Prenatální screening VVV

Transkript

1 Prenatální screening VVV Jaroslav Loucký Ústav klinické biochemie a patobiochemie UK 2. LF a FN Motol, Imalab s.r.o., Zlín loucky@imalab.cz

2 Kdy můžeme testovat nejdříve? PGD preimplantační genetická diagnostika Kombinuje postupy IVF a genetického testování Handyside a Verlinsky 1990 Biopsie pólového tělíska vajíčka (méně často) Biopsie blastomery embrya (častěji) Načasování odběru velikost embrya 8 buněk tj. 3. den po oplodnění vajíčka Podmínka oplodnění vajíčko musí být oplodněno jednou spermií (ICSI)

3 Metody používané pro testování Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) PCR microarray

4 Jaká onemocnění můžeme testovat Přítomnost aneuploidií (senzitivita 90%) Opakované potrácení plodu způsobené translokacemi parentálního původu Monogenní dědičná onemocnění (srpkovitá anémie, cystická fibróza, Huntigtonova choroba, Tay Sachsova choroba Přenášení translokací Gonosomální mosaiku u žen Vždy testujeme konkrétní genetické onemocnění

5 Co to vlastně je screening? vedle pozorování a monitorování patří mezi způsoby hromadného testování populace výstupem screeningu je identifikace vysoce rizikových probandů se snahou jim včas a účinně pomoci definitivní odpověď týkající se zkoumaného onemocnění dává diagnostický test, na rozdíl od něj screening pouze stanovuje riziko (pravděpodobnost), že zkoumaný jev nastane

6 Definice screeningu Systematická aplikace testu či vyš., kterým se identifikují jedinci s jistým rizikem pro výskyt určité vady nebo onemocnění. Smyslem screeningu je, aby nebyla prováděna další vyšetření nebo přímé diagnostické testy u osob, u nichž k tomu z hlediska výskytu těchto vad neexistují žádné medicínské důvody. N.J.Wald

7 Obecné požadavky na provádění screeningu I Onemocnění, porucha jasně definovaná Prevalence známá (v případě D.S. a NTD je ) Medicínsky závažné onemocnění, pro které existuje efektivní způsob léčby nebo jiný medicínský zásah Rovnocenný přístup - pacienti mají právo na rovnocenný přístup ke screeningu Ekonomický efektivní z hlediska nákladů Vybavení musí být dostupné nebo jednoduše instalovatelné

8 Obecné požadavky na provádění screeningu II Přijatelnost - v případě pozitivního výsledku musí existovat další postup, který je obecně akceptovatelný, jak z pohledu provádějících screening, tak z pohledu pacientů Test - musí být jednoduchý a bezpečný Charakter testu: - distribuce hodnot u postižených a nepostižených jedinců musí být známy, - překryv hodnot musí být dostatečně nízký - musí být definován cut-off

9 Parametry screeningu DR - Detection rate = senzitivita FPR Falešná pozitivita Prevalence onemocnění OAPR - pravděpodobnost pozitivního výsledku s přítomností vrozené vývojové vady (kombinací předchozích tří ) Požadavky na screening - nejvyšší možná senzitivita - nejnižší možná FPR Pro screening VVV 90% 1-2% FPR

10 Kdo se podílí na prenatálním Gynekologové Biochemici screeningu VVV Ultrazvukoví specialisté Genetici Molekulární biologové

11 Kdy a jak se prenatální screening může provádět? V 1. trimestru, při gest. stáří plodu 10+0 až 13+6 Ve 2. trimestru, při gest. stáří plodu 14+0 až 22+0 Ukončení těhotenství je možno z genetické indikace provést do 24.týdne těhotenství (zákon č. 66/1986 Sb.) Provádíme biochemické testy v 1. a 2.trimestru těhotenství Měříme UZ parametry v 1. trimestru těhotenství

12 Základní sérové markery, původ a hodnoty u plodů s D.S. Tyto sérové markery jsou produkovány fetoplacentární jednotkou a jejich hodnoty se v případě plodů s D.S. odchylují od hodnot u těhotenství s nepostiženým plodem AFP, fetální játra, snížené hodnoty ve 2. trimestru, (42%) ue3, plod + placenta, snížené hodnoty ve 2. trimestru (52%) F t-hcg, placenta, zvýšené hodnoty v 1., 2. trim. (61-53%) inhibin-a, placenta, zvýšené hodnoty v 1., 2. trimestru (59%) PAPP-A, placenta, snížené hodnoty v 1. trimestru Mnoho dalších látek vykazuje snížené, či zvýšené hladiny, ale nejsou tak významné.

13 Základní UZ markery Nuchální translucence (NT) lze vyjádřit v MoM a kombinovat s biochemickými markery Nosní kost (NB) Měření fronto-maxilárního úhlu Měření trikuspidální regurgitace Měření průtoku ductus venosus Pokud jsou správně prováděny mají vysokou senzitivitu (cca 70% procent). Problém je v tom, že se nedají vždy vyšetřit, výsledky měření se mnohdy špatně vyhodnocují a špatně se interpretují

14 Screeningové menu 2011 I. trimestr - kombinovaný test (PAPP-A, f β-hcg, NT) - kontingenční (měření dalších UZ markerů) II.trimestr - double test (HCG, AFP) - triple test (HCG, AFP, ue3) - kvadruple test (HCG, AFP, ue3, inhibin A) - vyšetřování UZ hard a soft markerů I + II trim. - sérum integrovaný - plně integrovaný - sekvenční forma integrovaného testu - kontingenční forma integrovaného testu Toto široké spektrum testů je potenciálem pro screeningový chaos

15 senzitivita (%) 5% FPR % 69% 74% 72% 79% 81% 79% 85% 85% 85% 79% 89% 84% 94% Věk + triple kvadruple kombinovaný sérum plně 93% 88% SURUSS BUN FASTER 2. trimestr 1. trimestr integrovaný

16 1.trimestr 5 FPR a pozorovaný MoM u plodů s DS Palomaki et al. A Summary Analysis of Down Syndrome Markers In The Late First Trimester, Advances in Clinical Chemistry, Vol.43) parametr 10.týden 11.týden 12.týden 13.týden PAPP-A (0,40) 42 (0,46) 36 (0,51) 29 (0,58) F HCG (1,72) 32 (1,82) 37 (1,98) 43 (2,21) NT 63 (2,18) 61 (1,92) 56 (1,69) Komb.test

17 Screening před 10.týdnem těhotenství PAPP-A 0, týden (Wald,1996) 0,33 8.t. 0,37 9.t. (Spencer,2002) F HCG 1,35 8.t. 1,55 9.t. (Spencer,2002) ADAM 12 0, týden 1,38 13.t (Spencer,2008)??? správná datace dle UZ před 8.týdnem, neznalost prevalence D.S. v 8. a 9. týdnu, neznalost toho jak jiné abnormality mohou ovlivňovat MoM těchto analytů.

18 Celková variabilita měření Schielen PC et al., Prenat Diagn 2006;26:711-8, Palomaki GE et al. Genet Med 2008;10(2): SD T = (SD A 2 + SD I2 ) 1/2

19 Celková variabilita měření

20 Kontrola kvality měření NT SEKK? Kontrola kvality měření NT prováděná pomocí speciálního počítačového programu Kontrola kvality měření CRL (naprosto zásadní význam pro kvalitu prováděného screeningu) Kontrola kvality měření NT Vyhodnocení obrázků a odeslání em Odesílatel nezná naměřenou hodnotu Vyhodnocení ve skupině dalších UZ pracovníků Dotazník SEKK, konec roku 2010

21 NT vliv na výsledek screeningu Věk matky 30 let Věk matky 30 let NT 1,0 MoM NT 1,7 MoM PAPP-A 0,65 MoM PAPP-A 0,65 MoM MS-AFP 0,72 MoM MS-AFP 0,72 MoM ue3 0,68 MoM ue3 0,68 MoM HCG 1,52 MoM HCG 1,52 MoM Inhibin-A 1,49 MoM Inhibin-A 1,49 MoM 1:930 Negativní 1:65 Pozitivní

22 Statistický příspěvek NB Celkový počet plodů s D.S - 41 Nosní kost nepřítomna 29 ( 71%) Nosní kost přítomna 13 ( 29%) Neexistuje přímý vztah mezi nepřítomností NB a hladinami biochemických markerů Maternal serum biochemistry at 11-13(+6) weeks in relation to the presence or absence of the fetal nasal bone on ultrasonography in chromosomally abnormal fetuses: an updated analysis of integrated ultrasound and biochemical screening : Prenat Diagn 2005 Nov;25(11): ARTICLE AU : Cicero Simona S; Spencer Kevin K; Avgidou Kyriaki K; Faiola Stefano S; Nicolaides Kypros

23 Statistický příspěvek NB Dvoustupňový proces měření NB pouze když je riziko DS hraniční (Nicolaides,2005) Přítomnost NB nepřidává nic významného k současným screeningovým protokolům. Absence NB má vysokou pozitivní prediktivní hodnotu ( Sepulveda, 2007 ) Doporučujeme využívat NB jako sekundární nebo kontigenční marker ( Rosen, 2007 )

24 Sekvenční integrovaný test N J Wald, A R Rudnicka,J P Bestwick, Sequential and contingent prenatal screening for Down syndrome, Prenat Diagn 2006; 26:

25 Základní pravidla pro provádění sekvenčního testu Dostupnost CVS Správné stanovení cutt-off v prvním trimestru (1:30) Jedno těhotenství, jedno vyjádření rizika

26 Výhody a nevýhody provádění sekvenčního testu Výhody U těhotenství s vysokým rizikem v 1. trimestru je proveden diagnostický test, jehož výsledek je znám o několik týdnů dříve. Nevýhody Logisticky komplikovanější Část žen nesoucí plod s D.S. by samovolně potratila před 16. týdnem Je nutné zajistit testování žen z hlediska NTD, pokud byl výsledek invazivní diagnostiky v 1. trim. Negativní (AFP).

27 Faktory ovlivňující výpovědní hodnotu sérových markerů UZ určení délky těhotenství Hmotnost těhotné ženy IDDM Vícečetná těhotenství Etnická příslušnost Kouření Parita

28 Další možnosti současných screeningových postupů Opakovaná měření ( Cross Trimester Ratios ) Wright DE, Bradbury I. Br J Obstet Gynaecol 2005;112:80-3. Wald NJ, et al. Prenat Diagn 2006;26: Příklad: Sérum integrovaný test ( ( 1.trim PAPP-A + 2. trim quad) 85% DR při 5% FPR Sérum integrovaný test + opakované PAPP A ve 2.trim: 85% DR při 1% FPR

29 1. Integrovaný test Doporučení o provádění laboratorního screeningu VVV týden: PAPP-A, resp. volný β hcg týden: měření NT (nuchální translucence šíjové projasnění plodu) sonografistou auditovaným u FMF Londýn týden: AFP, hcg, ue3 4 Společné vyhodnocení po dokončení všech vyšetření. 2. Sekvenční varianta integrovaného testu týden: PAPP-A, resp. volný β hcg týden: měření NT sonografistou auditovaným u FMF Londýn Předběžné vyhodnocení testu, vysoce pozitivní screening řešit okamžitě. Ostatní těhotné ženy pokračují do II. trimestru týden: AFP, hcg, ue3 Společné vyhodnocení po dokončení všech vyšetření. 3. Kombinovaný test (1.trimestr) týden: PAPP-A, volný β HCG týden: měření NT sonografistou auditovaným u FMF Londýn Záchytnost tohoto testu je vyšší při odběru biochemických markerů v týdnu než při odběru ve 13. týdnu. 4. Sérum integrovaný test v místech, kde není možné měřit spolehlivě NT týden těhotenství: PAPP-A, resp. volný β hcg týden: AFP, hcg, ue3 Společné vyhodnocení po dokončení všech vyšetření. 4. a) sekvenční varianta: u těhotných s PAPP-A pod 0,35 MoM - doporučit změření NT + fetální morfologie sonografistou auditovaný u FMF Londýn. 5. Triple nebo double test (2.trimestr) týden: AFP, hcg, ue3 vhodný pro ženy, které se dostaví pozdě na vyšetření v1.trimestru, nebo při později zjištěné graviditě.

30 Screening z pohledu těhotné ženy Požaduje Akceptuje Doporučíme včasný výsledek nejspolehlivější výsledek, nízké riziko invazivního výkonu přijde pozdě vyšší riziko invazivního výkonu, nižší senzitivitu screeningu, NTD pomocí UZ později Výsledek až po 2.trimestru (* sekvenční po 1.t u vysoce pozitivních.) nižší senzitivitu, vyšší riziko invazivního výkonu kombinovaný test Integrovaný test, resp. Sekvenční formu Druhotrimestrální test

31 Budoucnost prenatálního testování 1997 First report of free fetal DNA in maternal circulation. (Lo YMD et al. Lancet 1997;350:485-7) Možnost získaní genetické výbavy plodu prostřednictvím odběru krevního vzorku matky Placenta Maternal plasma Maternal blood cells

32 Dennis Lo Chinese University of Hong Kong

33 Vlastnosti mimobuněčné DNA v maternální cirkulaci V plasmě matky je identifikovatelná jak mateřská mimobuněčná DNA, tak mimobuněčná DNA fetálního původu Mimobuněčná DNA maternálního i fetálního původu v mateřské plasmě je tvořena relativně malými fragmenty ( bp) Tyto cirkulující fragmenty mimobuněčné DNA reprezentují kompletní genetickou informaci Fetální DNA je placentárního původu Maternalní DNA pochází z krvinek Fetální DNA tvoří 5-25% z celkové mimobuněčné DNA (průměrně ~10%).

34 Recentní práce a postupy v oblasti LMB Allelic Ratio Approach Using Methylated DNA Poon LLM et al. Clin Chem 2002;48:35-41, Tong YK et al. Clin Chem 2006;52: Digital PCR Approach to Determining Chromosome Copy Number YM Dennis Lo et al. PNAS USA 2007;104: Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood Fan HC et al. (Stephen Quake group). PNAS USA 2008;105: Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Chiu RWK et al. (Dennis Lo group) PNAS USA 2008;105: The use of cell-free fetal nucleic acids in maternal blood for noninvasive prenatal diagnosis. Wright CF, Burton H. Hum Reprod Update 2009;15:

35 Recentní práce a postupy v oblasti LMB Stanovení alelického poměru s využitím rozdílné metylace fetální a maternální DNA - pouze pro heterozygotní plody Digitální PCR měření malého rozdílu obsahu specifických sekvencí na chromozomu 21 u euploidních a aneuploidních vzorků Shotgun sequencing nevyžaduje oddělení volné mimobuněčné fetální a maternální DNA. Je nezávislá na polymorfismech a je univerzálně použitelná pro stanovení fetálních aneuploidií Masivní paralelní sekvenování vyjadřuje procento obsahu chromozomů 21 ve vzorku a srovnává jej pomocí odchylky od běžných euploidních vzorků

36 MPS Implementace na platformu Ilumina Příprava vzorků (cca. 270 USD) Příprava klastrů (cca. 600 USD) Sekvenování (1500 USD pro 1 celu, 7 pac.+qc) Počítačová analýza dat, vyhodnocení Délka procesu 3 pracovní dny Cena zařízení USD

37 Leden 2011 (BMJ 2011;342:c7401doi: /bmj.c7401) They reported detecting 100% of fetal T21 with a 2.1% false positive rate (96.6% PPV) using a 2-plex protocol (2 patient samples per lane). Using an 8-plex protocol, performance was not as robust: a 79.1% detection rate and 1.1% false positive rate were observed.

38 Březen 2011 Ehrich M, Deciu C, Zwiefelhofer T, et al. Noninvasive detection of fetal trisomy 21 by sequencing of DNA in maternal blood: a study in a clinical setting. Am J Obstet Gynecol 2011;204:205.e high risk pregnancies 39 correctly classified as T21 1 misclassified as T21 100% sensitivity 99,7% specificity

39 Infanet Study Enrollment Activity Women enrolled 4448 Samples Stored 4286 Karyotypes entered 4166 Trisomies 309 T T21 OAPR 1 in 20 Number of T21 pregnancies examined: 86 vs. 200 MPS Protocol 2-plex/8-plex vs. 4-plex Instrumentation: Illumina Genome Analyzer II/IIx vs. Illumina HiSeq 2000 Diversity 3 cities vs. 27 Recruitment Sites

40 Co můžeme očekávat? Současné nejlepší možnosti screeningu: Integrovaný nebo sekvenční Integrovaný Test 95% 5% FPR 90% 2% FPR Cíl: >98% <1%FPR

41 Děkuji za pozornost