Modul IB Histochemie CBO Odd. histologie a embryologie MUDr. Martin Špaček
Histochemie Histologická metoda užívaná k průkazu různých látek přímo v tkáních a buňkách Histochemie Katalytická histochemie Imunohistochemie Lektinová histochemie In situ hybridizace
Histochemie Příklady histochemických metod: Ionty Železo (Fe 3+ ) Perlsova reakce: řez tkání je inkubován ve směsi ferokyanidu draselného a kyseliny chlorovodíková výsledek: nerozpustné tmavě modré precipitáty ferokyanidu železitého Klinická aplikace: diagnóza u pacientů s chorobami, při kterých se nadměrně ukládá železo (např. hemochromatóza)
Slezina Perls (16)
Zinek Histochemie Příklady histochemických metod: Ionty v molekule insulinu lze barvit zinconem (modře) či dithizonem (červeně) Vápník např. depozita ionizovaného vápníku lze barvit hematoxylinem modře
Histochemie Příklady histochemických metod: Tuky barví se barvivy rozpustnými v tucích např.: Sudan IV, sudanová čerň, olejová červeň, nilská modř užívá se zpravidla fixace zmražením s následným krájením v kryostatu
Histochemie Příklady histochemických metod: DNA Feulgenova reakce: hydrolýza DNA kys. chlorovodíkovou to vede ke vzniku aldehydových skupin volné aldehydové skupiny reagují potom se Schiffovým reagens výsledek: nerozpustná červená hmota
Histochemie Příklady histochemických metod: RNA Organely obsahující RNA se barví bazickými barvivy tj. např.: toluidinovou modří, metylenovou modří RNA však není jedinou bazofilní látkou ve tkáních, proto je nezbytné kontrolní preparát inkubovat ribonukleázou
Histochemie Příklady histochemických metod: Cukry Cukry jsou prokazovány PAS reakcí (periodic acid-schiff) ta je založena na oxidaci kyselinou jodistou aldehydové skupiny ty potom reagují se Schiffovým reagens (jako ve Feulgenově reakci) výsledkem je sloučenina mající červenofialovou barvu
Histochemie Příklady histochemických metod: Cukry PAS-pozitivní látky: polysacharidy (glykogen) glykosaminoglykany /mukopolysacharidy/ (hyaluronová kys., chondroitin sulfát) proteoglykany glykoproteiny (thyreoglobulin, kolagen) glykolipidy (lipofuscin) Klinická aplikace: biopsie od pacientů s různými střádavými chorobami (glykogenózy, mukopolysacharidózy)
Slezina PAS (17)
Colon PAS (19)
Colon PAS (19)
Katalytická histochemie Enzymy jsou katalyzátory většiny biochemických reakcí Užívá se zpravidla fixace zmražením Princip: První reakce (histochemická): enzym + substrát reakční produkt Druhá reakce: vizualizace reakčního produktu Vždy nutnost kontrolních řezů
Katalytická histochemie vizualizační reakce precipitace s kationty kovů vznik barevné nerozpustné soli Pb, Co simultánní azokopulace produkt (naftol) se převede na azobarvivo indigogenní reakce štěpení na indoxyl a jeho oxidace na indigo tetrazoliová metoda redukce tetrazoliové soli na barevný formazan spřažená peroxidázová reakce oxidace DAB
Katalytická histochemie - příklady Gomoriho průkaz kyselé fosfatázy řez tkání + substrát štěpený enzymem (např. glycerofosfát sodný) uvolnění fosfátových iontů jejich zachycení dusičnanem olovnatým výsledek: elektrodenzní precipitát
Katalytická histochemie - příklady Peroxidáza tkáňové řezy jsou inkubovány v roztoku obsahujícím peroxid vodíku a DAB (diaminoazobenzidin) DAB je v přítomnosti peroxidázy oxidován výsledek: nerozpustné černé (hnědé) elektrodenzní precipitáty Klinická aplikace: diagnostika leukémií (detekce peroxidázové aktivity v krevních buňkách) Peroxidáza se rovněž užívá ke značení v imunohistochemii a ISH
Katalytická histochemie alkalická fosfatáza v proximálních tubulech ledvin
Katalytická histochemie demonstrace aminopeptidázy v proximálních tubulech ledvin
Imunohistochemie Metoda sloužící k průkazu tkáňových či buněčných antigenů pomocí vazby mezi antigenem a protilátkou Antigeny: proteiny, glykoproteiny, proteoglykany Protilátky: sérové proteiny známé jako imunoglobuliny jsou vytvářeny plazmatickými buňkami v imunohistochemii nejčastěji používáme třídu IgG
Protilátky Protilátka se skládá ze čtyř polypeptidových řetězců, dvou identických lehkých řetězců a dvou identických těžkých řetězců vazebná místa pro receptory fagocytárních buněk
Epitopy Specifické místo antigenu, na které se váže protilátka, se nazývá epitop (antigenní determinanta) Většina antigenů má více epitopů, které vyvolávají při imunizaci vznik skupiny různých protilátek (polyklonálních), namířených proti jednotlivým epitopům
Monoklonální protilátky Monoklonální protilátky jsou klonované protilátky, které jsou všechny zaměřené proti stejnému epitopu jsou tedy mimořádně specifické Aktivované B-buňky produkují směs protilátek zaměřených proti různým epitopům Aktivovaná B-buňka má jen omezenou životnost a sama se nemnoží Jak můžeme selektovat jeden klon B-buněk a prodloužit buněčnou linii?
Monoklonální protilátky
Monoklonální protilátky B lymfocyty mohou mutovat v nádorové buňky a vytvořit nádor zvaný myelom. Myelomové buňky se stávají nesmrtelnými a mohou růst neomezeně v tkáňové kultuře. Fůzí jedné plazmatické buňky s buňkou myelomovou vznikne hybridní buňka (hybridom), která se trvale množí a produkuje monoklonální protilátky
Metody značení protilátek (markery) enzymy (např. peroxidáza vizualizace DAB) částice koloidního zlata (EM) fluorochromy biotin (avidin-biotin)
Fluorochromy Fluorochromy jsou látky schopné absorpce záření ve formě UV či viditelného světla tato absorpce zapříčiní excitaci elektronů v molekule barviva při následném přeskoku zpět na energeticky nižší hladinu dojde k emisi záření o jiné vlnové délce fluorochromy: FITC (fluorescein isothiocyanát), rhodamine (TRITC), DAPI atd.
Fluorochromy Chromatin (DNA) je nabarven modrým fluorochromem DAPI
Fluochromy FITC Na+/K+ ATPáza v bazolaterálním labyrintu proximálních a distálních ledvinných tubulů
Avidin-biotin Tato metoda je založena na vysoké afinitě mezi (značeným) avidinem a biotinem Až 150 molekul biotinu se může navázat na jednu molekulu protilátky zvýšení senzitivity
Typy imunohistochemických metod Přímá metoda používá se značená primární protilátka Nepřímá metoda (citlivější) první krok: neznačená anti-x protilátka se naváže na antigen druhý krok: značená protiprotilátka se váže na anti-x protilátku
Typy imunohistochemických metod Amplifikační metody: při malém množství prokazovaného antigenu ve tkáni Např. značení sekundární protilátky biotinem, na který se následně váže avidin nebo avidinbiotinový komplex (ABC) značený peroxidázou vizualizace peroxidázy se potom provede pomocí katalytické histochemie
Kůže / keratin ABC (22)
Kůže / Melanocyty a Langerhansovy buňky
Anti - S - 100 protilátka, potní žlázy v kůži
Pankreas / insulin ABC (21)
Pankreas / somatostatin v D- buňkách Langerhansových ostrůvků
Protilátky značící neurofilamenta v neuronech
Protilátky značící neurofilamenta v Purkyňových buňkách a v axonech košíčkových buněk
Mozek / astrocyty ABC (96)
Tenké střevo ABC
Prostata / anti-psa ABC
Lektinová histochemie Lektiny jsou glykoproteiny schopné vázat různé sacharidové zbytky (zejména v integrálních proteinech buněčné membrány) Např. vazba v ABO systému (oligosacharid na povrchu erytrocytu a proteiny v séru aglutininy) Cukerné zbytky v membráně se mění při diferenciaci buněk i při jejich maligním zvratu Lektiny se značí podobně jako protilátky
In situ hybridizace Umožňuje detekci specifických sekvencí v nukleových kyselinách (DNA, m-rna) in situ Je založena na navázání (hybridizaci) sondy (krátký úsek nukleové kyseliny o známé sekvenci bází) na cíl Využití: detekce abnormálních genů (např. v prenatální diagnostice) identifikace virových infekcí, atd.
Značení sond: In situ hybridizace radioizotopy vazba nukleotidu s biotinem fluorochromy (FISH)
Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)
Fluorescence in Situ Hybridization (FISH)
Imunohistochemie + ISH DNA lidského papillomaviru prokázaná in situ hybridizací (růžově) v epitelových buňkách identifikovaných fluorescenčně (zeleně) značenými protilátkami proti keratinu