnosti a produkci senzoricky atraktivního a nezávadného jakostního výrobku je vždy třeba kombinovat několik překážkových efektů. (Hechelmann et. al, 1990) Vady fermentovaných masných výrobků Podle Ingr (2004) jsou popsány vady fermentovaných masných výrobků takto: rozmazaná mozaika (nedostatečně vychlazená či zmrazená surovina, tupé nože kutru, příliš dlouhé míchání) vrásnění obalů na povrchu salámu (nedostatečně pevné narážení díla, přívod příliš teplého kouře, zpracování masa s vysokým obsahem vody) měkká konzistence salámů (vysoký obsah vody v mase, nedostatečné vychlazení suroviny, ohřev masa při mělnění nebo míchání) tzv. kroužek (rychlé sušení vedoucí k vzniku povrchové krusty neboli kroužku, ve středu výrobku se zadržuje vlhkost, možnost mikrobiálního kažení) šednutí výrobků v nákroji (nedostatečné vychlazení masa a sádla, nízký přídavek solicí směsi a jeho nedostatečné rozmíchání v díle, rychlé vysoušení povrchu salámu, vysoká vlhkost vzduchu nebo nízké teploty během zrání) nadměrná kyselost výrobků (vysoký přídavek sacharidů v souvislosti s vysokou teplotou zrání, příliš vysoký podíl heterofermentativního kvašení). 20

21 Během zrání může dojít k řadě nežádoucích změn a odchylek v jakosti: tzv. vláknitost (při vyšších teplotách zrání, s vyšším obsahem sacharidů, dochází k tvorbě hlenovitých vláken druhy rodu Leuconostoc) nežádoucí povrchové zaplísnění (nedostatečné vyuzení, nedostatečná hygiena klimatizovaných komor, nedostatečný přívod vzduchu k výrobkům při sušení a zrání) hniloba na povrchu či uvnitř salámu (vzácný výskyt, původci: enterobakterie, klostridia, vzácně i bacily) povrchové osliznutí (nemusí souviset s povrchovou hnilobou, salám lze očistit a lehce zakouřit, původci: mikrokoky, kvasinky, stafylokoky) tzv. vykvetení (u salámů, které jsou pouze sušeny; suché bělavé nebo žlutavé nepravidelné pokryvy na povrchu, původci: kvasinky, stafylokoky; někde je považováno za jakostní znak) Balení fermentovaných masných výrobků Obalový materiál, se neuvádí jako hlavní překážkový efekt pro trvanlivé tepelně neopracované masné výrobky. Je však ale nutné, zohlednit některé aspekty používaného obalového materiálu, aby se vyrobily zdravotně nezávadné a při skladování stabilní fermentované masné výrobky. (Nicolai, 1997) Moderní ochranou balených potravinářských produktů je balení v modifikované atmosféře MAP, které je většinou spojováno se spotřebitelskými baleními. MAP zahrnuje balení vakuové (VP) a rovnovážné (EP). VP spočívá v odstranění všech plynů a par z okolí potraviny v takové míře, aby obsah kyslíku klesl pod hodnotu 1 % z původního množství. Principem EP je snaha o dosažení rovnovážného a stabilního stavu mezi potravinou a vnějším prostředím. V praxi se jedná o odstranění vzduchu z obalu a jeho nahrazení ochrannou atmosférou tvořenou třemi základními plyny, resp. jejich směsí a to kyslíkem, dusíkem a oxidem uhličitým. (Nicolai, 1997) Výrobky určené k plátkování musí být dobře fermentované a vysušené, aby se zaručila jejich stabilita po dobu skladování. Při nízké vodní aktivitě v kombinaci s nízkým ph, dochází k potlačení růstu většiny bakterií. Z tohoto důvodu je požadována pro používaný obal dobrá propustnost kyslíku, vodních par i výparů. U salámu zrajícího působením kulturních plísní na povrchu se může provádět vakuové balení výrobků za předpokladu, že jeho aktivita vody je velmi nízká (a w > 0,90), a také jejich skladování 21

22 by nikdy nemělo překročit teplotu nad 15 o C. Jestliže se tyto parametry nesledují, je zde riziko změny barvy (zelená/žlutá) způsobené aktivací plísní na povrchu. Pro balení metodou MAP pro předem plátkované fermentované salámy s aktivitou vody pod 0,94 se dává přednost směsi obsahující % kysličníku uhličitého a % dusíku. Má li výrobek přechodnou aktivitu vody mezi 0,94 a 0,97, lze použít vyšších koncentrací CO 2 (50 70 %) v kombinaci s dusíkem při vyloučení kyslíku ze směsi. (Nicolai, 1997) 3.2 Technologie výroby fermentovaných masných výrobků Výroba tepelně neopracovaných výrobků je složitá a často riziková. Fermentační a zrací procesy jsou ovlivňovány počátečními faktory a absence teplotního zákroku poskytuje přítomným mikroorganismům příležitost k rozvoji a ke kažení výrobků. (Ingr, 2004) Přísady do syrových salámů musí zajistit na rozdíl od jiných výrobků i optimální průběh zrání Suroviny pro fermentované salámy Základní suroviny zahrnují vepřové a hovězí maso v relaci libové hovězí : libové vepřové : hřbetní sádlo 1 : 1 : 1, nebo li také ze 70 % výrobního masa a 30 % tukové tkáně. Hovězí maso dodává výrobku pevnější konzistenci a intenzivnější chuť, vepřové pak větší šťavnatost (Sielaff et. al, 1986). Mnohé trvanlivé salámy se vyrábějí pouze z masa vepřového (Uherský salám, Křemešník, některé italské a francouzské salámy). V islámských zemích, kde se z náboženských důvodů nesmí konzumovat vepřové maso a sádlo, se používá hovězí a skopové maso; vepřové sádlo se nahrazuje ovčím ocasním lojem (Gökalp et. al, 1985). Pro fermentované salámy lze využít i libové krůtí maso. Velmi ceněné jsou fermentované salámy ze zvěřiny (jelen, los, medvěd). Maso musí být normálně okyselené, tedy pod hodnotu ph 5,8, aby se potlačila hnilobná mikroflóra a nedošlo k rozkladu bílkovin. Maso nedostatečně okyselené v průběhu autolýzy (DFD) je pro výrobu fermentovaných výrobků nevhodné a PSE maso lze použít jen v omezené míře. Pro syté vybarvení výrobku se volí maso ze starších zvířat, zejména starých krav a sviní; nejen pro vyšší obsah myoglobinu, ale i 22

23 pro nižší obsah vody, který je významný pro pěkný vzhled (mozaiku) salámů. (Ingr, 2004) Tuková tkáň má být jadrná, pevná, čerstvě vytěžená, důkladně vychlazená nebo i krátce zmražená. Musí mít vysoký bod tuhnutí a nesmí se mazat. Tomuto požadavku odpovídají tuky s vyšším obsahem nasycených mastných kyselin, tedy především tuk hřbetní, nikoliv vnitřní. Tukovou tkáň lze nahradit i tučným masem. K solení se používá dusitan sodný v množství 3,5 5,5 %, u syrových šunek 4,0 7,0 % a má v prvních dnech výroby zajistit údržnost. U fermentovaných salámů se jak uvádí Koch (1986), běžně používá přídavek soli 3 %, ve snaze snížit obsah soli v potravinách se někdy doporučuje dle Petäjä et. al (1985), snížit přídavek na 2,5 %. Při přídavku vyšším než 3 % se snižuje rychlost fermentace, může dokonce dojít k potlačení laktobacilů (Bacus, 1982). Obsah soli v okamžiku spotřeby fermentovaného salámu by měl být cca 3,5 %. U fermentovaných salámů je obtížné snížit obsah soli vzhledem k tomu, že zde má význam pro snížení a w a tudíž pro zajištění údržnosti. (Pipek, 1998) Volba koření dodává výrobkům charakteristickou chutnost, ale také může negativně ovlivnit průběh fermentace nežádoucí kontaminací, proto dávají výrobci přednost extraktům, které mají minimální obsah mikroorganismů. Přírodní koření je tak spíše užíváno k dekorativním účelům v mozaice či na povrchu výrobků. Sacharidy určují rychlost a intenzitu fermentace a okyselení výrobků, které je u fermentovaných salámů s vyšší kyselostí rozhodujícím faktorem jejich trvanlivosti. Používají se sacharóza, glukóza a fruktóza v podílu 0,3 0,7 % z hmotnosti všech surovin, případně i laktóza (0,5 1 %). Pro fermentované salámy s kratší dobou zrání a kratší trvanlivostí se přidává do díla místo sacharidů glukono-delta-lakton, který se velmi brzy rozkládá na kyselinu glukonovou, což umožní snížení ph díla na 4,8 za několik hodin po jeho přídavku, který činí 0,3 0,5 %. (Ingr, 2004) Výroba fermentovaných výrobků K úpravám masa, zejména u kvalitních výrobků, by mělo patřit odstranění šlach a jiných složek pojivové tkáně, k tomu slouží např. bubnový separátor. Výrobní postup začíná mělněním suroviny, která je pro fermentované salámy mimořádně důležitá. (Ingr, 2004) Kladou se vysoké nároky na vlastnosti kutru, ten musí být výkonný, nože ostré, pravidelně broušené, aby bylo zabráněno zbytečnému a nadměrnému namáhání a tím i zahřívání surovin. Tvar nožů (s výjimkou nožů oblých) není nejpodstatnější záležitostí i když jednotlivé firmy připisují této vlastnosti podstatnější význam. (Gayer, 1994) 23

24 Požadují se hladké a ostré řezy a proto je třeba mělnit surovinu, která byla těsně před mělněním zamrazena. Doporučuje se zmrazit (na -5 až -10 o C) jen část libového masa a zbytek přidat ve formě vychlazeného masa tak, aby teplota díla po naražení byla kolem 0 o C, čímž se zabrání rozmazání tuku. (Sielaff et. al, 1986) Není možné používat maso mrazírensky skladované. Mělnění se provádí v kutru (Obr.1), kam se přidává: maso, sacharidy, koření a nakonec tučný podíl s dusitanovou solicí směsí. Hotové zamíchané dílo vykazuje při opuštění mísy kutru teplotu okolo -1 o C a je tedy ve zmrzlém stavu. Hodnota ph díla bezprostředně po zamíchání je určena ph hodnotou použitého masa a tuku a neměla by být vyšší než 5,9. Hodnoty ph nižší než 6,0 a a w 0,96 v díle před naražením do obalu jsou nutné pro optimální rozvoj bakterií mléčného kvašení a tím zdárný průběh zrání. (Steinhauser aj., 1995). Bezprostředně po mělnění je dílo přemístěno do násypky narážečky a naráží se do střev. Při narážení je třeba s dílem pracovat šetrně využívají se proto nejlépe pístové narážečky. Některé salámy (Lovecký, Lukanka) mají plochý tvar, což je umožněno plochou narážecí trubicí. Dílo se nejčastěji naráží do klihovkových střev, je možno použít i přírodních střev. Nevýhodou přírodních střev je však vysoká mikrobiální kontaminace a obsah tuku, který urychluje žluknutí (Hechelmann et. al, 1996) Do popředí se dostávají také střeva celulózová, případně různé síťky. Obaly pro fermentované salámy musí být propustné pro vodní páru (vysušování) i pro plyny (kouř) a při sušení musí dokonale obepínat povrch salámu. (Steinhauser aj., 1995) Naražené salámy se zavěšují na udírenské vozíky nebo koše a zavážejí do klimatizovaných komor, kde za regulovaných podmínek probíhá jejich zrání. Zauzování probíhá současně se zráním. U nás se fermentované salámy udí studeným kouřem o teplotě do 25 o C, tím se výrobky aromatizují a vybarvují. Uzení se používá u salámů, kde není požadován porost plísní na povrchu; kouř totiž působí fungicidně, má také antioxidační účinky a vytvrzuje obal výrobku. Kouř se přivádí do komor v pravidelných intervalech po dobu až 8 dnů. V zahraničí se fermentované salámy většinou neudí a během zrání se na jejich povrchu vytvářejí plísňové pokryvy. Plísňové kultury se nanášejí na povrch salámů ponořením do roztoku s kulturou plísně, potřením, či postřikem suspenzí plísňových spor. Plísňový pokryv musí být suchý a čistě bílý. (Ingr, 2004) 24

25 Obr. 1 Kutr Kosteleckých uzenin a.s. Ingr (2004) uvádí, že je třeba při výrobě fermentovaných syrových salámů zajistit tyto rozhodující momenty (kritické či ochranné body) (Tab. 2): Tab. 2 Kritické body při výrobě fermentovaných syrových salámů (Ingr, 2004) OCHRANNÉ BODY SALÁMY s vysokou kyselostí s nízkou kyselostí Teplota fermentace počáteční pozdější o C o C méně než 12 o C o C Koncentrace soli (počáteční) 2,2 3,0 % 2,5 3,0 % Hodnota a w (konečná) méně než 0,95 méně než 0,88 Hodnota ph počáteční konečná méně než 6,2 x méně než 5,3 méně než 6,2 x 5,8 6,2 x ( x jedná se o hodnoty tzv. nekritické, nejsou tedy rozhodující) Zrání Rozhodující fází výroby fermentovaných salámů je vlastní fermentace, zrání. Zrání zahrnuje všechny procesy, probíhající od naražení díla do obalů až po konzumaci hotových výrobků. Jde o komplex odbourávání a přeměny jednotlivých složek díla, 25

26 které rozhodují o údržnosti, textuře, chuti, vůni a vybarvení hotových výrobků. (Ingr, 2004) Bílkoviny jsou štěpeny proteolytickými enzymy na jednodušší sloučeniny, z volných aminokyselin vznikají aldehydy a těkavé organické kyseliny, které se podílí na aromatu výrobku. Současně vzniká i amoniak a aminy. Působením soli a snižováním ph dochází k denaturaci bílkovin a také k tvorbě správné textury. Lipidy podléhají hydrolytickým a oxidačním změnám působením nativních i mikrobiálních lipáz. Štěpení tuků a následná oxidace mastných kyselin velmi výrazně ovlivňuje aroma výrobku, což je kladně hodnocené zejména u dlouho zrajících salámů. (Pipek, 1998) Sacharidy jsou zkvašovány na organické kyseliny zejména na kyselinu mléčnou, což vyvolává silné okyselení. O průběhu zrání rozhoduje složení mikroflóry, měnící se v průběhu výroby, zrání i následujícího skladování. Změny mikroflóry závisí na ph, a w, obsahu sacharidů a teplotě. (Pipek, 1998) V prvních hodinách a dnech zrání je riziko největší, protože syrový obsah má ještě poměrně vysoké hodnoty ph a a w. (Görner a Valík, 2004) Optimální teplota zrání pro většinu fermentovaných salámů je o C. Při vyšších teplotách (více jak 25 o C) na počátku zrání může dojít k rozvoji nežádoucí mikroflóry, zrání probíhá příliš rychle, dochází k rychlému okyselení, nadměrné tvorbě plynu a chybám ve zbarvení. Při příliš nízkých teplotách (nižších než 18 o C) je mikrobiální nebezpečí nejmenší, výroba odpovídá podmínkám přirozeného zrání v chladných měsících roku (Hechelmann, 1986). Snížením ph (při odbourávání sacharidů) je potlačena hnilobná mikroflóra a prosazují se mléčné bakterie (Pipek, 1998). Ve fermentovaných salámech je snížení ph na 5,3 dostatečné k potlačení Salmonella typhimurium a Staphylococcus aureus (Schillinger et. Lücke, 1989). Během zrání se objevuje maximum obsahu kyseliny mléčné a minimální ph (za 5 16 dní) (Seilaff, 1980). Z počátku procesu zrání se zvyšuje teplota výrobku, aby se mohla aktivovat ušlechtilá mikroflóra, která si konkuruje s mikroflórou hnilobnou (proteolytické MO). Mezi ušlechtilou mikroflóru se řadí především bakterie mléčného kvašení, významné jsou druhy Lactobacillus, Lactococcus a Pediococcus. Odbourávají sacharidy z 90 % na kyselinu mléčnou, zbylých 10 % jsou další organické kyseliny: octová, mravenčí, pyrohroznová, propionová, máselná a ethanol. Mléčné bakterie se v díle rychle pomnoží a rychle okyselí dílo. V důsledku zvyšování osmotického tlaku během zrání a nižší a w, klesá množství i aktivita bakterií mléčného kvašení a začnou převládat lipolytické bakterie. Významnou skupinou jsou též mikrokoky, rostoucí i v prostředí s nižší a w a jsou aerobní. Rostou tedy především v povrchových vrstvách salámu. (Pipek, 1998) 26

27 K významnému vzrůstu pevnosti dochází i vysycháním zřetelný vliv vysychání se projeví na změnách textury při poklesu obsahu vody pod 30 % hm. (Klettner, 1980). Současně se zráním probíhá ve zracích komorách sušení (Obr. 2). Obr. 2 Zrací komora Kosteleckých uzenin a.s. Typy zrání Výrobu fermentovaných salámů lze členit podle různých podmínek a způsobu zrání. Základní typy zrání, jak je rozdělil Hauzinger (2005) vedoucí technolog známé rakouské firmy WIBERG jsou tyto: Přírodní zrání, bez použití startovacích kultur (SK). Nevýhodou je dlouhá doba zrání (8 12 týdnů), k čemuž může být připočten výsledný nejistý nebo nestandardní výrobek. Předností je ovšem dosahování originálních a velmi typických chutí finálních výrobků. Kontrolované přírodní zrání (dusičnanová solicí směs + SK). Výsledkem je spolehlivý proces a zaručený výsledek, v protikladu stojí vysoké nároky na kvalifikaci a spolehlivost personálu. Zrání trvá 6 8 týdnů. 27

28 Kontrolované přírodní zrání (dusitanová solicí směs + SK). Doba zrání zkrácená na 3 4 týdny, výrobky velmi dobré, standardní chuti a aroma. Nevýhodou jsou tu značné technické nároky na technologická zařízení. Rychlé zrání (s dusitanovou solicí směsí a kyselinami, GdL). Výhoda standardního a rychlého výrobního cyklu je poněkud znehodnocována svíravější kyselou chutí výrobku. Semi dry představuje velmi rychlý způsob zrání (několik dnů), přičemž se ovšem výrobce zříká větší trvanlivosti a rovněž chuť výrobků bývá odlišná. (Král aj., 2005) Technologický postup výroby Kosteleckého Poličanu Předpokladem výroby tohoto tepelně neopracovaného masného výrobku je buď nákup živých zvířat nebo dokoupení částí masa z jiných podniků schválených Evropskou Unií. Požadují se starší kusy, zejména starší krávy a svině, kvůli vyššímu obsahu myoglobinu a nižšímu obsahu vody ve svalovině. V bourárně se vyberou potřebné suroviny a provede se jejich úprava, při které jsou odstraňovány části, které jsou nepřípustné zbytky kůže, krvavé ořezy, šlachy a povázky a to proto, že působí na pojivost a vaznost masa rušivě. Vytříděné a očištěné suroviny jsou zamrazovány, jak pro částečné odvodnění suroviny, tak i z mikrobiálních důvodů potlačení toxoplasmy. Maso se zmrazuje na -5 o C po dobu 48 hodin nebo na -10 o C po dobu 24 hodin a při těchto teplotách je udržováno až do opracování, které musí být provedeno do 96 hodin od zmrazení masa na uvedenou teplotu. Tyto teploty masa jsou technologicky nezbytné, jak z pohledu konečné teploty hotového díla po naražení do střev, tak i z pohledu šetření kutrových nožů, které při mělnění suroviny s příliš nízkou teplotou dosti trpí. (Gayer, 1994) Následuje výroba díla v kutru a to v pořadí: vepřový bok spolu s vepřovým špekem, startovací kultura BIOBAK SAL, vepřové libové I, vepřové libové II, hovězí zadní, koření a sůl. Toto pořadí je stanoveno proto, aby došlo k správnému vykutrování zrna, v případě tuku, aby se zabránilo jeho vytírání a tím snížení pojivosti díla a narušení procesu zrání. Rovněž sůl při delším působením v díle má nežádoucí účinek ( povolení zmražené suroviny). V kutru dojde k rozsekání surovin na požadovanou zrnitost 1 2 mm a teplota díla je -1 až - 2 o C. Vykutrované dílo se ihned přesune k narážce, kde se naráží do střeva Nalo fit BAKNAT 55 o průměru 55 mm. Za narážkou 28

29 a před klipsovačkou je instalován detektor kovů (Obr. 3) a po naražení jsou jednotlivé kusy oddělovány hliníkovými sponami. Nejvýznamnější fáze výroby nastává po narážení. Naražené výrobky jsou navěšeny na klece a osprchovány vlažnou pitnou vodou, aby byly odstraněny zbytky díla, které mohou ulpět na povrchu výrobků a také pro barevné změny, ke kterým by v díle pod povrchovými nečistotami docházelo. Barva povrchu výrobku je dle barvy střeva. Dále jsou výrobky namáčeny do protiplísňového přípravku (kaliumsorbát) a přesunuty do startovacích komor na 7 dní, aby došlo k oživení startovacích kultur. Zrací (startovací) komora je klimatizovaná nerezová jednotka, v níž je vlhkost a teplota řízená počítačem, obsahuje čidla pro případ selhání a chladící médium - etylenglykol. Zrání je zahájeno při 24 o C a % relativní vlhkosti. Proces zrání salámů zahrnuje fermentaci i sušení. Hodnoty jsou postupně snižovány a to tak, že vždy je nejprve snížena úroveň teploty a teprve následně, zpravidla druhý den, relativní vlhkost. (Gayer, 1994) Salámy jsou zakuřovány studeným kouřem podle příslušného programu. Jednotlivé tyče jsou otírány slanou vodou. Na 3 až 4 dny jsou přesunuty do zracích komor o teplotě 12 o C o snížené relativní vlhkosti 82 %, poté jsou klece převáženy z komor s větší relativní vlhkostí vzduchu do komor s nižší relativní vlhkostí vzduchu. Sedm dní před expedicí jsou salámy namáčeny přípravkem 0611 proti plísním a deset dní před expedicí jsou odeslány vzorky salámu k mikrobiologickému vyšetření na přítomnost listerie a salmonely, dále se zjišťuje hodnota aw ( 0,92). Po dozrání se výrobek etiketuje popřípadě vakuově balí do fólie a expeduje se. Celková doba zrání je minimálně 35 dnů, za tu dobu ztratí výrobek okolo 35 % své hmotnosti. Produkty musí mít výraznou chuť a aroma, přitom nesmí být tyto parametry poznamenány přílišnou kyselostí, musí být pouze mírně nakyslé. Povrch má být lesklý, mírně vrásčitý, barva sytě červenohnědá. Na řezu je výrobek lesklý, barvy růžově červené se stejnoměrně rozdělenými tukovými částicemi o velikosti 1-2 mm. V chuti a aroma musí být patrné vyuzení do příjemného stupně, přitom nesmí být potlačena vlastní masitá příchuť. Konzistence hotových výrobků musí být pevná až pružná. Jedná se o výrobky u nichž je součástí chuťového profilu také slanost (3,8 4,5 %). Obsah tuku je okolo 40 %. Trvanlivost tohoto salámu je 90 dní. Skladuje se rozvěšený, v temných chladných suchých prostorách, při mírném proudění čerstvého vzduchu. Skladovací teplota by měla být do 15 C (max. 20 C) při 85 % relativní vlhkosti. Při porušení skladovacích podmínek může dojít ke změnám smyslových vlastností 29

30 výrobku, popřípadě k poškození zdraví konzumenta. Na 100 g výrobku bývá použito 140 g masa. Energetická hodnota bývá asi 2038 kj/493 kcal. ( 100g výrobku obsahuje průměrně: Bílkoviny 18,0 g Tuky 46,8 g Sacharidy 0,1 g Obr. 3 Narážečka, detektor kovů a klipsovačka Kosteleckých uzenin a.s. 3.3 Mikrobiální kultury V současné době se v potravinářské výrobě provádí řízená fermentace technologického procesu pomocí čistých mikrobiálních kultur, tzn. že se cíleně zavádějí užitečné mikroorganismy do vlastního výrobního procesu. Čisté kultury jsou mikroorganismy určitého druhu, pěstované očkováním, tj. přenášením ze zralé kultury, v níž jsou mikroorganismy rozmnoženy na tekuté, polotuhé či pevné živné půdy, a to 30

31 buď v živém, nebo latentním stavu stádia vývoje. (Benešová aj., 1984) V plně aktivním stavu se udržují přeočkováním, které probíhá v pravidelných časových intervalech. Nejde o čisté kultury v pravém slova smyslu, tj. o absolutní druhovou čistotu. Jednotlivé druhy čistých kultur jsou definovány jednak účelem, kterému ve výrobě slouží, jednak mikrobiálním složením, tj. druhy mikroorganismů nebo charakteristickou skupinou mikroorganismů, které má obsahovat živné prostředí (Kněz aj., 1969) Základní funkce a vlastnosti čistých mikrobiálních kultur Základní funkce čistých kultur se uplatňují zejména v těchto směrech: změny ve fyzikálněchemické povaze potravin, tj. změny v textuře, reologických vlastnostech, hodnotě ph, nutriční hodnotě aj. biochemická aktivita, tj. činnost prokysávací, proteolytická, lipolytická a další, při které se vytvářejí chuťové a aromatické látky, ale i požadovaná struktura a konzistence finálních výrobků tvorba ochranných látek a prodloužení trvanlivosti výrobků, zejména vznikajícími kyselinami, které potlačují nežádoucí mikroflóru ve výrobcích, taktéž i vytvořená antibiotika (Benešová aj., 1984) Mikrobiální kultury jak uvádí Görner a Valík (2004) musí mít následující vlastnosti: mikroorganismy musí být halo- a nitritotolerantní (> 6 % NaCl; > 100 mg NO 2 /kg) musí růst v teplotním rozmezí 27 až 43 o C s optimem při 32 o C, ale i při nižších teplotách, nesmí produkovat štěpné produkty a metabolity bílkovin, které by nepříznivě ovlivňovali senzorické vlastnosti produktů, nesmí být nebezpečné pro zdraví konzumenta (nesmí být patogenní), bakterie mléčného kvašení musí být homofermentativní, aby netvořily plyn a jiné nežádoucí metabolity, nesmějí být proteolytické ani lipolytické, když to není v technologii požadováno 31

32 3.3.2 Výroba čistých mikrobiálních kultur Čisté mikrobiální kultury se mohou vyrábět různými postupy. Volba fermentačního postupu závisí na specifických vlastnostech pěstovaných mikroorganismů a rozhodující význam mají vztahy mezi technickým vybavením a látkovým systémem. Pro průběh biotechnologických reakcí je typické, že dochází ke stálým změnám v procesu, podmíněným určitou dobou. Vlastní výrobu mikrobiálních kultur můžeme rozdělit do tří úseků (Benešová aj., 1984): rozmnožování kultur koncentrace kultur pomocí biochemických, popř. fyzikálních postupů konzervace kultur pomocí biochemických, popř. fyzikálních metod Dle Kunze (1983) je možné rozdělit fermentační procesy k výrobě mikrobiálních kultur do jednotlivých stupňů, jak je uvedeno na Obr. 4. Výroba kultur udržování matečného kmene příprava živného média udržování expedičního kmene sterilace živného média rozmnožování expedičního kmene zrání kontrola průběhu zrání Obr. 4 Výroba kultur (Benešová aj., 1984) mikrobiální kultura V masném průmyslu se při výrobě fermentovaných masných výrobků využívá řada mikroorganismů. Podle jejich vlastností, činnosti a způsobu využití je lze rozdělit na mikroorganismy využívané jako: startovací kultury ochranné kultury plísňové kultury 32

33 3.3.1 Startovací kultury Tímto pojmem se označují vybrané a prověřené kmeny mikroorganismů, které jsou v čisté kultuře nebo ve směsích s jinými kmeny aplikovány do potravin v průběhu výrobního procesu za účelem vyvolání určitých požadovaných změn. Při výběru startovací kultury se přihlíží i ke zvyklostem v příslušné zemi. Startovací kultury se aplikují do díla odděleně od jiných přísad (solicí směs, GdL, koření), aby nedocházelo ke ztrátě aktivity, vlivem antimikrobních látek přirozeně přítomných. Jsou antagonisty hnilobné mikroflóry. (Kameník, 1994) Historický vývoj startovacích kultur pro fermentované masné výrobky Počátek aplikace mikroorganismů při výrobě a konzervaci potravin, lze hledat v prvních empirických pokusech a snahách člověka o zachování potravin v dobrém stavu během celého roku, nejen po jejich sklizni či výrobě. V 17. století, kdy se objevily první mikroskopy, byly pozorovány živé mikroorganismy. Už v 19. století Pasteur dokázal, že mikroby jsou vývojové formy mikroorganismů již dříve existující. Od tohoto okamžiku vědci začínají intenzivně zkoumat možnosti aplikace mikroorganismů a jejich využití pro dobro člověka. (Anonym, 2003) V letech 1919 a 1920 Cesari a Guillirmond prováděli první pokusy s aplikací kvasinek do díla fermentovaných salámů a doporučily je používat pro zlepšení aromatu i chuťových vlastností. V roce 1921 Kurk patentoval použití nepatogenního kmene rodu Micrococcus. Počátkem 40. let Jensen a Paddock pomocí laktobacilových kmenů vyizolovaných z masných výrobků, zlepšili senzorické vlastnosti fermentovaných salámů. Na přelomu 50. a 60. let použil Deibel kmen Pediococcus cerevisiae, šlo o první startovací kulturu pro masný průmysl vhodnou pro komerční účely, neboť přežívala lyofilizaci. Tento druh je dosud používán při výrobě tzv. letních fermentovaných salámů - American summer sausage v USA. (Kameník, 1994) Jako první startovací kultura v Evropě byl vyvinut kmen Micrococcus M 53. Tento kmen byl schopen rychle redukovat dusičnan, zlepšovat barvu, chuť a vůni hotového výrobku a potlačoval nežádoucí mikroorganismy. Nurmi v roce 1966 izoloval kmen druhu Lactobacillus plantarum, použil ho jako kombinovanou startovací kulturu spolu s kmenem Micrococcus vyizolovaným Pohjou v roce Tato kombinace přinesla vynikající výsledky, a to rychlé snížení ph hodnoty bez negativního ovlivnění barvy a ostatních senzorických vlastností a nalezla uplatnění v řadě vyspělých zemí 33

34 Evropy. V roce 1972 zavedla spol. Merk a Co. multikulturu sestávající z druhů Pediococcus a Lactobacillus pod obchodním názvem Lactacel (TM) MC. Použití těchto startovacích kultur zkrátilo fermentační dobu ze 150 na 15 hod., což znamená 90 % redukci doby fermentace. Eilberg a Liepe v roce 1977 zlepšili aroma a barvu fermentovaných salámů kombinovanou kulturou stafylokoků, laktobacilů a Streptomyces griseus. V roce 1987 se Zlámalová zabývala výzkumem startovacích kultur. Výsledkem bylo zavedení přípravku LACTIL, který obsahuje kmen Lactobacillus sp. VÚMP 20. Na Slovensku a částečně i v ČR se v roce 1991, začal distribuovat přípravek S-lac 1, obsahující kmen Lactobacillus plantarum CCM (Kameník, 1994) V současnosti je složité hledat výrobky, v jejichž receptuře startovací kultury chybí (Lovecký salám, Dunajská klobása, Čabajská klobása klasická). Výzkum umožnil nalézt během uplynulých desetiletí kmeny četných mikroorganismů, s jejichž pomocí lze vyrobit vysoce jakostní standardní produkty (Tab. 3). (Bouchner, 2005) Na světě existuje jen několik firem zabývající se výzkumem a výrobou startovacích kultur, jelikož výzkum je finančně náročný. Jednou z nich je firma QUEST Int., USA, která vyrábí kultury s komerčním názvem Saga. Sortiment zahrnuje široké spektrum startovacích kultur s nejrůznějšími vlastnostmi, jejichž účinek je buď čistě okyselující, nebo má kultura vliv pouze na organoleptické vlastnosti a nebo jsou k dispozici i kultury s kombinovanými účinky. V příloze jsou uvedeny startovací kultury již zmíněné firmy Quest Int, dále německé firmy Gewurzmüller a startovací kultury firmy Dera Food Technology Význam startovacích kultur pro fermentované masné výrobky Startovací kultury se přidávají do salámových směsí, aby: vytvořením kyseliny mléčné snižovaly ph výrobku zlepšovaly strukturu konečného výrobku gelovatěním myofibrilních proteinů při nižším ph zmenšovaly ztráty vody při sušení vzhledem k poklesu ph vytvořily výrobek se specifickou chutí a vůní v důsledku prohloubené lipolýzy nebo proteolýzy chránily tuk před oxidací peroxidem prostřednictvím činnosti katalázy zlepšily rozklad dusičnanů a tak zlepšily barvu konečného výrobku 34

35 snížily riziko tvorby nitrosaminů (Nikolai, 1997) Tab. 3 Nejrozšířenější mikroorganismy používané jako startovací kultury pro fermentované salámy (Kameník, 1994): MIKROORGANISMUS ÚLOHA ÚČINEK NA PRODUKT Bakterie mléčného kvašení Lactobacillus plantarum L. pentosaceus, L. brevis L. sake, L. fermenti L. curvatus Pediococcus acidilactici P. pentosaceus Grampozitivní katalázapozitivní koky Micrococcus varians Staphylococcus carnosus Staphylococcus xylosus Kvasinky Debaryomyces hensenii Candida famata Plísně Penicillium nalgiovense Penicillium chrysogenum Streptomyces griseus tvorba kyselin tvorby kyselin a bakteriocinu pediocin redukce NO 3 -, destrukce H 2 O 2, snížení hodnoty Eh, lipolýza spotřeba kyslíku, lipolýza, snížení hodnoty Eh, inhibice redukce NO 3 - ochrana povrchu, proti divokým plísním, rozklad bílkovin a tuků, destrukce peroxidů, oxidace kyseliny mléčné, spotřeba kyslíku konzervace, zpevnění, urychlení vybarvení, tvorba aroma urychlení vybarvení masa vybarvení, konzervace stabilizace barvy a chuti inhibice nežádoucí mikroflóry tvorba aroma, stabilizace barvy potlačení nežádoucích MO, ochrana proti vysušení a nežádoucímu účinku kyslíku, vliv na chuť a aroma V USA dominují podle Ricke et. al (2001) laktobacily a pediokoky, v Evropě se tyto rody často kombinují s mikrokoky a stafylokoky. U tepelně neopracovaných fermentovaných salámů hrají rozhodující roli mikrobiologické procesy. Tradiční výroba těchto výrobků spočívá v tom, že spoléhá na tzv. domácí heterofermentativní mikroorganismy přítomné v prostředí, kde zpracování probíhá, a na mikroorganismy vyskytující se v surovinách. Mezi domácí mikroorganismy se řadí především bakterie mléčného kvašení. Zastoupení jednotlivých druhů mikroorganismů není standardizováno a při klimatických změnách či změnách v surovinách se mohou vyskytnout ve výrobním procesu problémy, ke kterým dochází, tehdy když bakterie mléčného kvašení nebudou uplatňovat svůj vliv a převahu nad ostatními mikroorganismy. V důsledku toho dostanou příležitost mikroorganismy 35

36 způsobující kažení včetně patogenů, které způsobí zmetkovitost výroby nebo sníží skladovatelnost konečného výrobku. (Kameník, 1994) Mikroorganismy, kromě nižší hodnoty ph (pod ph 6,0), vodní aktivity (0,955 0,965), přítomnosti fermentovatelných sacharidů a dusitanu sodného (kolem mg/kg) v díle prodlužují trvanlivost těchto produktů. Z vnějších podmínek je to teplota v komorách na začátku zrání o C. (Kameník, 1994) Z počátku procesu fermentace se v mase vyskytuje jen malý počet mléčných bakterií, ty se rychle rozmnožují a prosazují vůči ostatní mikroflóře. Jejich růst se dá podpořit přídavkem soli a udržováním anaerobních podmínek. Bakterie se množí v malých ložiscích (hnízdech), které jsou v díle fermentovaných salámů uzavřena v malých dutinkách, kde dochází k silné vzájemné konkurenci. (Katsaras et Leistner, 1988) Dutinky a hnízda nejsou v díle rovnoměrně rozděleny. Při množení buněk dochází k vyčerpávání živin v dutinkách a jejich okolí, následkem je pak zpomalení, posléze až zastavení množení bakterií. Velmi významnou součástí mikroflóry při fermentaci masných výrobků jsou mikrokoky, uplatňující se při pozdějších fázích zrání, kdy je masný výrobek již částečně vysušen. Na zrání výrobků se podílí i některé druhy rodu Leuconostoc. V počátku zrání se mohou vyskytnout i proteolytické a lipolytické mikroby, jako Pseudomonas, Achromobacter, Escherichia, Alcaligenes a Aerobacter. Arpai et Bartl (1977) udává na počátku výroby počty mikroorganismů vyšší jak 10 6 /g. Leistner (1986), uvedl přehled účinku u jednotlivých (Tab. 4). skupin startovacích kultur. Tab. 4 Přehled účinku jednotlivých skupin startovacích kultur podle Leistnera (Pipek, 1998) Jakostní znak BMK Mikrokoky Kvasinky Plísně Barva: redukce dusitanů snížení ph spotřeba kyslíku rozklad H 2 O 2 Aroma: okyselení odbourání bílkovin odbourání tuků zpomalení žluknutí Pevnost (snížením ph) Konzervace: pokles ph redukce dusičnanů konkurence Ochrana povrchu (vysychání, O 2 ) Snížení rezidua dusitanů

37 Aplikační formy startovacích kultur Vývoj a výzkum startovacích kultur se zabýval a stále dosud hledá nejen nejvhodnější kmeny s nejlepší metabolickou aktivitou, ale také nejvhodnější aplikační formy těchto kultur. Cílem je volba takové formy, která vyhovuje jak z hlediska biologického, tj. uchování všech důležitých životních funkcí buňky pokud možno v původním stavu, dále z hlediska zpracovatelského, tzn. musí umožňovat jednoduchou manipulaci, spolehlivé dávkování, snadné skladování bez velkých nároků na prostor, vyloučení možné kontaminace apod. V neposlední řadě musí vyhovovat i z ekonomických důvodů. Vývoj aplikačních forem startovacích kultur probíhal od jednoduchých forem až po současné, dokonalé způsoby uchování buněk. Při aplikaci do díla jsou značně nepříznivé podmínky MO přichází do prostředí s teplotou pod 0 o C a navíc dochází k soutěži o živný substrát s ostatními divoce rostoucími kmeny v surovině, které jsou na podmínky v surovině adaptovány. (Kameník, 1994) Tekuté čerstvé kultury Nejjednodušší způsob aplikace startovacích kultur do díla fermentovaných salámů je jejich přímé dávkování v čerstvém stavu. Používá se koncentrát bakteriálních buněk, aby byl zaručen jejich vysoký počet v 1 g díla. Mezi výhody této aplikační formy patří: nízké provozní náklady, kdy odpadají prostředky vynaložené na konzervaci buněk, krátká lag-fáze (např. Pediococcus cerevisiae 4 6 hod.) a rychlý nástup fermentačního procesu po aplikaci do díla, neboť buňky obsažené v kultuře jsou metabolicky aktivní. Nevýhodami této tekuté formy jsou nízká, až nulová uchovatelnost kultur. Existuje rovněž riziko možné kontaminace tekutých preparátů. Z těchto důvodů se přešlo ve světě na jiné, dokonalejší způsoby uchování a aplikace kultur. (Kameník, 1994) Mražené koncentráty Jedná se o koncentrát bakteriálních buněk zmražených za velmi nízkých teplot. Buňky a jejich okolí, ve kterém se nacházejí, se skládají z velké části z vody. Jsou v ní rozpuštěny i ostatní složky ve formě roztoku. Voda přechází v pevné skupenství při 0 o C, teplota u roztoků se posouvá pod hranici 0 o C. Bod mrznutí je tím nižší, čím vyšší je podíl rozpuštěných substancí. Při pomalém procesu zmrazování, nejdříve krystalizuje 37

38 (zmrzne) čistá voda, klesá bod mrznutí a zbytkový roztok se koncentruje. Tato koncentrace způsobí změny prostředí a zvýší osmotický tlak, což vede k ireverzibilnímu poškození buněk. Při rychlém odnětí tepla se tvoří četná drobná krystalizační jádra, která nevedou ke změnám koncentrace. Čím rychlejší je zmrazení (přes 50 mm/h), tím lépe se fixuje roztok ve svém původním stavu a tím také je lepší kvalita rozmražení. (Kameník, 1994) Za těchto podmínek lze získat kvalitní preparáty startovacích kultur. Výhodou této aplikační formy je poměrně dlouhá údržnost a rychlý nástup metabolické aktivity po přidání do díla. Nevýhodou je skladování mražených koncentrátů za minusových teplot, neboť rozmražení, příp. i pokles pod doporučenou teplotu skladování je na újmu aktivity kultury. Mražené kultury mohou být také zmraženy ve formě pelet (FloraCarn pelet-kultura), kterou zavedla na trh dánská firma CH. HANSEN. Zvýšení skladovacích teplot nad povolenou hodnotu, se projeví táním pelet, což je vizuálně patrné na jednotlivých tabletách peletách. Výhodou je jednodušší manipulace při dávkování. (Kameník, 1994) Lyofilizované startovací kultury Touto metodou lze konzervovat bakteriální buňky bez porušení jejich morfologických a fyziologických vlastností za předpokladu, že při procesu lyofilizace se bakterie nacházejí v ochranném médiu tj. média s obsahem proteinů, příp. sacharidů nebo obou současně. Při lyofilizaci jsou buňky vystaveny dvěma negativním vlivům, a to působení nízké teploty a odnímání vody. Při lyofilizaci má také velký význam rychlost zamrazení. Vlastní sušení probíhá ve dvou fázích. Nejprve se během tzv. hlavního sušení odnímá z příslušného materiálu voda, až z %. Po dosušení zůstává v lyofilizátu v nejlepším případě méně než 1 % vody. Výhodou lyofilizovaných kultur je dlouhodobá údržnost, nenáročná manipulace a malá potřeba skladovacích prostor. Lze je krátkodobě, např. při transportu, uchovávat při pokojové teplotě, ale pro dlouhodobější skladování je třeba mrazírenských teplot, nejlépe min. -18 o C. Junker a Liep (1982) doporučili omezit dobu skladování lyofilizovaných startovacích kultur na 4 6 měsíců bez ztráty kvality. Neustálým zdokonalováním procesu se podařilo pozdější nástup aktivity buněk, což byla dříve nevýhoda, odstranit, takže rychlost spuštění procesu fermentace po aplikaci do díla je plně srovnatelná s použitím čerstvých tekutých kultur a svou kvalitou předčí zmražené koncentráty bakteriálních buněk. (Kameník, 1994) 38

39 3.3.2 Ochranné kultury Nikolaii (1997) definuje ochranné kultury jako kultury: které nevytvářejí žádné zdravotní ohrožení jsou schopny převládnout nad nežádoucí bakteriální flórou jsou metabolicky aktivní i při nízkých teplotách a vysokých koncentracích soli nevytvářejí žádné negativní změny v konečném výrobku které prostřednictvím činnosti enzymů mají příznivý účinek na chuť, vůni a barvu konečného výrobku vykazují inhibiční účinky na nežádoucí mikroorganismy např. tím, že produkují bakteriociny Rozdíl mezi startovací a ochrannou kulturou spočívá hlavně v tom, že při použití kompetitivních mikroorganismů, nemusí nutně existovat technologická výhoda, jako u startovacích kultur, ale na druhé straně je nutné prokázat antibakteriální účinky. Princip ochranné kultury je založen na skutečnosti, že takovýto vybraný (neškodný) mikroorganismus nebo kombinace různých, bude v potravinovém prostředí růst preferenčně, čímž se potlačí růst jiných bakterií, jako jsou mikroorganismy působící kažení včetně patogenů. (Nikolai, 1997) Bakteriociny Jak uvádí Schillinger et. al (1989) bakteriociny jsou sloučeniny bílkovinné povahy, které vykazují baktericidní aktivitu proti omezenému okruhu mikroorganismů většinou úzce příbuzných s daným producentem. Vznikají činností ušlechtilé mikroflóry (laktobacilů či pediokoků). Jejich malý přídavek do výrobku zasáhne cíleně určité spektrum nežádoucích mikroorganismů, jejichž činnost zastaví. Při vhodné aplikaci tak výrazně přispívají k prodloužení údržnosti potravin. Bakteriociny byly detekované u rodů Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus, Leuconostoc a Carnobacterium. Tab. 5 uvádí produkci bakteriocinů u rodů Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus. Množství produkovaného bakteriocinu je závislé na fázi růstového cyklu producenta tj. během střední nebo pozdní logaritmické fáze je produkováno maximum bakteriocinu a později produkce klesá. Pro praktické použití je výhodou, že molekuly bakteriocinů se přeměňují na aminokyseliny pomocí enzymu proteáza, která je přítomna v tenkém 39

40 střevě. Proto se jako takové nevstřebávají, nezasahují rušivě do základní bakteriální flóry přítomné v tlustém střevě a zůstávají tak pro tělo neškodné. Jako ochranné kultury se mohou využívat např. Lactobacillus rhamnosus a Propionibacterium freudenreichi ssp. shermanii (Görner a Valík, 2004). Zjednodušeně lze rozlišovat 2 typy bakteriocinů: 1) Bakteriociny vykazující poměrně široké spektrum účinnosti v rámci grampozitivních mikroorganismů. Tento typ je málo rozšířený a patří sem např. nisin a pediocin A. 2) Bakteriociny s aktivitou k druhům úzce příbuzným k produkčnímu kmeni. Laktobacily produkují bakteriociny, patřící do této skupiny. (Kameník, 1994) Tab. 5 Přehled vybraných mikroorganismů produkujících bakteriocin a jeho účinnost vůči některým patogenům (Kameník, 1994) MIKROBIÁLNÍ DRUH BAKTERIOCIN AKTIVNÍ PROTI Lactobacillus: L. fermenti 466 L. helveticus 27 L. helveticus L. acidophilus L. acidophilus L. plantarum L. sake Lb 706 L. sake L 45 L. casei BO lactocin 27 helveticin J lactacin B lactacin F plantaricin A sakacin A lactocin S caseicin 80 Listeria monocytogenes Pediococcus: P. acidilactici H pediocin AcH Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes Clostridium perfringens P. acidilactici PAC1.0 P. pentosaceus FBB61 Lactococcus lactis subsp.: L. lactis subsp. lactis L. lactis subsp. lactis L. lactis subsp. lactis L. lactis subsp. cremoris L. lactis subsp. diacetilactis Bo = bez označení pediocin PA1 pediocin A nisin lacticin 481 lactostrepcins diplococcin bacteriocin 550 Listeria monocytogenes Clostridium botulinum Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Bacillus sp. Listeria monocytogenes Streptococcus, Micrococcus, Lactobacillus, Clostridium 40

41 3.3.3 Plísňové kultury Salámy zrající s působením plísní na povrchu jsou ve středomořských zemích (Francie, Španělsko, Itálie) a zemích východní Evropy (Maďarsko, Rumunsko, Bulharsko) dobře známy. (Nikolai, 1997) Tradice těchto výrobků je známá již od 18. století. V Maďarsku je datován počátek výroby tradičních uherských salámů od roku 1835 a v ČR do období první republiky. Kmeny kulturních vláknitých mikromycetů vznikly v procesu selektivního výběru a domestikace 3 z divokých kmenů. K nejznámějším masným výrobkům s plísňovým pokryvem patří šunka Jámon Serrano, která se stala pojmem podobně jako parmská šunka. V ČR jsou to především výrobky Křemešník, Kostelecký uherák 4 a Čeřínek, které se v posledních letech vyrábí v masokombinátu v Kostelci u Jihlavy. (Malíř aj., 2003) Kvasinky Kvasinky se často nacházejí na nativních zrajících syrových salámech, které během výrobního procesu nejsou zakuřovány. Některé druhy tvoří CO 2, což není žádoucí. Kvasinky jako jsou Candida famata a Debaryomyces hansenii jsou při výrobě používány samostatně nebo v kombinaci s bakteriálními kulturami. Jestliže nejsou ovládnuty mohou kazit výrobky pudrovitým výkvětem nebo ovocným či alkoholovým aroma. Spotřebovávají v díle kyslík a tím snižují redoxpotenciál a urychlují tím vybarvení výrobku (Kameník, 1994). Plísně V důsledku častých negativních vlivů spontánně rostoucích plísní na jakost a hygienickou nezávadnost se jeví jako nutné, očkovat povrch fermentovaných salámů kulturními kmeny plísní. Z plísní přichází do úvahy ty, které přispívají svými metabolity k tvorbě chutnosti a aroma produktů, prodlužují jejich trvanlivost, chrání 3 Proces domestikace probíhal při mnohonásobném pasážování kmenů na specifickém substrátu (např. ze sóji). Příkladem domestikace jsou kulturní kmeny Aspergillus oryzae, které údajně vznikly z divokých kmenů Aspergillus flavus. (Malíř aj., 2003) 4 Uherský salám, má původ v severní Itálii. Je vyroben z jemně mělněného vepřového masa a špeku s přídavkem speciálních koření a bez přídavku startovacích kultur. (Pipek, 1998) 41

42 salám před působením vzdušného kyslíku a před světlem, inhibují růst divokých plísní produkujících mykotoxiny a jiných nežádoucích mikroorganismů a v neposlední řadě přispívají ke zlepšení vzhledu výrobku. (Kameník, 1994) Z hygienického a jakostního hlediska by měl být povlak ušlechtilé plísně jemný, bílý (Penicillium nalgiovense) až bělošedý (Aspergillus glaucus), suchý, celistvý, asi 0,5 mm silný. Aroma po plísních se vytvoří pouze u salámů s malým kalibrem (30 40 mm). Pro svůj častý výskyt mají význam především kmeny rodu Penicillium a to P. nalgiovense 5, P. chrysogenum, P. expansum. Barva plísňového pokryvu je dána kvalitativním složením kulturní mikroflóry. Nevhodné jsou porosty modrozelené, zelené nebo žluté (Scopulariopsis brevicaulis). (Malíř aj., 2003) Takto barevné plísně jsou okartáčovány a rovněž i na konci zrání se větší část porostu plísně okartáčuje a sníží se tak vlas porostu plísně, který u zrajících salámu přesahuje i 10 mm. Plísně nesmějí být patogenní, přesto mnohé kmeny mohou tvořit jako sekundární metabolity vysoce účinné mykotoxiny, které mají vedle akutní toxicity také subakutní karcinogenní potenciál. Rozvoji plísní brání tzv. alkalizující efekt, tj. metabolizace bílkovin plísněmi, při tom se uvolňuje amoniak a odbourávají se organické kyseliny. Efekt je patrný po 14 až 21 dnech. (Pipek, 1998) Povrch salámu je možné plísní uměle naočkovat, a to ponořením do roztoku s kulturou plísně, potřením, či postřikem suspenzí plísňových spor (Tab. 6). Další variantou je uplatnění domácí mikroflóry, tedy přirozených plísňových kultur žijících ve zracích komorách, kde jsou usazeny na zdech, regálech a stojanech (především dřevěných) i ve vzduchových kanálech a odtud se pak přenesou na salám. Podmínkou pro to, aby mohly na povrchu salámu růst plísně, je přiměřeně nízká a w, pokud není dodržena tato podmínka, mohou se na povrchu salámu prosadit konkurenční kvasinky. Na 20 l láku, kterým se může ošetřit asi 300 kg salámu, se spotřebuje 1 l kultury. (Anonym, 2004) Kultura se doporučuje přidávat při teplotě pod 0 o C. V různých vývojových stádiích vyžadují plísně i různé klimatické podmínky. Proto se výrobky v průběhu sušení a zrání přemisťují do dvou nebo tří sušárenských prostorů. Při nízké teplotě zrají a schnou do dosažení mikrobiální stability, poté pokračuje sušení a zrání do dosažení žádoucího obsahu vody. Dosušováním při teplotě o C, se rozvine plíseň, 5 Kmen Penicillium nalgiovense byl uložený a určený do světové sbírky plísní NRRL v roce 1932 českým mykologem Laxou pod číslem NRRL 911 (v dalších světových sbírkách je pod různými čísly, např. ATCC 10472, CCF ). Byl izolován ze sýrů camembertského typu, který byl vyráběn v Nalžovech v jižních Čechách. (Malíř aj., 2003) 42

43 její růst je podpořen řízeným ovlhčením (vlhkost až 95 %). Během zrání dochází k postupné hydrolýze tuků, neprobíhá však oxidační žluknutí (Incze, 1986). Rovnoměrná bílá, až našedle bílá plíseň, se objeví za 1 až 2 týdny v závislosti na velikosti salámu, celý povrch pokryje přibližně za 3 až 4 týdny. Plísňový povlak má význam zejména u dlouhozrajících syrových výrobků. Problém u plísňových výrobků bývá výskyt roztočů, např. sýrohuba (Tyrolichus casei), kteří se živí plísněmi a velmi obtížně se odstraňují z prostoru zracích komor (Leistner, 1986). Tab. 6 Využití kulturní mykoflóry při výrobě fermentovaných masných výrobků (Malíř aj., 2003) NÁZEV VÝROBEK MYKOFLÓRA Salámy italského typu Tepelně neopracovaný masný výrobek s plísňovým pokryvem Penicillium nalgiovense, Penicillium chrysogenum Salámy maďarského typu Salámy německého typu Salámy rumunského typu Sudtiroler Speck (D) Speck (I) Bindefleisch (D) Bundnerfleisch (CH) Country Cured Ham (USA) Jámon Serrano (E) Bischops cape (E) Tepelně neopracovaný masný výrobek s plísňovým pokryvem Tepelně neopracovaný masný výrobek s plísňovým pokryvem Tepelně neopracovaný masný výrobek s plísňovým pokryvem Slanina s plísňovým pokryvem Slanina s plísňovým pokryvem Masný výrobek s plísňovým pokryvem Masný výrobek s plísňovým pokryvem Šunka s plísňovým pokryvem Šunka s plísňovým pokryvem Šunka s plísňovým pokryvem Penicillium nalgiovense, Penicillium chrysogenum, Scopulariopsis brevicaulis Penicillium nalgiovense, Penicillium chrysogenum Penicillium nalgiovense, Penicillium chrysogenum, Scopulariopsis brevicaulis Penicillium spp., Aspergillus glaucus Penicillium spp., Aspergillus glaucus Penicillium spp., Aspergillus glaucus Penicillium spp., Aspergillus glaucus Penicillium spp., Aspergillus glaucus Penicillium spp., Aspergillus glaucus Aspergillus ruber 43

44 3.4 Mikroflóra fermentovaných masných výrobků Bakterie mléčného kvašení Kandler (1983) definuje bakterie mléčného kvašení (BMK) jako grampozitivní nesporogenní fakultativně anaerobní bakterie, které tvoří při fermentaci sacharidů jako hlavní produkt kyselinu mléčnou. Jsou odolné vůči dusitanu, kouři, oxidu uhličitému a jsou schopné růst a fermentovat při poměrně vysokých koncentracích soli. Mléčným bakteriím se připisuje i antikarcinogenní účinek (Incze, 1992). Tato skupina je tvořena 13 rody bakterií Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Paralactobacillus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella (Jay et. al, 2005) Görner a Valík (2004), k této skupině řadí také bakterie rodu Bifidobacterium, byť nejsou fylogeneticky příbuzné ostatním BMK Význam bakterií mléčného kvašení Spočívá v tvorbě: Kyseliny mléčné Kyselina mléčná vzniká jako konečný produkt fermentace sacharidů. V přírodě se vyskytuje jako pravotočivá L(+), levotočivá D(-) 6 nebo jako směs obou optických forem v různých poměrech. Vyšší živočichové a rostliny, produkují výlučně L(+) izomer 7. Její obsah je limitující, bez mléčného kvašení nelze odpovídající výrobky vůbec vytvořit. Význam kyseliny mléčné můžeme posuzovat z hlediska snížení hodnoty ph v díle a ovlivnění chuťových a aromatických vlastností výrobku. I když je kyselina mléčná konečný produkt mléčného kvašení, může být dále metabolizována za aerobních podmínek laktátdehydrogenázou nebo laktátoxidázou. 6 D(-) kyselina mléčná je obtížně utilizována u člověka i zvířat, dle údaje FAO/WHO, je její limitující denní příjem 100 mg/kg tělesné hmotnosti (Kameník, 1994). 7 Typ izomeru je druhově i rodově specifický a je užíván jako taxonomický znak (Kameník, 1994). 44

45 Dle toho mohou být laktobacily rozděleny do dvou skupin: druhy, které disponují flavin obsahující L-laktátoxidázu, která využívá O 2 jako akceptor elektronů, při reakci vzniká H 2 O 2 druhy, které vyžadují k oxidaci kyseliny mléčné ve větším rozsahu methylenovou modř (Kameník, 1994) Do první skupiny patří hlavně L. sake a L. curvatus. Produkce H 2 O 2 těmito druhy může přispívat k inhibici nežádoucí doprovodné mikroflóry u potravin a krmiv. Jeho nadměrné množství je pro fermentované salámy nežádoucí, dává se do souvislostí s oxidativním žluknutím lipidů a jsou mu přisuzovány i vady ve vybarvení. Fermentované salámy obsahují po naražení do obalového střeva jen omezené množství vzduchu, a tím i kyslíku. To dává předpoklady pro tvorbu H 2 O 2 pouze v povrchové zóně výrobku. Proto se zde uplatňují antioxidační účinky sloučenin obsažených v udírenském kouři, v některých druzích koření, zvláště papriky a stejnou schopnost má i dusitan. Peroxid vodíku je pouze jednou ze sloučenin, které mohou ovlivnit peroxidaci lipidů ve svalové tkáni. Peroxidaci je zabráněno tzv. kompetitivní oxidací redukčních sloučenin, účinkem katalázy, uvolněné ze svalových buněk. Bakterie mléčného kvašení jsou všeobecně považovány za mikroorganismy, které nedisponují katalázovou aktivitou, protože tyto organismy nejsou schopny syntetizovat hemové sloučeniny (Kandler et Weiss, 1986). Ukazuje se tedy, že podíl peroxidu vodíku uvolněný kmeny druhů L. sake a L. curvatus na oxidaci lipidů fermentovaných salámů není zcela jednoznačný a ani podstatný. Rozhodující vliv bude mít jakost lipidů vstupní suroviny. (Kameník, 1994) Okyselení Zkysnutí pomáhá uvolnit vodu vázanou proteiny, největší exploze nastává v izoelektrickém bodě masových protienů (ph = 5,4 5,3) v závislosti na obsahu soli, typu svalu a druhu zvířete, z něhož pochází (Anonym, 2003). Kyselina mléčná je přítomná v mase jatečných zvířat za hodin po porážce v množství 5 8 g/kg. V díle fermentovaných salámů je její obsah 3,3 g/kg a s postupujícím zráním se dále zvyšuje. (Kameník, 1994) Po porážce je v mase jatečných zvířat obsah glukózy poměrně malý, proto se přidávají do díla fermentovatelné sacharidy, aby vytvořené množství kyseliny mléčné bylo optimální pro zaručení správného průběhu zrání. 45

46 Intenzita tvorby kyseliny mléčné z cukrů závisí nejen na metabolismu samotné startovací kultury, ale také na druhu použitého cukru. C 6 H 12 O 6 2 CH 3 -CHOH-COOH + 2 ATP dextróza k. mléčná energie Při použití monosacharidů (převážně glukóza) je nástup fermentace zvlášť rychlý, zatímco u disacharidů (sacharóza, laktóza) a hlavně oligosacharidů je nutný delší čas pro mikrobiální rozklad. Působením mikrobiálních enzymů je glukóza i sacharóza spotřebována již den po výrobě. Pro salámy s pomalejším zráním (4 týdny a více) je optimální přídavek 0,3 % glukózy nebo sacharózy, pro výrobky s kratším zrání (max. 3 týdny) 0,5 0,7 %. Maximální množství přídavku se uvádí jako 2 % (Liepe et Porobic, 1986). Použilo li se správného množství cukru, zůstává ph stálé a nedochází k pozdějšímu znovuzkysnutí, ztrátě barvy a výskytu skvrn. Aby kultury začaly co nejvíce působit a aby střevo zůstalo prostupné a bylo možné unikání vody, je požadována vysoká relativní vlhkost 90 % a teplota o C. Zahřívání se provádí do dosažení určitého ph (4,9 5,2) v závislosti na typu výrobku, což odpovídá koncentraci přibližně 25 g kyseliny mléčné na kg sušiny fermentovaných masných výrobků. Během prvních 4 dní fermentace se tvoří přibližně 50 % k. mléčné, dalších 33 % připadá na období od 4. do 14. dne. (Kameník, 1994) Při použití laktózy je nutno počítat s vyšším obsahem zbytkového množství v díle, neboť má nižší obsah vody. Doporučuje se proto přídavek 0,5 % laktózy pro pomalu zrající a 1,0 % pro rychle zrající salámy. Při poklesu ph díla na hodnotu 5,3 přechází roztok bílkovin, uvolněných při mělnění díla ze svalových buněk, a NaCl ze stavu sol na stav gel. (Katsaras et Leistner, 1988) Tím se vytváří prvotní struktura díla, která je dále upravována sušením výrobku. Proces je aktivován enzymy pocházejícími z mikrobiálních kultur. Produkty fermentace působí ve výrobku tak, že umožňují jeho správné zkysnutí a vytvářejí enzymy, jež zasahují do procesu fermentace. Barva masných výrobků je určována obsahem svalového barviva, v použité surovině a může se zlepšit aplikací redukčních činidel, ale také použitím mikroorganismů, které vykazují aktivitu tzv. dusičnanové reduktázy. Pro požadované vybarvení je nutný přídavek dusitanu, příp. dusičnanu. Dusitan je převeden chemickou reakcí na oxid dusnatý, který je vlastním reagenčním článkem při vybarvení masných výrobků. Přeměna je závislá na ph díla, a probíhá tím intenzivněji, čím nižší je ph. I když v receptuře salámu se nepřidá žádný dusičnan, bude dusičnan přítomen v důsledku 46

47 okysličování dodaného dusitanu (Obr. 5). Odbourání dusitanu z masných výrobků je možné s použitím startovacích kultur již 2. den fermentace při ph nižším než 5,7. Kyselina mléčná ovlivňuje aroma fermentovaných salámů spolu s jinými látkami, vznikajícími při fermentaci sacharidů, jako je k. octová, příp. acetaldehyd a aceton. Kyselinu octovou uvolňují za normálních podmínek heterofermentativní laktobacily a leukonostoky, které tvoří méně než 10 % mikrobiální populace fermentovaných salámů. (Kameník, 1994) NO 3 NO 2 dusičnanová reduktáza NO 2 HNO 2 nízké ph 3 HNO 2 NO NO + H 2 O Obr. 5 Interakce mezi dusičnanem a dusitanem ve fermentovaných salámech (Nicolai, 1997) Tvorba látek s antimikrobiální aktivitou Absence tepelného ošetření u fermentovaných salámů poskytuje různým druhům mikroorganismů široký prostor pro jejich uplatnění. Cílem výroby je proto potlačení růstu, příp. úplná eliminace patogenních, podmíněně patogenních a technologicky nežádoucích mikrobů v hotovém produktu. Antagonistický efekt BMK je založen na nízkých hodnotách ph prostředí (následkem tvorby kyseliny mléčné), kromě tohoto přímého inhibičního účinku nízké hodnoty ph se uplatňuje i účinek nepřímý, při nižším ph je vyšší a rychlejší ztráta vody z díla a tím je i nižší a w výrobku. (Kameník, 19994) Podle Hassan et Frank (2001) produkují BMK také mikrobiální inhibitory nekyselinové povahy, ty zahrnují peroxid vodíku, CO 2, nízkomolekulární uhlíkaté inhibiční látky a bakteriociny (nisin, pediocin, lactocin). Tvorba látek aromatických a chuťově aktivních Specifické aroma a chuť fermentovaných salámů jsou způsobeny mnoha sloučeninami. Některé z nich jsou přidávány do díla jako takové tj. kuchyňská sůl, koření, působení kouře; jiné vznikají bez přímé účasti mikroorganismů např. produkty autooxidace, a mnohé se uvolňují při mikrobiálním štěpení sacharidů, lipidů a proteinů. 47

48 (Lücke, 1985) Tyto látky mohou být tvořeny bakteriemi mléčného kvašení, ale také stafylokoky a mikrokoky. Lipidy jsou prekurzory mnoha aromatických sloučenin, zvláště jejich metabolity, vznikající při odbourávání tuků mají podstatný podíl na aromatizaci fermentovaných salámů. Zahrnují aldehydy, ketony a karboxylové kyseliny s krátkými řetězci. Některé kmeny laktobacilů izolované z fermentovaných salámů mohou hydrolyzovat tributyrin 8, jehož obsah je ve fermentovaných salámech minimální. Nejsilnější lipolýzu mají heterofermentativní kmeny např. Leuconostoc. Lipázy jsou produkovány během logaritmické fáze růstu, při optimální teplotě 30 o C, počátečním ph 7,0 a nízké koncentraci glukózy. Lipolýza je méně výrazná se stoupající délkou uhlíkatého řetězce karboxylových kyselin. Kmeny používané ve startovacích kulturách mají lipolytické vlastnosti jen minimální. BMK jsou ve srovnání s jinými skupinami bakterií (např. rody Proteus, Pseudomonas) slabě proteolytické. Působením proteolytických systémů se zpřístupňují dusíkaté látky proteinového i peptidového charakteru pro růst buněk, které jsou lokalizovány extra- i intracelulárně. Přeměněné aminokyseliny slouží jako nutriční zdroj nebo růstový stimulans pro BMK, přičemž nejnáročnější jsou laktobacily. (Kameník, 1994) Rozlišení bakterií mléčného kvašení Bakterie mléčného kvašení, které jsou součástí komerčních startovacích kultur, lze rozlišit na dva typy, resp. na startovací kultury 1. a 2. generace. Startovací kultury 1. generace byly původně izolovány z rostlinného materiálu a po aplikaci do díla se během krátké doby pomnoží na vysoké počty buněk. Po dosažení hodnoty ph kolem 5,0 následuje velmi rychlý pokles jejich aktivity a nastupuje pozvolné snižování početní převahy. Na jejich místo se dostává původní laktobacilová mikroflóra přítomná v díle fermentovaných salámů. (Kameník, 19994) Snahy o použití těchto startovacích kmenů vedly k vývoji a použití startovacích kultur 2. generace, tj. kmenů Lactobacillus sake a L. curvatus. Četné pokusy dokázaly, že tyto druhy vyvolávají na počátku zrání žádoucí pokles ph hodnoty a jsou také schopny jistým způsobem kontrolovat celý průběh fermentace. Při zrání fermentovaných salámů mají rozhodující roli bakterie rodu Lactobacillus a 8 Tributyrin je nejcitlivější testovací substrát k průkazu lipáz. Díky dobré rozpustnosti vznikajícího dibutyrinu je rychleji atakován. (Kameník, 19994) 48

49 Pediococcus. Ve středoevropských podmínkách se používají teploty fermentace max. do 25 o C, dominanci proto získávají zástupci rodu Lactobacillus Bakterie používané ve startovacích kulturách Rod Pediococcus, (čeleď Lactobacillaceae) Grampozitivní fakultativně anaerobní, nepohyblivé, nesporulující, chemoorganotrofní, homofermentativní koky o velikosti 1,0-2,0 µm. Tvoří tetrády, vzácně uspořádané jednotlivě nebo ve dvojicích (nikdy ne v řetízcích). (Sedláček, 2007) Fermentují těžko fermentovatelné pentózy (arabinóza, xylóza) a glukózu fermentují bez tvorby plynu. Optimální růstová teplota je 25 až 40 o C. Kataláza negativní, neredukující dusičnany. Jsou náročné na růstové faktory a to vitamíny a aminokyseliny. V masném průmyslu se vyskytují jako startovací kultury, ale také se mimo jiné zúčastňují kažení masných produktů a výrobků studené kuchyně tvorbou diacetylu (P. damnosus, v minulosti P. cerevisiae). Proto se zde uplatňuje jejich méně výrazná kysací schopnost a halotolerantnost. (Görner a Valík, 2004) P. acidilactici vytváří velmi rychle kyseliny při teplotách C, při nízkých teplotách vytváří kyseliny pomalu současně s jemnou chutí. Produkuje pediocin a inhibuje růst Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes a Clostridium perfringens, tím že rozrušuje buněčnou stěnu (Erkkilä, 2001). Druh P. pentosaceus má nižší optimální teploty růstu (21 35 o C) a vyšší produkci kyseliny mléčné, než P. acidilactici. (Doyle et. al, 2001) Rod Lactobacillus, (čeleď Lactobacillaceae) Grampozitivní pravidelné tyčinky, někdy kokovité, uspořádané v krátkých řetízcích nebo v palisádách o velikosti 0,5-1,2 x 1,0-10,0 µm. Nesporulující, zřídka pohyblivé s peritrichálními bičíky. Fakultativně anaerobní až mikroaerofilní (slabý růst na vzduchu, ale lepší růst při redukované koncentraci kyslíku), obecně platí, že přítomnost 5 % CO 2 podporuje růst laktobacilů. Chemoorganotrofní, kataláza negativní, neredukují nitráty. Optimální růstová teplota je o C, při optimálním ph 5,5-6,2. (Sedláček, 2007) Vzácně mohou být patogenní. Laktobacily dekarboxylují některé aminokyseliny 49

50 jako např. k. glutamovou a tyrosin za vzniku aminů. Na základě konečného produktu fermentace se dělí do tří skupin: Obligátně homofermentativní Hexosy fermentují výhradně na k. mléčnou (více jak 90 %), pentózy a glukonát nefermentují. Rostou při 45 o C, nerostou při 15 o C a optimální teplota je o C. Patří sem např. L. delbrueckii ssp. delbrueckii, L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii ssp. lactis, atd. Fakultativně heterofermentativní Hexosy fermentují na k. mléčnou (více jak 90 %), nebo na směs k. mléčné, k. mravenčí, k. octové a ethanolu. Pentosy fermentují na k. mléčnou a k.octovou. Rostou při 15 o C, výjimečně při 45 o C a optimální teplota je o C. (Sedláček, 2007) L. plantarum svou metabolickou činností chrání proti kažení proteolytickými bakteriemi, sami však mohou způsobit vady, jako kyselá chuť, nežádoucí pachutě, tvorbu plynu, slizu nebo zelenání. (Görner a Valík, 2004) Podobné vlastnosti má i L. pentosus, L. sake a L. curvatus Obligátně heterofermentativní Hexózy fermentují na k. mléčnou, k. octovou, ethanol a CO 2. Pentózy fermentují na k. mléčnou a k. octovou. Rostou při 15 o C (L. fermentum), optimální teplota je o C (L. reuteri). L. halotolerans roste za přítomnosti % NaCl. (Sedláček, 2007) Do této skupiny patří např. L. brevis, L. buchneri, atd. Podle Hutkins (2001) jsou v homofermentativní dráze hexosy metabolizovány enzymy Embden Meyerhoffovy dráhy za vzniku 2 molů pyruvátu (k. mléčné) a 2 molů ATP z 1 molu hexózy. Pyruvát je následně redukován na laktát laktátdehydrogenázou. V heterofermentativním metabolismu jsou hexózy katabolyzovány 6-fosfoketolázovou dráhou za vzniku 1 molu CO 2, 1 molu k. octové nebo ethanolu a 1 mol k. mléčné. Pak vzniká z hexózy jen 1 mol ATP. Ke zvratu z homo- na heterofermentaci může dojít tehdy, je li glukóza limitujícím faktorem v prostředí. Následkem jsou změny v metabolických drahách, vlivem inhibice glykolitických enzymů, jako jsou pyruvátkináza nebo laktátdehydrogenáza a zvyšováním intracelulární koncentrace 3-fosfoglycerátu a anorganického fosforu. Stejný účinek jako limitující obsah glukózy má i přítomnost kyslíku, tj. aerobní podmínky kultivace. (Kameník, 1994) 50

51 Obr. 6 Lactobacillus sake ( Rod Staphylococcus, (čeleď Staphylococcaceae) Grampozitivní nepohyblivé, nesporulující, fakultativně anaerobní, koky o průměru 0,5 1,0 µm. Vyskytují se jednotlivě, po dvou a v nepravidelných shlucích, občas v tetrádách. Mohou produkovat pigmenty karotenoidní povahy a zbarvovat tak kolonie žlutě až oranžově. Silně kataláza pozitivní, chemoorganotrofní, redukující dusičnan. Rostou v 10 % přítomnosti NaCl. Optimální teplota je o C. (Sedláček, 2007) Z fyziologického hlediska se většinou jedná o fakultativně anaerobní bakterie, avšak za aerobních podmínek rostou lépe. Zkvašují cukry za vzniku kyselin. Obecně jsou stafylokoky velmi rozšířené v prostředí, ve kterém primárně osidlují povrch těla člověka a mnoha zvířat, také různé sliznice ptáků a savců. (Klaban, 1999) Potravinářsky významné jsou dva druhy koaguláza negativních stafylokoků a to: S. carnosus a S. xylosus. S. xylosus má nižší teplotní optimum, a to nižší než 24 o C. Je upřednostňován pro zvýraznění chuti a červené barvy (Doyle et. al, 2001) 51

52 Obr. 7 Staphylococcus carnosus ( Rod Lactococcus, (čeleď Streptococcaceae) Grampozitivní fakultativně anaerobní koky nebo ovoidní buňky, 0,5-1,2 x 0,5-1,5 µm, vyskytující se v párech nebo v krátkých řetízcích. Jsou nepohyblivé, nesporulující, nepatogenní, bez pouzder, chemoorganotrofní, kataláza i oxidáza negativní. Fermentují sacharidy na kyselinu mléčnou a netvoří plyn. Optimální růstová teplota je 37 o C, rostou i při 10 o C, nerostou při 45 o C a 6,5 % NaCl. (Sedláček, 2007) Podle Görner a Valík (2004) některé kmeny Lactococcus lactis ssp. lactis produkují polypeptidové antibiotikum nisin inhibující růst grampozitivních bakterií, např. Clostridium. Lactococcus lactis je nově patentovaná okyselující kultura. Vytváří těkavé produkty látkové výměny, které přispívají k chuti a brání příliš kyselé chuti fermentovaných výrobků Rod Micrococcus, (čeleď Micrococcaceae) Grampozitivní striktně aerobní koky o velikosti 0,5 2,0 µm, vyskytující se jednotlivě, v párech, tetrádách či shlucích, ale ne v řetízcích. Jsou nepohyblivé, nesporulující, nepatogenní a mezofilní, z cukrů produkují malé nebo žádné množství kyselin. Optimální teplotou růstu je o C. (Sedláček, 2007) Jsou poměrně dost halofilní, snášejí koncentrace NaCl až do 12 %, což je velmi důležité pro jejich 52

53 používání v uzených výrobcích jako šunka a bůček (Bacon). Působí pouze ve vnějších vrstvách salámu a jsou tak vystaveny případným bakteriostatickým účinkům kouře, k němuž jsou vnímavější, než laktobacily. Mikrokoky se v díle fermentovaných salámů rozmnožují jen velmi málo, musejí se proto přidávat v dostatečném množství (Lücke et Hechelmann, 1986). Dostatečný přídavek těchto mikrobů je /1 g díla. Selgas et. al (1988) udávají nejlepší záchytnost grampozitivních koků mezi 5. a 15. dnem zrání, po 20 dnech byly izolace již negativní. K nejužívanějším druhům patří Micrococcus varians (I, II, III) a M. cristinae. Bývají častou složkou vícedruhových kultur. Některé jeho kmeny jsou producenty bakteriocinu variacinu, jehož účinky jsou poměrně širokospektrální. Mikrokoky mají trojnásobný význam díky existenci tří enzymatických systémů, které s sebou nesou a jež se využívají při výrobě uzenin ze syrového, uzeného masa. Jsou to tyto: Enzymatický systém nitrátoreduktázy - při aplikaci dusičnanu přechází molekuly přes buněčnou stěnu do bakteriální buňky a aktivují příslušný enzym nitrátreduktázu 9, který přemění přijatý dusičnan na dusitan a tím dochází k vybarvení masných výrobků. Molekula dusitanu potom putuje zpět z bakteriální buňky do vnějšího prostředí. Chybí - li dusičnan jako substrát, je enzym neaktivní. Podle Potthasta (1991) oxiduje asi % přidaného množství dusitanu na dusičnan podle rovnice: NaNO H + HNO Na HNO - 2 HNO NO - + H 2 O Nitrátreduktáza přenáší protony z NADH nebo NADPH na substrát podle rovnice: NO NADH + H nitrátreduktáza NO NAD + H 2 O Systém enzymatické katalázy - kataláza rozrušuje peroxid vodíku, který mohou uvolňovat některé laktobacily. Tvorba katalázy nastupuje v pozdějším stádiu zrání, kdy je již v díle méně kyslíku. Aplikací startovacích kultur s aktivitou katalázy je 9 Nitrátreduktáza je intracelulární enzym (endoenzym), který se váže na cytoplazmatickou membránu bakteriální buňky. Patří ke katabolickým enzymům. (Kameník, 1994) 53

54 možné dobu skladování výrobku prodloužit. Peroxid produkovaný některými bakteriemi se může neutralizovat enzymem katalázou za tvorby vody a kyslíku. (Kameník, 1994) 2 H 2 O 2 kataláza 2H 2 O + O 2 Systém enzymatické lipázy - Selgas et. al, (1988) uvádějí, že druhy této čeledě disponují lipolytickou a proteolytickou aktivitou. Hydrolýzou tuků, během zrání uzeniny, vznikají mastné kyseliny, které ovlivňují chuť a aroma správně uzeného výrobku Nežádoucí mikroorganismy a produkty jejich metabolismu Chyby při produkci a skladování fermentovaných výrobků mohou vést ke kontaminaci a pomnožení patogenních a podmíněně patogenních mikroorganismů ve výrobku a po jeho konzumaci může dojít ke vzniku alimentárních onemocnění (Steinhauser aj., 1995). Kromě pozitivního účinku mohou některé BMK způsobit i vady produktů. Nežádoucí je velké pomnožení laktobacilů ve vakuově baleném mase nebo jeho vizuální projevy zezelenání produktů (Lactobacillus viridescens). Při nepřiměřeném rozmnožení BMK ve zrajících produktech může vzniknout příliš kyselá chuť a vůně. Kyselina octová vznikající při heterofermentaci, udílí hotovým výrobkům štiplavé aroma a štiplavou, pálivou chuť. Oxid uhličitý vyvolává pórovitost až tvorbu trhlin patrných na řezu výrobku. V extrémních případech může vyvolat i prasknutí výrobku. Bakterie mléčného kvašení mají inhibiční vliv na rozmnožování salmonel, jejich přežití je pak závislé na množství, kontaminaci a použití kultur. Nejčastěji vyskytující se mikroorganismy způsobující vady fermentovaných masných výrobků jsou shrnuty v Tab. 7 (Hechelmann, 1986, In Görner a Valík, 2004). 54

55 Tab. 7 Přehled nejzávažnějších mikroorganismů, způsobující problémy fermentovaných salámů (Hechelmann, 1986, In Görner a Valík, 2004) Mikroorganismy Bakterie mléčného kvašení - homofermentativní - heterofermentativní Senzorické změny zkysnutí tvorba plynu, nežádoucí změna chuti a vůně, vady barvy Bakterie produkující peroxid Leuconostoc spp. Enterobakteriaceae Micrococcus spp. Staphylococcus Clostridium spp. Kvasinky Plísně destrukce barvy, jiné barevné změny, nitkovitost zkažení jádra výrobku, tvorba plynu tvorba slizu, zešednutí povrchu (po umytí) kažení povrchu, kontaminace, (při použití přírodních střev) mazovitost povrchu, kvasný pach a chuť defekty na povrchu, ztuchlý pach a chuť Rod Leuconostoc, (čeleď Leuconostocaceae) Grampozitivní fakultativně anaerobní, chemoorganotrofní, nepohyblivé a nesporulující, heterofermentativní koky nebo ovoidní bakterie, 0,5-0,7 x 0,7-1,2 µm. Uspořádány po dvou nebo v dlouhých řetízcích. Optimální růstová teplota je 20 až 30 o C, nerostou při 45 o C. Růst je pomalý, podmíněný přítomností fermentovatelného sacharidu a vytváří malé kolonie. Glukózu fermentují za produkce kyseliny a plynu, hlavními produkty fermentace jsou ethanol a D(-)-laktát. Kataláza negativní, neredukují nitráty. Obecně považovány za nepatogenní. Jsou významnou složkou mikroflóry masa a masných produktů, příkladem může být Leuconostoc carnosum, L. galidum vyskytující se ve vakuově baleném mase, skladovaném při nízkých teplotách. (Sedláček, 2007) Rod Salmonella, (čeleď Enterobacteriaceae) Gramnegativní fakultativně anaerobní rovné tyčky, většinou pohyblivé, velikost 0,7-1,5 x 2,0-5,0 µm. Chemoorganotrofní, kataláza pozitivní s optimální růstovou teplotou 37 C, tepelné minimum i maximum je závislé na kmenu. Všechny druhy 55

56 salmonel fermentují glukózu za tvorby plynu, typickou vlastností je také produkce sirovodíku. (Sedláček, 2007). Je patogenní pro člověka i zvířata, kvůli jejich termostabilnímu endotoxinu. Salmonely nepřežívají pasteraci při teplotě 65 C a vyšší s výdrží s. Optimální ph (6,5-7,5). (Jičínská a Havlová, 1995) Jsou relativně odolné vůči solení, vysoušení, uzení a mražení. Vyskytují se v zažívacím traktu domácích zvířat, hlodavců, nemocných lidí a bacilonosičů, v drůbežích vejcích, hlavně kachních. Přenášejí se kontaminovaným masem, masnými i vaječnými surovinami, polotovary a potravinami, zmrzlinami, mlékem a mléčnými výrobky, vodou. (Šilhánková aj., 1995) Salmonella typhi subsp. enteritica sv. Typhi způsobuje velmi vážné a často smrtelné střevní onemocnění lidí břišní tyfus. Je patogenní pouze pro člověka a množí se ve střevním traktu. Salmonella enteritidis subsp. enteritica sv. Enteritidis se vyskytuje v trusu ptáků (kachny, holubi), odkud se může dostat do potravin. U člověka vede požití potraviny, jež ji obsahují, k lehčím onemocněním, která jsou charakterizována krátkou inkubační dobou (6 až 20 hodin), průjmy a často i zvracením. Tento typ onemocnění se označuje jako salmonelóza. Ve většině států Evropy nejčastější salmonela způsobující gastroenteritidy u člověka (Sedláček, 2007) Rod Escherichia, (čeleď Enterobacteriaceae) Gramnegativní rovné tyčky o velikosti 1,1-1,5 x 2,0-6,0 µm, vyskytující se jednotlivě ve dvojicích nebo v krátkých řetízcích. Jsou nesporotvorné, kataláza pozitivní, chemoorganotrofní, fakultativně anaerobní. Optimální teplota růstu je 37 C a ph 6,8 7,2. Nepřežívají záhřev s při teplotách vyšších než 64,5 C. (Jičínská a Havlová, 1995, Sedláček, 2007) Escherichia coli se nachází ve spodní části střevního traktu člověka, teplokrevných zvířat, a ve výkalech. Ve vodách nebo v potravinách je ukazatelem fekálního znečištění a úrovně sanitace a hygieny. Některé její kmeny způsobují průjmová střevní onemocnění a onemocnění močových cest. (tzv. enteropatogenní Escherichia coli - EPEC). Nejvýznamnější je EHEC enterohemoragická E. coli 0157:H7, vyskytuje se v syrovém mléce, infikovaném hovězím mase a způsobuje až krvavý průjem, bolesti břicha a zvracení. Infekční dávka je velmi nízká, nižší jak 10 mikroorganismů/g (Cempírková aj., 1997). 56

57 Rod Staphylococcus, (čeleď Staphylococcaceae) S. aureus je halotolerantní až mírně halofilní, dobře roste i při koncentraci 10 % NaCl. (Sedláček, 2007) Stafylokoky jsou poměrně rezistentní k vyšším teplotám, tj. více než 60 C. Podle studií prováděných s různými kmeny za rozdílných podmínek mohou přežívat při C po dobu 30 až 120 min. (Jičínská a Havlová, 1995) Stafylokokové otravy jsou způsobeny enterotoxinem typu A, producentem je Staphylococcus aureus. Na tvorbu enterotoxinu má vliv složení potraviny a teplota. Pokud jde o rezistenci enterotoxinu, ten je termostabilní, není inaktivován ani působením teploty 100 C po dobu 20 minut (Komprda, 2004). Proto může onemocnění také vyvolat potravina či pokrm ohřívaný nebo krátce povařený, tyto potraviny pak většinou nemají viditelné známky kažení. Příznaky otravy se projevují hodinu až 6 hodin po požití potraviny. Vyznačují se žaludeční nevolností, křečemi, zvracením, průjmy, bolestí hlavy a někdy i poklesem teploty. K otravě dochází obyčejně tehdy, je-li koncentrace buněk Staphylococcus aureus v potravině řádu 10 5 až 10 7.g -1 (Šilhánková, 1995, Sedláček, 2007). Doporučuje se proto kvalitní surovina, správná hygiena, kontrolované okyselení mikrobiálními kulturami, nebo chemickými okyselujícími prostředky. Minimální a maximální teplota pro růst S. aureus a tvorbu enterotoxinu je C, optimální C Rod Clostridium, (čeleď Clostridiaceae) Grampozitivní rovné nebo mírně zakřivené tyčky, uspořádané po dvou v krátkých řetízcích. Jsou sporulující, obligátně anaerobní, kataláza negativní s optimální teplotou 10 až 65 o C. (Sedláček, 2007) Kyslík inhibuje růst a po 5 až 10 minutách působení usmrcuje vegetativní buňky většiny druhů. Při anaerobní oxidaci sacharidů tvoří velké množství plynu (CO 2, H 2 ). Některé druhy produkují velmi nebezpečné toxiny a jiné mají zase silné proteolytické schopnosti, uplatňují se při anaerobním rozkladu bílkovin (př. C. sporogenes). Bakterie mléčného kvašení v kombinaci se zkvasitelným substrátem jsou ve fermentovaných masech účinným prostředkem proti Clostridium botulinum. C. botulinum má optimální teplotu pro růst v rozmezí C, s optimálním ph 6,5 7. Je inhibovaný při ph 8,5 a 6,5 % NaCl. (Görner a Valík, 2004) Produkuje tzv. botulotoxiny, které patří k nejúčinnějším jedům, otrava se nazývá botulismus. 57

58 Botulotoxiny jsou bílkovinné povahy a proto se inaktivují zvýšenou teplotou během 15 až 20 minut při 100 C (Šilhánková, 1995). 1 mg botulotoxinu představuje smrtící dávku pro lidí. C. botulinum se v těle živočicha se nerozmnožuje, takže působí pouze toxinem vytvořeným při rozmnožení této bakterie v potravině. Nejsou žádné informace o tom, že by během zrání a skladování trvanlivých tepelně neopracovaných salámů došlo k množení klostrídií a tvorbě jejich toxinů. Inhibici C. botulinum zajišťuje nízké ph, nízká hodnota a w, včetně přídavku dusitanu. (Steinhauser aj., 1995) Dalším druhem produkujícím toxin je Clostridium perfringens, roste při teplotě C, optimální teplota růstu je 45 C. Vegetativní buňky nepřežívají záhřev s na 72 C. Enterotoxin je inaktivován záhřevem při 60 C po dobu 5 min. Otrava toxinem nastává pouze při silné kontaminaci potraviny touto bakterií, tj. při koncentraci buněk v potravině alespoň 10 6 /g. Ke sporulaci dochází až ve střevním traktu člověka. Vyskytuje se hojně v půdě a prachu. (Jičínská a Havlová, 1995) Rod Bacillus, (čeleď Bacillaceae) Grampozitivní pohyblivé, rovné tyčky, uspořádané ve dvojicích nebo v řetízcích o velikosti 1,0-1,2 x 3,0-5,0 µm. Mají bohaté enzymové vybavení, takže mohou rozkládat nejrůznější organické sloučeniny. Jsou aerobní nebo fakultativně anaerobní, kataláza pozitivní, chemoorganotrofní, tvořící endospory. Optimální teplota růstu je 15 až 50 C a ph 7,0 až 7,4. (Sedláček, 2007) Bacillus cereus je saprofyt, rostoucí na rozkládajících se zbytcích rostlin, v půdě, v hnoji a v krmivech. Vegetativní buňky nepřežívají pasterační záhřev 72 C a spory sterilaci v autoklávu při 110 C. Při růstu na polysacharidových substrátech produkují toxiny, které mohou být příčinou otrav potravin obsahujících především obiloviny nebo škrob. Jejich koncentrace je 10 7 /g potraviny, u dětí stačí koncentrace 10 5 /g. Nízké hodnoty ph, nízké a w a nízký obsah kyslíku zabraňuje ve fermentovaných salámech růstu bakterií rodu Bacillus. (Steinhauser aj., 1995) Rod Listeria, (čeleď Listeriaceae) Grampozitivní krátké, nesporulující tyčinky, fakultativně anaerobní, kataláza pozitivní. Vyskytují se jednotlivě nebo v krátkých řetízcích. Optimální teplota pro růst je o C. (Sedláček, 2007) V přírodě velmi rozšířené, vyskytující se také ve 58

59 fekáliích a v potravinách. Pohybují se při C, naopak při teplotách nad 30 C jsou prakticky nepohyblivé. Ne všichni zástupci jsou patogenní. (Klaban, 1999) Nejvýznamnějším druhem je Listeria monocytogenes. Byla popsána před více jak100 lety, ale až v polovině 80. let byla potvrzena jako původce alimentárního onemocnění člověka. Závažnost tohoto onemocnění spočívá především ve vysoké smrtelnosti postižených osob, v České republice je ročně nahlášeno kolem 20 případů. (Karpíšková a Koláčková, 2004) Listerie jsou poměrně odolné k vnějšímu prostředí, k vyšším teplotám, dobře se jim daří v potravinách s koncentrací 10 % soli, přežívají také mrazení. Rozmnožují se v chladírenských teplotách, v potravinách s aktivitou vody vyšší než 0,92 (0,93-0,95) a ph nad 4,5. Infekční dávka není dosud přesně známa, je udávána v rozsahu mikroorganismů/g. Vedle svých psychrotrofních vlastností má tento mikrob významný mezofilní potenciál, který umožňuje přežívat teploty mezi C. Za bezpečnou hranici se považuje teplota 71,8 C (Cempírková aj., 1997). Nepřežívají sterilační teploty, jsou citlivé k běžným dezinfekčním látkám. Bakterie mléčného kvašení a bakteriociny inhibují jejich růst, taktéž i nízké ph a vyšší koncentrace NaCl brzdí jejich růst, ale buňky neničí. Infekční dávka u zdravých jedinců je kolem 10 8 buněk, u rizikových skupin je podstatně nižší V potravinách se většinou pohybuje do 100 KTJ/g. Počáteční příznaky se spíše podobají těžkému chřipkovému onemocnění provázené horečkou, průjmy, bolestmi hlavy a nechutenstvím. Nejtěžší formy se projevují jako meningitidy a encefalitidy, projevující se silnými bolestmi hlavy, křečemi a zmateností, končící smrtí. U gravidních žen bývají příčinou spontánního potratu, porodu mrtvého dítěte nebo i onemocněním či smrtí novorozence. K nejčastěji kontaminovaným potravinám patří syrové maso, syrové mléko, některé druhy sýrů (např.sýry s plísní na povrchu nebo sýry zrající pod mazem), vařené masné výrobky a syrová zelenina. Inkubační doba je 8 dní až 3 měsíce, onemocnění je léčitelné antibiotiky. Hlavním preventivním požadavkem při výrobě, skladování a prodeji potravin je striktní dodržování zásad správné hygienické a výrobní praxe i požadavků vyplývajících z interních systému HACCP u všech provozovatelů v potravinářském průmyslu. (Konečný, 2007) Mykotoxiny Jsou produkty sekundárního metabolismu plísní, které se tvoří během vegetativního saprofytního růstu, především v postexponenciální fázi (idiofázi) během 59

60 sporulace. (Jičínská a Havlová, 1995) Mezi nejznámější a nejvíce sledované mykotoxiny patří aflatoxiny. Jsou produkovány kmeny Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus. Mají poměrně silný toxický účinek na játra lidí, zvláště dětí a mláďata zvířat. Dlouhodobou konzumací malého množství aflatoxinů dojde ke vzniku zhoubných nádorů. Ranft (1975) vypočítal, že akutní toxická dávka aflatoxinu pro člověka s hmotností 70 kg by mohla být 25 mg (Klaban, 1999). Mezi nebezpečné aflatoxiny patří zejména B 1, B 2, G 1, G 2 a M 1. Další nebezpečný mykotoxin je ochratoxin A, vyznačující se imunosupresivními a teratogenními účinky. Je vytvářený kmeny plísní Aspergillus ochraceus, ale i vzácnějšími druhy A. melleus, A. sulphureus, taktéž i Penicillium variabile a P. viridicatum Biogenní aminy Ve fermentovatelných salámech se ve vysokém množství nacházejí i biogenní aminy. Mezi biogenní aminy patří: histamin, kadaverin, putrescin, agmatin, fenylethylamin, tyramin, dopamin a tryptamin. Tyto nízkomolekulární organické báze se mohou tvořit působením nativních enzymů potravin, nebo jsou výsledkem mikrobiální činnosti, jako běžné produkty metabolismu. Nárůst biogenních aminů je patrný hlavně v počátečních fázích fermentace výrobků a je závislý na druhu přítomných mikroorganismů. Na vzniku se mohou podílet jak mikroorganismy použité ve startovacích kulturách, tak i mikroorganismy zpracované suroviny. Proto se doporučují kratší doby fermentace a pečlivý výběr startovacích kultur. Na počátku fermentace se vyskytuje zejména kadaverin a histamin, ke konci je to putrescin a tyramin (Tiecco, 1986). Podle Komprda et. al (2002) je tyramin kvantitativně nejvýznamnějším biogenním aminem v salámu Poličan v průběhu zrání i skladování. Pokud se biogenní aminy nahromadí v potravině v toxickém množství, pak mohou způsobit alimentární otravu. Symptomy konzumace vysokých dávek biogenních aminů jsou zvracení, dýchací potíže, pocení, bušení srdce, hypotenze nebo hypertenze (histamin), migrény (fenylethylamin, tyramin), pálení v ústech, červená vyrážka na kůži. Koncentrace histaminu vyšší než mg/kg se považuje pro člověka za nebezpečnou. (Velíšek, 1999) 60

61 4. MATERIÁL A METODY ZPRACOVÁNÍ 4.1 Charakteristika materiálu Fermentované salámy K mikrobiologickým analýzám byly při každém rozboru použity dva vzorky fermentovaného salámu Kostelecký Poličan o hmotnosti 500 g, které byly odebírány přímo ze zracích komor Kosteleckých uzenin a.s. jedenkrát týdně během procesu výroby (narážení a zrání). K výrobě salámu bylo použito mělněné vepřové a hovězí maso, dále vepřové sádlo, jedlá sůl, cukr, speciální směsi koření a startovací kultury Biobak Sal (Wiberg) s Pediococcus pentosaceus, Staphylococcus carnosus a Staphylococcus xylosus. Maso a tuk byly před zpracováním skladovány při t 5 o C po dobu 48 hod. Hotové dílo bylo naráženo do kutisinových střev o průměru 55 mm. Takto vyrobené salámy pak zrály 35 dní v řízených teplotních a vlhkostních podmínkách. Obr. 8 Kostelecký Poličan Kořenící směs V rámci analýz byl proveden rozbor i kořenící směsi Rokomplett - Trvanlivý salám (Rovita) pro fermentovaný salám Poličan. Směs obsahovala koření, cukr, jedlou sůl, konzervanty a antioxidanty. Tento krémově zabarvený prášek s částicemi koření byl za sterilních podmínek odebrán přímo z provozu z 25 kg pytle a následně byl analyzován v laboratoři. 61

62 4.2 Mikrobiologické analýzy Příprava mikrobiologických analýz Sterilace laboratorního skla Před vlastní analýzou bylo laboratorní sklo používané při rozborech vysterilováno v horkovzdušné sušárně při 165 C po dobu 60 minut. Pipety (1 ml, 2 ml) byly před sterilací zavatovány a zabaleny do hliníkové fólie. Zkumavky s destilovanou vodou pro přípravu ředících řad byly uzavřeny víčky, umístěny do kádinek a překryty hliníkovou fólií. Erlenmayerovy baňky s destilovanou vodou byly taktéž uzavřeny hliníkovou fólií. Erlenmayerovy baňky s živnými půdami a zkumavky s fyziologickým roztokem byly sterilizovány v parním sterilizátoru při 121 C 20 minut. Při analýzách byly použity sterilní jednorázové Petriho misky Složení živných půd Vzhledem k různým životním nárokům stanovovaných skupin mikroorganismů byla k mikrobiologické analýze použita tato živná média: PCA - Plate Count Agar (Biokar Diagnostics, Francie) Účel: ke stanovení celkového počtu mikroorganismů (CPM) a anaerobních mikroorganismů. Složení: trypton 5,0 g, kvasničný extrakt 2,5 g, glukóza 1,0 g, agar 12,0 g, sušené mléko 1,0 g, destilovaná voda 1000 ml. Příprava: 20,5 g dehydratovaného živného média se smíchá s destilovanou vodou a nechá se několik minut stát, poté se zahřívá do úplného rozpuštění za častého míchání. Upravuje se ph tak, aby jeho hodnota po sterilizaci 121 o C 15 min. činila 7 ± 0,2, při 25 C. Složení půdy dle ČSN ISO

63 MRS DeMan, Rogosa, Sharpe agar (Biokar Diagnostics, Francie) Účel: ke stanovení bakterií mléčného kvašení (BMK). Složení: pepton 10,0 g, masový extrakt 10,0 g, kvasniční extrakt 5,0 g, glukóza 20,0 g, tween 80 1,0 g, hydrogenfosforečnan draselný 2,0 g, octan sodný 5,0 g, citran amonný 2,0 g, síran hořečnatý 0,2 g, síran manganatý 0,05 g, agar 15,0 g, destilovaná voda 1000 ml. Příprava: 70,3 g dehydratovaného živného média se smíchá s destilovanou vodou a nechá se několik minut stát, poté se zahřívá do úplného rozpuštění za častého míchání. Upravuje se ph, aby jeho hodnota po sterilizaci 121 o C 15 min. činila ph 5,7 ± 0,1, při 25 C. VRBG Violet Red Bile Agar (Biokar Diagnostics, Francie) Účel: ke stanovení koliformních bakterií. Složení: pepton 7,0 g, kvasniční extrakt 3,0 g, glukóza 10,0 g, chlorid sodný 5,0 g, žlučové soli 1,5 g, neutrální červeň 0,03 g, krystalová violeť 0,002 g, agar 13,0 g, destilovaná voda 1000 ml. Příprava: 39,5 g dehydratovaného živného média se smíchá s destilovanou vodou a nechá se několik minut stát, poté se důkladně promíchá a upravuje se ph, aby jeho hodnota po uvaření činila ph 7,4 ± 0,2, při 25 C. Za občasného míchání se přivede směs k varu a vaří se dvě minuty. Poté se půda ihned ochladí ve vodní lázni na 45 o C a použije se do tří hodin od její přípravy. Složení půdy dle ČSN ISO Chloramfenikol glukózový agar (Biokar Diagnostics, Francie) Účel: ke stanovení počtu plísní a kvasinek. Složení: kvasniční extrakt 5,0 g, glukóza 20,0 g, chloramfenikol 0,1 g, agar 15,0 g, destilovaná voda 1000 ml. Příprava: 40,1 g dehydratovaného živného média se smíchá s destilovanou vodou a nechá se několik minut stát, poté se důkladně promíchá a upravuje se ph, aby jeho hodnota po uvaření činila ph 6,6 ± 0,2, při 25 C. Složení půdy dle ČSN ISO

64 4.2.2 Postup při vlastních mikrobiologických analýzách Při rozborech byla využívána kultivace na pevných půdách tj. plotnová metoda se zalitím inokula živnou půdou. Analýza fermentovaných salámů Salámy pro mikrobiologickou analýzu byly odebírány v průběhu výroby v intervalu jednoho týdne, vždy ve dvou opakováních. Vzorky k analýzám byly odebírány z okrajové a středové části tyčového salámu. Analýzy byly provedeny dvakrát s časovým odstupem. 20 g navážky vzorku bylo se 180 ml sterilní destilované vody zhomogenizováno v homogenizátoru typu STOMACHER po dobu jedné minuty. Z této suspenze bylo ve zkumavkách s 9 ml fyziologického roztoku připraveno desetinné ředění dle potřeby stanovovaných skupin mikroorganismů. Při analýzách bylo používáno desetinné ředění 10-1 až Z příslušného ředění byl odebrán 1 ml a pomocí pipety byl převeden do označených sterilních Petriho misek. Tyto misky byly postupně přelévány příslušnou agarovou živnou půdou zchlazenou na cca 45 C. Krouživým pohybem po desce stolu byla živná půda pečlivě promíchána s inokulem a směs se nechala na vodorovné ploše ztuhnout. Po úplném ztuhnutí se Petriho misky nechaly inkubovat v termostatu při daném čase a teplotě. Při stanovení počtu anaerobních bakterií a bakterií mléčného kvašení byly Petriho misky nejprve vloženy do Anaerostatu a až poté do termostatu. Stanovovány byly tyto skupiny mikroorganismů: Celkový počet mikroorganismů na PCA agaru, kultivace při 30 o C, 72 hod. Anaerobní mikroorganismy na PCA agaru při 37 o C, 72 hod. Bakterie mléčného kvašení na MRS agaru při 37 o C, 72 hod. Koliformní mikroorganismy na selektivní půdě VRBG při 37 o C za 24 hod. Plísně a kvasinky na Chloramfenikol glukózovým agaru při 25 o C, 120 hod. Analýza koření Při mikrobiologické analýze kořenící směsi bylo na laboratorních vahách odváženo 5 g a vpraveno do Erlenmayerovy baňky se 45 ml sterilní destilované vody. Po vytřepání vzorku následovala příprava desetinného ředění 10-1 až 10-4 ve zkumavkách s 9 ml fyziologického roztoku. Z příslušného ředění vzorku byl odebrán 64

65 1 ml a pomocí pipety byl převeden do označených Petriho misek. Mikrobiologický rozbor koření byl proveden jedenkrát. Stanovovány byly tyto skupiny mikroorganismů: Celkový počet mikroorganismů na PCA agaru, kultivace při 30 o C, 72 hod. Anaerobní mikroorganismy na PCA agaru při 37 o C, 72 hod. Koliformní mikroorganismy na selektivní půdě VRBG při 37 o C za 24 hod. Plísně a kvasinky na Chloramfenikol glukózovým agaru při 25 o C, 120 hod. 4.3 Vyjádření výsledků Po ukončení kultivace byly na jednotlivých Petriho miskách spočítány narostlé kolonie mikroorganismů. Výsledné počty mikroorganismů pak byly uvedeny v KTJ na gram, dle rovnice: C N = n + 0,1 n ) d ( 1 2 kde C je součet kolonií spočítaných na Petriho miskách; n 1 n 2 d je počet Petriho misek použitých pro výpočet z prvního ředění; je počet Petriho misek použitých pro výpočet z druhého ředění; je faktor prvního pro výpočet použitého ředění 65

66 5. VÝSLEDKY A DISKUSE Během procesu výroby salámů byly vzorky odebírány ve dvou opakováních. Vzorky k mikrobiologickým analýzám byly odebírány z okrajové a středové části tyčového salámu. Analýzy byly provedeny dvakrát s časovým odstupem. Ve vzorcích salámu byly stanovovány tyto skupiny mikroorganismů: celkový počet mikroorganismů, počty bakterií mléčného kvašení, anaerobních mikroorganismů, plísní a kvasinek a počty koliformních bakterií. Pro porovnání obou sérií analýz jsou v následujících tabulkách č uvedeny počty příslušných skupin mikroorganismů, z nichž jsou patrné větší či menší rozdíly. Tab. 8 Průměrné počty bakterií mléčného kvašení v průběhu výroby (zrání)- průměrné hodnoty ze dvou pokusů Bakterie mléčného kvašení KTJ/g den pokus 1. série (10 6 ) pokus 2. série (10 6 ) 0 5, 1 2, , 1 72, , 4 29, , 2 38, , 9 11, , 2 33, 9 Tab. 9 Průměrné hodnoty celkového počtu mikroorganismů v průběhu výroby (zrání) - průměrné hodnoty ze dvou pokusů Celkový počet mikroorganismů KTJ/g den pokus 1. série (10 6 ) pokus 2. série (10 6 ) 0 10, 9 32, , 5 78, , 8 88, , 5 53, , 1 63, , 4 48, 5 66

67 Tab. 10 Průměrné hodnoty anaerobních mikroorganismů v průběhu výroby (zrání )- průměrné hodnoty ze dvou pokusů Anaerobní mikroorganismy KTJ/g den pokus 1. série (10 6 ) pokus 2. série (10 6 ) 0 7, 8 5, , 4 67, , 1 72, , 6 40, , 3 29, , 7 50, 8 Tab. 11 Průměrné hodnoty koliformních mikroorganismů v průběhu výroby (zrání) průměrné hodnoty ze dvou pokusů Koliformní mikroorganismy KTJ/g den pokus 1. série pokus 2. série , , , Tab. 12 Průměrné hodnoty plísní a kvasinek v průběhu výroby (zrání) - průměrné hodnoty ze dvou pokusů Plísně a kvasinky KTJ/g pokus 1. série pokus 2. série den celkem kvasinky plísně celkem kvasinky plísně ,25 0 6, ,3 0 1,3 67

68 Tyto rozdíly mohou být způsobeny tím, že 2. série analýz připadla na výrobní šarži, kdy byla výroba tohoto typu salámu v masokombinátu ukončena. Pro konečné hodnocení bylo použito průměrných výsledků z výše uvedených tabulek č Průměrné počty z obou sérií analýz jsou uvedeny v Tab.13. Tab. 13 Změny v počtech mikroorganismů (KTJ/g) v průběhu zrání ( den) - průměrné hodnoty ze dvou pokusů KTJ/g den CPM x 10 7 koliformní m. anaerobní m. BMK x 10 6 kvasinky a x 10 6 plísně 0 2,1 50,6 6,5 3, ,5 7 10,3 0 80, ,5 1,3 69, ,5 21 4,8 0 37,7 23,2 72,2 28 4,4 0,63 28,1 9,6 160, ,7 0 48,8 24,6 0,65 CPM celkový počet mikroorganismů, BMK bakterie mléčného kvašení Bakterie mléčného kvašení (Tab. 13 a Graf 1) se řadí k užitečným mikroorganismům, jejichž enzymy uskutečňují nezbytné biochemické přeměny v průběhu výrobního procesu a proto jsou záměrně přidávány. Přidávají se do díla v množství /g, rychle se pomnožují, rychle okyselí dílo a poté většinou odumírají (Pipek 1998, Ricke et. al 2001). Pipek (1998) uvádí, že počty mikroorganismů v tomto období stoupají z 10 4 až na /g. Obr. 9 Bakterie mléčného kvašení 68

69 KTJ/g 8,00E+07 7,00E+07 6,00E+07 5,00E+07 4,00E+07 3,00E+07 2,00E+07 1,00E+07 0,00E den Graf 1 Bakterie mléčného kvašení v průběhu zrání (výroby) - průměrné hodnoty ze dvou pokusů Vývoj v počtech BMK je znázorněn v grafu č. 1. Je zde patrný výrazný nárůst počtů mezi 0. a 7. dnem zrání, kdy došlo ke zvýšení ze 3, na 7, /g. Počty mléčných bakterií začínají klesat ještě během zrání. Jejich počty ale nepoklesly pod 10 7 /g. Takové hodnoty uvádí v průběhu zrání také Ansorena et. al (2002), podobné počty zjistil také Kalhotka (2007). Celkový počet mikroorganismů je v díle okamžitě po naražení poměrně vysoký a může se ještě dále zvyšovat, jak je to patrné 7. den a 14. den po naražení (viz. Tab. 13 a Graf 2), kdy dosahuje hodnot 10 8 /g. Podobně i Smith et Palumbo (1973) zjistili celkový počet aerobních mikroorganismů v rozmezí /g s převahou druhů tvořících kyselinu mléčnou. Obr. 10 Celkový počet mikroorganismů 69

70 2,50E+08 2,00E+08 KTJ/g 1,50E+08 1,00E+08 5,00E+07 0,00E den Graf 2 Celkový počet mikroorganismů v průběhu zrání (výroby) - průměrné hodnoty ze dvou pokusů V počtech této skupiny mikroorganismů se tedy odráží i počty BMK, které jsou spolu s dalšími bakteriemi složkou startovací kultury. Výjimkou je nejvyšší hodnota /g, které bylo dosaženo 35. den zrání, což může být způsobeno pomnožením mikroorganismů nedodržením výrobních podmínek procesu či špatnou sanitací výrobního zařízení. Ve vyhlášce 132/2004 Sb. o mikrobiologických požadavcích na potraviny nebyl limit pro CPM uveden. Podle Görner a Valík (2004) se pomocí celkového počtu mikroorganismů zjišťuje, zda při výrobě určitého produktu (který nemá, nebo nemusí z technologických příčin obsahovat mikroorganismy), bylo jeho mikrobiologické čistotě věnována přiměřená pozornost. Toto tvrzení tedy právě kvůli přidaným bakteriím startovací kultury neplatí pro fermentované salámy, tedy i pro Poličan. Anaerobní mikroorganismy jejichž početní vývoj v průběhu zrání je zachycen v Grafu 3 do jisté míry kopírují vývoj počtů bakterií mléčného kvašení. Což může být způsobeno právě metabolickými vlastnostmi bakterií mléčného kvašení. Podobný trend zjistil i Kalhotka (2007) u salámu Herkules a Paprikáš. Maximálních hodnot dosáhly 7. den ( /g, viz. Graf 3 a Tab. 13). 70

71 KTJ/g 9,00E+07 8,00E+07 7,00E+07 6,00E+07 5,00E+07 4,00E+07 3,00E+07 2,00E+07 1,00E+07 0,00E den Graf 3 Anaerobní mikroorganismy v průběhu zrání (výroby) - průměrné hodnoty ze dvou pokusů Obr. 11 Anaerobní mikroorganismy Koliformní mikroorganismy patří ke skupině indikátorových mikroorganismů, z jejichž výskytu lze usuzovat na možnou přítomnost patogenních mikroorganismů, závady v hygieně, sanitaci, případně v technologických postupech. 71

72 6,00E+01 5,00E+01 4,00E+01 KTJ/g 3,00E+01 2,00E+01 1,00E+01 0,00E den Graf 4 Koliformní mikroorganismy v průběhu zrání (výroby) - průměrné hodnoty ze dvou pokusů V analyzovaných vzorcích byly počty koliformních bakterií velmi nízké, nejvyšších hodnot dosáhly v čerstvě naraženém díle (Tab. 13 a Graf 4). Bover-Cid et. al (2001) uvádí, že v mase dobré kvality by počet bakterií čeledi Enterobacteriaceae neměl přesáhnout 10 3 /g. Vlivem působení startovací kultury jejich počty klesly a 35. den zrání nebyly v salámech detekovány. Escherichia coli nebyla ve vzorcích detekována. Výskyt plísní a kvasinek v analyzovaných salámech není vysoký. Nejvyšších hodnot bylo dosaženo v čerstvě naraženém díle, a to 2, /g (viz. Tab. 13 a Graf 5). V průběhu zrání pak došlo postupně ke snížení jejich počtu na minimální množství. 72

73 2,50E+04 2,00E+04 KTJ/g 1,50E+04 1,00E+04 5,00E+03 0,00E den celkem kvasinky plísně Graf 5 Plísně a kvasinky v průběhu zrání (výroby) - průměrné hodnoty ze dvou pokusů Počty kvasinek nejsou legislativou omezené, ale jejich vyšší počty mohou signalizovat pozdější vady. Růst plísní nebyl na povrchu salámů viditelný. Zajímavé je zjištění, že ve 2. sérii analýz převládly plísně nad kvasinkami, jak je to patrné v Tab. 12. To mohlo být zapříčiněno možnou nižší kvalitou hygieny ve zracích komorách způsobenou ukončením výroby tohoto druhu salámu v masokombinátu. To samozřejmě vedlo k ovlivnění průměrných počtů v této skupině mikroorganismů. Obr. 12 Plísně a kvasinky Obr. 13 Plísně a kvasinky 73