Prenatální screening chromozomálních aberací plodu Prenatal Screening of Chromosomal Aberrations in the Fetus

Transkript

1 ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ Katedra zdravotnických oborů a ochrany obyvatelstva Prenatální screening chromozomálních aberací plodu Prenatal Screening of Chromosomal Aberrations in the Fetus Bakalářská práce Studijní program: Specializace ve zdravotnictví Studijní obor: Zdravotní laborant Autor bakalářské práce: Veronika Dvořáková Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Jindřiška Příhonská Konzultant bakalářské práce: RNDr. Taťána Jarošíková Kladno, květen 2016

2

3 Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci s názvem Prenatální screening chromozomálních aberací plodu vypracovala samostatně a použila k tomu úplný výčet citací použitých pramenů, které uvádím v seznamu přiloženém k bakalářské práci. Nemám závažný důvod proti užití tohoto školního díla ve smyslu 60 Zákona č.121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon). V Kladně dne 20. května podpis

4 Na tomto místě bych ráda poděkovala MUDr. Jindřišce Příhonské za odborné vedení, ochotu, pomoc a užitečné rady, které mi poskytla v průběhu zpracování této bakalářské práce. Mé poděkování patří také RNDr. Taťáně Jarošíkové, CSc. za vstřícnost při konzultacích.

5 Název bakalářské práce: Prenatální screening chromozomálních aberací plodu Abstrakt: Tato bakalářské práce podává stručný přehled o možnostech prenatální detekce vrozených vývojových vad se zaměřením na nejčastější chromozomální vady, trizomie chromozomu 21, 13 a 18, v České republice. Teoretická část práce se zaměřuje na obecnou charakteristiku vrozených vývojových vad a jejich rozdělení. Detailněji se zabývá popisem numerických chromozomálních aberací. V další části je popsána jejich prevence a diagnostika. Obsahuje také základní informace o screeningových programech, používaných k vyhledávání těhotných žen se zvýšeným rizikem těchto chromozomálních vad a porovnává je. Praktická část podává podrobnější popis zvolené screeningové metody a organizace prenatálního screeningu ve zvolené gynekologické praxi. Cílem této bakalářské práce bylo zjistit, zda procento falešně pozitivních výsledků prenatálního screeningu sledovaných chromozomálních aberací v této praxi odpovídá procentu falešné pozitivity deklarované používaným screeningovým programem. Klíčová slova: vrozené vady, Downův syndrom, prenatální diagnostika, prenatální screening, falešná pozitivita

6 Master s Thesis title: Prenatal Screening of Chromosomal Aberrations in the Fetus Abstract: This thesis gives a brief overview of prenatal detection of congenital defects with a focus on the most common chromosomal anomalies, trisomy of chromosome 21, 13 and 18, in the Czech Republic. The theoretical part is focused on the general description of congenital defects and their classification. It deals in detail with the description of numerical chomosomal aberrations. The other part of the study describes their prevention and diagnosis. It also contains basic information about screening programs used to search for pregnant women at increased risk of these chromosomal defects and compares these programs. Practical part gives a detailed description of one screening method and presents how the prenatal screening program is run in one particular gynecological practice. The aim of this thesis was to detect whether the percentage of false positive results of prenatal screening with observed chromosomal aberrations in this practice agrees with the percentage of false positivity stated by used screening program. Key words: congenital defect, Down syndrome, prenatal diagnosis, prenatal screening, false positivity

7 Obsah Seznam symbolů a zkratek Úvod Současný stav Přehled současného stavu Vrozené vývojové vady (VVV) VVV podle období vzniku VVV podle mechanismu vzniku VVV podle klinických projevů VVV podle příčin vzniku Chromozomální aberace Strukturní chromozomální aberace Numerické chromozomální aberace Prevence a diagnostika Prevence Prenatální screening chromozomálních aberací Charakteristika screeningových programů Screeningové testy prováděné v prvním trimestru těhotenství Screeningové testy prováděné ve druhém trimestru těhotenství Screeningové testy v prvním i ve druhém trimestru Cíl práce Metodika práce Anamnéza Prenatální screening VVV Prvotrimestrální screeningové vyšetření Druhotrimestrální screening... 31

8 4.3 Organizace screeningu chromozomálních vad ve zvolené gynekologické praxiv Praze Vyhodnocení výsledků: Diskuze Závěr Citovaná literatura Seznam obrázků Seznam tabulek... 55

9 Seznam symbolů a zkratek BPD - biparietální průměr CRL - temenokostrční délka DNA - deoxyribonukleová kyselina E 3 hcg MoM - nekonjugovaný estriol - choriový gonadotropin - násobky mediánů normálních hodnot pro daný gestační týden MS AFP - mateřský alfa fetoprotein NB - nosní kost NT - šíjové projasnění PAC. - pacientka PAPP A - plazmatický protein PFP - procento falešné pozitivity

10 1 Úvod Tato bakalářská práce se zabývá problematikou vrozených vývojových vad plodu se zaměřením na Downův syndrom, který je nejčastější chromozomální anomálií. V současné době zaznamenáváme nárůst těhotných žen starších 35 let, přičemž je známo, že se vzrůstajícím věkem rodičů se zvyšuje riziko vzniku odchylek v chromozomech u plodu. Včasné potvrzení nebo vyloučení této genetické vady je tedy důležitou součástí péče o těhotné. K vyhledávání těhotných žen se zvýšeným rizikem tohoto geneticky podmíněného onemocnění slouží prenatální screeningové programy. Cíl práce spočívá ve zjištění, zda procento falešně pozitivních výsledků prenatálního screeningu ve vybrané gynekologické praxi za určité období odpovídá procentu falešné pozitivity deklarované zvoleným screeningovým programem. Práce zahrnuje statistické zobrazení a vyhodnocení. 10

11 2 Současný stav 2.1 Přehled současného stavu Každá žena touží po tom, aby se jí narodilo zdravé dítě. V současné době je kladen důraz na posun diagnostiky možného poškození plodu do co nejranějšího stadia těhotenství. To je umožňováno neustálým zdokonalováním vyšetřovacích metod a přístrojového vybavení. V rámci asistované reprodukce byla vypracována metoda, která umožňuje rozpoznání poškození plodu dokonce již na úrovni blastocysty preimplantační genetická diagnostika. Preferovány jsou přitom metody, které jsou maximálně bezpečné pro matku i pro plod. Mezi ně nově patří i stanovení karyotypu z fetálních erytrocytů získaných z krve matky. 2.2 Vrozené vývojové vady (VVV) Vrozené vývojové vady jsou takové odchylky od normálního vývoje plodu, které již nelze zahrnout do variability populace a které vznikají během jeho prenatálního vývoje. Výskyt vrozených vývojových vad se pohybuje asi mezi 3 5 % novorozenců. Tyto vady mají za následek poruchy struktury a funkce orgánů a způsobují svému nositeli různý stupeň obtíží, od zcela zanedbatelných, až po velmi závažné. Některé mohou být i neslučitelné se životem a vedou ke smrti postiženého jedince ještě během nitroděložního vývoje nebo krátce po narození [1]. VVV můžeme dělit podle různých hledisek např. podle období jejich vzniku, mechanismu vzniku, klinických projevů anebo příčin vzniku [2], [3] VVV podle období vzniku Gametopatie Poruchy, které vznikají v zárodečných (pohlavních) buňkách na základě chyby při rozdělení chromozomů během jejich vývoje nebo dělení [4]. 11

12 Blastopatie Poruchy vznikající v časných stádiích těhotenství (15 dnů po oplodnění), při kterých dochází ke vzniku zrůd (výrazná odchylka od normálu) a vrozených defektů [4]. Embryopatie Embryopatie vznikají mezi 4. a 12. týdnem těhotenství v důsledku infekce (rubeola) nebo toxinů (léky, chemikálie). V tomto období těhotenství dochází k vývoji orgánů plodu a také k poruchám jejich vývoje (nevyvinutý mozek, rozštěpy rtu, patra a páteřního kanálu a další) [4], [5]. Fetopatie Vznikají po 12. týdnu těhotenství až do porodu např. působením infekce matky na plod (toxoplazmóza), nebo Rh imunokompatibilitou mezi matkou a plodem (morbus haemolyticus neonati) [5] VVV podle mechanismu vzniku Malformace Jedná se o vady orgánů nebo tkání, které vznikají na základě genetických nebo exogenních vlivů. Orgány nebo jeho části se abnormálně vyvíjí od samého počátku, např. defekty neurální trubice [6]. Disrupce Jedná se o poruchu vývoje plodu, která vznikla na základě působení vnějších vlivů na dosud správně se vyvíjející orgán nebo jeho část, např. amniální pruhy [6]. Deformace Deformace jsou změny tvaru nebo polohy části těla působením mechanického vlivu (tlak), např. dislokace končetin [6]. 12

13 Dysplazie Tato VVV je způsobena abnormálním uspořádáním buněk ve tkáních. [6] VVV podle klinických projevů Isolované vady Vady, které se vyskytují samostatně, např. isolované polydaktylie [8]. Sekvence Vícečetné vady, které jsou způsobeny jedním faktorem způsobujícím patologickou kaskádu na sebe navazujících dějů, např. sekvence Potterové [8]. Asociace Vrozené vady, které vykazují tendenci vyvíjet se společně s jinými vadami, např. Vater asociace [8]. Syndrom Soubor příznaků, které se projevují současně a vytváří typický klinický obraz, např. Downův syndrom [9] VVV podle příčin vzniku Genetické vlivy Mezi genetické vady patří změny na úrovni genů genové mutace a změny v chromozomech (odchylky v počtu nebo ve struktuře chromozomů). Chromozomální odchylky se projevují jako syndromy Downův, Patauův, Edwardsův syndrom [5]. Vlivy vnějšího prostředí, které mají vliv na VVV Teratogeny jsou exogenní faktory, které způsobují vznik VVV nebo zvyšují pravděpodobnost jejich vzniku. Dělíme je na faktory chemické, fyzikální a biologické. 13

14 Mezi faktory chemické patří různé chemické látky (těžké kovy, atd.) a léčiva (některá antibiotika, cytostatika, antiepileptika). Teratogenní účinek byl také prokázán u alkoholu. Fyzikální vnější vlivy zahrnují radioaktivní záření (způsobuje zlomy chromozomů), rentgenové záření (nepříznivé ovlivnění vývoje neurální trubice) a vysokou teplotu. Mechanickými vlivy (tlak) vznikají tzv. amniální pruhy, které mohou způsobit amputaci končetin [3]. Do skupiny biologických vlivů spadají původci infekčních onemocnění viry (herpesviry, CMV, zarděnky), bakterie (syfilis) a prvoci (toxoplazmóza). Přímý teratogenní účinek mají i některá chronická onemocnění matky např. diabetes mellitus [3]. Multifaktoriálně dědičné vady Jedná se o vady, které vznikají na základě genetické predispozice a působením vnějších faktorů (např. rozštěpy rtu a patra, neurální trubice, vrozené srdeční vady a další) [10]. 2.3 Chromozomální aberace Normální chromozomální výbava člověka (karyotyp) představuje 46 chromozomů. Každá somatická buňka obsahuje 22 párových chromozomů (autozomů) a 2 pohlavní chromozomy (gonozomy). U žen XX a u mužů XY [4]. Pohlavní buňky (gamety) vznikají v procesu redukčního dělení tzv. meiózy. Výsledkem tohoto procesu jsou buňky s haploidním (polovičním) počtem chromozomů. Náhodné rozdělení otcovských a mateřských chromozomů během meiózy do pohlavních buněk umožňuje genetickou variabilitu jedince [11]. Během vzniku zárodečných buněk a časného vývoje embrya může dojít k chybě při rozdělení chromozomů. Chyba se projeví v počtu (numerické aberace) nebo ve změně struktury chromozomu (strukturní aberace). V případě, kdy k poruše rozdělení chromozomů dochází až po oplození vajíčka, může vzniknout část buněk s normální chromozomální výbavou a část buněk s chromozomální odchylkou. 14

15 Takový jedinec má v těle dva typy buněk jedná se o chromozomální mozaiku. Na vzniku chromozomálních odchylek se podílí více rizikových faktorů, např. věk ženy, záření, infekce a řada dalších dosud neznámých příčin. Některé chromozomální aberace vedou k zastavení vývoje zárodku v časných stádiích těhotenství, tzv. zamlklý potrat [4] Strukturní chromozomální aberace Strukturní chromozomální aberace vznikají na základě chromozomálních zlomů, na které navazuje ztráta, zdvojení nebo odlišná přestavba segmentu způsobená abnormálním spojením úseků. Můžeme je rozdělit na balancované, kdy je zachováno původní množství genetické informace, a na nebalancované, při které část genetické informace chybí nebo naopak přebývá např. delece (ztráta části chromozomu), duplikace (zdvojení části chromozomu), translokace (vyštěpení části chromozomu a připojení k jinému chromozomu) a další [3], [22] Numerické chromozomální aberace Numerické chromozomální aberace vznikají při chybném rozdělení chromozomů do dceřiných buněk. Do této skupiny patří polyploidie, při kterých dochází ke znásobení celé chromozomové sady, a aneuploidie, při nichž dochází ke vzniku odchylky pouze některého chromozomu nebo některých chromozomů, nikoliv celé sady. Pokud jsou v buňce přítomny tři kopie chromozomu, jedná se o trizomii, naopak pokud jeden chromozom v buňce chybí, jedná se o monozomii. Odchylky v počtu chromozomů se mohou týkat autozomů i gonozomů [11], [3]. Syndromy spojené s odchylkami autozomů Downův syndrom Jedná se o nejčastější numerickou chromozomální aberaci provázenou závažnou duševní a tělesnou poruchou, která je způsobena trizomií 21 chromozomu a vyznačuje se typickým fenotypem. 15

16 Tato porucha se vyskytuje přibližně u 1 ze 700 novorozenců všech etnických skupin a může vznikat dvojím způsobem: a) nondisjunkcí (porucha dělení buněk) b) translokací Fenotypových projevem poruchy je mongoloidní vzhled obličeje, špatný psychomotorický vývoj, zešikmené oči, malá a zavalitá postava. Častější jsou vrozené srdeční vady. Riziko výskytu Downova syndromu u plodu se zvyšuje s přibývajícím věkem matky. Karyotyp jedince s tímto postižením je značen: 47 XX (XY), Mírnější forma onemocnění se vyskytuje asi ve 3 % a je způsobena tzv. mozaicismem (chromozomální vadou je postižena jen část buněk) [9], [14]. Edwardsův syndrom Tato numerická chromozomální aberace postihuje 1 z narozených dětí a je způsobena přítomností tří kopií chromozomu 18 v buňkách. Pravděpodobnost rizika výskytu stoupá spolu s věkem matky. Ve značné většině případů umírá plod již v těle matky v průběhu těhotenství. Mezi fenotypové projevy jedince patří nižší porodní váha, deformace hlavy, rozštěpové vady obličeje, překrývající se prsty, oči daleko od sebe. Dále jsou časté vrozené srdeční vady, mentální retardace a další. Karyotyp jedince vypadá takto: 47, XX (XY) + 18 [23]. Patauův syndrom Vzácně se vyskytující vrozená genetická vada, která u těhotné ženy s takto postiženým plodem končí nejčastěji spontánním potratem. Výskyt vady se pohybuje kolem 1 z živě narozených dětí. Karyotyp jedince s Patauovým syndromem: 47, XX (XY) +13. Fenotypový projev zahrnuje deformaci hlavy a obličeje, malé nebo úplně chybějící oči nebo naopak jedno centrální oko, rozštěpové vady, polydaktylii. Děti se rodí s nízkou porodní váhou, mívají vrozené vady ledvin a vrozené srdeční vady. Jsou mentálně retardované [23]. 16

17 Vrozené poruchy gonozomů: Jedná se o poruchy v počtu pohlavních chromozomů. Za normálních podmínek má každá žena v karyotypu dva chromozomy X a každý muž jeden chromozom X a jeden chromozom Y [4]. Klinefelterův syndrom Karyotyp jedince obsahuje jeden chromozom Y a různý počet chromozomů X. Nejčastější variantou je forma 47, XXY. Při tomto dědičném onemocnění dochází k ovlivnění produkce hormonu testosteronu, jehož nedostatek způsobuje typický fenotyp. Vada postihuje asi 1 z novorozených dětí převážně mužského pohlaví. Mezi znaky, které syndrom charakterizují, patří vysoká postava, dlouhé končetiny, varlata s narušenou funkcí, neplodnost, méně svalové hmoty. Z důvodu snížené hladiny testosteronu vyskytuje se u těchto jedinců typ pubického ochlupení, vyšší hlas, zvětšené prsní žlázy [23]. Turnerův syndrom Jedná se o jedinou monozomii slučitelnou se životem, při které je u žen v buňce přítomen pouze jeden chromozom X nebo jeho část karyotyp 45, X, místo dvou chromozomů X. Turnerův syndrom se však může vyskytovat i ve formě mozaiky, to znamená, že chromozom X chybí pouze v některých buňkách. Mezi typické znaky projevu patří porucha dospívání, porucha činnosti vaječníků neplodnost, výskyt kožní řasy na krku, miskovité nehty, časté záněty středního ucha a poškození zraku barvoslepost a vrozené srdeční vady. Riziko výskytu Turnerova syndromu je z 1 z narozených děvčat [11], [23]. 2.4 Prevence a diagnostika Prevence VVV představují vážný zdravotní, sociální a ekonomický problém, a proto je velký důraz kladen na předcházení vzniku těchto vad prevenci. Existují dva typy prevence: primární a sekundární. 17

18 Hlavním opatřením je primární prevence, neboli opatření, která mohou zabránit samotnému vzniku vady. Sekundární prevence zahrnuje prenatální testy, které umožňují prokázat výskyt již vzniklé vady ještě před narozením jedince [1], [24] Primární prevence Do primární prevence patří plánované rodičovství, věk a dobrý zdravotní stav ženy, omezení styku s teratogenními látkami, kvalitní a vyvážená strava, přísun minerálů a vitaminů. Každá žena by si měla uvědomit, že se vzrůstajícím věkem dochází k častějšímu výskytu vrozených vad u plodu a že po 35. roku života stoupá pravděpodobnost výskytu numerických chromozomálních aberací, zejména Downova syndromu. Pro těhotnou ženu je také důležitá správná a vyvážená strava, která je doplněna vitaminy a minerály. Lékaři doporučují těhotným ženám pravidelné užívání kyseliny listové, která je důležitá pro početí plodu a pro jeho správný růst a vývoj. Dále snižuje výskyt defektů nervové trubice u plodu. Přítomnost jódu ve vodě nebo v soli eliminuje pravděpodobnost výskytu mentální retardace a kostních deformit. Dalším důležitým bodem primární prevence je omezení styku s teratogenními látkami, mezi které řadíme alkohol, kouření, některé léky a drogy. Plánování rodičovství na optimální dobu a zajištění co nejlepších podmínek při početí snižuje riziko výskytu vrozených vad [24]. Preimplantační genetická diagnostika Za součást primární prevence lze považovat i preimplantační genetickou diagnostiku, metodu, která se provádí při asistované reprodukci v rámci umělého oplodnění a umožňuje vybrat k přenosu do dělohy zdravé embryo. Metoda je využívána k vyšetření pohlavních buněk a embrya. Je vhodná pro rodiny, ve kterých se vyskytují některé dědičné vady, pro páry s opakujícími se potraty a pro ženy ve vyšším věku (nad 30 let). Embryo je vyšetřeno geneticky v době, kdy doroste do stádia 8 buněk (30 hodin), a to pouze z 1 2 buněk embrya [7]. 18

19 Sekundární prevence prenatální diagnostika Prenatální diagnostika je definována jako soubor vyšetření, metod a postupů, které jsou využívány v průběhu těhotenství k diagnostice VVV plodu. Úkolem prenatální diagnostiky je odhalit co největší množství VVV, které jsou neslučitelné se životem, nebo vady, jejichž léčba není možná nebo je velice obtížná. Díky pokrokům ve speciálních vyšetřovacích metodách je možné vyšetřit plod v jakémkoli období prenatálního vývoje. Na základě způsobu vyšetření dělíme prenatální diagnostiku na neinvazivní a invazivní [28], [5]. Neinvazivní diagnostika U metod neinvazivní prenatální diagnostiky nedochází k zásahu do těla matky, a proto nehrozí riziko potratů. Mezi neinvazivní preventivní vyšetření patří především tzv. prenatální screening. Je to metoda, která slouží k vyhledávání těhotných žen se zvýšeným rizikem neboli zvýšenou pravděpodobností, že jejich dítě může být postiženo některou VVV. Zahrnuje podrobné anamnestické vyšetření těhotné zaměřené na výskyt dědičných onemocnění v rodině, screeningové vyšetření ultrazvukem a stanovení specifických biochemických markerů z mateřského séra. Těmito vyšetřovacími metodami jsou vyšetřovány všechny těhotné ženy. V současné době je k dispozici i analýza fetální DNA, získané z mateřského séra, která v indikovaných případech doplňuje metody neinvazivní diagnostiky [28], [5]. Ultrazvuková diagnostika Ultrazvuková diagnostika je nedílnou součástí prenatální péče a provádí se v průběhu celého těhotenství. V současnosti je prováděno ultrazvukové vyšetření minimálně 4x v průběhu těhotenství. V případě stanovení gravidity, po vynechání menstruace, mezi týdnem těhotenství jako součást prvotrimestrálního screeningu, mezi týdnem těhotenství, dále mezi týdnem těhotenství (vyloučení hypotrofizace plodu). Další vyšetření jsou přidávána podle potřeby [25]. 19

20 Vstupní ultrazvukové vyšetření: Vstupní ultrazvukové vyšetření by mělo být provedeno před 13. týdnem těhotenství. Součástí vyšetření je stanovení gestačního stáří, zjištění počtu plodů, vitality plodu a detekce hrubých fetálních anomálií [25]. Vyšetření v rámci prvotrimestrálního screeningu: Toto vyšetření umožňuje určit četnost těhotenství, stanovení velikosti plodu, respektive upřesnění gestačního stáří a zaměřuje se na zjišťování přítomnosti ultrazvukových nálezů, které jsou charakteristické pro chromozomální aberace z nichž nejdůležitější jsou šířka tzv. šíjové projasnění (nuchální translucence NT) a přítomnost nosní kosti [21]. Dalšími sledovanými markery jsou např. délka horní čelisti, stehenní a pažní kosti, srdeční frekvence plodu, abnormální tok krve v ductus venosus a další [18]. Vyšetření mezi týdnem těhotenství Cílem vyšetření je posoudit proporciální růst plodu a vyloučit jeho strukturální anomálie. Provádí se postupným podrobným vyšetřením celého plodu a posouzením všech zobrazitelných orgánů. Na základě měření plodu lze stanovit jeho váhový odhad. Posuzuje se množství plodové vody a uložení placenty [21], [26]. Vyšetření mezi týdnem Vyšetření zahrnuje opět biometrii plodu měření rozměrů a výpočet hmotnosti potřebné k vyloučení hypotrofizace plodu, které může být způsobeno nedostatečnou funkcí placenty. Znovu se posuzuje morfologie plodu, průtok cévami pupečníku, kontroluje se množství plodové vody a nyní i definitivní uložení placenty [21], [26]. Biochemický screening Biochemický screening je metoda, která slouží ke stanovení specifických biochemických markerů (PAPP A, free beta hcg, AFP, hcg, E 3 ) z mateřského séra a je zaměřena na vyhledávání nejčastějších chromozomálních aberací plodu (Downův syndrom) a defektů neurální trubice (NTD) [27]. 20

21 Invazivní prenatální diagnostika Cílem odběru invazivní prenatální diagnostiky je přímo získat materiál potřebný ke stanovení chromozomální výbavy plodu nebo k průkazu některých látek. Vzhledem k tomu, že dochází k zásahu do těla matky, může dojít ke komplikacím, které mají za následek poškození plodu, vyvolání potratu či předčasného porodu. Do invazivní prenatální diagnostiky patří odběr choriových klků (CVS), odběr plodové vody (AMC), odběr placentární tkáně (pozdní CVS) a odběr fetální krve z pupečníku (kordocentéza). Vyšetřením chromozomů v buňkách choria a v buňkách získaných z plodové vody je možné stanovit karyotyp plodu. Indikací pro odběr je věk matky, pozitivní ultrazvukový a biochemický screening nebo předchozí potomek s genetickou vadou. Odběry se provádí pod kontrolou ultrazvuku, aby byly bezpečné pro matku i pro plod [28]. Odběr vzorku choria (CVS) Odběr choriových klků (chorionic villi sampling) spočívá v zisku malého množství placentárních tkáně tzv. trofoblastu, neboť tyto buňky mají stejnou genetickou informaci jako plod. Provádí se zavedením punkční jehly (transabdominálně) nebo speciálního katétru (transcervikálně) přes břišní stěnu, pod kontrolou ultrazvuku, a je prováděn mezi týdnem těhotenství. V České republice je využíván pouze odběr transabdominální a je prováděn lékařem gynekologem. Množství odebraného vzorku činí 3-5 mg choriové tkáně a je možné zpracovat ho přímo bez kultivace buněk nebo s kultivací krátkodobou (24 48 hodin), anebo nepřímou kultivací dlouhodobou. Výhodou přímého zpracování od zpracování buněk nepřímého je vysoká spolehlivost, využití malého množství materiálu, nedochází k ovlivnění výsledku kontaminací mateřskými buňkami. Při kultivaci dlouhodobé může dojít k selhání kultivace, ovlivnění výsledku kontaminací mateřskými buňkami a dochází ke spotřebě většího množství materiálu. Po odběru vzorku mohou nastat komplikace (krvácení, RH izoimunizace, infekce a odtok plodové vody, samovolný potrat). Určitou komplikací této metody je také placentární mozaicismus jev, kdy jsou chromozomální změny přítomny v choriu, ne však u plodu. 21

22 V tomto případě je nutné provést amniocentézu. Riziko komplikací výkonu se pohybuje kolem 0,5 1 % [5], [28], [29]. Placentocentéza (pozdní CVS) Tato metoda umožňuje odběr placentární tkáně v pozdějších stádiích těhotenství (druhý a třetí trimestr) [5]. Amniocentéza (AMC) Plodová voda obsahuje odloupané buňky plodu, které je možné izolovat a kultivovat pro diagnostické účely. Odběr plodové vody je prováděn pomocí punkční jehly přes břišní stěnu do dělohy, pod kontrolou ultrazvuku, a to obvykle po 15. týdnu těhotenství. Odebraný vzorek činí asi ml plodové vody, kultivovány jsou odloupané epitelie plodu (amniocyty). Část vzorku je zpracována v cytogenetické laboratoři, kde je stanovována chromozomální výbava jedince. Cytogenetické vyšetření buněk používá metody FISH (fluorescenční in situ hybridizace) a PCR (polymerázová řetězová reakce). Další možnou diagnostikou je genová detekce pomocí imunofluorescenčních sond a DNA analýza. Pomocí sond je možné diagnostikovat určité chromozomální aberace, např. trizomie 21, 18 a 13 chromozomu a monozomie pohlavního chromozomu X. Druhá část vzorku je odeslána na biochemické vyšetření k vyšetření biochemických markerů jako je např. AFP (alfa 1 fetoprotein), které je důležité pro diagnostiku rozštěpů břišní stěny a páteře, GGT (gamaglutamyltransferáza) ukazující na onemocnění cystickou fibrózu a další speciální markery sloužící při detekci některých dědičných metabolických vad. Mezi komplikace patří odtok plodové vody při odběru, infekce plodového vejce a Rh izoimunizace matky. Výkon je zatížen přibližně 0,5 1% rizikem komplikací [5], [30], [31]. 22

23 Kordocentéza (KDC) Jedná se o punkci pupečníkové žíly, která umožňuje odběr fetální krve. Indikací pro provedení kardocentézy je stanovení karyotypu (při nejasném výsledku amniocentézy, pozdním záchytu pozitivity při biochemickém screeningu), diagnostika infekce plodu stanovením protilátek (toxoplazmóza, rubeola, cytomegalovirová infekce, varicela a parvoviróza B19), ke stanovení hematologických parametrů (stanovení krevního obrazu, krevní skupiny plodu, vrozených hemoragických syndromů) a stanovení imunologických a metabolických parametrů plodu. Odběr je prováděn od 18. týdnu těhotenství pomocí punkční jehly je odběr prováděn přes břišní stěnu, pod kontrolou ultrazvuku. Odebraný vzorek činí 2 ml fetální krve. Rizika spojená s odběrem jsou krvácení, odtok plodové vody, předčasný porod a bradykardie plodu, spasmus nebo hematom cévy. Riziko komplikací je udáváno do 1 % [5], [32]. 2.5 Prenatální screening chromozomálních aberací Prenatální screening jako vyhledávací metoda musí splňovat některé požadavky: jednoduchost a snadné provedení, ekonomickou únosnost, vysokou spolehlivost a specifičnost, ale i bezpečnost pro matku i pro plod. Ani v současné době však neexistuje žádný univerzální screeningový test, který by byl schopný odhalit všechny VVV. Vzhledem k tomu, že aneuploidie jsou zásadní příčinou perinatálního úmrtí a také častou příčinou psychomotorického a fyzického postižení, byla v posledních 40 letech vyvíjena snaha nalézt co nejefektivnější screeningový program pro stanovení rizika nejčastějších aneuploidií, zejména Downova syndromu [5], [15] Charakteristika screeningových programů Základní charakteristikou screeningových programů je procento detekce (DR), hladina falešné pozitivity (FPR), gestační stáří v době výsledku testu a cena testu. 23

24 U každého screeningového testu je důležité stanovení procenta detekce, musí však být současně řečeno, při jaké falešné pozitivitě je této detekce dosaženo, a dále musí být stanovena hranice, kterou musí výsledné riziko překročit, aby došlo k pozitivitě testu. Nezanedbatelnou výhodou posunutí diagnostiky do ranějších stádií gravidity je snížení rizik zdravotních komplikací při případném ukončení těhotenství. Srovnání ekonomické náročnosti je pak velmi obtížné a záleží na finančních možnostech jednotlivých států [15] Screeningové testy prováděné v prvním trimestru těhotenství Kombinovaný test Kombinovaný test je vysoce efektivním všeobecným screeningovým testem, který dokáže odhalit 90 % plodů s trizomií 21, 18 a 13 chromozomu, při max. 5% falešné pozitivitě. Kombinovaný test se skládá ze dvou částí - stanovení biochemických markerů (PAPP A, free beta hcg) v séru matky a vyšetření ultrazvukové (měření NT, zachycení závažných strukturálních vad, datace těhotenství, ověření četnosti těhotenství). Do výpočtu rizika je zahrnut také věk matky. Výsledek tohoto testu je znám do konce 14. gestačního týdne [15]. Kontingenční test Tento screeningový test pracuje se stejnými podklady jako test kombinovaný. Posunutím odběru biochemického screeningu I. trimestru (free beta hcg, PAPP A) do gestačního týdne a přidáním tzv. minor markerů (přítomnost NB, srdeční frekvence plodu, průtok krve v ductus venosus, délka maxilly a fronto - maxilární úhel, délka kosti stehenní a kosti pažní, délka ucha, jedna umbilikální arterie, přítomnost megavesiky) se zvyšuje detekce Downova syndromu na 95 % při falešné pozitivitě 2 %. [15]. 24

25 2.5.3 Screeningové testy prováděné ve druhém trimestru těhotenství Double test Double test stanovuje riziko výskytu trizomie 21, 18 a 13 chromozomu na podkladě věku těhotné biochemických markerů AFP, hcg. Pokud tento test zahrnuje celou molekulu hcg odhalí při 5% falešné pozitivitě % postižených plodů, ale pokud zahrnuje pouze volnou podjednotku beta hcg je detekce postižených plodů o 5 % vyšší při stejném procentu falešné pozitivity. Tento test je v praxi neustále využíván i přesto, že je nespolehlivý [15]. Triple test Tripple test stanovuje riziko Downova, Patauova a Edwardsova syndromu na podkladě biochemických markerů AFP, hcg, E 3 a věku těhotné ženy. Pokud test zahrnuje celou molekulu hcg, odhalí při 5% falešné pozitivitě % postižených plodů, ale pokud zahrnuje pouze free beta hcg, je detekce postižených plodů o 5 % vyšší, při stejném procentu falešné pozitivity [15]. Quadruple test Quadruple test slouží, na podkladě biochemického vyšetření AFP, hcg, E3 a inhibin A a věku ženy ke stanovení rizika výskytu Downova, Patauova a Edwardsova syndromu. Pokud test zahrnuje celou molekulu hcg, odhalí při 5% falešné pozitivitě % postižených plodů, ale pokud zahrnuje pouze free beta hcg, detekuje postižené plody s detekcí zvýšenou o 5 % [15] Screeningové testy v prvním i ve druhém trimestru Integrovaný test Integrovaný test je v současné době v klinické praxi považován za nejefektivnější test ze všech. Na základě věku těhotné, stanovení biochemického markeru (PAPP A), ultrazvukového vyšetření (NT) v prvním trimestru a hladiny inhibinu A, AFP, hcg, E 3 v trimestru druhém, je stanovováno riziko výskytu Downova, Edwardsova a Pataova syndromu. Na základě DR a FPR má tento test nejlepší výsledky. 25

26 Zásadní předností testu je jeho nízká falešná pozitivita. Té je ovšem dosaženo pouze za předpokladu, že po stanovení PAPP A a NT u těhotných žen v prvním trimestru není na pozitivní výsledek testu reagováno invazivním vyšetřením a následnou karyotypizací, ale hodnotí se až s výsledkem biochemického screeningu druhého trimestru. Konečný výsledek testu je tak znám až ve druhém trimestru těhotenství, což může být vnímáno i jako jeho nevýhoda. Je proto vhodný pro ženy, které tento odklad akceptují [15]. Varianta integrovaného testu Variantou integrovaného testu je sérum integrovaný test, který je založen pouze na stanovení biochemických markerů PAPP A v prvním trimestru a AFP, hcg, E 3 a inhibinu A ve druhém trimestru bez ultrazvukového vyšetření. Na základě věku těhotné a biochemických markerů je stanoveno riziko výskytu Downova syndromu, Edwardsova a Patauova s 5% falešnou pozitivitou, která ale může být i vyšší v závislosti na gestačním stáří v době odběru. Při takovém procentu falešné pozitivity dosahuje test 86% záchytu Downova syndromu [15]. Sekvenční test Sekvenční test se skládá z kombinovaného testu v prvním trimestru a biochemického screeningu ve druhém trimestru. To znamená, že riziko výskytu aneuploidií (trizomie 21, 18 a 13 chromozomu) je stanovováno na základě věku těhotné ženy, biochemického vyšetření (PAPP A, free beta hcg) a ultrazvukového vyšetření (NT) v prvním trimestru a biochemického vyšetření (AFP, hcg, E 3 ) a hladiny inhibinu A ve druhém trimestru těhotenství. Rozdíl mezi integrovaným a sekvenčním testem spočívá ve vyhodnocení kombinovaného testu v prvním trimestru (pozitivita, negativita). Pokud je kombinovaný prvotrimestrální test pozitivní, provádí se invazivní vyšetření odběr choriových klků (CVS) a následná karyotypizace. Těhotné s negativním výsledkem testu většinou ještě podstupují biochemický screening ve trimestru druhém, který je vyhodnocen buď samostatně, nejčastěji však spolu s výsledkem prvního trimestru. V České republice se používá název sekvenční varianta integrovaného testu [15]. 26

27 3 Cíl práce Experimentální část této bakalářské práce se zabývá výskytem vrozených vývojových vad u plodu, zejména Downova syndromu. Vyšetřováno bylo 120 pacientek v průběhu let 2014 a 2015 v soukromé gynekologické praxi v Praze zvoleným screeningovým programem (modul OSG). Pacientky se věkově nachází v intervalu let. Cílem bakalářské práce je zjistit, zda procento falešně pozitivních výsledků prenatálního screeningu nejčastějších chromozomálních aberací plodu odpovídá procentu falešné pozitivity deklarované zvoleným screeningovým programem. 27

28 4 Metodika práce 4.1 Anamnéza Důležitou součástí vyšetření v těhotenství je znalost anamnézy (rodinná, osobní, gynekologicko - porodnická), díky níž mohou být zhodnocena jistá rizika, která by mohla ovlivnit vývoj plodu, zdraví těhotné nebo průběh porodu. Do anamnézy rodinné patří geneticky podmíněné choroby a závažná onemocnění (diabetes mellitus). Osobní anamnéza zahrnuje veškerá prodělaná onemocnění (infekční, chronická), operační výkony, alergie a užívané léky. Gynekologicko - porodnická anamnéza informuje lékaře o menstruačním cyklu ženy, užívání antikoncepce, o všech těhotenstvích, porodech a komplikacích s nimi spojenými [2]. 4.2 Prenatální screening VVV V České republice se výskyt chromozomálních abnormalit pohybuje asi okolo 6/1000 živě narozených dětí. Více jak polovina z tohoto počtu jsou numerické chromozomální aberace, zbývající část aberace strukturní a pouze 3 % jsou kombinací obou typů. Prenatální screening slouží k vyhledávání žen s vyšším rizikem výskytu Downova syndromu Prvním screeningovým vyšetřením v České republice byl druhotrimestrální screening, založený na vyhodnocení tří markerů - triple test (AFP, hcg, E 3 ). S postupným rozvojem vznikl screening prvotrimestrální a integrovaný (integrace výsledků prvotrimestrálního i druhotrimestrálního screeningu) [2], [16] Prvotrimestrální screeningové vyšetření Jako první se provádí vyšetření biochemické a s odstupem zhruba 14 dnů je pacientka vyšetřena ultrazvukem. 28

29 Biochemický screeningový test V těhotenství se v séru matky vyskytují specifické bílkoviny, jejichž stanovení se využívá v biochemických screeningových testech. Optimální doba pro odběr je mezi týdnem těhotenství. V prvním trimestru těhotenství je stanovována hladina plazmatického proteinu PAPP A. Funkce tohoto proteinu nebyla prokázána, ale zřejmě se účastní regulace fetoplacentárního růstu. Jeho snížená hladina je dávána do souvislosti s výskytem Downova syndromu hcg se v tělních tekutinách vyskytuje jako celá molekula hcg nebo jako samostatné volné podjednotky free beta hcg, která je pro screeningová vyšetření vyhovující [19], [34]. V rámci přípravy praktické části této práce jsem navštívila jednu z pražských nemocnic, kde probíhá zpracování odebraných vzorků. Séra pacientek na biochemické screeningové vyšetření jsou sbírána a zamrazována, protože se vyšetření provádí jen jednou týdně. Před analýzou musí být vzorky rozmraženy. Z každého vzorku séra jsou stanoveny hladiny bílkovin PAPP A a free beta hcg v prvním trimestru a v trimestru druhém AFP a free beta hcg tzv. TRACE (time resolved amplified cryptate emission) metodou. TRACE je metoda, při které se měří v homogenním prostředí fluorescenční signál se zpožděním. Jedná se o sendvičovou reakci, která probíhá 19 minut mezi PAPP A ze vzorku, myší monoklonální protilátkou vůči PAPP A se složkou, kterou obsahuje donor, a myší monoklonální protilátkou vůči PAPP A, která je připojena na sběrný protein. Donor po ozáření dusíkovým laserem emituje světlo o vlnové délce 620nm s dlouhou životností a akceptor neboli sběrný protein generuje signál o vlnové délce 665 nm s krátkou životností. Jestliže jsou donor i akceptor v imunokomplexu, dochází k zesílení signálu a prodloužení jeho životnosti. Měřený signál je po připojení protilátek k PAPP A, přímo úměrný hladině PAPP A [17]. 29

30 Ultrazvukové vyšetření Při ultrazvukovém vyšetření je zvolené gynekologické praxi využíván B obraz neboli dvourozměrné, rovinné zobrazení plodu v reálném čase. Obraz plodu je popisován na základě obrazu na monitoru ve stupňované šedi tzv. grey scale. Optimální doba pro prvotrimestrální ultrazvukový screening je gestační týden [2], [5]. Ultrazvukové markery: CRL CRL určuje gestační stáří. Hodnota CRL by se měla být minimálně 45mm a maximálně 84mm [18]. BPD BPD je rozměr hlavičky měřený mezi spánkovými kostmi [33]. NT NT je tvořeno vrstvou tekutiny pod kůží krku. NT je přítomno u všech plodů mezi týdnem těhotenství. NT můžeme měřit dvěma způsoby - u 95 % případů lze šíjové projasnění měřit přes břišní stěnu matky, u zbývajících 5 % je ultrazvukové vyšetření prováděno transvaginálně. Výsledky z obou vyšetření jsou srovnatelné. Plod by měl být zobrazen v sagitální poloze, od hlavy po horní část hrudníku, v co největším zvětšení. Pokud se tento marker zvětšuje (nad 3 mm), zvyšuje se také pravděpodobnost výskytu vrozených vad u plodu [18], [19], [33]. NB U většiny plodů s chromozomální aberací NB úplně chybí. V prvním trimestru těhotenství se zjišťuje její přítomnost a může se měřit i její délka Dalšími doplňujícími markery tzv. minor markery jsou tok venózním duktem, trojcípou chlopní, fronto maxilární obličejový úhel (FMF) a další. Ultrazvukovými markery typickými pro identifikaci trizomie 21 jsou rozšířené šíjové projasnění a nepřítomnost nosní kosti v prvním trimestru. Dalším markerem je např. změna v charakteru toku přes trojcípou chlopeň a venózním duktem [18], [19]. 30

31 4.2.2 Druhotrimestrální screening Druhotrimestrální screening je založen pouze na biochemickém vyšetření, nelze podle něj posoudit morfologii plodu. Snížená hladina MS AFP byla historicky prvním markerem, který představoval zvýšené riziko výskytu trizomie 21 a jediným faktorem, na kterém byla postavena senzitivita screeningu. Postupem času bylo zjištěno, že vyšší efektivity screeningového vyšetření můžeme dosáhnout stanovením dalších biochemických markerů ze séra matky - hcg, E3, AFP a inhibin A [5]. Sérové markery: AFP je sérový onkofetální protein, který je v průběhu těhotenství produkován žlutým váčkem a fetálními játry. Využívá se pro detekci chromozomálních aberací, defektů neurální trubice, ale také může zachytit malformace, odumření plodu a další [34]. E 3 je estrogenní hormon, který vzniká ve fetálních nadledvinkách, játrech a v placentě. Účastní se reakcí, které předcházejí přípravě mléčné žlázy před laktací. Za předpokladu dodržení preanalytických podmínek na vzorek je nekonjugovaný estriol lepším markerem pro detekci Downova syndromu, než AFP [34]. Inhibin A je sérový protein, který inhibuje produkci FSH. Vzniká v hypofýze, ovariu a placentě [34]. 4.3 Organizace screeningu chromozomálních vad ve zvolené gynekologické praxiv Praze Prvním příznakem těhotenství je ve většině případů vynechání menstruace. V tomto případě si žena obvykle udělá těhotenský test, objedná se na vyšetření ke svému gynekologovi a podstupuje vstupní ultrazvukové vyšetření, při kterém se gravidita potvrdí. 31

32 V případě potvrzení těhotenství jsou naplánována další potřebná vyšetření. V rámci toho je pacientce nabídnuto screeningové vyšetření, díky němuž je možné stanovit riziko pravděpodobnosti výskytu chromozomálních aberací u plodu. Zvolená gynekologická praxe provádí prenatálních screening chromozomálních aberací formou integrovaného (sekvenčního) testu. V prvním trimestru je prováděn kombinovaný test biochemické vyšetření (PAPP A, free beta hcg) a ultrazvukové vyšetření (gestační stáří, NT, NB). Kombinovaný test v prvním trimestru vyhodnocuje lékař gynekolog provádějící prvotrimestrální ultrazvukový screening. Po zadání naměřených ultrazvukových markerů a výsledků biochemie prvního trimestru do počítačového programu je ihned k dispozici zpráva s výsledkem. V případě pozitivity je těhotná odeslána ke konzultaci do centra, kde je nabídnuta invazivní diagnostika (CVS). Pokud je kombinovaný test negativní, je naplánován další termín pro odběr biochemie v druhém trimestru. Integraci výsledku pak provádí centrum, které následně zprávou o definitivním výsledku prenatálního screeningu informuje ošetřujícího gynekologa. V případě pozitivity integrovaného screeningu je těhotná žena opět odeslána ke genetické konzultaci, kde je nabídnuta invazivní diagnostika nebo provedení DNA testu. K vyhodnocení screeningu je používán modul OSG (Obstetrician s Screening Guide), který je interpretačním a organizačním modulem pro prenatální screening Downova syndromu a dalších patologických stavů v těhotenství. Tento modul je součástí programu SmartMEDIX informačního systému pro zdravotnická zařízení [20]. Vlastnostmi modulu OSG jsou možnost naplánovaní optimálních termínů prenatálních screeningových vyšetření, výpočet rizika postižení plodu trizomií 21, 18, 13 z hodnot sérových bílkovin prvního trimestru a z hodnot nuchální translucence, získaných ultrazvukovým vyšetřením, tisk žádanek pro biochemické vyšetření v obou trimestrech, tisk výsledků z prvotrimestrálního i druhotrimestrálního screeningu v různých jazykových verzích [20]. 32

33 Obrázek 1 - Žádanky na screeningové vyšetření v I. a ve II. trimestru těhotenství 33

34 Obrázek 2 - Zpráva o screeningovém vyšetření v I. trimestru těhotenství 34

35 Obrázek 3 - Zpráva o screeningovém vyšetření ve II. trimestru těhotenství 35

36 5 Vyhodnocení výsledků: Tabulka 1- Hodnoty ultrazvukových a biochemických markerů u těhotných žen v prvním trimestru a vyhodnocení prvotrimestrálního screeningu PAC. CRL (mm) BPD (mm) NT (mm) NB PAPP - A (MoM) volný beta - hcg (MoM) negativní/pozitivní 1 69,29 21,78 1,59 přítomna 0,69 1,13 negativní 2 75,22 21,20 1,44 přítomna 0,32 0,56 negativní 3 75,36 24,02 1,70 přítomna 0,55 0,84 negativní 4 63,25 19,66 1,30 přítomna 1,50 2,25 negativní 5 57,83 17,31 1,19 přítomna 0,27 0,85 negativní 6 60,13 19,70 0,59 přítomna 0,53 0,81 negativní 7 61,82 21,20 1,95 neměřena 0,36 1,83 pozitivní 8 76,37 23,35 1,47 přítomna 1,40 0,87 negativní 9 78,13 24,94 1,38 přítomna 2,56 2,69 negativní 10 75,55 22,13 1,47 přítomna 0,78 4,10 negativní 11 72,38 22,69 1,78 neměřena 2,23 1,64 negativní 12 61,95 20,87 1,53 přítomna 0,76 3,93 negativní 13 65,99 22,10 1,24 přítomna 0,58 1,63 negativní 14 79,87 25,98 1,56 přítomna 0,83 1,63 negativní 15 72,18 22,40 1,64 přítomna 0,62 1,01 negativní 16 69,60 21,37 1,10 přítomna 1,06 1,44 negativní 17 66,25 19,95 1,40 přítomna 1,01 1,23 negativní 18 74,51 22,18 1,27 přítomna 2,78 2,49 negativní 19 62,78 20,52 1,57 přítomna 1,30 0,63 negativní 20 72,31 23,27 1,55 přítomna 0,53 0,51 negativní 21 49,74 18,92 0,84 přítomna 1,72 0,79 negativní 22 66,02 20,69 1,19 přítomna 1,02 1,24 negativní 23 67,87 19,59 3,65 přítomna 0,28 5,09 pozitivní 24 71,31 20,15 1,28 přítomna 0,56 3,54 negativní 25 73,44 25,10 1,41 přítomna 2,13 2,20 negativní 26 74,51 24,45 1,32 přítomna 0,50 0,78 negativní 27 70,21 22,05 1,14 přítomna 1,74 1,03 negativní 28 66,03 24,64 1,23 přítomna 0,24 0,77 negativní 29 77,69 23,35 1,82 přítomna 0,52 0,80 negativní 30 66,32 20,63 1,29 přítomna 2,11 2,34 negativní 31 65,71 22,01 1,44 přítomna 1,34 0,70 negativní 32 66,49 22,69 1,25 přítomna 1,89 4,47 negativní 33 70,26 22,46 1,25 přítomna 1,39 5,46 negativní 34 61,42 21,20 1,20 přítomna 1,62 1,39 negativní 35 58,16 17,79 1,22 neměřena 0,83 2,28 negativní 36 64,81 20,58 1,28 přítomna 0,64 1,15 negativní 37 71,30 22,70 1,20 neměřena 0,95 0,59 negativní 38 67,98 20,57 1,61 přítomna 0,41 0,53 negativní 39 60,13 19,07 0,59 přítomna 0,53 0,81 negativní 40 59,72 19,20 1,18 přítomna 1,41 2,07 negativní 36

37 Tabulka 2 - Hodnoty biochemických markerů u těhotných žen ve druhém trimestru a vyhodnocení integrovaného screeningu PAC. MS - AFP (MoM) volný beta - hcg (MoM) E3 (MoM) negativní/pozitivní 1 1,45 1,18 1,21 negativní 2 0,55 1,17 0,52 negativní 3 0,86 1,71 1,47 negativní 4 0,73 2,65 1,06 negativní 5 1,19 0,73 0,94 negativní 6 1,13 0,34 0,94 negativní 7 0,92 0,83 0,74 negativní 8 0,84 0,81 0,92 negativní 9 1,62 0,67 1,17 negativní 10 0,73 1,66 0,68 negativní 11 0,91 1,01 1,24 negativní 12 1,66 2,69 1,01 negativní 13 1,24 0,93 0,60 negativní 14 1,15 1,13 1,10 negativní 15 0,68 1,13 1,14 negativní 16 0,68 1,86 0,59 negativní 17 1,02 1,50 0,92 negativní 18 1,89 2,32 14,26 pozitivní 19 0,76 0,50 1,29 negativní 20 0,76 0,26 1,11 negativní 21 1,11 2,37 0,87 negativní 22 0,96 1,48 1,26 negativní 23 0,94 0,41 0,93 negativní 24 2,41 5,00 0,93 negativní 25 1,43 2,19 0,94 negativní 26 0,86 0,81 1,00 negativní 27 0,67 0,43 1,19 negativní 28 3,47 3,81 0,77 negativní 29 0,53 0,49 0,88 negativní 30 0,89 3,65 0,74 negativní 31 1,46 0,84 1,10 negativní 32 0,76 2,17 0,74 negativní 33 1,04 1,80 0,98 negativní 34 0,91 1,44 1,66 negativní 35 0,99 2,58 1,14 negativní 36 1,64 1,26 1,12 negativní 37 0,97 0,88 0,96 negativní 38 1,26 0,42 1,00 negativní 39 1,13 0,34 0,94 negativní 40 0,79 1,41 0,85 negativní 37

38 Tabulka 3 - Hodnoty ultrazvukových a biochemických markerů u těhotných žen v prvním trimestru a vyhodnocení prvotrimestrálního screeningu PAC. CRL (mm) BPD (mm) NT (mm) NB PAPP - A (MoM) volný beta - hcg (MoM) negativní/pozitivní 41 62,71 21,47 1,03 přítomna 0,58 0,75 negativní 42 65,97 20,70 1,43 přítomna 0,46 0,62 negativní 43 59,81 19,89 1,30 přítomna 0,91 3,08 negativní 44 65,79 22,25 2,04 neměřena 0,72 0,84 negativní 45 57,14 18,07 1,18 přítomna 0,61 2,57 negativní 46 61,02 19,43 1,24 přítomna 2,33 1,32 negativní 47 75,13 23,11 1,76 přítomna 1,29 0,76 negativní 48 62,24 21,78 1,24 přítomna 0,97 1,09 negativní 49 62,47 20,94 1,17 přítomna 0,46 0,53 negativní 50 68,36 20,14 1,14 přítomna 0,62 0,83 negativní 51 61,22 19,14 0,83 přítomna 0,42 1,84 negativní 52 64,01 19,96 1,71 přítomna 1,19 1,34 negativní 53 65,47 22,07 1,10 přítomna 0,27 0,88 negativní 54 65,40 21,10 1,41 přítomna 0,90 1,41 negativní 55 60,12 19,63 1,37 přítomna 0,57 0,78 negativní 56 65,52 21,60 1,33 přítomna 0,50 0,42 negativní 57 68,70 20,90 1,20 přítomna 0,73 1,74 negativní 58 67,30 22,29 1,24 přítomna 1,42 0,58 negativní 59 73,64 22,17 1,57 přítomna 2,49 1,09 negativní 60 62,77 20,49 1,45 přítomna 0,63 0,90 negativní 61 70,99 19,84 1,29 přítomna 1,09 0,36 negativní 62 62,96 21,20 1,56 přítomna 1,32 1,19 negativní 63 66,68 23,13 1,56 neměřena 1,48 1,44 negativní 64 66,49 21,08 1,11 přítomna 0,50 3,12 negativní 65 72,31 23,02 1,54 přítomna 0,42 1,19 negativní 66 73,82 22,42 1,20 přítomna 2,05 3,14 negativní 67 61,09 15,86 1,22 neměřena 0,74 0,75 negativní 68 61,61 19,49 1,48 přítomna 0,83 0,68 negativní 69 65,48 20,73 1,34 přítomna 0,75 4,46 negativní 70 66,04 22,88 1,29 přítomna 0,91 0,53 negativní 71 68,32 23,08 1,43 přítomna 3,23 3,15 negativní 72 64,66 20,41 1,59 neměřena 0,56 1,18 negativní 73 64,09 20,24 1,30 přítomna 0,52 1,66 negativní 74 74,04 22,91 1,91 přítomna 2,83 0,84 negativní 75 70,80 23,00 1,55 neměřena 0,50 2,00 negativní 76 61,88 18,76 1,15 přítomna 1,54 1,00 negativní 77 68,73 20,65 1,20 přítomna 3,63 1,62 negativní 78 68,69 22,13 1,03 přítomna 1,10 1,36 negativní 79 74,51 24,47 1,03 přítomna 1,22 1,09 negativní 80 71,23 21,37 1,53 přítomna 0,63 1,27 negativní 38

39 Tabulka 4 - Hodnoty biochemických markerů u těhotných žen ve druhém trimestru a vyhodnocení integrovaného screeningu PAC. MS - AFP (MoM) volný beta - hcg (MoM) E3 (MoM) negativní/pozitivní 41 1,13 1,57 0,48 negativní 42 1,36 0,72 0,49 negativní 43 1,43 2,50 0,90 negativní 44 0,88 1,18 0,83 negativní 45 1,19 2,01 0,47 negativní 46 0,73 0,89 0,98 negativní 47 0,93 1,49 0,88 negativní 48 1,39 0,98 1,08 negativní 49 1,47 0,82 0,77 negativní 50 0,74 1,08 1,04 negativní 51 1,04 1,98 0,98 negativní 52 0,79 2,65 0,92 negativní 53 1,00 0,96 1,03 negativní 54 1,16 1,19 1,20 negativní 55 2,48 1,56 1,08 negativní 56 0,55 0,55 0,74 negativní 57 0,89 0,78 0,86 negativní 58 1,60 1,23 0,77 negativní 59 0,83 1,46 0,39 negativní 60 0,96 1,06 1,13 negativní 61 1,08 0,51 1,19 negativní 62 0,70 1,09 1,06 negativní 63 1,43 2,25 1,49 negativní 64 1,36 2,16 0,56 negativní 65 0,85 0,71 1,44 negativní 66 0,80 1,56 0,71 negativní 67 0,38 0,68 1,15 negativní 68 1,50 1,64 1,15 negativní 69 0,99 5,70 0,87 negativní 70 0,86 0,44 1,06 negativní 71 1,13 1,54 1,09 negativní 72 1,23 2,30 1,01 negativní 73 0,48 0,89 0,85 negativní 74 1,76 0,74 0,89 negativní 75 1,08 1,13 1,21 negativní 76 1,09 0,48 1,09 negativní 77 1,03 1,90 0,49 negativní 78 0,68 0,86 0,93 negativní 79 0,83 0,89 0,73 negativní 80 1,40 1,03 0,90 negativní 39

40 Tabulka 5 - Hodnoty ultrazvukových a biochemických markerů u těhotných žen v prvním trimestru a vyhodnocení prvotrimestrálního screeningu PAC. CRL (mm) BPD (mm) NT (mm) NB PAPP - A (MoM) volný beta - hcg (MoM) negativní/pozitivní 81 68,76 18,97 1,19 přítomna 0,50 2,29 negativní 82 66,10 21,28 1,60 přítomna 0,47 3,93 pozitivní 83 68,47 20,78 1,40 přítomna 1,21 1,78 negativní 84 60,55 19,68 1,43 neměřena 1,41 1,45 negativní 85 65,00 21,00 1,20 neměřena 2,10 1,63 negativní 86 67,90 22,60 1,60 neměřena 1,37 2,87 negativní 87 71,59 23,32 2,40 přítomna 4,44 1,45 negativní 88 64,79 21,43 1,04 přítomna 0,52 0,29 negativní 89 63,89 19,50 1,28 přítomna 1,37 1,05 negativní 90 79,29 24,85 1,36 přítomna 1,62 1,27 negativní 91 69,88 20,43 1,33 přítomna 0,72 0,71 negativní 92 64,62 21,09 1,39 přítomna 1,59 2,58 negativní 93 72,98 23,14 1,23 přítomna 1,44 0,88 negativní 94 67,18 19,66 1,38 přítomna 2,52 2,41 negativní 95 76,30 24,44 1,53 přítomna 0,22 1,74 pozitivní 96 60,09 18,99 1,25 přítomna 0,71 4,98 negativní 97 56,26 18,92 1,16 přítomna 1,81 0,96 negativní 98 69,83 21,30 1,40 přítomna 0,45 0,59 negativní 99 67,80 20,60 1,50 neměřena 1,77 2,83 negativní ,31 21,01 1,48 přítomna 2,13 0,89 negativní ,60 16,60 1,70 neměřena 1,33 0,65 negativní ,56 20,29 1,06 přítomna 1,47 1,05 negativní ,24 21,50 0,93 přítomna 1,47 0,64 negativní ,08 21,57 1,40 přítomna 1,05 4,46 negativní ,87 20,49 1,34 přítomna 0,34 0,64 negativní ,51 21,15 1,32 přítomna 0,94 1,28 negativní ,22 18,82 1,59 přítomna 0,80 1,29 negativní ,47 24,64 1,55 přítomna 1,50 1,61 negativní ,53 17,79 0,93 neměřena 1,31 6,20 negativní ,22 21,43 1,26 přítomna 0,48 0,67 negativní ,37 22,36 1,92 přítomna 1,47 0,48 negativní ,40 20,92 1,35 přítomna 0,95 0,92 negativní ,82 24,50 1,84 přítomna 0,32 0,92 negativní ,12 21,60 1,60 přítomna 0,45 0,96 negativní ,31 22,58 1,48 přítomna 0,70 2,38 negativní ,50 21,35 1,19 neměřena 1,36 1,23 negativní ,00 20,50 1,50 přítomna 2,00 1,28 negativní ,70 19,90 1,00 přítomna 0,63 1,04 negativní ,20 22,00 1,50 přítomna 0,53 2,86 negativní ,71 23,67 1,40 přítomna 0,83 0,36 negativní 40

41 Tabulka 6 - Hodnoty biochemických markerů u těhotných žen ve druhém trimestru a vyhodnocení integrovaného screeningu PAC. MS - AFP (MoM) volný beta - hcg (MoM) E3 (MoM) negativní/pozitivní 81 0,56 1,13 0,94 negativní 82 0,82 1,41 1,17 negativní 83 0,66 1,02 1,12 negativní 84 0,96 1,50 1,00 negativní 85 1,34 1,78 0,76 negativní 86 0,85 2,12 1,42 negativní 87 1,30 0,84 1,06 negativní 88 1,00 0,35 1,13 negativní 89 1,22 1,16 0,96 negativní 90 0,90 1,21 0,73 negativní 91 0,97 0,52 1,06 negativní 92 1,02 1,15 0,94 negativní 93 0,77 1,82 0,82 negativní 94 0,62 1,67 0,86 negativní 95 1,19 1,04 0,54 negativní 96 1,35 1,92 1,11 negativní 97 1,27 1,09 0,78 negativní 98 1,02 1,25 0,66 negativní 99 0,74 0,45 0,76 negativní 100 1,33 1,41 0,85 negativní 101 1,08 1,17 0,78 negativní 102 0,78 1,14 0,98 negativní 103 1,86 0,83 0,79 negativní 104 0,62 1,60 0,97 negativní 105 0,97 0,48 0,97 negativní 106 1,53 1,80 1,02 negativní 107 1,17 0,62 1,03 negativní 108 0,82 1,87 0,91 negativní 109 0,91 2,99 0,88 negativní 110 0,82 1,45 0,60 negativní 111 1,16 0,66 0,99 negativní 112 1,37 1,10 0,97 negativní 113 0,48 1,29 0,70 negativní 114 0,81 0,99 0,85 negativní 115 0,90 1,03 1,01 negativní 116 0,66 2,39 0,44 pozitivní 117 2,25 1,48 1,21 negativní 118 1,33 0,96 1,03 negativní 119 0,71 1,99 1,03 negativní 120 2,20 0,25 0,80 negativní 41

42 Výpočet FPR z hodnot z tabulek: Procento falešné pozitivity screeningu v prvním trimestru= 100 = = 3,3 % Vyhodnocení procenta falešné pozitivity sekvenčního integrovaného testu: PFP = 100 = = 5 % Gynekologická praxe, se kterou jsem spolupracovala, má vypracovaný systém prenatální péče s přesným načasováním jednotlivých vyšetření, který je kontrolován na několika úrovních (lékař, sestra). To umožňuje dokonalý přehled o tom, zda každá těhotná ženy podstoupila ve správnou dobu všechna potřebná vyšetření. Otázka prenatálního screeningu chromozomálních vad je jednou z prvních, která je s ženou konzultována, a umožňuje naplánovat jednotlivé kroky. Screening je zajišťován ve spolupráci s jedním z center prenatální diagnostiky a využívá sekvenční integrovaný test. Biochemická vyšetření v prvním i druhém trimestru jsou zpracována jednou laboratoří, k vyhodnocení je použit stejný počítačový program, což umožňuje integraci výsledků obou trimestrů. V posuzovaném vzorku 120 žen, které prošly sekvenčním integrovaným testem v rámci prenatálního screeningu chromozomálních vad, jsem zjistila pozitivitu v kombinovaném testu u 4 žen. Tyto ženy byly následně odeslány do centra a zde jim byla po konzultaci s genetikem nabídnuta invazivní diagnostika (CVS). U všech těchto žen byl po karyotypizaci zjištěn zdravý plod. Jednalo se tedy o falešnou pozitivitu v kombinovaném testu. Výpočtem jsem zjistila, že tato hodnota falešné pozitivity 3,3 % je v souladu s obecně udávanou falešnou pozitivitou (nižší než 5 %). I u těchto žen byl pak prováděn invazivní odběr ve druhém trimestru. Po provedení integrace výsledků prvního a druhého trimestru byla zjištěna pozitivita u dalších 2 žen. I tyto ženy pak na základě genetické konzultace podstoupily invazivní výkon (AMC) s karyotypizací plodu a také u nich byl zjištěn zdravý plod. Celkové zjištěné množství pozitivních výsledků sekvenčního integrovaného testu je 6 žen - falešná pozitivita sekvenčního integrovaného testu je tedy 5 %. 42

43 6 Diskuze Prenatální screeningové testy se stále rozvíjejí a zdokonalují, tak jak se postupně zlepšují vyšetřovací metody a přístrojové vybavení. V České republice byl jako první zaveden druhotrimestrální screening vyhodnocující sérové markery těhotné (AFP, hcg, E 3 ) tzv. triple test. Po zavedení prenatální diagnostiky se její úspěšnost do roku 1988 postupně zvyšovala až na 22 %. S uplatněním věkové indikace pro invazivní prenatální diagnostiku (pro ženy 35leté a starší) se zvyšuje i podíl prenatálně diagnostikovaných případů v první polovině 90. let (30 38 %). Tento nárůst ukázal opodstatněnost stanovení věkové indikace pro ženy 35leté je statisticky významné zvýšení rizika, hraniční významnost je již pro ženy 34leté. Další významné zvýšení efektivity prenatální diagnostiky Downova, Edwardsova a Patauova syndromu je v souvislosti s celoplošným zavedením screeningových testů (druhotrimestrální biochemický screening). Tato efektivita se v letech pohybovala v rozmezí % [16]. Graf 1 - Downův syndrom v České republice, , procento prenatálně diagnostikovaných a ukončených případů z celku [8]. 43

44 Od té doby byl učiněn značný krok kupředu zvláště v souvislosti s možností posunutí diagnostiky do ranějších stádií těhotenství pomocí prvotrimestrálního screeningu, popř. integrace výsledků prvotrimestrálního screeningu a druhotrimestrálního screeningu tj, integrovaný screening (viz. graf 1). Do prvotrimestrálního screeningu jsou pak kromě biochemických markerů zařazeny i markery ultrazvukové (NT, NB a další). Časná ultrazvuková diagnostika se tak stává významnou a nedílnou součástí prenatální diagnostiky především vrozených chromozomálních vad, ale i závažných strukturálních vad. Díky zavádění prvotrimestrálního screeningu a časné invazivní prenatální diagnostiky (CVS) jsou hodnoty úspěšnosti prenatální diagnostiky v období nad 80 % [16]. Nejnovější údaje z roku 2014 udávají hodnotu 92,17 % (viz. graf 1 ). Prevalence nejčastějších chromozomálních vad se během posledních let zvyšuje. Zvýšení počtu aneuploidií je přičítáno především nepříznivé demografické situaci v České republice. Zvyšuje se průměrný věk rodiček a stejně tak i procento rodících žen nad 35 let. Dalším faktorem, který se určitým způsobem podílí na tomto vzestupu, je i zvýšení podílu prenatálně diagnostikovaných případů [16]. Žádný test nelze hodnotit pouze na základě procenta detekce, které dosahuje, ale také podle toho jaké cut off riziko je používáno, tedy jakou hranici musí výsledné riziko překročit, aby byl výsledek považován za pozitivní [16]. Integrovaný test se jeví z hlediska DR a FPR jako nejlepší. Jeho velmi nízkou FPR je však možné zachovat pouze tehdy, není li na pozitivitu kombinovaného testu v prvním trimestru reagováno nabídkou invazivního vyšetření a karyotypizací plodu. To pro těhotnou ženu znamená odklad definitivního vyhodnocení prenatálního screeningu do období druhého trimestru. To však může být pro ženu velmi stresující, a proto nepřijatelné. Současně se tak při potvrzení pozitivity screeningového testu ve druhém trimestru dostáváme do období těhotenství, které je při jeho ukončení (pokud se tak žena rozhodne) rizikovější oproti trimestru prvnímu [16]. Sekvenční varianta integrovaného testu (sekvenční integrovaný test), který se také v ČR používá, se tak jeví jako možná dobrá alternativa. Rozdíl oproti integrovanému testu spočívá v tom, že pokud je prvotrimestrální kombinovaný test hodnocen jako pozitivní je těhotným ženám nabídnuta karyotypizace (CVS). 44

45 Hranice pozitivity (cut off) kombinovaného testu je volena různě, obvykle se však pohybuje mezi 1:10 1:100. Těhotným, které mají negativní kombinovaný test, je nabídnut biochemický test druhotrimestrální. Ten je pak hodnocen samostatně, nebo je integrován s výsledkem prvního trimestru. Samostatné hodnocení však velmi zásadním způsobem navyšuje falešnou pozitivitu a tím i nárůst počtu invazivních vyšetření, a proto je dnes obecně považováno za obsolentní. Bohužel, v naší české praxi je však tento postup poměrně častý. Pokud je biochemická část kombinovaného testu a biochemie druhého trimestru zpracována v jiné laboratoři, nebo je prvotrimestrální test proveden v jiném centru než druhotrimestrální, není pak integrace výsledků možná. Řešení tohoto spíše organizačního problému by tak mělo být jedním z prvořadých úkolů v současné péči o těhotné ženy [16]. Obecně lze říci, že praktická DR a FPR závisí na nastavení cut off pozitivity prvního a druhého trimestru - tedy čím vyšší riziko je považováno za hranici mezi negativním a pozitivním výsledkem, tím je celková falešná pozitivita nižší. Na druhé straně nevýhodou takto nastavené cut off je, že je v prvním trimestru zachyceno nižší procento plodů s Downovým syndromem, resp. jejich diagnostika je přesunuta do trimestru druhého. Jedním z argumentů zastánců tohoto screeningového programu je i fakt, že některá onemocnění Downova syndromu byla diagnostikována až na podkladě druhotrimestrální části testu, který následoval po negativním kombinovaném testu, přičemž hranice pozitivity kombinovaného testu byla poměrně nízká (vždy více než 1:300) [16]. To znamená, že pokud by tyto ženy podstoupily pouze kombinovaný test v prvním trimestru, nebyly by tyto plody s Downovým syndromem pravděpodobně prenatálně diagnostikovány. Porovnání falešné pozitivity a cut off hodnoty kombinovaného a sekvenčního integrovaného testu ve zvolené gynekologické praxi s hodnotami nalezenými v literatuře: Tabulka 7 - Falešná pozitivita a cut off hodnota kombinovaného a sekvenčního integrovaného testu získaná z doporučení z časopisu Aktuální gynekologie a doporučení z České gynekologie [35], upraveno. Test Cut off FPR testu (%) Kombinovaný 1:30-1:50 5 Sekvenční integrovaný 1:

46 Tato tabulka je zajímavá tím, že je v ní uvedeno jakým způsobem musí být nastaveno cut off jednotlivých testů, aby bylo dosaženo FPR max. 5 %. Tabulka 8 Falešná pozitivita a cut off hodnota kombinovaného a sekvenčního integrovaného testu, z Novelizovaného doporučení pro screening vydaného Registrem laboratoří, provádějících screening VVV [36], upraveno. Test Cut off FPR testu (%) Kombinovaný 1:30 0,5 Sekvenční integrovaný 1:180 2,25 Registr laboratoří provádějící screening vrozených vývojových vad zahrnuje 36 laboratoří vyšetřujících v prvním i druhém trimestru. Ve svém Novelizovaném doporučení pro screening z roku 2010 uvádí údaje ze studie SURUSS (2003), která udává u kombinovaného testu při cut off 1:30 0,5% FPR a u sekvenčního integrovaného testu při cut off 1:180 FPR 2,25% Tabulka 9 Falešná pozitivita a cut off hodnota kombinovaného a sekvenčního integrovaného testu ve zvolené gynekologické praxi Test Cut off FPR testu (%) Kombinovaný 1:250 3,3 Sekvenční integrovaný 1:250 5 Zvolená gynekologická praxe má v modulu OSG nastavenou cut off hodnotu na 1 : 250 pro oba trimestry. Výpočtem jsem zjistila, falešnou pozitivitu u kombinovaného testu v prvním trimestru 3, 3 % a v sekvenčním integrovaném testu 5 %. V obou případech můžeme konstatovat, že vypočtená falešná pozitivita, nepřesahuje hodnotu FPR nalezenou v literatuře. Nejnižší falešnou pozitivitu udává studie SURUSS. Této hodnoty je však dosaženo, jak je patrné v tabulce 8, poměrně vysoko nastavenou hranicí rizika mezi pozitivním a negativním výsledkem. Lze tedy říci, že ve zvolené gynekologické praxi bylo docíleno přijatelné falešné pozitivity při, podle mého názoru, rozumně stanovené hranici rizika. 46

47 Procento rodiček nad 35 let věku [%] ,7 4,8 4,9 5 5,1 5,2 6 6,5 7 7, , , Rok Graf 2 Procento rodiček nad 35 let věku v České republice, v letech , [8], upraveno. Jak je patrné z grafu 2, v roce 1994 se procento rodiček nad 35 let pohybovalo okolo 5. Od roku 2000 pozorujeme jejich pozvolný nárůst, který se v roce 2014 vyšplhal až na 21 %. Do roku 2016 se dá předpokládat nárůst počtu těchto žen. Tabulka 10 - Pravděpodobnost výskytu Downova syndromu spolu se vzrůstajícím věkem matky [12]. Tabulka 7 znázorňuje pravděpodobnost výskytu Downova syndromu spolu se vzrůstajícím věkem matek, přičemž u matek ve věku let je pravděpodobnost výskytu Downova syndromu 1 z 2000 narozených dětí. 47