STŘEDOŠKOLSKÁ ODBORNÁ ČINNOST

Transkript

1 STŘEDOŠKOLSKÁ ODBORNÁ ČINNOST Obor č.6: Zdravotnictví Využití NIPT (neinvazivní prenatální testování) v prenatální diagnostice Jakub Velemínský Jihočeský kraj České Budějovice 2018

2 STŘEDOŠKOLSKÁ ODBORNÁ ČINNOST Obor č.6: Zdravotnictví Využití NIPT (neinvazivní prenatální testování) v prenatální diagnostice NIPT (noninvasive prenatal testing) in prenatal diagnostics Autor: Jakub Velemínský Škola: Česko-anglické gymnázium s.r.o. Kraj: Jihočeský kraj Konzultant: Mgr. Jitka Konvičková České Budějovice, 2018

3 Prohlášení Prohlašuji, že jsem svou práci SOČ vypracoval samostatně a použil jsem pouze prameny a literaturu uvedené v seznamu bibliografických záznamů. Prohlašuji, že tištěná verze a elektronická verze soutěžní práce SOČ jsou shodné. Nemám závažný důvod proti zpřístupňování této práce v souladu se zákonem č. 121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon) ve znění pozdějších předpisů. V Českých Budějovicích Jméno a Příjmení autora

4 Rád bych poděkoval vedení Centra lékařské genetiky s.r.o. za možnost a podporu této práce. Dále bych chtěl poděkovat Jitce Konvičkové a kolektivu laboratoře za odborné vedení, trpělivost a ochotu, kterou mi v průběhu zpracování seminární práce věnovali.

5 Anotace Tato práce se zabývá metodami prenatální diagnostiky a zaměřuje se na novou metodu NIPT (neinvazivní prenatální testování) založenou na přímé analýze volné DNA (cfdna) plodu v krvi matky. V molekulární laboratoři Centra lékařské genetiky s.r.o. je využívaná diagnostická souprava Clarigo od firmy Multiplicom, která v současnosti nabízí vyhodnocení aneuploidií chromozomů 13, 18 a 21 a orientační stanovení pohlaví. Tento test je (po souhlasu pacientky) nejčastěji indikován v případě pozitivního screeningu chromozomálních aberací. V dnešní době jsou známy některé limitace NIPT testů, avšak s nárůstem hodnocených vzorků bude nutno přesněji identifikovat limitace nové. Ve své práci jsem se zaměřil na vzorky, které nebylo možné z neznámého důvodu vyhodnotit. Anonymní data exportovaná ze složek těchto pacientek byla použita pro studium ukazatelů např. lékové indikace, rodinná a osobní anamnéza atd. Cílem této práce bylo mezi těmito faktory najít ty, které by mohly mít pravděpodobně vliv na vyhodnocení vzorků. Klíčová slova: prenatální diagnostika, invazivní, neinvazivní testování, limitace Anotation This work focuses on prenatal diagnostic methods especially on the NIPT method (noninvasive prenatal testing) that is based on analysis of fetal cell-free DNA contained in maternal blood. Clarigo kit provided by Multiplicom company is being used in molecular laboratory of Center for Medical Genetics Ltd České Budějovice. This kit can evaluate aneuploidies of chromosomes 13, 18, and 21 and detect presumable gender. This test is most often indicated in case of positive screening of chromosomal aberrations. Nowadays, some NIPT limitations are known. However, the increase number of samples allow us to reveal new limitations. In this work I have focused on samples that could not have been evaluated for unknown reasons. Anonymous data exported from folders of these clients were used to examine many factors such as medicaments, family anamnesis etc. that could potentially lead to the failure of the test. The aim of this work was to find factors that could most probably influence the ability to evaluate NIPT results. Key words: prenatal diagnostics, invasive, noninvasive testing, limitations

6 Obsah 1 Úvod Základní metody genetické diagnostiky Neinvazivní vyšetření Invazivní vyšetření NIPT neinvazivní prenatální testování volné fetální DNA plodu v krvi matky Princip NIPT Kit CLARIGO pro NIPT Cíle práce Metodika a výsledky Závěr Seznam použité literatury: Seznam zkratek použitých v textu Molekulárně genetické pojmy užité v textu:... 23

7 1 Úvod Prenatální diagnostika v dnešní době zahrnuje soubor vyšetření určených pro těhotné (gravidní) ženy. Některá z těchto vyšetření se provádějí u žen se zvýšeným rizikem vrozené vývojové vady (VVV) u plodu, nebo u kterých k VVV již došlo v předchozích graviditách či v rodinné anamnéze. V naší populaci je riziko narození dítěte s více či méně závažnou vývojovou vadou 3-5 % [1-4]. Některé z těchto vad jsou zcela náhodné a nemají žádnou souvislost s rodinným výskytem. Se stoupajícím věkem rodičů vzrůstá rovněž riziko vzniku některých genetických vad u potomků. Základními metodami jsou takzvaná screeningová vyšetření. Tato vyšetření prováděná u všech těhotných žen slouží k selekci pacientek s vyšším rizikem pro výskyt vrozených vývojových vad u plodu. Tyto vady většinou vznikají náhodně při početí nebo v prvních týdnech těhotenství. Standardním screeningovým vyšetřením je vyšetření biochemických a ultrazvukových markerů v I. trimestru nebo v I. a II. trimestru těhotenství a ultrazvukové vyšetření ve týdnu těhotenství [23]. Za počátek prenatální diagnostiky je považován rok 1966, kdy Stele a Brek zjistili, že chromozomální karyotyp plodu (soubor všech chromozomů v buněčném jádře) lze vyšetřit odebráním buněk z plodové vody matky a jejich následnou analýzou. Vyšetření karyotypu je jednou ze základních metod současné klinické genetiky, jejímž hlavním cílem je vyloučení numerických a strukturních chromosomálních aberací (odchylek). Toto je možné provádět klasickými metodami barvení chromozomů či specializovaným vyšetřením např. fluorescenční metodou FISH (fluorescenční in situ hybridizace) pro barvení vybraného úseku či celého chromozomu pomocí fluorescenčních sond. V současné chvíli je rutinně možné vyšetřit řadu závažných chromozomálních onemocnění a syndromů. Před samotným vyšetřením je zapotřebí pacientku (rodiče) informovat o indikovaných vyšetřeních, možných rizicích spojených s vyšetřením a o možném uchování vzorku na pracovišti. Pacient lékaři stvrzuje souhlas a pochopení těchto informací svým podpisem na informovaném souhlasu při genetické konzultaci. 1.1 Základní metody genetické diagnostiky Metody užívané pro prenatální diagnostiku dělíme na invazivní a neinvazivní. V dnešní době je možno diagnostikovat více jak 200 dědičných onemocnění. 1

8 Dříve bylo u těhotných žen určeno kritérium věková hranice 35 let, kdy měly ženy možnost genetického vyšetření plodu (odběr plodové vody, odběr choriových klků). Při současných možnostech nepřímého vyšetření plodu (např. ultrazvuk, biochemické parametry, neinvazivní testování) jsou kritéria a důvody pro genetickou konzultaci nejčastěji pozitivní výsledek screeningu, tj. zvýšené riziko pro výskyt vrozené vývojové vady. V těchto případech je ženě doporučena konzultace na genetickém pracovišti, kde je s pacientkou probrána rodinná a osobní anamnéza a případné výsledky screeningu. Následně je lékařem (atestovaným klinickým genetikem) navrhnut další postup s eventuálním vyšetřením. Tím může být například odběr plodové vody (amniocentéza) či odběr choriových klků, neinvazivní vyšetření z krve matky (vyšetření podílu fetální DNA obsažené v periferní krvi matky - NIPT) aj. Tato vyšetření by měla vyloučit anebo potvrdit případnou VVV plodu. Hlavní indikace (důvod) ke genetické konzultaci a laboratornímu vyšetření těhotné ženy: - Pozitivní screening v I. trimestru, pozitivní integrovaný test nebo triple test (pozn. popis screeningových vyšetření viz níže) - Plod se vzniklou chromozomální vadou v předchozí graviditě - Přítomnost strukturální chromozomální vady u jednoho z rodičů - Příbuznost partnerů - Objevení abnormalit při rutinním screeningu nebo ultrazvukovém vyšetření Neinvazivní prenatální vyšetření: - Kombinovaný screening v I. trimestru, integrovaný test nebo triple test - Ultrasonografie - Stanovení nejčastějších chromozomálních aneuploidií (chromozomy 13, 18, 21, X, Y) metodou NIPT (pozn. Aneuploidie chromozomu X a Y a vybrané mikrodeleční syndromy lze NIPT metodou stanovit pomocí jiného komerčního NIPT testu poskytovaného též v Centru lékařské genetiky s.r.o.) Invazivní prenatální vyšetření: - Amniocentéza - Odběr choriových klků - Kordocentéza 2

9 1.1.1 Neinvazivní vyšetření Ultrasonografie Ultrasonografie neboli ultrazvukové vyšetření je jednou z nejdůležitějších součástí prenatální diagnostiky. Umožňuje určení stáří plodu, identifikaci vícečetných těhotenství, potvrzení životaschopnosti plodu a také určení pohlaví plodu. Dále je možné pomocí ultrazvuku objevit mnoho závažných vývojových vad. Jako jeden z markerů měřených ultrazvukem se používá měření nuchální translucence (NT), což je podkožní projasnění mezi kůží a měkkými tkáněmi překrývající krční páteř. Tento screeningový test odhalí až 80 % těhotenství s Downovým syndromem. Část vrozených vývojových vad plodu lze najít při ultrazvukovém vyšetření ve 13. týdnu těhotenství, další část ve 20. týdnu těhotenství. Pomocí ultrazvuku lze také již od 12. týdne těhotenství určit pohlaví plodu. Díky tomu se dá vyloučit postižení plodu onemocněním, které je vázané na mužské pohlaví (např. X-vázaná hemofilie, barvoslepost). Prenatální screening Každá gravidní žena má v rámci komplexního prenatálního vyšetření právo na provedení screeningu VVV. Výsledek prenatálního screeningu je většinou stanoven z hodnot získaných biochemickým screeningem v kombinaci s ultrasonografií [7]. Mezi biochemické parametry jsou zahrnuty [5]: PaPP-A těhotenský plazmatický protein A fβ hcg volná beta podjednotka lidského choriového gonadotropinu hcg lidský choriový gonadotropin AFP alfafetoprotein ue3 nekonjugovaný estriol Mezi ultrazvukové markery (ukazatele) řadíme: NT hodnota nuchální translucence (šíjové projasnění plodu) NB přítomnost nosní kosti Případně další ultrazvukové markery 3

10 Prenatální screening je možný provést několika různými typy testů. Testy a jejich doporučení dle Americké gynekologicko-porodnické společnosti jsou uvedeny v Tabulce 1. V České republice patří mezi nejvíce využívané testy v dnešní době tyto 4 varianty [7, 11]: (pozn. V textu je uvedena vždy délka gravidity jako např. 11+3, tj. týden + den délky těhotenství) 1) Sekvenční integrovaný test 10+0 až 11+3: biochemický test hodnot PAPP-A, resp. volný fβ hcg 11. týden 13+6: ultrazvukové měření NT (nuchální translucence šíjové projasnění plodu), možné změřit pouze sonografistou certifikovaným u FMF Londýn týden: biochemický test hodnot AFP, hcg, ue3 Po dokončení všech vyšetření probíhá celkové vyhodnocení rizika pro výskyt vývojových vad u plodu. 2) Kombinovaný test (I. trimestr) : biochemický test hodnot PAPP-A, volný fβ hcg 11. týden 13+6: ultrazvukové měření NT, měření provádí sonografista certifikovaný u FMF Londýn Záchytnost tohoto testu je vyšší při odběru biochemických markerů v týdnu, než při odběru ve 13. týdnu. 3) Sérum integrovaný test provádí se u pacientek, kde není možné měřit NT sonografistou certifikovaným u FMF Londýn : biochemický test hodnot PAPP-A, resp. volný fβ hcg týden: biochemický test hodnot AFP, hcg, ue3 Po dokončení všech vyšetření probíhá celkové vyhodnocení rizika pro výskyt vývojových vad u plodu. 4) Triple test (II. trimestr) týden: biochemický test hodnot AFP, hcg, ue3 Tento typ testu je vhodný pro ženy, které se dostaví pozdě na vyšetření v I. trimestru, nebo při později zjištěné graviditě. 4

11 Tabulka 1 - Charakteristiky, výhody a nevýhody testů prenatálního screeningu aneuploidií dle amerického doporučení (2016) (Překlad doporučení: The American College of Obstetricians and Gynecologists, 2016) Screeningový test Délka těhotenství pro screening (týdny) Míra detekce pro Downův syndrom (%) Míra pozitivních výsledků* (%) Prvotrimestrální test ii Triple test Quadruple test Integrovaný test 11-14; poté Sekvenční stupňovitý (stepwise) test ; poté Kontingenční sekvenční test 11-14; poté Sérově integrovaný test cfdna Nuchální translucence 11-14; poté termín porodu (u pacientek, které obdrží výsledek) 0, ii Časný screening. 2. Jednotlivý test. 3. Výsledky je možno využít s dalším screeningovým testem. 1. Jednotlivý test. 2. Nevyžaduje se specializovaný ultrazvuk. 3. Zahrnuje také screening otevřených defektů neurální trubice. 4. Výsledky je možno využít s dalším screeningovým testem. 1. Jednotlivý test. 2. Nevyžaduje se specializovaný ultrazvuk. 3. Zahrnuje také screening otevřených defektů neurální trubice. 4. Výsledky je možno využít s dalším screeningovým testem. 1. Nejvyšší míra detekce z kombinovaných testů. 2. Zahrnuje také screening otevřených defektů neurální trubice. Výhody Nevýhody Metoda 1. Poskytnuté výsledky testu z prvního trimestru. 2. Srovnatelná výkonnost s kombinovanými testy, ale poskytuje výsledky prvotrimestrálního screeningu. 3. Zahrnuje také screening otevřených defektů neurální trubice. 4. Výsledky je možno využít s dalším screeningovým testem. Výsledek testu v prvním trimestru: - vysoké riziko DS: nabídnout diagnostický test - nízké riziko pro DS: bez dalšího testu - střední riziko pro DS: nabídnout test ve druhém trimestru Finální hodnocení: posouzení rizika zahrnuje výsledky z prvního a druhého trimestru. 1. Míra detekce je dobře srovnatelná s ostatními testy. 2. Není potřeba měření NT. 1. Nejvyšší míra detekce pro Downův syndrom. 2. Možno provádět v jakémkoli týdnu těhotenství po 10. týdnu. 3. Nízká míra falešně pozitivních výsledků u žen s vysokým rizikem (nebo u žen s vysokým rizikem Downova syndromu). 1. Umožňuje individuální posouzení při multifetální gestaci. 2. Poskytuje dodatečný screening fetálních anomálií a případně detekuje transfuzní syndrom u dvojčat Nižší míra detekce než u kombinovaných testů. 2. Nutnost změření NT. 1. Nižší míra detekce než u testu v prvním trimestru nebo quadruple testu. 2. Nejnižší přesnost z jednotlivých testů v laboratoři. Nižší míra detekce než u kombinovaných testů. Potřeba dvou nezávislých odběrů. Potřeba dvou nezávislých odběrů. Pravděpodobnost dvou nezávislých odběrů. 1. Potřeba dvou nezávislých odběrů. 2. Bez výsledků testu v prvním trimestru. 1.NPVa PPV nejsou jasně uvedeny 2. Vyšší míra falešně pozitivních výsledků u žen s nízkým rizikem Downova syndromu 3. Omezené informace o trizomiích 13, 18, 21 a pohlaví plodu 4. Výsledek ne vždy prezentuje DNA plodu 1. Nedostatečný screening, pokud se jedná o izolovaný test 2. Nutnost certifikace pracovníka provádějícího ultrazvuk NT PAPP-A hcg hcg AFP ue3 hcg AFP ue3 IA NT PAPP-A; následně quadruple test NT HCG PAPP-A; následně quadruple test NT hcg PAPP-A; následně quadruple test PAPP-A; následně quadruple test MG metody Pouze ultrazvuk

12 Zkratky: AFP - alfa fetoprotein; cfdna - cell-free DNA; DS - Downův syndrom; IA - inhibin-a; hcg - lidský choriový gonadotropin; MG metody - molekulárně-genetické metody; NPV - negativní prediktivní hodnota; NT - nuchální translucence (šíjové projasnění plodu); PAPP-A - těhotenský plazmatický protein A; PPV - pozitivní prediktivní hodnota; ue3 - nekonjugovaný estriol. * Pozitivní screeningový výsledek zahrnuje všechny pozitivní výsledky testů: skutečně pozitivní i falešně pozitivní. Kombinovaný screening v prvním trimestru: 87 %, 85 % a 82 % pro měření provedená v 11. týdnu, 12. týdnu a 13. týdnu v uvedeném pořadí. Malone FASTER Cuckle H, Benn P, Wright D. Down syndrome screening in the first and/or second trimester: model predicted performance using meta-analysis parameters. Semin Perinatol 2005;29: Bianchi DW, Platt LD, Goldberg JD, Abuhamad AZ, Sehnert AJ, Rava RP. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. MatErnal BLood IS Source for Accurately diagnose fetal aneuploidy (MELISSA) Study Group [published erratům appears in Obstet Gynecol 2012;120;957]. Obstet Gynecol 2012; 119: a Palomaki GE, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, Haddow JE, Neveux LM, Ehrich M, et al. DNA seguencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study. Genet Med 2011; 13: ii V důsledku variability v růstu a délky těhotenství mohou být některé plody na spodní a horní hranici mimo požadovaný rozsah temenokostrční délky. Údaje od Cuckle H, Benn P, Wright D. Down syndrome screening in the first and/or second trimester: model predicted performance using meta-analysis parameters. Semin Perinatol 2005;29: [5-8] 6

13 Preimplantační genetická diagnostika Preimplantační genetická diagnostika (PGD) je součástí programu umělého oplození (IVF - in vitro fertilizace), kdy je splynutí vajíčka a spermie prováděno laboratorně. Úkolem metody je vybrat vzniklé embryo bez genetické vady, která se vyskytla u partnerů, v rodinné anamnéze, nebo která se vyskytuje u již narozených potomků či vzniká de novo [20]. Před samotným vyšetřením je nezbytné stanovit karyotyp obou partnerů. Většina párů podstupuje dále vyšetření na nejčastější vzácná onemocnění (cystická fibróza, spinální muskulární atrofie, syndrom fragilního X, mikrodeleční syndromy aj.). Pro samotné IVF je odebráno několik vajíček partnerky (po hormonální stimulaci) a vzorek spermií partnera. Gamety (pohlavní buňky) mohou být ponechány spontánnímu splynutí nebo jsou jednotlivé spermie vpraveny řízenou mikromanipulací do zralých oocytů, aby vznikla zygota a následně embryo [21]. Z těchto embryí je následně odebrána 1 buňka, která slouží pro provedení genetického testu na zmíněné choroby. Po nalezení zdravého embrya je toto (v případě jeho správného vývoje) vloženo do dělohy matky, kde dále probíhá jeho vývoj. Zbylá embrya mohou být zmražena a připravena na další případný IVF cyklus. Dosud nebylo zjištěno, že by biopsie (odebrání buňky) embryonální buňky měla na vývoj plodu škodlivý vliv. NIPT neinvazivní prenatální testování Tato kapitola je samostatně popsána níže jako stěžejní část této práce Invazivní vyšetření Nejčastější invazivní metody jsou amniocentéza (odběr plodové vody matky), CVS (odběr klků choria) a kordocentéza. Jejich provedení je komplexně zobrazeno na obrázku č.1. Tato vyšetření jsou spojena s rizikem spontánního potratu plodu, byť toto riziko není příliš vysoké. Mezinárodní výsledky rizika spontánního potratu u odběru plodové vody či choriových klků jsou v rozmezí 0,5-1 % [14], v současnosti se u těchto odběrů uvádí ještě nižší riziko 0,06 % [25]. Tato vyšetření jsou i z tohoto důvodu indikována co nejmenšímu počtu žen, u kterých se metoda jeví jako nezbytná. V současnosti je u některých pacientek možné invazivní metody nahradit moderní metodou neinvazivního testování. Tato metoda se zpracovává neinvazivně z periferní krve matky, na rozdíl od invazivní amniocentézy. 7

14 Amniocentéza Amniocentéza, odběr plodové vody, je invazivní výkon, který probíhá ve sterilních podmínkách vpichem jehly (průměr 0,9 mm) přes břišní stěnu do dělohy. Poloha hrotu jehly je stále kontrolována ultrazvukem. Je odebráno asi 20 ml plodové vody, což je pouze malá část celkového objemu, která se v amniové dutině rychle nahradí. Plodová voda obsahuje buňky odloupané hlavně z kůže a sliznic plodu. Tento materiál může být použit pro celou řadu molekulárních a cytogenetických metod. Buňky se dají též kultivovat a zvýšit tak množství primárního materiálu pro další testy. Amniocentéza bývá prováděna mezi 15. a 16. týdnem těhotenství [22]. Odběr choriových klků (CVS) Choriové klky jsou prstovité výběžky placenty, které je možné využít pro následná genetická vyšetření. Při tomto zákroku je opět, stejně jako u amniocentézy, sterilní vpich jehlou kontrolovaný ultrazvukem. Výhodou tohoto vyšetření je možnost provádět odběr již mezi 11. a 13. týdnem těhotenství. Tento zákrok lze provádět dvěma způsoby, a to v závislosti na poloze plodu a placenty. Jednou z možností je odebrání klků přes břišní stěnu (transabdominálně). Druhým typem je odebrání klků přes děložní čípek (transcervikálně). Tato metoda může být použita v případě umístění placenty na zadní stěně dělohy [26]. Kordocentéza Kordocentéza, odběr krve z pupečníku plodu, je prováděna pod ultrazvukovou kontrolou. Obvykle je toto vyšetření vykonáváno pro získání informací o stavu plodu ve II. a III. trimestru těhotenství, je-li lékařem stanoven důvod (např. nezdárný odběr plodové vody, neštovice, zarděnky, toxoplazmóza apod.). Nebezpečí potratu je v tomto případě méně než 1 % [9]. Kordocentéza je prováděna mezi 19. a 21. týdnem těhotenství. 8

15 Obrázek 1 - Souhrnný pohled na možné invazivní metody odběru prenatálního vzorků. [10] Pozn. Každá metoda je prováděna samostatně pod kontrolou ultrazvuku. Zpracování vzorku: Materiál odebraný invazivní cestou se dále používá pro specializovaná cytogenetická a převážně molekulárně-genetická vyšetření zaměřená na diagnostiku velkého množství genetických vad: - Aneuploidie chromozomů 13, 18, 21, X, Y - Mikrodeleční syndromy - Metody zaměřené na detekci monogenních chorob (např. spinální muskulární atrofie, cystická fibróza, ) 9

16 1.1.3 NIPT neinvazivní prenatální testování volné fetální DNA plodu v krvi matky Neinvazivní prenatální testování (NIPT) je moderní pokročilá genetická metoda založená na přímé analýze volné DNA (cfdna) v krvi matky, která obsahuje i cfdna plodu [12]. NIPT umožňuje velmi přesnou detekci chromozomálních vad u plodu (Tabulka č. 1 barevně zvýrazněný text) a výrazně snižuje falešnou pozitivitu screeningových testů (NIPT - 0,2-2% falešná pozitivita, oproti 5% falešné pozitivitě u kombinovaného nebo integrovaného testu) [15]. NIPT metoda byla v klinických laboratořích poprvé uvedena v Hong Kongu v roce 2011 [16], později téhož roku i ve Spojených státech [12]. V posledních šesti letech je touto metodou možné detekovat aneuploidie u chromozomů 13, 18 a 21 [17]. Trizomie těchto chromozomů způsobují vážné, a především časté vývojové vady: trizomie 21 Downův syndrom, trizomie 13 Patauův syndrom, trizomie 18 Edwardsův syndrom. V poslední době je možné (u některých diagnostických souprav pro NIPT) testovat také aneuploidie pohlavních chromozomů X, Y a dále některé mikrodeleční/mikroduplikační syndromy [17, 18]. NIPT metoda se ukazuje jako výborný kandidát pro možnost budoucího testování dalších mikrodelečních syndromů a jednobazových záměn u plodu [12] Princip NIPT V plazmě člověka je přítomna cfdna pocházející z rozpadu buněk a jejich DNA. Během těhotenství se v periferní krvi (v plazmě) matky vyskytuje v malém množství i fetální cfdna pocházející přímo z placenty plodu. cfdna je tvořena malými fragmenty ( bazí dlouhé), které vznikly rozpadem genomové DNA [12]. Podíl fetální (plodové) frakce (4-20 %) u jednotlivých těhotenství, tj. množství fetální cfdna oproti maternální cfdna, může být ovlivněn mnoha faktory, z nichž nejčastěji popisovanými jsou například: délka těhotenství a váha pacientky [19]. Principem metody je analýza fragmentů získaných NIPT metodou ze vzorku cfdna izolovaného z plazmy těhotné ženy od 10. týdne těhotenství. Na základě porovnání maternální a fetální cfdna je pomocí specializovaného softwaru, který umí takto složitá data analyzovat, vyhodnoceno riziko pro výskyt aneuploidií. 10

17 1.1.5 Kit CLARIGO pro NIPT V molekulární laboratoři Centra lékařské genetiky s.r.o. je v současnosti využívána jediná komerčně dostupná metoda pro vyšetření NIPT naplňující současné potřeby tohoto centra. Od roku 2015 je na pracovišti zavedena a následně akreditována diagnostická souprava Clarigo od firmy Multiplicom (Belgie). Tento test v současnosti nabízí vyhodnocení aneuploidií u chromozomů 13, 18 a 21 a orientační stanovení pohlaví a je označen CE-IVD značkou. Princip metody je založen na analýze volné cfdna v několika krokovém postupu (Obrázek 2). Prvním krokem je odběr periferní krve těhotné ženy, separace plazmy (Obrázek 3) a z ní izolace volné cfdna. Dalším krokem je kontrola koncentrace cfdna vzorku pro detekci případné kontaminace genomovou DNA. Následuje amplifikace (zmnožení) mnoha úseků, které obsahují chromozomální úseky 13., 18., 21., Y chromozomů a kontrolních úseků na jiných chromozomech. Toto zmnožení probíhá pro každý vzorek v oddělené zkumavce jako multiplexní PCR, tj. polymerázová řetězová reakce, která probíhá za přítomnosti více jak 4000 párů primerů. Následuje purifikace (přečištění) PCR reakce k odstranění fragmentů o jiné délce, než je požadovaná délka amplifikovaných úseků. Vzhledem k tomu, že sekvenování nové generace (NGS) (systém MiSeq, Illumina) probíhá vždy pro 12 vzorků současně, je nutné jednotlivé vzorky označit, aby je analyzátor byl schopen rozlišit. K tomu slouží tzv. univerzální PCR reakce, kdy je ke každému vzorku přidán rozpoznávací index. Po PCR reakci jsou vzorky opět promyty, je provedena kontrola kvality vzorku (elektroforeticky na agarózovém gelu) a po změření koncentrace vzorků mohou být spojeny do jednoho vzorku tak, aby měly vyrovnané výsledné koncentrace. Finální vzorek je nakonec naředěn a denaturován pro následnou sekvenaci, tj. rozvolní se DNA dvoušroubovice. Data získaná ze sekvenátoru jsou analyzována Clarigo Reporterem (Multiplicom, Belgie) softwarem vytvořeným přímo pro analýzu Clarigo NIPT metody. Výsledná data jsou zpracována odborným pracovníkem, který vydá na jejich základě výsledek NIPT metody pro indikujícího lékaře. 11

18 Obrázek 2 CLARIGO postup pro NIPT analýzu [24]. Průběh práce se vzorky: 1) Odběr vzorku periferní krve; 2) Separace plazmy (centrifugací); 3) Izolace cfdna; 4) Multiplexní PCR; 5) Purifikace; 6) Univerzální PCR; 7) Kontrola kvality vzorků na gelu; 8) Purifikace; 9) Sloučení 12 jednotlivých vzorků do 1; 10) Sekvenace vzorku; 11) Vyhodnocení v Clarigo Reporteru. Obrázek 3 Separovaná periferní krev po centrifugaci. A. Schéma, B. reálný vzorek pro NIPT. Oddělené části periferní krve po centrifugaci v přítomnosti antikoagulační látky. 12

19 2 Cíle práce 1. Sepsat literární přehled o metodách prenatální diagnostiky 2. Zdokumentovat metodický postup pro neinvazivní prenatální test CLARIGO (Multiplicom) 3. Zpracovat přehled pacientů vhodných pro invazivní i neinvazivní testování 4. Posoudit limitační kritéria NIPT testu vzhledem k laboratorní praxi 13

20 3 Metodika a výsledky Tato práce je zaměřena na zpracování informací získaných z NIPT metodiky CLARIGO (Multiplicom) prováděné v Centru lékařské genetiky s.r.o. Cílem je získat přehled kritérií pro indikaci neinvazivního testování NIPT a důvody pro možné rozšíření limitací tohoto testu. Zpracování výsledků proběhlo z primárně získaných dat ze softwaru CLARIGO Reporter, která jsou zpracovávána anonymně pod unikátním laboratorním číslem. Zpracovány byly výsledky neinvazivního testování z posledních dvou let rutinního používání metodiky CLARIGO (Multiplicom). Pro tuto práci jsou publikovány pouze části těchto dat. Statistický úřad v současné chvíli poskytuje data z genetického testování do roku 2014 a z tohoto hlediska jsou NIPT data v současné době veřejně nepřístupná. Na základě biochemického a ultrazvukového screeningu pacientky je vyhodnoceno riziko pro výskyt častých aneuploidií (trizomie chromozomu 13, 18, 21). Ultrazvukový a biochemický screening v I. a II. trimestru oproti neinvazivnímu testování z krve matky využívá pouze porovnání hodnot biochemických a ultrazvukových parametrů spojených s vyšším rizikem vzniku VVV [13]. Toto riziko je důvodem k další genetické konzultaci a k nabídnutí možnosti následného prenatálního vyšetření, stejně jako další indikační kritéria (např. plod chromozomální vadou z předchozí gravidity, přítomnost strukturální chromozomální vady u jednoho z rodičů, příbuznost partnerů, a jiné). V této práci jsou představena u jednotlivých pacientek konkrétní kritéria, která představují důvody pro možné genetické vyšetření (Tabulka č.2). V případě těchto indikací je pacientce nabídnuto neinvazivní, případně invazivní prenatální testování. Tato kritéria dříve odpovídala indikaci pouze k invazivnímu vyšetření jako je amniocentéza či odběr choriových klků. V současnosti, díky pokroku v molekulární genetice, je možné nabídnout pacientkám neinvazivní testování z periferní krve matky (NIPT). V tabulce jsou popsána indikační kritéria, která by odpovídala indikaci k amniocentéze (případně CVS), nicméně všechny tyto pacientky již mohly podstoupit (pozn. a podstoupily) NIPT. 14

21 Tabulka 2 Ukázka indikačních kritérií k invazivnímu/neinvazivnímu prenatálnímu vyšetření u jednotlivých pacientek Pacient Integrovaný screening ** Riziko aneuploidií* Pozn.: CNS-centrální nervový systém; DS-Downův syndrom; OA-osobní anamnéza; RA-rodinná anamnéza; UPT-umělé přerušení těhotenství; VVV HK-vrozená vývojová vada horních končetin. * riziko nejčastějších aneuploidií chromozómů 13, 18, 21 a defektu neurální trubice ** sekvenční integrovaný test Délka těhotenství (týdny+dny) Indikace k vyšetření 1 negativní 12+1 v předchozí graviditě UPT z genetické indikace - triploidie u plodu 2 negativní 12+2 v RA - DS 3 negativní 12+5 v předchozí graviditě UPT z genetické indikace - omfalokéla a hydrops u plodu 4 negativní 13+3 v RA UPT DS 5 negativní 13+3 v předchozí graviditě UPT z genetické indikace - DS v mozaice 6 pozitivní 1: pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test v RA DS pozitivní sekvenční integrovaný test věk v době porodu 41 let 8 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test 9 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test 10 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test věk v době porodu 36 let 11 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test 12 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test věk v době porodu 35 let v předchozí graviditě UPT z genetické indikace - komplexní vada CNS 13 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test 14 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test věk v době porodu 35 let 15 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test věk v době porodu 35 let 16 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test 17 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test 18 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test 19 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test 20 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test věk v době porodu 38 let 21 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test 22 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test 23 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test v RA - VVV HK 24 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test věk v době porodu 38 let 25 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test 26 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test věk v době porodu 37 let 27 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test věk v době porodu 37 let v RA - DS 28 pozitivní 1: pozitivní sekvenční integrovaný test 15

22 Pacientky, které podstupují NIPT vyšetření, jsou informovány odborným pracovníkem o zpracování dat, vzorku a jeho uchování. Svým podpisem stvrzují seznámení a pochopení těchto informací. Na základě zpracování vzorku a následně získaných dat ze softwaru CLARIGO Reporter (Multiplicom) je vydán výsledek NIPT metody indikujícímu lékaři, který jej interpretuje pacientce. Firma Multiplicom udává až 5 % možnost opakování testu, tj. až u 5 % vzorků není možno NIPT vyhodnotit. Při zpracování primárních výsledků NIPT metody v Centru lékařské genetiky s.r.o. za uplynulé dva roky (2016, 2017) nebylo test možné vyhodnotit pouze u 3-4 % vzorků. Na obrázku č. 4 je ukázka primárních výsledkových listů: A. negativní pro aneuploidie chromozomu 13, 18 a 21; B. vzorek s nízkou fetální frakcí (podíl cfdna plodu vůči cfdna matky); C. vzorek, který nebylo možné vyhodnotit z důvodu nízké korelace s ostatními hodnocenými vzorky; D. vzorek, který nebylo možné vyhodnotit z důvodu nízkého pokrytí čtení během sekvenace. Tento obrázek znázorňuje možné způsoby, jak vyhodnocovací software Clarigo reporter vytváří primární výsledek. Rozpoznání chyby během analýzy je reportováno do tohoto záznamu. Obrázek 4 Ukázka výsledků ze softwaru Clarigo Reporter. A. Vyhodnocený negativní vzorek mužského pohlaví (male); B. Nevyhodnocený vzorek s nízkou fetální frakcí 0,5 %; C. Nevyhodnocený vzorek s nízkou korelací mezi analyzovanými vzorky; D. Nevyhodnocený vzorek s nízkým pokrytí čtení během sekvenace. Z ambulantních lékařských záznamů pacientek, u nichž nebylo možné vzorek vyhodnotit, byla odborným pracovníkem CLG anonymně exportována data. V těchto datech bylo 16

23 sledováno mnoho ukazatelů pro následné roztřídění, např. léková indikace, alergie, rodinná anamnéza, osobní anamnéza, operační zákroky, biochemické markery atd. (data nejsou v práci uvedena). Ze zpracovaných údajů byly dále vytříděny ty ukazatele, které by mohly mít pravděpodobný vliv na kvalitu a množství cfdna a tím pádem na získání výsledku NIPT vyšetření. Nejčastěji se vyskytující ukazatele jsou zobrazeny v tabulce č. 3. U vzorků, které nebylo možné vyhodnotit, je nejvíce zastoupena nízká hodnota PaPP-A proteinu tvořeného placentou (49,21 %), těhotenství po IVF (19,05 %) a léková indikace pro udržení těhotenství, nemoci štítné žlázy a trombofilních stavů (dohromady 12,6 %). Tabulka 3 Nejčastější a nejpravděpodobnější důvody selhání vyhodnocení NIPT. Výskyt ukazatele Důvod u nehodnocených vzorků [%] Nízká hodnota PaPP-A 49,21 Těhotenství po IVF 19,05 Léky na onemocnění štítné žlázy * 6,93 Léky na ředění krve (nízkomolekulární heparin) ** 3,78 Léky k udržení těhotenství *** 1,89 * Letrox, Euthyrox; ** Clexane, Fraxiparin *** Utrogestan 17

24 4 Závěr Tato práce se zabývá neinvazivním genetickým vyšetřením NIPT a jeho postavením v prenatální diagnostice. Nespornou výhodou NIPT je bezpečnost odběru a možnost provést vyšetření již od 10. týdne těhotenství. U většiny pacientek lze NIPT indikovat jako alternativu invazivního testování, které mohou pacientky podstoupit až v případě pozitivního nálezu NIPT. V dnešní době jsou známy některé limitace NIPT testů. Nevyhodnotitelnost NIPT vzorků může ovlivnit mnoho faktorů (např. vysoké BMI, délka těhotenství [27]). Pokud nelze vzorek vyhodnotit, je neprodleně informován lékař a následně pacient. Na genetické konzultaci jsou nabídnuty pacientce tři možné postupy: I) Opakovaný odběr pro NIPT stejným testem; II) Opakovaný odběr pro jiný typ NIPT testu; III) Invazivní vyšetření plodu. Na základě rozhodnutí pacientky je zvolen další postup. S rozvojem NIPT metod se postupně zvyšuje počet hodnocených vzorků a tím pádem lze přesněji identifikovat limitace pro odběr a zpracování vzorku. Toto bylo provedeno v molekulární laboratoři CLG centra na základě dvouleté praxe s NIPT metodou Clarigo od firmy Multiplicom. Z výsledků vyplývá, že jedním z nejčastějších ukazatelů, společných pro vzorky, které nebylo možné metodou NIPT vyhodnotit, je nízká hodnota PaPP-A proteinu (49 % nevyhodnocených vzorků). Tento protein vzniká v placentě což poukazuje na možný vliv na množství fetální cfdna vzhledem k jejímu placentárnímu původu. Množství PaPP-A proteinu je popisováno jako nepřímý průkaz velikosti placenty v prvním trimetru těhotenství [28]. Těhotenství po IVF vychází jako druhý nejčastěji se vyskytující faktor při selhání NIPT testu, a to sice v 19 % z nevyhodnocených případů. Jedním z důvodů tohoto faktoru může být syndrom mizejícího dvojčete, tj. jedno z implantovaných embryí odumře v počátku těhotenství. Dřívější publikace ukazují, že taková těhotenství, kde není syndrom mizejícího dvojčete rozpoznán, způsobují až 15 % falešně pozitivních nebo nevyhodnotitelných vzorků. To je způsobeno častými chromozomálními vadami u zanikajícího plodu a jeho zbytkové DNA v maternální krvi [29]. Poslední z nejvýznamnějších ukazatelů, který se vyskytl u nevyhodnocených vzorků je léková indikace při zdravotních obtížích těhotné ženy. Již publikované studie poukazují na vliv nízkomolekulárního heparinu na kvalitu cfdna. Během užívání léků na ředění krve se v krvi nachází velké množství krátkých úseků cfdna, které mohou mít vliv na vyhodnocení NIPT [30]. U pacientek s takovými léky je vhodné před odběrem vzorku pro NIPT doporučit 18

25 vysazení léku na 24 hodin. Léky na štítnou žlázku se jeví jako důležitý faktor, nicméně z hlediska nedostatečných studií je toto nutné ověřit výzkumem možných vlivů těchto léků na kvalitu cfdna. Do budoucna bude potřeba podložit takováto tvrzení statistickými daty z více genetických center, z národních a světových statistik. Tím bude možné tyto limitace potvrdit, případně vyvrátit. Při potvrzení konkrétních limitací je třeba zvážit jejich dopad na indikaci a provedení NIPT. Pokud budou limitační kritéria znemožňovat provedení testu, případně budou zvyšovat riziko nevyhodnocení testu, bude nutné poskytnout dostatečné informace lékařům poskytujícím toto vyšetření, stejně jako pacientkám a laboratořím, které NIPT provádějí. NIPT metoda je jedním z nejvýznamnějších posunů v současné prenatální genetické diagnostice. Implementace metody probíhá v laboratořích celosvětově stejně jako její výzkum a vývoj. Rozšíření laboratorních diagnostických souprav o hodnocení gonozomálních aberací, mikrodelečních syndromů, možnost rozlišení syndromu mizejícího dvojčete aj. může v blízké budoucnosti výrazně zlepšit neinvazivní prenatální testování. S tímto faktem souvisí i náklady spojené s vyšetřením NIPT vývoj ceny testu je jedním z kritérií dostupnosti metody na trhu a v laboratořích. 19

26 5 Seznam použité literatury: 1. Hájek Z., Kulovaný E., Macek M. Základy prenatální diagnostiky. Praha: Grada, 2000; Str.19. ISBN X 2. Myrianthopoulos NC, Chung CS. Congenital malformations in singletons: epidemiologic survey. Report from the Collaborative Perinatal project. Birth Defects Orig Artic Ser 1974;10: Christianson RE, van den Berg BJ, Milkovich L, Oechsli FW. Incidence of congenital anomalies among white and black live births with long term follow-up. Am J Pub Health 1981;71: Van Regemorter N, Dodion J, Druart C, Hayez F, Vamos E, Flament-Durand J, Perlmutter- Cremer N, Rodesh F. Congenital malformations in 10,000 consecutive births in a university hospital: need for genetic counseling and prenatal diagnosis. J Pediatr 1984;104: Polák P., Loucký J., Tomek V. Prenatální diagnostika vrozených vývojových vad. Maxdorf, 2017; Str Doporučení o laboratorním screeningu vrozených vývjových vad v prvním a druhém trimestru těhotenství. 2011; 7. Společnost lékařské genetiky a genomiky ČLS JEP, Doporučený postup č. 1 Provádění všeobecného prenatálního screeningu vrozených vývojových vad. 2014; 8. Practice Bulletin No. 163 Summary: Screening for Fetal Aneuplody. Obstet Gynecol 2016;1257: ČECH, Evžen, Zdeněk HÁJEK, Karel MARŠÁL a Bedřich SRP. Porodnictví. 2., přepracované a doplněné vyd. Praha: Grada, 2006, Str.107,544. ISBN Dorian J Pritchard, Bruce R. Korf. Základy lékařské genetiky. 2007, Galén. Str.137. ISBN Doporučený postup č. 1: PROVÁDĚNÍ VŠEOBECNÉHO PRENATÁLNÍHO SCREENINGU. VROZENÝCH VÝVOJOVÝCH VAD Allyse M., Minear M.A. et al. Non-invasive prenatal testing: a review of international implementation and challenges. International Journal of Women s Health 2015: Doporučení o laboratorním screeningu vrozených vývojových vad v prvním a druhém trimestru těhotenství Bustamante-Aragones A et al. Non-invasive prenatal diagnosis of single-gene disorders from maternal blood. Gene 2012;504(1): Belošovičová H, Calda P. Screening Downova syndromu v prvním, druhém nebo obou trimestrech? Actual Gyn. 2012;4:

27 16. Haymon L, Simi E, Moyer K, Aufox S, Ouyang DW. Clinical implementation of noninvasive prenatal testing among maternal fetal medicine specialists. Prenat Diagn. 2014; 34(5): Neufeld-Kaiser WA, Cheng EY, Liu YJ. Positive predictive value of non-invasive prenatal screening for fetal chromosome disorders using cell-free DNA in maternal serum: independent clinical experience of a tertiary referral center. BMC Med, 2015;13: Porreco RP et al. Noninvasive prenatal screening for fetal trisomies 21, 18, 13 and the common sex chromosome aneuploidies from maternal blood using massively parallel genomic sequencing of DNA. Am J Obstet Gynecol, 2014;211(4): Song Y et al. Non-invasive prenatal testing for fetal aneuploidies in the first trimester of pregnancy. Ultrasound Obstet Gynecol, 2015;45(1): Zudová D., Sobotka V., et al. Preimplantační genetická diagnostika. Sanquis, Kobilková J., Jirásek J.E., et al. Základy gynekologie a porodnictví. Galén, Praha, 2005, str Webové stránky Centra lékařské genetiky s.r.o.: ( ) 23. Gregora M., Velemínský M. Těhotenství a mateřství: nová česká kniha. 2., aktualizované vydání. Praha, Grada, ISBN (multiplicom)/prenatal/clarigo#features#zoom ( ) 25. Eddleman et al. Pregnancy Loss Rates After Midtrimester Amniocentesis. Obstet Gynecol 2006;108: Nussbaum R.L., McInnes R. R. a Willard H.F. Klinická genetika. 6. vyd. Praha: Triton, c2004. ISBN isbn ; Str Taglauer E.S., Wilkins-Haug L., Bianchi D.W. Review: Cell-free fetal DNA in the maternal circulation as an indication of placental health and disease. Placenta Epub 2014/01/07. doi: /j.placenta Metzenbauer M., Hafner E., et al. Three-dimensional ultrasound measurement of the placental volume in early pregnancy: method and correlation with biochemical placenta parameters. Placenta 2001;22: Study Shows Natera's NIPT Can ID Unrecognized Twins, Fetal Triploidy; May Lower False Positive Rate. 2014: Hui L. Noninvasive prenatal testing for aneuploidy using cell-free DNA New implications for maternal health. Obstetric Medicine. 2016;9(4): doi: / x

28 6 Seznam zkratek použitých v textu AFP alfa fetoprotein BMI body mass index index tělesné hmotnosti CE-IVD certifikovaná diagnostická souprava cfdna cell free DNA volná nebuněčná DNA CLG Centrum lékařské genetiky s.r.o. CVS odběr choriových klků fβ hcg volná beta podjednotka lidského choriového gonadotropinu FISH fluorescenční in situ hybridizace FMF The Fetal Medicine Foundation hcg lidský choriový gonadotropin IVF in vitro fertilizace umělé oplodnění NIPT neinvazivní prenatální testování z periferní krve matky NB přítomnost nosní kosti NT hodnota nuchální translucence (šíjové projasnění plodu) PaPP-A těhotenský plasmatický protein A ue3 nekonjugovaný estriol VVV vrozená vývojová vada 22

29 6.1 Molekulárně genetické pojmy užité v textu: Aneuploidie chybění či nadbytek chromozomů Plazma tekutá složka krve bez buněk, oddělena může být, pokud je odebrána do zkumavky s protisrážlivým činidlem Maternální / fetální DNA genetická informace pocházející z matky / plodu Amplifikace zmnožení v genetice využíváno pro zmnožení DNA pomocí PCR PCR polymerázová řetězová reakce pro amplifikaci konkrétního úseku/úseků v termocykleru za přítomnosti termostabilního enzymu DNA-polymerázy. Amplifikace probíhá v mnoha (15-100) opakujících se cyklech: Denaturace Nasednutí primerů elongace DNA vlákna. Primer specifické úsek nukleové kyseliny DNA dlouhý několik bází, který slouží jako počáteční místo replikace DNA. Primer je komplementární (zapadající do sebe) k úseku DNA, který chceme pomocí PCR metody amplifikovat. Pro PCR reakci se standardně využívá vždy 1 či více párů primerů Multiplexní PCR PCR reakce při níž amplifikujeme více produktů a využívá se tedy více párů primerů Purifikace přečistění vzorků odstranění veškerých nežádoucích kontamintant z daného vzorku Sekvenování nové generace (NGS) moderní metoda, kterou se zjišťuje pořadí nukleových bazí (A, C, T, G) v sekvencích DNA Denaturace DNA vratný proces rozvolnění dvou vláken dvoušroubovice DNA (např. vysokou teplotou v průběhu PCR reakce umožní otevření cílové sekvence pro primer a DNA polymerázu dojde k syntéze požadovaného produktu) Mikrodeleční / mikroduplikační syndrom chromozomální abnormalita charakterizované ztrátou/ziskem malého úseku chromozomu Nízkomolekulární heparin antikoagulační látky zabraňující nadměrnému srážení krve (léky např. Clexane, Fraxiparin, aj.) 23