Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 14 Iontově výměnná chromatografie Iontově výměnná chromatografie se používá pro separaci aminokyselin od roku 1956. Jak z pohledu nákladů, tak i výsledků, byly tyto rané separace srovnatelné s klasickou kolonovou/sloupcovou chromatografií na silikagelu nebo alumině. Používané pryskyřice nebo gely byly relativně hrubé, tlaky nízké a chromatografie složité biologické směsi trvala i několik dní. Tlak na rychlou analýzu biologických vzorků pomocí instrumentální analýzy ve spojení s automatizací a optimalizací vedl k moderní HPLC. Protože dnes existuje velké množství stacionárních fází odolných vůči vysokým tlakům, je koncepce moderní HPLC aplikovatelná i na iontově výměnnou chromatografii a díky tomu lze v krátkém čase separovat složité směsi. Princip Princip iontově výměnné chromatografie je podobný adsorpční chromatografii, kde jsou na povrchu adsorbentu aktivní centra. Ta více či méně definovatelným způsobem specificky interagují s molekulami ve svém okolí. Složky vzorku a mobilní fáze soutěží o jednotlivá interakční místa. Stacionární fáze pro iontovou výměnu má na svém povrchu fixně vázaný elektrický náboj, kdy ionizované skupiny jako SO 2 4, COO, NH + 3 nebo NR + 3 jsou součástí pryskyřice nebo gelu. Náboje jsou kompenzovány ionty obsaženými v mobilní fázi, které soutěží s ionty/konkurují iontům ve vzorku o vazebná místa.
Měnič kationtů V obrázku výše je struktura katexu, který interaguje s kationty. Pryskyřice se skupinami SO 3 je silným katexem, zatímco pryskyřice s COO skupinami je slabý katex. Silné anexy obsahují skupiny NR + 3, slabé anexy NR 2 H + nebo NH + 3 a interagují se záporně nabitými anionty. Jak lze za těchto podmínek vzájemně si konkurujících iontů vzorku a mobilní fáze, což je podstatou této techniky, ovlivnit separaci? Je třeba nalézt optimální podmínky volbou: (a) typu iontoměniče, (b) ph mobilní fáze, (c) iontovou silou (koncentrací) mobilní fáze a (d) typem protiiontů v mobilní fázi,
a pokud je to nutné úpravou všech těchto faktorů. Tato optimalizace je často empirická, ale samozřejmě je nutné dodržet některá pravidla. Protože se zde uplatňuje mnoho vlivů, je obtížné předem predikovat eluční pořadí. Vlastnosti iontoměničů Iontoměniče jsou označovány mnoha zkratkami, z nichž několik nejběžnějších je uvedeno v tabulce níže. První čtyři zkratky se týkají typu iontoměniče a ostatní vlastních funkčních skupin na jeho povrchu. Všechny uvedené funkční skupiny jsou na površích organických pryskyřic jako např. styren-divinylbenzenu nebo silikagelu (pozor na omezenou chemickou stabilitu chemicky modifikovaných silikagelů popsanou dříve). Hustota ligantů, která je identická s maximální iontově výměnnou kapacitou, je asi 3 meq (miliekvivalenty) na gram u iontoměniče S-DVB a asi 1 meq pro silikagel. Protože má ale silikagel větší hustotu, jsou kapacity vztažené na objem HPLC sorbentu stejné pro oba typy. Silné anexy a silné katexy jsou ionizovany v celém rozsahu ph používaném v HPLC a jejich kapacita se proto změnami ph nemění. Používají se pro separace slabých kyselin nebo zásad a hlavní hnací silou separace je náboj těchto separovaných analytů, které nejsou
v závislosti na ph vždy plně ionizovány. Jestliže jsou ve vzorku silné kyseliny nebo silné zásady, jejich ionizace není hodnotou ph mobilní fáze ovlivněna a jsou zcela ionizované v celém rozsahu. Při extrémních hodnotách ph mohou silné katexy v H-cyklu (ph<2) nebo silné anexy v OH-cyklu (ph>10) katalyzovat řadu reakcí, které mnou změnit vzorek (hydrolýza esterů nebo peptidů, disproporcionace aldehydů apod.). Kapacita slabých iontoměničů, tedy jejich retenční chování, je ovlivňována hodnotou ph mobilní fáze. Slabý katex přestane fungovat jako měnič kationtů, jestliže bude ph mobilní fáze významně sníženo pod pk a hodnotu jeho imobilizovaných funkčních skupin (asi o dvě jednotky ph) (viz obr. a níže). Pak slabý katex v protonované formě váže proton tak pevně, že nedochází k jeho výměně za kation analytu a jeho iontově výměnná kapacita se blíží nule. Naopak, jestliže je ph výrazně vyšší než je pk a, všechny jeho funkční skupiny mohou s ionty vzorku interagovat s maximální kapacitou (viz obr. b níže). Při ph blízkém hodnotě pk a je slabý katex disociován jen částečně (viz obr. c níže). Analogické úvahy platí pro slabé anexy, přičemž jejich iontově výměnná kapacita je vysoká při nízkých ph a nízká při vysokých ph. Ideální chování slabých iontoměničů v závislosti na ph znázorňuje obrázek dole. Hodnoty pk a 4,2 a 9,0 byly zvoleny jako typické příklady.
Vliv mobilní fáze Při iontově výměnné chromatografii se uplatňuje několik rovnováh charakterizovaných rovnovážnými konstantami. 1 Jak je patrno z níže prezentovaného obrázku je kationtová výměna funkcí: (a) konkurencí mezi ionty analytu P + a protiionty pufru Na +, vyjádřené konstantou K 1 ; (b) iontovou silou (související s koncentrací) protiiontů; (c) iontovou silou iontů analytu; (d) bazicitou analytu, vyjádřenou konstantou K 2 (odpovídá hodnotě pk a ); (e) kyselostí katexu, vyjádřenou konstantou K 3 ; (f) hodnotou ph mobilní fáze. V tomto systému lze učinit následující závěry: (a) (b) Vzrůstající koncentrace protiiontů snižuje retenční časy (hodnota K 2 je taková, že přednostně interagují protiionty a ionty P + zůstávají v mobilní fázi). Zvýšení ph mobilní fáze způsobuje na katexech pokles retenčních časů (rovnováha charakterizovaná ve Figure 12.4 konstantou K 2 se posouvá vpravo a nedisociované 1 Rovnovážná konstanta je pro reakci A + B C + D definována jako K = [A][B]/[C][D], kde hranaté závorky reprezentují rovnovážné koncentrace
částice P + OH nemohou interagovat s vazebnými místy iontoměniče). Výjimkou jsou slabé katexy, které díky plné disociaci při vysokých hodnotách ph více interagují se vzorkem a retenční časy jsou delší. Naproti tomu: (c) Pokles ph mobilní fáze snižuje retenční časy na anexech. Výjimkou jsou opět slabé anexy, jejichž ionizace roste s klesající hodnotou ph a eluce je tudíž pomalejší. Na iontovou výměnu má vliv i vhodná volba protiiontu. Iontoměniče preferují: ionty s velkým nábojem; ionty s malým poloměrem; ionty s velkou polarizovatelností (větší pohyblivost elektrického náboje, tj. větší schopnost vzniku indukovaného dipólu). Snadno polarizovatelné ionty jsou označovány jako měkké, nepolarizovatelné jako tvrdé (d) Retenční časy na katexech rostou, když je jeden protiiont zaměněn jiným v následujícím pořadí: Ba 2+ Pb 2+ Sr 2+ Ca 2+ Ni 2+ Cd 2+ Cu 2+ Co 2+ Zn 2+ Mg 2+ Mn 2+ UO 2+ 2 Te + Ag + Cs + Rb + K + NH + 4 Na + H + Li +. Např. roztoky draselných iontů eluují rychleji, než roztoky lithných iontů (přesné pořadí závisí i na konkrétním iontoměniči). Nejběžněji používanými protiionty v mobilních fázích jsou ionty K +, NH + 4, Na + a H +.
(e) Retenční časy na anexech vzrůstají záměnou protiiontů v následujícím pořadí: citrát síran šťavelan vinan jodid borát dusičnan fosforečnan chroman bromid thiokyanatan kyanid dusitan chlorid mravenčan octan fluorid hydroxid chloristan. Např. roztoky dusičnanů eluují rychleji než roztoky chloridů (přesné pořadí závisí i na konkrétním iontoměniči). Ionty korozivní a redukující a ionty silně absorbující UV záření se v praxi nepoužívají a nejčastější pufry obsahují fosforečnany, boritany, dusičnany nebo chloristany, vedle nichž se někdy používají i sírany, octany a citrany. Speciální možnosti iontové výměny Iontově výměnnou separaci lze ovlivnit i jinými způsoby než pouhou iontovou výměnou. Díky smíšenému retenčnímu mechanismus, který se uplatňuje, se pak technika označuje jako iontově-moderovaná rozdělovací chromatografie. Uplatňuje se při ní jeden nebo více z následujících mechanismů, které se spolu podílejí na separaci analytů (organických kyselin a bází, sacharidů, alkoholů a metabolitů): iontová výměna, iontové vylučování, normální nebo reverzní rozdělovací rovnováha, ligandová výměna a vylučovací chromatografie. Kationty těžkých kovů lze separovat jako chemické komplexy na anexech; např. Fe 3+ tvoří stabilní ionty s chloridy: Fe 3+ + 4 Cl = [FeCl 4 ] V iontově výměnné chromatografii se uplatňují i ligandově výměnné reakce, ačkoliv účastnící se ligandy nemusí být iontové. Nejprve probíhá vazba iontů mědi nebo niklu na povrch pryskyřice nebo gelu. Protože aminokyseliny mohou sloužit jako selektivní ligandy, obsahuje mobilní fáze ammoniové ionty (také dobrý ligand pro ionty mědi a niklu). Sacharidy (včetně cukerných alkoholů) mohou tvořit komplexy s ionty vápníku a dalšími ionty kovů, jestliže tři z jejich OH skupin mají axiální-ekvatoriální-axiální konformaci:
Katexy s vápenatými protiionty (katex v Ca cyklu) jsou tedy důležitými stacionárními fázemi pro analýzu sacharidů. Iontové vylučování je dalším separačním mechanismem, který lze uplatnit na iontoměničích. Ionizované funkční skupiny na povrchu iontoměniče odpuzují elektrostatickou interakcí stejně nabité ionty, čímž jim brání ve vstupu do pórů stacionární fáze. Separace je založena na vylučovacím principu, ačkoliv důvody vylučování se v těchto dvou případech liší. Ionty jsou eluovány v mrtvém objemu kolony za podmínek uplné iontové exkluze. Iontová chromatografie je jako důležitý speciální případ iontově výměnné chromatografie detailně popsána v jiné časti. Praktická doporučení Množství vzorku musí být zvoleno tak, aby výměnná kapacita iontoměniče byla využita maximálně z 5 %. Příklad Katex LiChrosorb CXS má výměnnou kapacitu 850 µekv g -1. Kolona je naplněná 15 g iontoměniče. Jaké je maximální dovolené množství vzorku radioaktivního 24 NaCl? Řešení Celková výměnná kapacita = 0,85 mekv g -1 15 g = 12,75 mekv Z toho 5 % = 0,64 mekv
Pro molární hmotnost 24 NaCl 59,5 g mol -1 odpovídá 0,64 mmol 24 NaCl hmotnosti 38 mg. Při vývoji metody je dobré začít s pufrem s koncentraci kolem 50 mmol l -1. Neměla by být nižší než 20 mmol l -1, pak není zajištěná dostatečná pufrovací kapacita. Použité soli musí mít vysokou čistotu. Hodnota ph mobilní fáze je funkcí síly kyseliny nebo zásady tvořící pufr, tj. jejich hodnot pk a. Při separaci na katexech je vhodné volit ph o 1,5 jednotky vyšší než je pk a separovaných zásad. Tehdy je méně než 10 % vzorku v disociované formě a malé změny ph mobilní fáze způsobí velké rozdíly v retenčních časech. Naproti tomu by mělo být ph při separacích kyselin na anexech asi o 1,5 jednotek pod hodnotou pk a. Nejvhodnější hodnota ph nebo rozmezí ph pro gradientovou eluci je třeba zjistit empiricky. Typické hodnoty ukazuje tabulka nahoře. V případě používaných pufrů je třeba brát zřetel na skutečnost, že dostatečnou pufrační kapacitu mají pufry, jejichž ph se liší maximálně o jednotku od pk a. Např. kyselina fosforečná má hodnoty pk a 2,1, 7,2 a 12,3. Proto je možné připravit fosfátový pufr pro HPLC o ph v intervalech 1,1 3,1 a 6,2 8,2 (ph=12,3 je pro HPLC příliš bazické). Citrát má hodnoty pk a 3,1, 4,7 a 5,4, octan má pk a = 4,8. Aditiva do mobilních fází: chvostování píků lze snížit přídavkem rozpouštědla mísitelného s vodou. Malé množství fungicidu, jakým je např. kyselina kapronová (hexanová),
fenylrtuťnaté soli, azid sodný, trichlobutanol, tetrachlormethan nebo fenol, je třeba někdy přidat, aby se zamezilo růstu plísní na styren-divinylbenzenových a jiných organických pryskyřicích. Iontově výměnná chromatografie probíhá často za zvýšené teploty (60-80 C), aby se dosáhlo nízké viskozity rozpouštědla, nárůstu počtu teoretických pater a kratších retenčních časů. Promytí jiným roztokem snadno změní formu iontoměniče, jestliže se nový ion váže na iontoměnič pevněji než ten, který má být nahrazen, např.: R K + + AgNO 3 R Ag + + KNO 3 a R + Cl + NH 4 NO 3 R + NO 3 + NH 4 Cl Pokud je jiný protiiont nežádoucí, je třeba na iontoměnič převést nejprve do H + nebo OH cyklu promytím iontoměniče velkým množstvím kyseliny nebo zásady a následně vodou, až je ph efluentu neutrální: R K + + HNO 3 R H + + KNO 3 a R + Cl + NaOH R + OH + NaCl Roztok nového protiontu je pak čerpán na kolonou, přičemž ph je co nejvyšší pro katexy a co nejnižší pro anexy (maximální kapacita). Produktem iontové výměny je nyní voda, která posouvá rovnováhu požadovaným směrem: R H + + Li + + OH R Li + + H 2 O
a R + OH + ClO 4 + H + R + ClO 4 + H 2 O Upozornění: je nutné vyvarovat se vzniku málorozpustných solí v koloně. Aplikace Výše prezentovaný chromatogram zachycuje velkou účinnost vysokoúčinné iontově výměnné chromatografie při rychlé separaci 22 nukleotidů a podobných látek.
Dále je příklad separace RNA, DNA a plasmidu z buněčného lyzátu pomocí makroporézní (400 nm) aminofáze.